Journal of acteriology and Virology 2008. Vol. 38, No. 3 p.139 147 Detection of Infectious ursal Disease Virus by Double Antibody Sandwich ELISA Woo-Jin Jeon 1, yung-sik Chang 2, Mi-Ja Park 1, Eun-Kyoung Lee 1, Hoo-Don Joo 2, Jun-Hun Kwon 1 and Kang-Seuk Choi 1 * 1 National Veterinary Research Institute, National Veterinary Research and Quarantine ServiceAnyang, Gyeonggi, Republic of Korea; 2 Jenoiotech Inc, Chuncheon, Gangwon, Republic of Korea Received : June 16, 2008 Revised : August 25, 2008 Accepted : September 1, 2008 Infectious bursal disease virus (IDV) is responsible for a highly contagious disease of poultry causing severe immunosuppression in chickens. A double antibody sandwich ELISA (DAS-ELISA) was developed to detect IDV from clinical samples. Two kinds of anti-idv antibodies, monoclonal antibody R63 and chicken anti-idv sera, were used for DAS-ELISA. Detection limit of IDV by DAS-ELISA was approximately 10 2.7 EID 50 /ml. The DAS-ELISA detected IDV from most (13/14) of vaccine products including mild, intermediate and intermediate-plus types. The DAS-ELISA also detected IDV from all (19/19) of field Korean isolates including very virulent and intermediate-plus phenotypes. Our results indicate that the DAS-ELISA would provide useful diagnostic tool to detect IDV from clinical samples as well as rapid quantitative detection of IDV. Key Words: Antigen detection, Diagnosis, ELISA, Infectious bursal disease 서 닭전염성F낭병 (infectious bursal disease, ID) 은전염성과치사율이높은닭의급성전염병으로 infectious bursal disease virus (IDV) 가원인체이다. IDV에감염된닭은 F낭내 임파구가급속히파괴됨으로써심한면역억제를초래되고그로인하여타질병에대한감수성이증가되고예방백신에대한면역반응저하를유발하게한다. 또한, 3주령내지 6주령의어린연령의닭은 IDV에대한감수성이매우높아, 이연령의계군에발생할경우 spike 형태의폐사가수일간에걸쳐집중적으로일어나는특징을가지고있다 (23). * Corresponding author: Kang-Seuk Choi, DVM, MS, PhD. National Veterinary Research Institute, National Veterinary Research and Quarantine Service, Anyang, Gyeonggi, 430-824, Republic of Korea. Phone: +82-31-467-1821, Fax: +82-31-467-1814 e-mail: choiks@nvrqs.go.kr ** This work was supported by a grant (M-AD15--07-01) from National Veterinary Research & Quarantine Service. 론 IDV는분류학적으로 irnaviridae의 Avibirnavirus에속하며, genome은이중나선으로된두개의 RNA segments (segment A와 segment ) 를가지고있다 (6). Segment A는두개의 open reading frames (ORFs) 을함유하고있으며, 이중 ORF1은 VP2 (outer capsid), VP3 (inner capsid) 및 VP4 (protease) 를, ORF2는 VP5 단백질 (nonstructural protein) 을발현한다. 이중 VP2 및 VP3는 IDV capsid를구성하는주요단백질이다 (3,8). 특히, VP2는주요숙주방어단백질로서바이러스중화항체를유발하는 epitopes 를가지고있다 (4). Segment 는 RNA-dependent RNA polymerase 활성을가진 VP1 단백질을발현한다 (22). IDV는두가지의 serotype (serotype 1 및 serotype 2) 이존재한다 (16). Serotype 1은닭에서병원성을나타내지만, 칠면조에서주로분리되는 serotype 2는닭에서병원성을나타내지않는다 (11). Serotype 1은닭에서의병원성및항원적특성에따라 mild, intermediate, intermediate plus, classical virulent, antigenic variant, very virulent phenotype 으로분류하고있다 (23). 이중 mild, intermediate, inter- 139
140 W-J Jeon, et al. mediate plus에속하는 IDV strains들은병원성이약하여닭에감염이되더라도폐사를거의유발하지않아백신 strain으로많이활용되고있다 (23). Classical virulent phenotype의경우 30% 에서 60% 까지폐사를유발할수있으며, very virulent phenotype 의경우 70% 에서 100% 의폐사를유발할수있다 (5,24). Antigenic variant phenotype 의경우닭에서의폐사는거의없으나, F낭의심한위축을유발하는특징을가지고있다 (2,17). 분자생물학적기법이발달함에따라 IDV의 VP2 단백질유전자염기서열비교분석과계통분석학적기법 (phylogenetic analysis) 으로 IDV strain의 phenotype을분류하고있다 (7,12,23). 국내의경우 1980년에 classical IDV의발생이처음보고되었으며 (1), 1992년 9주령산란계에서병원성이증가된 very virulent IDV의발생이확인되었다 (15). 그이후국내백신접종정책실시에도불구하고야외에서 ID 발생이지속적으로발생하여양계산업에피해를주고있는실정이다. 그러므로, IDV에의한질병피해최소화는예방백신접종뿐만아니라철저한차단방역그리고신속진단등을통하여질병발생의오염원과의접촉을조기에차단하는시키는것이중요하다. 현재 ID의진단은임상증상, 발생피해, 백신접종내역등을종합적으로고려하여 ID로의심되는경우감염닭에서항원검출및바이러스분리동정에의해이루어진다. ID 진단을위해적용되고있는항원검출방법으로는한천겔침강반응법 (agar gel immunoprecipitation, AGP) 과역전사중합효소연쇄반응법 (reverse transcriptasepolymerase chain reaction, RT-PCR) 등이있다. 최근 15종의 H형조류인플루엔자바이러스 (H1-H15) 를동시에신속검출하기위한방법으로서두가지종류의항체를이용한 double antibody sandwich (DAS)-ELISA가보고된바있다 (26). IDV의경우 classical, antigenic variant, very virulent IDV를감별분석하기위한목적으로 protein A와항-IDV 단클론항체를이용한 antigen capture (AC)-ELISA가적용되고있다 (7,9,18,21,23). 본연구에서는 IDV serotype 1 특이단클론항체 R63 (19,20) 와항-IDV 닭면역혈청을이용한 DAS-ELISA 방법을개발하였으며, 개발된 DAS-ELISA을이용하여 IDV의검출민감도와특이도를조사하고, IDV의정량적검출과야외의심사례에서 ID 신속진단에의적용가능여부를조사하였다. 재료및방법 1. 바이러스본연구를위하여사용한공시 IDV는 very virulent () type IDV 국내분리주 12주, intermediate plus() type 국내분리주 7주등 field strain 19주, intermediate (I) type D78 백신 strain 1종이었다. 이들공시 IDV들은모두국립수의과학검역원에서보유중인 IDV strain들로서, 국내에서분리된 IDV field strain에대한구체적인정보는 Table 1에서보는바와같다. 이들바이러스는 RT-PCR 에의한 IDV 특이유전자검출, IDV VP2 단백질유전자염기서열분석및계통발생학적분석에근거하여 IDV 로동정되었다. 국내분리주 15주는바이러스를증식시킨발육계란의 chrioallantoic membrane (CAM) 을유제 (homogenization) 하여사용하였으며, 국내분리주 4주는감염닭의조직 (F낭또는맹장편도 ) 을유제한상태로실험에사용하였다. 모든바이러스시료는실험에사용할때까지 -70 에냉동보관하였다. 이중 IDV D78 strain은 DAS-ELISA 양성항원으로, 정상 SPF (specific pathogen free) 발육계란의 CAM 유제액을음성항원으로각각사용하였다. 또한, 국내시판중인 IDV 생독백신제품 15종 (intermediate-plus type 백신 5종, intermediate type 백신 6종, mild type 백신 4종 ) 을백신회사들로부터확보하여본연구에서사용하였다. 이들백신들은백신바이러스를증식시킨발육계란 CAM 유제액으로제조되었다. 대조바이러스로서국립수의과학검역원에서보유하고있는 Newcastle disease virus (NDV) La Sota strain, infectious bronchitis virus (IV) M41 strain, 그리고 avian influenza virus (AIV) H9N2 MS91 strain을사용하였다. 또한, 대조음성검사시료 5점 (NS1-NS5) 은 IDV에감염된적이없는 5건의닭병성감정의뢰조직시료를상기와동일한방법으로발육계란내접종하여얻은 CAM 유제액이었다. IDV의감염량 (embryo infectivity dose 50%, EID 50 ) 은바이러스를계단희석하여 SPF 발육계란내접종시 50% 감염율을보이는희석배수의역수로측정하였다. 2. 단클론항체본연구에사용된단클론항체 R63은미국 American Tissue Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) 로부터융합세포주를구입하여사용하였다. 단클론항체를대
DAS-ELISA for the Detection of IDV 141 Table 1. Field IDV strains used for evaluation of DAS-ELISA History Virus Sample IDV Strain Phenotype a Region Year reed b Passage c 1 SH92 Chungnam 1992 L CE5 2 07D29 Chungnam 3 06Q44 Chungbuk 2006 4 06D62 Gangwon 2006 5 05Q66 Chungnam 6 07D4 Chungbuk 7 05D99 Gyeonggi KN 8 07D6 Jeonbuk 9 05D62 Jeonnam 10 04Q10 Jeonnam 2004 F 11 03099 Gyeonggi 2003 12 07D11 Gyeonggi IP1 03243 Jeonnam 2003 IP2 07D24 Chungbuk F IP3 05D110 Chungnam L IP4 05D58 Chungbuk IP5 05D42 Jeonbuk F IP6 03244 Jeonbuk 2003 IP7 05D21 Gyeonggi CT a, very virulent;, intermediate plus. The phenotype was determined by phylogenetic analysis based on the VP2 protein gene of IDV. b, broiler; L, layer; KN, Korean native boiler c CE, chicken embryo (passage no.); F, bursa of Fabricius; CT, cecal tonsil 량으로생산하기위하여, pristane (Sigma, St. Louis, MO, USA) 을미리감작시킨 alb/c 마우스에융합세포주세포 ( 약 10 7 cells/mouse) 를복강내주입하여복강내종양형성과복수액 (ascitic fluid) 생성을유도하였다. 접종후 7일에서 14일사이에복강내생성된복수액을무균적으로수확하였다. 수확된복수액은 Affi-Gel Protein A (io-rad, Hercules, CA, USA) 를이용하여단클론항체를정제하였다. 정제된단클론항체는실험에사용하기전에 CA TM protein assay reagent (Pierce, Rockford, IL, USA) 를사용하여정량하였다. 3. 항-IDV 면역닭혈청제작항-IDV 면역닭혈청은 IDV에대한항체가부재한 SPF 닭을면역하여제작하였다. 60일령 SPF 닭 6수에 ID 시판백신 (ur706) 을수당 2 doses를점안으로 2주간격으로 2회반복접종한다음마지막접종 35일후에 채혈하였다. 각면역개체로부터혈청 6점을 ID 항체검출용 ELISA 킷트 (IDEXX, Portland, ME, USA) 로항체수준을측정함으로서고도면역면역혈청을선발하였다. 선발된면역혈청은소분하여실험에사용하기전까지 -70 에냉동보관하였다. 4. Double antibody sandwich ELISA IDV를검출하기위한 DAS-ELISA는다음과같이실시하였다. 우선, 0.01 M PS 용액으로희석한단클론항체 R63 ( 최종희석농도 4 μg/ml) 을 Maxisorp TM ELISA plate (Nunc, Roskilde, Denmark) 에 well당 50 μl씩첨가하여 37 에서 1시간동안부착시켰다. 그후세척용완충용액 (0.002 M PS, 0.2% tween 20) 으로 3회반복세척한후 10% (w/v) 조직유제액을 blocking buffer (0.01 M PS, 0.02% tween 20, 3% skimmed milk) 로 1:5 희석한항원검사용시료를 well당 50 μl씩첨가하여 37 에서 1시간동안
142 W-J Jeon, et al. 반응시켰다. 대조음성으로 SPF 닭 F낭유제상층액을, 대조양성으로 IDV P4주를감염시킨 SPF 닭의 F낭유제상층액을포함시켰다. 세척용완충용액으로 3회반복세척한후항-IDV 고도면역혈청 (1:1,000 희석 ) 을 well 당 50 μl씩첨가하여 37 에서 1시간동안반응시켰다. 세척용완충용액으로 3회반복세척한후 horseradish peroxidase (HRP) 가부착된 anti-chicken immunoglobulins antibody (100 ng/ml) (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, USA) 를 well당 50 μl씩첨가하여 37 에서 1시간동안반응시켰다. 세척용완충용액으로 3회반복세척한후 TM 용액 (Sigma) 을 well당 50 μl씩첨가하여 10분간실온에서발색시킨다음, 반응중지용액 (1 M HCl) 을 well당 50 μl씩첨가하여발색을중지시켰다. 흡광도는 ELISA reader (TECAN, Grödig, Austria) 를이용하여 A450 nm에서측정하였다. DAS-ELISA의양성판정기준치 (cut-off) 는음성항원 ( 정상계태아의 CAM 유제액 ) 의평균흡광도의 2.5배를곱한값으로설정하였다. 5. RT-PCR Genomic viral RNA는상기의 CAM 유제액으로제조한공시바이러스액으로부터추출하였으며, 추출방법은 RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) 을이용하여제조사의권장방법을따랐다. RT-PCR은 one-step RT-PCR kit (Qiagen) 을사용하여제조사의권장방법에따라실시하였다. RT-PCR 은또한 Jackwood와 Sommer-Wagner (13) 가사용한 RT-PCR 반응온도와시간조건에따라실시하였다. RT-PCR을위한 Jackwood와 Sommer-Wagner (12) 가사용한 PCR primer sequences (forward primer 5'-GCCCAG- AGTCTACACCAT-3', reverse primer 5'-CCCGGATTATGTC- TTTGA-3') 를사용하여 VP2 유전자의 743 bp (position: nt 738~1191) 가증폭되도록설계되었다. PCR 산물은 1% (w/v) agarose 겔에서전기영동한다음한천겔영상분석기 (Geldoc XR, iorad) 을이용하여 743 bps 크기의핵산증폭여부로판단하였다. 증폭된핵산의증폭정도는한천겔영상분석기에내장된 Quantity One 1-D Analysis Software를이용하여겔내전체 DNA 증폭량대비증폭된핵산의상대정량 (%) 으로분석하였다. 증폭된핵산은 direct sequencing을실시하여진위여부를최종판단하였다. 결과 1. DAS-ELISA 조건확립본연구의 DAS-ELISA에 IDV 항원을검출하기위하여단클론항체 R63이 coating 항체로, 항-IDV 닭면역혈청이검출항체로사용되었다. DAS-ELISA의최적조건을설정하기위하여항원으로서 IDV D78주 ( 발육란 CAM 유제상층액 ) 를사용하였다. SPF 계태아의 CAM 유제상층액을음성대조항원으로사용하였다. Endpoint titration에의하여 DAS-ELISA의최적조건을조사한결과단클론항체 R63의농도는 4 μg/ml, 항-IDV 닭면역혈청 (203239) 은 1:1000 희석배수로결정되었다. DAS- ELISA의양성판정기준치 (cut-off) 는음성대조항원 ( 정상계태아의 CAM 유제액 ) 의평균흡광도의 2.5배를곱한값으로설정하였다. 본연구에서사용한음성항원의평균흡광도는 0.21이었기때문에검사시료내 IDV 검출여부판정을위한 cut-off치는흡광도 0.53 (0.21 2.5) 로결정하였다. 2. DAS-ELISA에의한 IDV 정량본연구에서개발한 DAS-ELISA에의한검사시료내함유되어있는 IDV의검출한계를조사하였다. 이를위하여 IDV D78 strain를 10 4.6 EID 50 /ml부터계단희석한다음그바이러스희석액을사용하여 DAS-ELISA를실 A Figure 1. Quantitative titration of IDV D67 strain by DAS ELISA () and comparison with RT-PCR assay (A).
DAS-ELISA for the Detection of IDV 143 시하고, 동일한바이러스희석액으로 RT-PCR 법으로실시한결과와비교조사해보았다 (Fig. 1). 그결과 ELISA 의경우약 10 3.4 EID 50 /ml 이상의바이러스역가에서바이러스역가와 ELISA 흡광도간높은상관성을나타내었다 (R 2 =0.946). 상기에서설정한 cut-off 기준치인흡광도 0.53을기준으로하였을때, IDV 검출한도는 5 10 3 EID 50 /ml 즉, 10 3.8 EID 50 /ml이었다. 동일바이러스시료에대하여 RT-PCR 을실시한결과, RT-PCR의검출한도는 10 2.5 EID 50 /ml이었으며, DAS-ELISA (10 3.8 EID 50 /ml) 보다약 16배 (10 1.2 EID 50 /ml) 민감하게바이러스를검출하였다. 3. DAS-ELISA에의한 IDV vaccine strain의검출 DAS-ELISA를사용하여국내시판중인 intermediateplus type 백신 5종, intermediate type 백신 6종, mild type 백신 4종등총 15종의 IDV 생독백신제품으로부터 IDV 의검출여부를조사하고그결과를 RT-PCR 결과와비 교하였다 (Fig. 2). 그결과, 14종의시판용 IDV 생독백신제품으로부터 IDV를검출할수있었으며 (ELISA 흡광도 0.53 이상 ), IDV 백신 1종 (mild type 제품 Q) 은 ELISA 흡광도가 0.52로거의 cut-off 수치의 doubtful 판정수준의결과를나타내었다. 그러나, 이들 IDV 생독백신들은 RT-PCR 에서모두양성반응을나타내었다. RT- PCR에의해증폭된각 IDV 핵산증폭산물들의증폭정도를상대적으로비교평가하기위하여 DNA량을상대정량하여분석한결과, 각증폭산물간에다양한수준 (1.4% 에서 9.1%) 의핵산증폭량을보였다. DAS-ELISA에서 doubtful 수준의반응성을나타낸백신제품 Q는 RT- PCR에서도매우약한반응성 ( 상대정량 1.9%) 를보였다. 양성대조항원 (D78 strain, 10 4.6 EID 50 /ml) 은 DAS- ELISA에서평균 ELISA 흡광도 3.3의양성반응을나타내었다. 대조음성바이러스로사용한 NDV (La Sota strain), IV (M41 strain) 그리고 AIV H9N2 (MS91 strain) 는 DAS- A + + + + + + + + + + + + + + + - - - + - OD value, 650nm OD value, 650nm 4.6 1.5 5.0 8.5 8.3 6.8 8.6 5.7 9.7 6.8 8.6 7.4 8.7 8.5 1.9 4.0 4.0 3.5 3.5 3.0 3.0 2.5 2.5 2.0 2.0 1.5 1.5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 A A C C D D E E F F G G Intermediate plus Intermediate Mild H H I I Commercial ID vaccine Cut-off J J M M N N O O P P Q Q NDV NDV IV IV AIV AIV Pos Pos Neg Neg Other virus Control Figure 2. Detection of IDV in commercial IDV vaccines by DAS-ELISA () and comparison with results of RT-PCR (A). Data in the RT-PCR (A) represents relative quantity percent of each amplified DNA to total DNA amplified in the gel.
144 W-J Jeon, et al. Figure 3. Detection of field isolates of IDV by DAS-ELISA. Line (OD 0.53 at 450 nm) represents cut-off. ELISA와 RT-PCR 검사결과모두음성이었다. 4. DAS-ELISA 에의한 IDV 국내분리주의검출본연구에서개발한 DAS-ELISA가 IDV 국내분리주를검출할수있는지여부를조사하고, 그결과를 RT- PCR법과비교하였다. DAS-ELISA 검사결과, very virulent type 분리주 12, intermediate-plus type 분리주 7주등총 19종의 IDV 국내분리주모두양성반응 ( 흡광도 0.53 이상 ) 을보였으며, 1.3에서 3.4의 ELISA 흡광도를보였다. 한편, 대조로사용된 5개의 IDV 음성시료는모두 DAS-ELISA에서음성반응을나타내었다. 고찰 ID 진단을위한바이러스검사방법은현재 IDV 항체부재발육계란에의심시료를접종하여바이러스증식여부를검사하여최종판정하고있다 (23) 그러나, 바이러스분리검사방법은검사비용과수일간의검사기간이소요되는문제점이있다. 그러한연유로, 민감도와 특이도가높고단시간에검사결과를판단할수있는장점을가지고있는 RT-PCR 이나 real-time RT-PCR법이 IDV 진단의대체진단법으로서많이활용되고있다. 유전자진단법은분자생물학적전문지식과관련검사장비를구비한연구실에서는매우효율적이나그렇지않은일반실험실에서적용하기에는한계점을가지고있다. 그러므로, 현재많은병성감정실시기관에서는검사비용이저렴하고간편하게사용할수있는한천겔침강반응법 (AGP) 으로 IDV 항원검사를실시하고있는실정이나수일이상의검사시간과낮은민감도가단점으로지적되고있다. 현재신속대량검사에적합한항원검출방법으로서 AC (antigen capture)-elisa가개발된바있다. 이방법은 ELISA plate상에 protein A를 coating한다음, 다양한종류의 IDV 단클론항체를부착시킨후첨가한 IDV strains 과의반응성을측정하여 IDV의 phenotype을감별하는연구에주로적용되어왔다 (7,9,18,21,23). 이와반대로, 본연구에서는모든 IDV strains에특이적으로반응하는단클론항체를 ELISA plates에직접 coating한다
DAS-ELISA for the Detection of IDV 145 음검사시료내 IDV 존재여부를검출하여감염닭의 IDV 감염여부를판정하는진단목적으로개발하였다. 그러므로본연구의 DAS-ELISA는기존의개발된 ELISA 에비해반응단계를한단계줄이고, 검사시료내 IDV 검출여부판정만으로단순화시킴으로서대량신속검사에적합하도록하였다. 본연구에서개발한 DAS-ELISA 는고도의전문기술이필요없이수시간이내에일반실험실에서도검사결과를판정할수있도록하였고, 본연구의 DAS-ELISA가민감도또한높기때문에상기에서언급한기존항원검사방법을대체하는방법으로서유용할것으로판단된다. 본연구에서는발육계란의 CAM을유제하여증식한바이러스시료를대상으로주로평가하였으나, 실제병성감정에적용될수있는감염닭의 F낭조직등시료에서도성공적으로 IDV를검출할수있었다. 그러므로, 본연구의 DAS-ELISA는 IDV 특이단클론항체를검사시료내 IDV를포획하기위한항체로사용하였기때문에실제감염닭의 F낭조직등에존재하는 IDV 검출하는데있어서비특이적반응또는반응저해요소등에의한영향을미미할것으로판단된다. 이것은단클론항체로 IDV를포획하는 AC-ELISA에서도 F낭조직유제액에서성공적으로 IDV가검출되었다는점이이를뒷받침한다 (20). 본연구에서적용한 DAS-ELISA는시료내 IDV의검출한계가 10 3.7 EID 50 /ml였다. 실험적으로감염시켰을때감염닭의 F낭조직내최소한 10 5.0 EID 50 / ml 이상의 IDV가분포하고있음 (3,25) 을감안한다면본연구의 DAS-ELISA는 IDV 감염의심닭의 F낭으로부터 IDV를검출하기에충분한민감도를가지고있다고판단된다. 또한, 대량검사가가능한 ELISA 방법을사용하고있기때문에대량검사또는신속진단이요구되는 IDV 병성감정이나항원예찰에적용하기에도유용할것으로판단된다. 최근의국내연구자들의연구결과 (13,14) 에의하면, intermediate plus, classical, very virulent 등다양한형태의 serotype 1 IDV가야외농장에서분리되고있기때문에, 이들바이러스들을모두검출할수있도록 IDV serotype 1 strains 에공통적으로반응하는단클론항체 R63 (19,20) 을사용하였다. 예상했던바와같이, 단클론항체 R63를이용한 DAS-ELISA는본연구에서사용한 IDV 국내분리주및백신 strain들을모두검출하였다. 이것은 IDV VP2 단백질상에존재하는단클론항체 R63의바 이러스단백질반응부위가국내분리주들사이에서도여전히공통적으로존재하고있다는것을의미하며, 국내유행하는 IDV를진단하는데적합한항체임을말해주는것이다. Fig. 2에서보여주는바와같이 15종의국내시판 IDV 생독백신을검사하였을때, DAS-ELISA는백신바이러스들의 phenotype에관계없이검사한 14종의제품에서 IDV를검출하였다. 이들제품들은 DAS-ELISA로검출가능한 10 3.7 EID 50 /ml 이상의바이러스를함유하고있다는것을말해준다. 다만, 나머지 1종의제품은 Fig. 2에서보여주는바와같이백신 Q는 ELISA에서양성판정기준치에근접한음성결과를보였는데, RT-PCR을실시한결과에서도유전자증폭농도가상대적으로적은것으로나타났다. 이것은백신 Q내바이러스함량이상대적으로적은데에서기인하였을가능성이높다고보여진다. 비록이들 IDV 생독백신제품들대부분은 DAS-ELISA 에의해 IDV 검출이가능하였지만, 검사한생독백신들간에 ELISA 흡광도 (1.12 내지 3.2) 에서차이가크게나타났다. 이러한차이는크게두가지의요인에의해기인하였을것으로추정된다. 첫번째, DAS-ELISA에서사용한단클론항체의 IDV strain별반응성의차이에의한가능성이있다. 즉, 본연구에서사용한단클론항체 R63가 IDV에공통적으로반응하는항체이긴하지만, IDV strain들과의항원-항체반응정도에서차이 (10) 에서일부기인한것으로보인다. 예를들면, Fig. 2에서보여주는바와같이백신 A와백신 N는 DAS-ELISA에서 1.13과 1.12의비슷한흡광도를나타내었지만, RT-PCR 결과백신 A ( 상대정량 4.6%) 는백신 N (1.9%) 보다 2.4 배의유전자증폭농도를나타내었다. 두번째, 검사한백신제품내바이러스함량의차이에의한가능성이있다. Fig. 1에서보여주는바와같이바이러스함량과 ELISA 흡광도가 94.6% 상관성을보였다는점을감안해볼때검사한백신들간흡광도의차이는 IDV 함량차이도어느정도관련이있다고보여진다. 현재국내 IDV 생독백신의경우현재바이러스정량은 SPF 발육란접종법에의존하고있는실정이며, 이경우최소일주일이상의기간이소요되는단점이있다. 또한, Fig. 1에서보여주는바와같이, DAS-ELISA는 10 3.7 EID 50 /ml 이상의바이러스감염역가에서바이러스함량과 ELISA 흡광도간상관성을감안하면바이러스정량또한가능하므로 IDV 생독백신의함량검사에도적용이
146 W-J Jeon, et al. 가능할것으로여겨진다. 즉, IDV 생독백신최소바이러스함량이 10 2.0 EID 50 /dose 이상을요구하고, 시판 IDV 생독백신제품의경우 vial당천수분 (1000 doses/vial) 이상의바이러스함량을동결보존형태로시판되기때문에백신을 ml당 100수분되게희석한다음 titration DAS- ELISA로검사한다면정량이가능할것으로보인다. 그러므로본연구의 DAS-ELISA는 SPF 발육란검사법에비해검사시간이수시간이내로단축되고, 검사방법또한일반실험실에서도사용하기에간단하기때문에 IDV 생독백신의함유량을신속정밀검사하는데유용할것으로판단된다. 결론적으로, 본연구의 DAS-ELISA는의심사례에서의 IDV 병성감정뿐만아니라생독백신의바이러스함량평가에도적용하기에유용할것으로여겨진다. 참고문헌 1) 이영옥, 김순재, 최정옥, 전무상, 박근식 : 국내종계의 infectious bursal disease virus의감염상황및분리주의생물학적특성. 농사시험보고서 ( 축산, 가축위생편 ). 23: 136-142, 1981. 2) Abdel-Alim GA, Saif YM: Pathogenicity of cell culturederived and bursa-derived infectious bursal disease viruses in specific-pathogen-free chickens. Avian Dis 45: 844-852, 2001. 3) öttcher, Kiselev NA, Stel'Mashchuk VY, Perevozchikova NA, orisov AV, Crowther RA: Three-dimensional structure of infectious bursal disease virus determined by electron cryomicroscopy. J Virol 71: 325-330, 1997. 4) randt M, Yao K, Liu M, Heckert RA, Vakharia VN: Molecular determinants of virulence, cell tropism, and pathogenic phenotype of infectious bursal disease virus. J Virol 75: 11974-11982, 2001. 5) Chettle N, Stuart JC, Wyeth PJ: Outbreak of virulent infectious bursal disease in East Anglia. Vet Rec 125: 271-272, 1989. 6) Delmas, Kibenge FS, Leong JC, Mundt E, Vakharia VN, Wu JL: irnaviridae. pp 561-569. In Virus Taxonomy. Eighth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, all LA (Ed), Academic Press, London, 2004. 7) Eterradossi N, Arnauld C, Toquin D, Rivallan G: Critical amino acid changes in VP2 variable domain are associated with typical and atypical antigenicity in very virulent infectious bursal disease viruses. Arch Virol 143: 1627-1636, 1998. 8) Fahey KJ, Erny K, Crooks J: A conformational immunogen on VP-2 of infectious bursal disease virus that induces virusneutralizing antibodies that passively protect chickens. J Gen Virol 70: 1473-1481, 1989. 9) Fahey KJ, McWaters P, rown MA, Erny K, Murphy VJ, Hewish DR: Virus-neutralizing and passively protective monoclonal antibodies to infectious bursal disease virus of chickens. Avian Dis 35:365-373, 1991. 10) Hassan MK, Saif YM, Shawky S: Comparison between antigen-capture ELISA and conventional methods used for titration of infectious bursal disease virus. Avian Dis 40: 562-566, 1996. 11) Ismail NM, Saif YM, Moorhead PD: Lack of pathogenicity of five serotype 2 infectious bursal disease viruses in chickens. Avian Dis 32: 757-759, 1988. 12) Jackwood DJ, Sommer-Wagner S: Genetic characteristics of infectious bursal disease viruses from four continents. Virology 365: 369-375,. 13) Kim TK, Yeo SG: Cloning and nucleotide analysis of segment A gene of infectious bursal disease virus detected in Korea. Virus Genes 26: 97-106, 2003. 14) Kwon HM, Kim DK, Hahn TW, Han JH, Jackwood DJ: Sequence of precursor polyprotein gene (segment A) of infectious bursal disease viruses isolated in Korea. Avian Dis 44: 691-696, 2000. 15) Kwon YK, Mo IP, Seong HW, Kang MI, Koh H, Lee JG, Yang CK: Studies on the Pathogenicity of infectious bursal disease virus (SH/92) isolated in Korea. RDA J Agri Sci 37: 637-647, 1995. 16) McFerran J, McNulty MS, McKillop ER, Conner TJ, McCracken RM, Collins DS, Allan GM: Isolation and serological studies with infectious bursal diseases from fowl, turkey and duck: demonstration of a second serotype. Avian Pathol 9: 395-404, 1980. 17) Rodriguez-Chavez IR, Rosenberger JK, Cloud SS, Pope CR: Characterization of the antigenic, immunogenic, and pathogenic variation of infectious bursal disease virus due to propagation in different host systems (bursa, embryo, and cell culture), III: pathogenicity. Avian Pathol 31: 485-492, 2002. 18) Sapats SI, Ignjatovic J: Antigenic and sequence heterogenicity of infectious bursal disease virus strains isolated in Australia. Arch Virol 145: 773-785, 2000.
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