Original Article J Sasang Constitut Med 2016;28(2):147-162 http://dx.doi.org/10.7730/jscm.2016.28.2.147 Bleomycin 으로유발한폐약 ( 肺弱 ) 태음인동물모델에서의비만에대한영향평가 김윤하 * ㆍ박정환 * ㆍ곽진영 * ㆍ박정미 ㆍ안택원 * * 대전대학교한의과대학사상체질의학과교실, 대전대학교한의과대학 Abstract A Study of the Effect on Obesity in Taeeumin Animal-experimental Model Induced Lung Fibrosis with Bleomycin Yoonha Kim *, Junghwan Park *, Jinyoung Kwak *, Jungmi Park, Taek won Ahn * * Dept. of Sasang Constitutional Medicine, College of Oriental Medicine, Daejeon Univercity College of Oriental Medicine, Daejeon Univercity Objectives The objective of this study is to develop a taeeumin animal-experimental model induced lung fibrosis with Bleomycin and evaluate the effect on obesity in this animal-experimental model. Methods The subjects were divided into 3 groups : normal group, high fat diet(hfd) control group, and HFD group administered with bleomycin(n=10 per group). To develop taeeumin animal-experimental model with reduced respiratory metabolism, 8-week-old C57BL/6 mice were administered with 0.03ml solution of bleomycin 1U/ml dissolved in distilled water, intratracheal(it), once. Then, the HFD control group and the experimental group were fed with high fat diet for 6 weeks. Airway hyperresponsiveness(ahr) to methacholine was measured at the 1st and 3rd week after bleomycin was administered. Food intake and body weight were measured at regular time weekly. After the final experiment, blood was gathered by cardiac puncture for bloodchemical examination and organs(liver, fatty tissue) were remoed, weighted, and mrna was analyzed. Results and Conclusions Through the experiment, it was found that Bleomycin induced Taeeumin animal-experimental models have leptin resistace. In the experimental group administered with Bleomycin, fatty acid synthesizing gene expression increased and energy metabolizing gene expression decreased. As mrna expression of adiponectin decreased, it was found that Taeeuim animal-experimental model is susceptible to metabolic syndrome and cardiovascular diseases. Key Words : Taeeumin, Obesity, Leptin, Adiponectin, Bleomycin, Animal-experimental model Received April 17, 2016 Revised May 12, 2016 Accepted June 22, 2016 Corresponding Author Taek-Won Ahn Dept. of Sasang Constitutional Medicine, Cheonan Oriental Hospital of Daejeon Univercity Doojeong-dong 621, Seobuk-gu, Cheonan city, Chungcheongnamdo, 331-958, Korea Tel: +82-41-521-7535 Fax: +82-41-521-7007 E-mail: twahn@dju.kr C The Society of Sasang Constitutional Medicine. All rights reserved. This is an open acess article distributed under the terms of the Creative Commons attribution Non-commercial License (http:// creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/)
148 A study of the effect on obesity in taeeumin animal-experimental model induced lung fibrosis with Bleomycin Ⅰ. 緖論 사상체질의학은조선후기동무이제마가창안한것으로, 사람의체질을體形氣像, 容貌詞氣, 性質材幹, 病證藥理를기준으로나눠질병의예방과치료, 양생을달리하는의학이다 1. 이제마는肺와肝은氣液을呼吸하는門戶로, 脾와腎은水穀을出納하는府庫라고하였다. 태양인ㆍ태음인은肺肝의大小와관련된氣液之氣의관계로, 소양인ㆍ소음인은脾腎의大小와관련된水穀之氣의관계로설명하였다 2. 사상체질의학에서의肺는四象중事의속성으로서肺氣는直而伸하고氣液을呼散하는기능을주관하는장기이며, 胃脘에서氣液을呼할때肺가그것을衛한다고하였다. 頭腦의膩海는肺의근본이되는데肺는事務之哀力을가지고膩海의精汁을吸得하여肺元을자양케하고안으로는津海를擁護하여그氣를鼓動시키고津을생성시킨다. 또肺는心善學하여正直中和한즉津이充하게된다. 만일偏倚過不及하게되면津이爍한다. 哀性이遠散하면氣主肺하여肺가더욱盛하나, 樂情이促急하면氣激肺하여肺가더욱衰한다하였다 3. 이러한肺는呼散之氣의주체가되고, 胃脘은肺의통제하에氣液을上達而呼散하는기능을수행한다. 반면, 肺와함께氣液을관장하는기관인肝은吸聚之氣의주체가되며, 小腸은肝의통제하에氣液을中執而吸聚하는기능을수행한다. 사상체질중太陰人은肝大肺小한臟局특징을가진체질로, 肺局은太陰人의偏小之臟으로本元에해당이되고, 肺局의呼散之氣는太陰人의保命之主가된다. 태음인병증분류에관한연구에의하면太陰人表裏病證중表病證은胃脘寒을, 裏病證은肝熱을그기본병리로하여결국에는모두偏小之臟의本元인肺局의呼散之氣손상病證으로귀결되며, 이를넓은의미에서 肺燥證 이라할수있다고하였다 4. 人稟臟理가肝大肺小하여呼散之氣가부족하고吸聚之氣가강한태음인은쉽게비만해지는 경향을보이는데, 이와관련하여태음인과비만의상관성에대한연구들이많이이뤄지고있다 5-8. 한의학표준확립및보험적용확대를위해서는한방의약품의임상시험수행과품목허가를위한연구들이활발히행해져야한다. 사상체질별病證이나藥理메커니즘을연구하기위해서비임상시험이진행되어야하나, 현재까지각체질별동물모형이개발되지않았다. 이에체질별동물모형개발을위한연구를진행하게되었고, 그시작으로폐약태음인동물모형을개발하게되었다. 그리고폐약태음인동물모델을대상으로태음인에게가장취약한질환인비만에대한영향을평가해보기로하였다. Ⅱ. 硏究方法 1. 재료 1) 동물수컷 C57bl/6 생쥐를대한바이오링크 (Korea) 로부터수입하여사용하였다. 분양받은실험동물을 2주간기본사료 (AIN-76A diet) 와물을자유롭게공급하면서실험실환경에적응시킨후, 건강상태가양호한 8주령의생쥐를사용하였다. 동물사육실의환경은항온 (25±2 ), 항습 (50±5%) 및 12시간간격의광주기 (light on 07:00~19:00) 로명암으로조절되는 SPF 환경에서유지실험에사용하였다. 실험동물은 10마리씩정상대조군 (ND), 비만대조군 ( 고지방식이군, HFD), 실험군 (Bleomycin+HFD) 으로분리하여사육하였으며, 식이와식수는자유롭게섭취하도록하였다. 동물실험의윤리적, 과학적타당성검토및효율적인관리를위하여대전대학교동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC) 의승인을받았다. 2) 폐섬유화유발약물기관지내투여 (intratracheal instillation, IT) 방법으
YH Kim et al. 149 로 Bleomycin 1U/ml 를증류수 0.03ml 에녹인용액을폐속에주입하였다. 항암제로흔히쓰이는 bleomycin 은폐손상및폐섬유화의부작용을일으키며이를이용하여실험동물에서급성폐손상과폐섬유화의모델로널리사용하고있다 9. 2. 방법 1) 폐섬유화유발방법 C57BL/6J 계생쥐에게티오펜탈소디움 (thiopental sodium) 0.08ml 를복강내주사하여마취시킨상태에서, 전경부의피부를절개하고근육을정리하여기관을노출시킨다음안과용수술가위로기관을조금절개하였다. 앞을둥글게만든 30gauge 주사바늘을장착한 0.5ml 인슐린주사기를사용하여 Bleomycin 1U/ml 를녹인증류수용액 0.03ml 를절개된기관을통하여직접폐속으로단번에주입하였다. 주입직후곧바로절개한전경부의피부를봉합하고일반사육케이지에담아사육하였다. 2) 메타콜린기관지유발검사 C57bl/6 마우스에 Bleomycin 을 IT로단회투여하고, 1ㆍ3주후에동물폐용적측정기 (one chamber plethysmograghy, All medius, Seoul) 를이용하여기도저항의지표인 Penh 등을포함한다양한호흡지표들의변화를측정하였다. 메타콜린기관지유발검사는 3분간연무기를통해메타콜린농도를 6.25, 12.5, 25, 50mg/mL 의농도로점차증가시켜흡입시킨후폐용적측정기에 3분동안기록하되 Penh 을평균하여측정하였다 10. 2) 동물시험군분류 C57bl/6 마우스를 2주간기본사료 (AIN-76A diet) 로적응시킨후 10주령부터 Diet Induced Obesity Diet Formulas(D12451 & D12492) Bleomycin 투여후대조군과시험군에게고지방식이 (HFD) 섭취를 6주간진행하였다. 정상군과고지방식이 (HFD) 군을비교하여정상장부상태의쥐에게고지방식이가미치는영향을알아보았으며, HFD 식이군과 Bleomycin+HFD 투여군을비교하여정상폐기능동물군과 Bleomycin 에의한폐약태음인동물모델에서의비만에대한영향차이를알아보았다. (1) 정상 C57bl/6j 생쥐 ( 수컷 8주령 24g 생쥐 ) : 정상군 (n=10) (2) HFD 식이군 : 대조군 (n=10) (3) Bleomycin+HFD 투여군 : 시험군 (n=10) 3) 체중및식이효율측정체중및식이섭취량은매주일정한시간에측정하여기록하였다. (1) 체중 (body weight) 1 체중변화 : 매주수요일 9시에측정, 기록 2 총체중증가량 : Final body wt- initial body wt 3 1일평균체중증가량 = Total body wt gain/days (2) 식이섭취량 (food intake) : 1일평균식이섭취량- Total food intake/days (3) 식이효율 (food efficiency ratio, FER) : FER = [Total weight gain/total food intake] 100 4) 혈액생화학검사최종실험종료후희생전 3시간동안절식시킨후심장천자법으로채혈하여혈액생화학적검사를실시하기위하여채혈후 30분이내에 3,000rpm, 4 에서 15분간원심분리하여혈장 (plasma) 을분리하여 -70 에보관하였다가분석하였다. 각실험동물로부터분리한혈장 (plasma) 에서간기능의지표인 ALT 및 AST를, 신장기능지표인 BUN, creatinine 을, 혈장및간의지질함량의지표인총콜레스테롤, HDL(Highdensity lipoprotein)-cholesterol, LDL(Low-density lipoprotein)-cholesterol, 중성지방 (triglyceride), 그리고혈
150 A study of the effect on obesity in taeeumin animal-experimental model induced lung fibrosis with Bleomycin 중 Leptin, Insulin, Adiponectin, 혈당의함량을생화학자동분석기 (Hitachi-720, Hitachi Medical, Japan) 를이용하여측정하였다. 5) 부검및장기조직검사각실험동물의장기조직 ( 간, 지방조직 ) 은혈액채취후즉시적출하여칭량하였다. 적출한간과지방조직들의유전자발현양상을알아보기위해간과지방조직에서 RNA 를추출한뒤 One-step SYBR Green PCR kit(ab science) 를사용하여 cdna 및 real-time PCR 분석을하였다. 3. 통계분석각실험군결과값은 unpaired student's T-test 통계프로그램을사용하여통계처리하였으며, p<0.05 이하의수준에서유의성검정을실시하였다. Ⅲ. 結果 1. 메타콜린에대한기도과민성메타콜린에대한기도과민성은 Bleomycin을 IT로 단회투여하고 1ㆍ3 주후에측정하였다. 대조군에비해 Bleomycin 을투여한실험군에서기도과민성이증가한것으로보아, 급성폐손상과폐섬유화가일어났을것이라고간접적으로확인할수있었다 (Figure 1). 2. 체중, 식이효율비교 1) 체중비교최종 14주에서비만대조군은정상군에비하여평균적으로 10g 의체중이증가하였다. 실험군에서는비만대조군에비하여큰차이는볼수없었지만, 14 주부터실험군이비만대조군에비해 1.4 g의체중증가량차이를보였다 (Figure 2). 하지만체중의뚜렷한차이를보여주는결과가없어 14주이후추가적으로실험기간을늘려야할것으로사료된다. 2) 식이효율비교식이효율 (feeding efficiency ratio: FER%) = 체중증가량 (g) / 사료섭취량 (g) 100) 의공식에서의미하는바와같이사료를섭취하는양이많음에도불구하고체중의증가가적다는것은비만조절효과가있는것으로생각할수있다. 따라서식이효율은비만가능성을나타내는하나의척도로사용할수있고, 식이효율 C57bl/6-Nr : C57bl/6J normal group 60% HFD_CT(1st) : High Fat Diet-Negative Control after 1 week 60% HFD_CT(2nd) : High Fat Diet-Negative Control after 3 week BLM-60% HFD(1st) : High Fat Diet-Bleomycin injection after 1 week BLM-60% HFD(2nd) : High Fat Diet-Bleomycin injection after 3 week Figure 1. Penh value change Figure 2. Body weight change
YH Kim et al. 151 Table 1. The Effect of BLM on Food Intake, Body Weight Gain, Food Efficiency Ratio and Tissue Weights in HFD-fed Obese Mice Normal HFD-CTL HFD-BLM Food intake (g/day) 2.06 2.48 3 Body weight gain (g/day) 0.17±0.015 0.37±0.026 0.37±0.024 Food efficacy ratio (FER, %) 8.06±0.74 14.85±1.064 11.92±0.797 Subcutaneous fat (g) 0.224±0.025 1.188±0.084 1.259±0.169 Epididymal adipose tissue (g) 0.374±0.043 1.957±0.134 1.870±0.202 Viceral fat (g) 0.144±0.040 0.586±0.087 0.651±0.096 Kidney fat (g) 0.100±0.013 0.764±0.052 0.802±0.097 Liver weight (g) 1.142±0.049 1.175±0.064 1.260±0.081 Lung weight(g) 0.183±0.009 0.228±0.031 0.320±0.051 * BLM: bleomycin, CTL: control, HFD: high fat diet. Figure 3. Food efficiency ratio (FER, %) 의수치가적을수록비만조절효과가있다고할수있다. 이번연구결과에서비만대조군의식이효율이 14.8% 이었으며, 이에비하여실험군에서는비만대조군에비하여통계학적으로유의성있게 (p<0.05) 식이효율이감소된추이를보였다 (Table 1, Figure 3). 이러한결과는 Bleomycin으로유도된폐약태음인동물모델에서식이섭취량대비체중증가정도가다소억제되었음을알수있었다. 3. 혈액생화학검사 1) 혈청내총콜레스테롤 Figure 4. Total cholesterol level in serum 비만대조군의혈청내총콜레스테롤 (total cholesterol) 수준은정상대조군의혈청내총콜레스테롤 (total cholesterol) 에비하여약 36.0% 이상증가를나타내었다. 하지만실험군에서는비만대조군과차이를보이지않았다 (Table 2, Figure 4). 2) 혈청내중성지방 비만대조군의혈청내중성지방 (triglyceride) 수준은정상대조군의혈청내중성지방에비하여약 20.4% 이상증가를나타내었다. 그리고실험군에서는비만대조군에비하여 8.6% 이상증가를보였다 (Table 2, Figure 5).
152 A study of the effect on obesity in taeeumin animal-experimental model induced lung fibrosis with Bleomycin Table 2. The Effect of BLM on Blood Biochemistry Prameters in HFD-fed Obese Mice Normal HFD-CTL HFD-BLM Total-cholesterol, mg/dl 120.0±3.0 187.3±4.8 193.2±6.7 Triacylglycerol, mg/dl 102.2±10.1 128.0±6.4 140.6±6.5 Triacylglycerol, mg/dl (liver) 2.0±0.1 5.5±1.5 10.0±1.0 HDL-cholesterol, mg/dl 71.5±1.1 85.3±1.2 85.7±1.8 LDL-cholesterol, mg/dl 503.6±92.8 634.4±183.9 1066.7±412.7 Glucose, mg/dl 150.0±10.3 233.4±5.9 242.8±7.3 AST, U/L 102.0±17.7 103.2±14.3 138.7±33.2 ALT, U/L 27.4±2.4 40.6±4.0 52.6±4.9 ALP, U/L 79.6±1.8 60.1±4.5 65.2±3.0 IGF-1, pg/ml 6519.7±495.0 7732.5±325.0 8465.9±519.0 Leptin, pg/ml 587.7±86.0 38256.0±3072.0 41300.0±3312.0 Eotaxin2, μg/ml (lung) 0.84±0.192 1.25±0.370 0.86±0.351 IL-4, μg/ml (lung) 0.78±0.112 2.17±1.250 0.89±0.411 IL-5, μg/ml (lung) 1.14±0.394 1.05±0.142 2.20±0.604 IL-6, μg/ml (lung) 2.29±0.238 2.21±1.259 4.19±2.523 MUC5AC, μg/ml (lung) 1.72±0.437 1.18±0.296 3.44±0.979 TARC, μg/ml (lung) 1.07±0.352 1.25±0.375 1.82±0.289 TNF-α, μg/ml (lung) 1.41±0.180 1.34±0.442 3.23±0.842 IL-13, μg/ml (lung) 1.42±0.323 1.57±0.678 0.79±0.209 Eotaxin2, μg/ml (skin) 11.44±0.702 0.89±0.343 0.43±0.118 IL-13, μg/ml (skin) 1.00±0.520 6.53±5.508 6.29±4.028 IL-31R, μg/ml (skin) 0.74±0.164 1.37±0.484 2.16±0.485 IL-6, μg/ml (skin) 1.47±0.715 2.23±1.052 3.54±2.236 TNF-α, μg/ml (skin) 0.79±0.298 1.54±0.948 2.52±1.295 TGF-b, μg/ml (skin) 2.80±1.024 11.21±7.401 19.93±10.831 * BLM: bleomycin, CTL: control, HFD: high fat diet, HDL: high density lipoprotein, LDL: low density lipoprotein, AST: aspartate aminotransferase, ALT: alanine aminotransferase, ALP: alkaline phosphatase, IGF: insulinlike growth factor, IL: interleukin, MUC5AC: Mucin 5AC; TARC, thymus and activation-regulated chemokine; TNF, tumor necrosis factor; TGF, transforming growth factor 3) 혈청내고밀도콜레스테롤및저밀도콜레스테롤 Figure 5. Triglyceride level in serum 비만대조군의혈청내고밀도콜레스테롤 (HDLcholesterol) 수준은정상대조군의혈청내고밀도콜레스테롤 (HDL-cholesterol) 과비교하여약 16.2% 이상증가를나타내었고, 실험군에서비만대조군에비하여큰차이를보이지않았다 (Table 2, Figure 6). 혈청내저밀도콜레스테롤 (LDL-cholesterol) 의수준을나타내는그래프로, 비만대조군의혈청내저밀도콜레스테롤 (LDL-cholesterol) 수준은정상대조군의혈청내저밀도콜레스테롤 (LDL-cholesterol) 에비하여약 20.7% 이상
YH Kim et al. 153 Figure 6. HDL & LDL cholesterol level in serum Figure 7. Glucose level in serum Figure 8. Creatine level in serum 증가를나타내었다. 실험군에서비만대조군에비하여차이가없었고이는통계학적으로유의성을띄었다 (p<0.001). 따라서 Bleomycin으로유도된폐섬유화모델생쥐는고지방식이에따른차이를볼수없었다. 4) 혈청내혈당비만대조군의혈청내혈당 (Glucose) 수준은정상대조군의혈청내혈당에비하여약 29.3% 이상증가를나타내었다. 실험군에서는비만대조군과차이를보이 지않았다 (Table 2, Figure 7). 5) 혈청내크레아틴비만대조군의혈청내크레아틴 (creatine) 수준은정상대조군에비하여증가를나타내었다. 하지만실험군의혈청내크레아틴은정상대조군수준으로관찰되었다 (Table 2, Figure 8). 따라서실험군은정상대조군과큰차이가없어신장독성은나타나지않았다고생각된다.
154 A study of the effect on obesity in taeeumin animal-experimental model induced lung fibrosis with Bleomycin * AST: aspartate aminotransferase, ALT: alanine aminotransferase Figure 9. AST & ALT level in serum * NEFA: non-esterified fatty acid Figure 10. NEFA level in serum * IGF: insulinlike growth factor Figure 11. IGF-1 level in serum 6) 혈청내 AST 및 ALT 비만대조군의혈청내 AST 수준은정상대조군의혈청내 AST와차이가없었고, 실험군에서비만대조군에비하여약 25.4% 이상증가를나타내었다. 또한비만대조군의혈청내 ALT 수준은정상대조군에비하여약 32.5% 이상증가를나타내었다. 실험군에서비만대조군에비하여약 23.0% 이상증가를나타내었다 (Table 2, Figure 9). 7) 혈청내 NEFA 비만대조군의혈청내 NEFA 수준은정상대조군의혈청내 NEFA 에비하여약 7.2% 이상증가를나타내었다, 실험군에서비만대조군에비하여약 6.7% 이상증가를나타내었다 (Table 2, Figure 10). 8) 혈청내 IGF-1 비만대조군의혈청내 IGF-1 수준은정상대조군의
YH Kim et al. 155 Figure 12. Fat weight in body Figure 13. Liver and Lung weight in body 혈청내 IGF-1 에비하여약 15.7% 이상증가를나타내었다. 실험군에서비만대조군에비하여약 8.7% 이상증가를나타내었다 (Table 2, Figure 11). 4. 장기조직검사 1) 피하및복부지방량분석비만대조군의총피하지방량 (total abdominal subcutaneous fat) 은정상대조군의총피하지방량 (total abdominal subcutaneous fat) 에비하여 4.5배이상증가를하였다. 반면실험군에서비만대조군에비하여차이를보이지않았다 (Table 1, Figure 12). 2) 간, 폐무게분석비만대조군의간무게 (liver weight) 은정상대조군의간무게 (liver weight) 에비하여약 2.9% 이상증가를나타내었다. 실험군에서비만대조군의간무게에비하여약 6.8% 이상증가를나타내었다. 또한비만대조군의폐무게 (Lung weight) 는정상대조군의폐무게 (Lung weight) 에비하여약 19.8% 이상증가를나타내었다. 실험군에서비만대조군의간무게에비하여약 28.8% 이상증가를나타내었다 (Table 1, Figure 13). 3) 폐조직의 mrna 분석적출한폐에서 real-time PCR 증폭법을사용하여천식과면역조절에관련있는유전자발현양상을확인해보았다. 폐섬유화와비만이연관성이있는지, 그리고폐기능과면역저하에어떤영향을미치는지알아보고자하였다. 호산구가활성화되는과정에서 T helper(th) 세포에서분비하는 cytokine 이중요한역할을한다. Th세포는 cytokine 분비양상에따라 Th1세포와 Th2 세포로나누어지는데 Th1세포에서는 IL-2, IFN-γ 를분비하고 Th2세포는 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 을분비한다. IL-4는순환호산구를내피세포로유착시키는작용이있고, IL-5는 chemokine 의작용에의해서염증목표조직으로의유도를이끄는작용이있는것으로알려져있다. 따라서기관지천식에있어호산구가이동하고활성화하는데 Th2 cytokine이중요한역할을한다고알려져있다. 또한호산구분비 chemokine 인 eotaxin 은천식환자기관지점막에발현이증가된다는보고가있다 11-13. 실험결과폐조직에서의 Eotaxin2 와 IL-4, IL-13의발현은비만대조군에서정상대조군에비하여증가를나타내었다. 실험군에서비만대조군에비하여감소를나타내었다. 또한폐조직에서의 IL-6와 IL-5, MUC5AC, TARC, TNF-α 의발현은비만대조군에서정상대조군에비하여큰차이를보이
156 A study of the effect on obesity in taeeumin animal-experimental model induced lung fibrosis with Bleomycin (A) Eotaxin2 (B) IL-4 (C) IL-6 (D) IL-5 (E) MUC5AC (F) TARC (G) TNF-α (H) IL-13 The mrna expression of (A) Eotaxin2, (B) IL-4, (C) IL-6, (D) IL-5, (E) MUC5AC, (F) TARC, (G) TNF-α,(H) IL-13 were measured with RT-PCR analysis. * BLM: bleomycin, mrna: messenger ribonecleic acid, IL: interleukin, MUC5AC: Mucin 5AC, TARC: thymus and activation-regulated chemokine, TNF: tumor necrosis factor, RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction Figure 14. Effects of BLM on the mrna expression levels in lung tissue 지않았다. 실험군에서비만대조군에비하여증가를나타내었다 (Figure 14). 4) 피부조직의 mrna 분석적출한피부에서 real-time PCR 증폭법을사용하여천식과면역조절에관련있는유전자발현양상을확인해보았다. 실험결과피부조직에서의 TNF-α 와 IL-6, IL-31R 의발현은비만대조군에서정상대조군에비하여증가를나타내었다. 실험군에서비만대조군에비하여증가를나타내었다. 또한피부조직에서의 IL-13 의발현은비만대조군에서정상대조군에비하여큰증가를나타내었다. 실험군에서비만대조군에비하여차이를보이지않았다 (Figure 15). 오히려 eotaxin2 의발현은비만대조군에서정상대조군에비하여감소를나타내었다. 실험군에서비만대조군에비하여감소를나타내었다 (Figure 15). 5) 간조직의 mrna 분석적출한간에서 real-time PCR 증폭법을사용하여비만과에너지소비에관련있는유전자발현양상을확인하여폐섬유화와비만이연관성이있는지, 그리
YH Kim et al. 157 (A) TNF-α (B) IL-13 (C) IL-6 (D) IL-31R (E) Eotaxin2 The mrna expression of (A) TNF-α, (B) IL-13, (C) IL-6, (D) IL-31R, (E) Eotaxin2 were measured with RT-PCR analysis. * BLM: bleomycin; mrna, messenger ribonecleic acid: RT-PCR, reverse transcription polymerase chain reaction Figure 15. Effects of BLM on the mrna expression levels in skin tissue 고폐기능의저하가비만에어떤영향을미치는지알아보고자하였다. 실험결과간조직에서의지방산합성관련유전자인 SREBP-1c, FAS, ap2 의유전자발현은비만대조군에서정상대조군에비하여증가를나타내었다. 실험군에서비만대조군에비하여증가를나타내었다. 또한간조직에서의에너지소비 (thermogenesis activity) 와관련된단백질들 (PPARγ, AMPK-a1, AMPK-a2, UCP2) 의유전자발현은비만대조군에서정상대조군에비하여비슷하거나약간감소하는경향성을보였다. 실험군에서비만대조군에비하여감소를나타내었다 (Figure 16). 하지만오히려 PPAR-γ의발현은실험군에서비만대조군에비하여증가를나타내었다. 또한비만과대사증후군에핵심적역할을하는렙틴 (leptin) 과아디포넥틴 (adiponectin) 중렙틴유전자발현은비만대조군에서정상대조군에비하여증가를나타내었다. 실험군에서비만대조군에비하여증가를나타내었다. 반면아디포넥틴유전자발현은비만대 조군에서정상대조군에비하여감소를나타내었다. 실험군에서비만대조군에비하여감소를나타내었다. 따라서렙틴과아디포넥틴사이에유의한역상관관계를나타내었다 (Figure 16). Ⅳ. 考察 체질동물모델개발에있어서가장큰문제점은인간의사상체질분류의기원과같이性情에따른장부편차를구현할수가없다는것이다. 이에본연구에서는실현이힘든性情보다는장부자체에치우친체질모델을가정하고실험을하게되었다. 태음인병증분류에관한연구 4 에서언급되었듯결국에는表裏病모두偏小之臟의本元인肺局의呼散之氣손상病證으로귀결된다고하여, 太陰人동물모델의특징으로太陰人의偏小之臟인肺小의동물모델을개발하게되었다. 이에肺小의의미에
158 A study of the effect on obesity in taeeumin animal-experimental model induced lung fibrosis with Bleomycin (A) C/EBP-a (B) AP2/FABP4 (C) FAS (D) Leptin (E) PPAR-γ (F) UCP2 (G) SREBP-1c (H) AMPK-a1 (I) AMPK-a2 (J) Adiponectin The mrna expression of (A) C/EBP-a, (B) AP2/FABP4, (C) FAS, (D) Leptin, (E) PPAR-gamma, (F) UCP2, (G) SREBP-1c, (H) AMPK-a1, (I) AMPK-a2, (J) Adiponectin were measured with RT-PCR analysis. * BLM, bleomycin Figure 16. Effects of BLM on the mrna expression levels in Liver tissue 대한고찰이필요하였다. 太陰人의偏小之臟인肺小의의미와관련하여사상체질과폐기능간의연관성연구들이있었는데, 이 14 는 BMI 정상군 (18.5 BMI<23) 에서태음인의경우 FVC%pred 와 FEV1%pred 가다른체질에비해낮은것을확인하였다. 또다른연구로박 15 은다른체질에비해태음인이 FVC%pred 가유의하게낮은것을확인하였다. 또한태음인과소양인에서소음인보다폐기능
YH Kim et al. 159 장애의위험도가높았는데, 소양인은 FVC 만유의하게관계가있었고태음인은 FVC 와 FEV1 에서모두유의하게관계가있었다고하여폐기능장애의양상이다른체질에비해태음인에서보다뚜렷하게나타나고있음을알수있다고하였다. 또한같은연구에서대사증후군의구성요소중이상지질혈증군이폐기능장애 (FVC, FEV1) 와모두유의한관계가있었고, 복부비만군과공복혈당상승군은각각 FEV1, FVC 의폐기능장애와관계가있었다고하여태음인이폐기능저하로인해비만및대사증후군질환에취약할수있음을증명하였다. 이에太陰人의肺小가폐기능저하와유의한관계가있는것으로판단하여 Bleomycin을이용하여인위적으로폐기능저하를유발한쥐모델을폐약태음인동물모델로개발하게되었다. 렙틴 (leptin) 은지방세포에서분비되는아디포카인 (adipokine) 중하나로, 뇌의시상하부에작용하여음식섭취를억제하고교감신경을활성화하여에너지소비를촉진시킨다 14,15. 최근연구에서렙틴이염증전매개물로작용하며 16, 만성폐쇄성폐질환, 천식, 알레르기성비염, 비용종등의염증성호흡기질환에서혈청내렙틴수치가증가한다고하였다 16-19. 또한렙틴이폐포대식세포의수용체에결합하여 Phospholipase D1(PLD1) 을활성화시켜 TNF-α 의발현을증가시키는결과를얻어, 비만과호흡기질환과의연관성을밝혀냈다 20. 본연구에서비만대조군에비해실험군의식이효율이유의하게낮았으나, 오히려실험군의체중이대조군에비해유의하게높은양상을보였다. 이는실험군의일일평균섭취량이비만대조군에비해 20% 이상많았기때문인데, 이러한결과는식이섭취를억제하는기능을하는렙틴의 mrna 발현이비만대조군에비해실험군에서유의하게증가된결과와상반된내용이다. 렙틴이 b형렙틴수용체 (LRb) 와결합하면서식욕억제신경펩티드인 proopiomelanocortin(pomc) 의발현은증가하고, 식욕증진신경펩티드인 Neuropeptide Y(NPY) 의발현은억제된다. 한편, 렙틴과 LRb 의결합 은 suppressor of cytokine signaling-3(socs3) 와 protein tyrosine phosphatase 1B(PTP1B) 를증가시켜 LRb 로부터의과도한신호를억제하는역할을한다. SOCS3 와 PTP1B의증가는렙틴과다로유도되는렙틴저항성의기전이된다 21. 실험군에서렙틴 mrna의발현이증가되었음에도불구하고일일평균섭취량이많았던것은렙틴저항성때문인것으로사료된다. 렙틴저항성과관련된과거선행연구로렙틴저항성과관련하여쥐나비만인에게고지방식이를공급했을때근육조직의렙틴저항성이증가하였다는결과를보여준연구가있었다 22,23. 최근의연구를통해렙틴저항성의원인이시상하부의염증이나소포체스트레스에있다고알려졌는데, 고지방식이와같은과도한영양섭취, TNF-α, IL-6 와같은염증성사이토카인이염증과소포체스트레스의원인으로인식되었다 24,25. 본연구에서도비록유의성은없었으나, 정상군이나비만대조군에비해실험군에서폐조직과피부조직에서 TNF-α, IL-6 등의사이토카인이증가하는경향성을확인할수있었다. 실험군에서의렙틴저항성여부를확인하기위하여 POCM, NPY 의발현여부, SOCS3 와 PTP1B 등을추가적으로조사해볼필요가있을것으로사료된다. 아디포넥틴 (adiponectin) 은지방조직에서가장많이분비되는아디포카인으로, 지방ㆍ당대사, 인슐린감수성등을조절한다 26. 또한선행연구들을통해인슐린저항성과관련하여아디포넥틴의낮은농도가대사증후군및심혈관계질환발생의독립적인인자임이밝혀졌다 27,28. 아디포넥틴의분비량은카테콜아민, 글루코코르티코이드, TNF-α, IL-6, 성장호르몬, 치아졸리딘디온 (thiazolidinediones), 안드로겐등의생물학적지표들과대사스트레스등에의해조절된다 29. 본연구에서실험군의간조직내아디포넥틴 mrna 의활성이비만대조군에비해유의하게저하되어 Bleomycin 으로유도한폐약태음인동물모델이대사증후군과심혈관계질환에대해취약함을확인할수있었다. SREBPs는인슐린의역할을매개하여지방산생합
160 A study of the effect on obesity in taeeumin animal-experimental model induced lung fibrosis with Bleomycin 성에중요한효소인 acetyl-coa carboxylase (ACC) 와 fatty acid synthase (FAS) 유전자의발현을활성화시키는중요한전사인자이다 30. SREBP 는 1a, 1c, 2의세가지종류로나뉘는데, SREBP-1a 와 SREBP-1c는지방산과중성지방의합성에관여하고, SREBP-2 는콜레스테롤의대사및합성을조절한다고알려져있다 31. 이번연구에서 SREBP-1c 를제외한다른결과에서비록유의성은없었지만, 다른대조군들에비해실험군에서의 AST, ALT 가증가하였고, 지방산합성관련유전자인 SREBP-1c, FAS, ap2 의활성이증가하는경향성을보였다. 또한혈청과간조직내중성지방이다른대조군들에비해증가된결과를얻었다. 이를통해실험군에서지방간병변을의심할수있었다. 성정의편급과선천적인장부대소로인해체질의구분및소증과병증의차이가발생하기때문에후천적으로혹은인위적으로장기기능의불균형을유발하는것이특정체질의대표동물모델이라고이르기에는무리가있다. 하지만향후체질별취약질환에대한연구나체질약물에대한연구를위하여체질동물모델의개발이꼭필요하며, 이에본연구는인위적인장부기능의저하를유도한새로운관점으로체질동물모델의개발을시도하였다는것에의의가있다. Ⅴ. 結論 Beomycin 으로유발한폐약태음인동물모델의비만에대한영향에대하여다음과같은결과를얻을수있었다. 1. Bleomycin 을 IT로단회투여한 1ㆍ3 주후, 실험군의기도과민성이증가하여급성폐손상및폐섬유화를간접적으로확인하였다. 2. 실험군에서비만대조군에비해유의하게식이효율이감소하였으나식이섭취량이증가하였다. 3. 실험군과비만대조군에서정상군에비해혈청내총콜레스테롤및중성지방, 저밀도콜레스테롤, 혈 당이증가하였으나유의성이없었다. 4. 실험군과비만대조군에서정상군에비해고밀도콜레스테롤이증가하였다. 실험군과비만대조군사이에차이가없었고이는통계학적으로유의성이있었다. 5. 간조직에서의지방산합성관련유전자인 SREBP-1c, FAS, ap2 의유전자발현이실험군, 비만대조군, 정상대조군순으로증가하였고, 에너지대사관련유전자인 AMPK-a1, AMPK-a2, UCP2 의유전자발현은실험군에서정상군과비만대조군에비해감소하였다. PPAR-γ 의발현은실험군에서정상군과비만대조군에비해증가하였다. 지방산합성관련유전자는발현이증가하고에너지대사관련유전자의발현은감소하는경향을보였으나 SREBP-1c를제외한모든결과에서유의성이없었다. 6. leptin 유전자발현은실험군, 비만대조군, 정상군순으로증가하였고, adiponectin 유전자발현은정상군, 비만대조군, 실험군순으로증가하여 leptin과 adiponectin사이에유의한역상관관계를나타냈다. 이상으로 Bleomycin으로유발한폐약태음인동물모델에서렙틴저항성의가능성을확인하였다. 또한실험군에서염증유발유전자와지방산합성유전자발현이증가하고에너지대사유전자의발현이감소하는경향성을확인하였다. 아디포넥틴 mrna의활성저하로 Bleomycin으로유발한폐약태음인동물모델이대사증후군과심혈관계질환에취약함을확인하였다. Ⅵ. Acknowledgement 상기연구는미래창조과학부 체질특성에따른대사성질환의치료약물및기기임상연구 ( 과제번호 : 2015M3A9B6028311) 의지원을받아수행되었음.
YH Kim et al. 161 Ⅶ. References 1. Lee JM. Dongeisusebowon. Seoul: Daesungmoonhwasa. 1997;1:5, 4:1,10,29-32. (Korean) 2. Lee JM. Dongeisusebowon. 2nd rev. Seoul: Yeogang. 2003:36,278. (Korean) 3. Dept. of Sasang Constitutional Medicine. All colleges of Korean med. in Korea(compilation). The revised and enlarged Sasang Constitutional Medicine. Seoul: Jipmoondang. 2012:131. (Korean) 4. Lee JH, Lee EJ, Koh BH. A study on the schematic organization of the sub-classification system of the Taeeumin symptomatology. J Sasang Constitut Med. 2011:23(1):63-78. (Korean) 5. Moon SH, Sin SH, Kim HJ, Kim JY. A relationship of the obesity and body composition analysis by Sasang constitution. J Oriental Rehab Med. 2002;12(4):1-10. (Korean) 6. Kim DR. A study on 4 type constitution and life character of obese patients. J of Const Med. 1997;9(1): 303-13. (Korean) 7. Kim DR, Baek TH. Clinical Study on the Relationship of Sasang constitution and Obesity. J Sasang Constitut Med. 1996;8(1):319-35. (Korean) 8. Ryu SM, Shin SU, Kim KS, Moon JS, Yoon YS. Analysis of obesity degree and comparision of weight control program among Sasang constitution. Journal of Korean Oriental Association for Study of Obesity. 2005;5(1):21-9. (Korean) 9. Adamson IYR, Bowden DH. The pathogenesis of bleomycin induced pulmonary fibrosis in mice. Am J Pathol. 1974;77:185-97. 10. Chandler DB, Hyde DM, Gin SN. Morphometric estimates of infiltrative cellular changes during the development of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in hamsters. Am J Pathol. 1996;112:981-92. 11. Vanhee D, Gosset P, Boitelle A, Wallaert B, Tonnel AB. Cytokines and cytokine network in silicosis and coal workers' pneumoconiosis. Eur Respir J 1995.8: 834-42. 12. Zhang K, Gharaee Kermani M, McGarry B, Remick D, Phan SH. TNF-alpha-mediated lung cytokine networking and eosinophil recruitment in pulmonary fibrosis. J Immunol. 1997;158:954-9. 13. Huaux F, Lardot C, Arras M, Delos M, Many MC, Coutelier JP, et al. Lung fibrosis induced by silica particles in NMRI mice is associated with an upregulation of the p40 subunit of interleukin-12 and Th-2 manifestations. Am J Respir Cell Mol Biol. 1999;20: 561-72. 14. Lee SG, Kwak CK, Lee EJ, Koh BH, Song IB. The study on the upgrade of QSCCII(II);the study on the re-validity of QSCCII. J Sasang Constitut Med. 2003;15:39-50. (Korean) 15. Pak YS, Kim JS, Lee JH, Lee EJ, Koh BH. Association between Sasang Constitution, Impaired Lung Function and Metabolic Syndrome among Middle-aged Adults in Korea. J Sasang Constitut Med 2013;25(3):180-194. (Korean) 16. Muoio DM, Dohm GL. Peripheral metabolic actions of leptin. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2002;16(4):653-66. 17. Galic S, Oakhill JS, Steinberg GR. Adipose tissue as an endocrine organ. Mol Cell Endocrinol. 2010;316: 129-139. 18. Unal M, Eskandari G, Muslu N, Pata YS, Akbas Y. Serum leptin levels in patients with allergic rhinitis. Otolaryngol Head Neck Surg. 2006;134:331-333. 19. Guler N, Kirerleri E, Ones U, Tamay Z, Salmayenli N, Darendeliler F. Leptin: does it have any role in childhood asthma? J Allergy Clin Immunol. 2004;114: 254-259. 20. Bruno A, Chanez P, Chiappara G, Siena L, Giammanco S, Gjomarkaj M, et al. Does leptin play
162 A study of the effect on obesity in taeeumin animal-experimental model induced lung fibrosis with Bleomycin a cytokine-like role within the airways of COPD patients? Eur Respir J. 2005;26:398-405. 21. Guven M, Bulut Y, Aladag I, Yelken K, Erdogan H. Serum leptin levels in patients with nasal polyposis. J Laryngol Otol. 2008;122:590-592. 22. Lee SM, Choi HJ, Oh CH, Oh JW, Han JS. Leptin Increases TNF-α Expression and Production through Phospholipase D1 in Raw 264.7 Cells. PLoS One. 2014;9(7):e102373. 23. Björnholm M, Münzberg H, Leshan RL, Villanueva EC, Bates SH, Louis GW, et al. Mice lacking inhibitory leptin receptor signals are lean with normal endocrine function. J Clin Invest 2007;117:1354-60. 24. Lantz KA, Hart SG, Planey SL, RoitmanMF, Ruiz-White IA, Wolfe HR, et al. Inhibition of PTP1B by Trodusquemine (MSI 1436) Causes Fat specific Weight Loss in Diet induced Obese Mice. Obesity (Silver Spring) 2010;18:1517-23. 25. Steinberg GR, Smith AC, van Denderen BJW, Chen Z, Murthy S, Campbell DJ, et al. AMP-activated protein kinase is not down-regulated in human skeletal muscle of obese females. J Clin Endocrinol Metab. 2004;89:4575-4580. 26. Cintra DE, Ropelle ER, Moraes JC, Pauli JR, Morari J, Souza CT, et al. Unsaturated fatty acids revert diet-induced hypothalamic inflammation in obesity. PLoS One. 2012;7:e30571. 27. Ozcan L, Ergin AS, Lu A, Chung J, Sarkar S, Nie D, et al. Endoplasmic reticulum stress plays a central role in development of leptin resistance. Cell Metab. 2009;9:35-51. 28. Ziemke F, Mantzoros CS. Adiponectin in insulin resistance: lessons from translational research. Am J Clin Nutr. 2010;91:258S-61S. 29. Berg AH, Combs TP, Du X, Brownlee M, Scherer PE. The adipocyte-secreted protein Acrp30 enhances hepatic insulin action. Nat Med. 2001;7(8):947-953. 30. Matsuzawa Y. Establishment of a concept of visceral fat syndrome and discovery of adiponectin. Proc Jpn Acad 2010;86:131-140. 31. Matsuzawa Y. Adiponectin: Identification, physiology and clinical relevance in metabolic and vascular disease. Atheroscler Suppl. 2005;6:7-14. 32. Marceau P, Biron S, Hould FS, Marceau S, Simard S, Kral JG, et al. Liver pathology and the metabolic syndrome X in severe obesity. J Clin Endocrinol Metab. 1999;84(5):1513-1517. 33. Brown MS, Goldstein JL. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell. 1997; 89(3):331-340.