J Plant Biotechnol (2019) 46:37 44 DOI:https://doi.org/10.5010/JPB.2019.46.1.037 ISSN 1229-2818 (Print) ISSN 2384-1397 (Online) Research Article 에탄올농도에따른돌외잎차추출물의생리활성 김경철 김주성 Physiological activity of the extract from Dolwoe (Gynostemma pentaphyllum Makino) leaves tea by different ethanol concentrations Kyeoung Cheol Kim Ju-Sung Kim Received: 30 October 2018 / Revised: 29 November 2018 / Accepted: 30 November 2018 c Korean Society for Plant Biotechnology Abstract The objective of this study was to compare the effects of different concentration of ethanol extraction on the total phenol and flavonoid contents and physiological activities. The total phenol content of the extracts ranged from 35.54 to 71.52 mg GAE/g. An increase in the ethanol concentration of the solvent led to an increase in the phenol content, with the highest content being found in the 80 and 99.5% ethanol extract. The same trend was observed for flavonoid content. DPPH, nitric oxide, superoxide, hydroxyl radical scavenging activity and TEAC, FRAP and ORAC were measured by antioxidant assay. Radical scavenging activity of aqueous ethanol extracts was better than that of water and 99.5% ethanol extracts. TEAC and FRAP were highly dependent on ethanol concentration and ORAC showed high activity in 40 ~ 80% ethanol extract. Antioxidant activity of Dolwoe leaves tea showed different results among the assay systems. In most experiments, the activities of water and 99.5% ethanol extracts was relatively low. α- Glucosidase inhibitory activity and microorganism inhibitory activity were highest in the 80% and 99.5% ethanol extracts. Therefore, it was considered that extraction with 80% ethanol was appropriate when considering the antioxidative and physiological activities of Dolwoe leaves tea. Based on these results, it can be used as a basic data for the development of food of Dolwoe leaves tea. K. C. Kim J.-S. Kim ( ) 제주대학교식물자원환경전공 (Major in Plant Resource and Environment, SARI, Jeju National University, Jeju, 63243, Korea) e-mail: aha2011@jejunu.ac.kr Keywords Antioxidant, Bacterial inhibition, Ethanol concentration, Flavonoid, α-glucosidase inhibition, Tea extract 서언 인간은생존에있어호흡과정이필수적이며이러한과정에서체내에산소가유입된다. 유입된산소는대사과정이나광화학적반응, 화학물질등여러요인에의하여반응성이높은산소화합물이생성된다 (Beckman and Ames 1998). 체내에생성된활성산소는일정농도로존재할때침입한박테리아, 세균등을제거하기위한면역반응에관여하지만체내활성산소와항산화제사이에불균형이나타나산화스트레스상태가되면심혈관계질환, 암, 노화, 당뇨병등의질병에노출되게된다 (Ratnam et al. 2006). 따라서생체내의활성산소를조절하기위한보조적수단으로항산화제와관련된연구가요구되고있다. 소득이증가하고생활수준이향상됨에따라식품의영양기능과감각기능보다생체방어, 질병예방및노화억제등의생체조절기능에관심이증가하게되었다. 식물성식품에는활성산소종제거효과를나타내는항산화물질이존재하게되는데주로 ascorbic acid, tocopherol 과같은비타민류, 플라보노이드, 폴리페놀물질이대표적이다. 식물의대표적인 2 차대사산물중하나인페놀성화합물은현재까지약 8,000 종이상밝혀졌으며항산화, 항암등의다양한생리활성을나타낸다고보고하였다 (Huang et al. 2009). 특히기호식품인차는우수한항산화물질을함유하고있어관심의대상이되는식품군이다. 차를제조할때주로열을가하는덖음처리공정을시행하게되는데식물체에적절한열이가해지면유효성분추출증대및맛이나향을더이끌어내는역할을한다고보고되었다 (Kim et al. 1996; Ryu et al.1997). 이러한덖음 This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
38 J Plant Biotechnol (2019) 46:37 44 처리공정을통하여 2 차대사산물을가진식물을식품으로이용하기위한차개발이진행되고있다 (Xu et al. 2018). 하지만제조된차를음용할경우일반적으로열수추출된성분위주로흡수되기때문에효율적인섭취가제한된다. 돌외는박과에속하는덩굴성식물로우리나라에서는덩굴차, 덩굴잎차등의여러이름으로부른다. 돌외의사포닌은 80 종이상이존재하고있으며주요 gypenoside 는생리활성측면에서항산화와더불어항비만 (Lu et al. 2018), 항당뇨 (Megalli et al. 2006), 항암 (Liu et al. 2014) 등의다양한효과가보고되고있다. 돌외잎은주로덖음가공처리를거쳐차의형태로이용된다. 또한건강기능식품기능성원료로인정되어돌외추출물은긴장완화, 체지방감소와관련된식품으로사용된다. 따라서본연구에서는다양한생리활성을가진국내산돌외잎차의기능성소재로써이용가능성을높이기위해에탄올농도를달리하여추출물을제조한뒤각추출물에대한항산화활성및생리활성을비교분석하였다. 이러한결과를바탕으로향후돌외잎차의기호음료및가공식품의개발에있어제조조건의용매설정을위한기초자료로활용하고자하였다. 재료및방법 실험재료 본실험에사용한돌외잎차는덖음공정 (1 회덖음 : 160 C 에서 7 분, 30 분실온숙성, 2 회덖음 : 180 C 에서 12 분, 30 분실온숙성, 3 회덖음 : 180 C 에서 7 분, 30 분실온숙성 ) 을거쳐제조하였다. 추출에앞서 0.5 mm 크기로분쇄하였고시료 5 g 에각 100 ml 씩증류수와 20%, 40%, 60%, 80%, 99.5% 농도에탄올을가한뒤 80 C 에서 3 시간동안추출하였다. 추출된여과액은감압회전농축기 (Hel-VAP Precision, Heidolph, Germany) 로용매를제거한뒤 -20 C 에보관하면서실험에사용하였다. 총폴리페놀및플라보노이드함량측정 돌외잎차에탄올농도별추출물의총페놀함량은 Ko et al. (2017) 의방법으로측정하였다. 추출물 20 µl 에증류수 700 µl 와 50% Folin-Ciocalteu 시약 100 µl 를혼합하였다. 2 시간반응후 20% sodium carbonate 용액을 100 µl 씩가하여 1 시간동안발색하고 i-mark microplate reader (168-1135, Bio-Rad, Hercules. CA, USA) 를사용하여 750 nm 의흡광도를측정하였다. 총페놀함량의계산은 gallic acid 를표준품으로검량선을작성하였고추출물 g 당 GAE (gallic acid equivalent) 로나타내었다. 총플라보노이드함량은 Ko et al. (2017) 의방법으로측정하였다. 추출물에 100 µl 에에탄올 300 µl, 10% (w/v) aluminum nitrate 20 µl 와 1 M potassium acetate 20 µl 를혼합한다음증류수 560 µl 를가하여 1 시간반응하였다. 반응액은 microplate reader 를사용하여 415 nm 흡광도를측정하였다. 총플라보노이드함량의계산은 quercetin 을표준품으로작성한검량선을작성하였고추출물 g 당 QE (quercetin equivalent) 로나타내었다. Radical 소거활성측정 DPPH radical 소거능은 Blois (1958) 의방법을응용하여측정하였다. 추출물과 0.15 mm DPPH 를 1:4 비율로총 200 µl 로혼합하고암실에서 30 분간반응시켰다. 반응액은 microplate reader 로 490 nm 의흡광도를측정하였다. Nitric oxide radical 소거능은 10 mm sodium nitroprusside dihydrate (SNP) 와추출물을 1 시간 30 분반응한뒤 Griess reagent 를 100 µl 가하여 10 분뒤 560 nm 에서흡광도를측정하였다. Superoxide radical 소거능은추출물 50 µl 에 150 µm nitroblue tetrazolium, 50 µl, 60 µm phenazine methosulfate 50 µl, 468 µm β-nicotinamide adenine dinucleotide 50 µl 를가하고 5 분뒤 560 nm 의흡광도를측정하였다. Hydroxyl radical 소거능을측정하기위하여 0.1 unit/ml esterase 10 ml 에 1 mm dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) 20 µl 를가하고 37 C 에서 30 분간배양하여 esterase treated DCFH-DA 를제조하였다. 추출물 50 µl 와 0.2 mm FeSO 4 50 µl, 2 µm esterase treated DCFH-DA 50 µl 를가한뒤 1 mm H 2 O 2 50 µl 를처리하였다. 반응액은 30 분뒤 excitation 460 nm, emission 530 nm 에서형광도를측정하여계산하였다. 항산화지수측정 Zulueta et al. (2009) 의방법을변형하여 trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) 를측정하였다. 우선적으로 7 mm 2,2- azino-bis-(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulphonic acid) 와 2.45 mm potassium persulfate 를 16 시간반응하여 ABTS 용액을제조하고 734 nm 의흡광도값이 0.70 ± 0.02 범위가되도록만들어실험에이용하였다. 추출물 50 µl 와 ABTS 용액 1 ml 를 5 분간반응하여 UV-spectrometer (UV-1800, Shimadzu, Japan) 를이용해 734 nm 에서흡광도를측정하였다. Trolox 를농도별로처리하여측정된흡광도는추출물의 TEAC 값계산에사용하였고추출물 g 당 TE (trolox equivalent) 로나타냈다. Ferric reducing antioxidant power (FRAP) 측정을통해추출물의환원력을확인하였다 (Benzie and Strain 1996). 10 mm 2,4,6-tripyridyls-triazine (TPTZ) 과 20 mm FeCl 3 를 1:1 비율로혼합한뒤 0.3 M sodium acetate buffer (ph 3.6) 를가하고 37 C 에서 10 분간반응하여 FRAP working solution 을제조하였다. 제조된 FRAP working solution 150 µl 와추출물 5 µl 을 37 C
J Plant Biotechnol (2019) 46:37 44 39 조건에서 30 분간발색하여 microplate reader 를이용해 595 nm 의흡광도를측정하였다. FeSO 4 를농도별로처리하여측정된추출물의 FRAP 값계산에사용하였고추출물 g 당 FE (FeSO 4 equivalent) 로나타냈다. Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) 는추출물 50 μl 에 78 nm fluorescein 용액을 150 µl 가하여 37 C 에서 10 분처리하고, 221 mm 2,2 azobis(2-amino-propane) dihydrochloride 50 µl 를가하여감소되는형광도를 excitation 485 nm, emission 535 nm 에서 1 시간동안 1 분간격으로측정하였다 (Zulueta et al. 2009). 측정된형광도를이용하여 Area under the curve (AUC) 를산출하였고, trolox 의 AUC 에대비하여추출물의 AUC 를계산한뒤 g 당 TE (trolox equivalent) 로나타냈다. α-glucosidase 저해활성 ɑ-glucosidase 저해활성을측정하기위하여 Kim and Kim (2016) 의방법을기반으로측정하였다. 추출물 20 µl 에 20 mm potassium phosphate buffer (ph 6.8) 120 µl 와 ɑ-glucosidase (0.3 U/mL) 50 µl 를혼합하고 37 C 에서배양하였다. 10 분간배양한시료는 2 mm p-nitrophenyl α-d-glucopyranoside (pnpg) 10 µl 를가하여 37 C 에서반응하고 100 mm sodium carbonate 를 100 µl 로 30 분뒤반응정지시켜 microplate reader 로 415 nm 흡광도를측정하였다. 각에탄올농도별추출물의활성을비교분석하였고혈당강하제로사용되는 acarbose 를대조군으로사용하였다. 미생물저해활성 미생물저해활성측정에이용된균주는한국생명공학연구원미생물자원센터에서분양받아사용하였다. 실험균주는그람양성균 Bacillus cereus (KCTC 1012), Micrococcus luteus (KCTC 1056) 와그람음성균 Pseudomonas aeruginosa (KCTC 1750), Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae (KCTC 2208) 을대상으로생장저해능을확인하였다. 우선적으로각균주를 3 회계대배양하고배지로희석하여배양액을제조하였다. 저해활성을측정하기위하여배양액과추출물을혼합하여추출물의최종농도를 1 mg/ml 가되도록제조하였다. 혼합액은각균주의적정온도에서배양하며 4 시간간격으로 24 시간동안 microplate reader 595 nm 의흡광도를측정하였다. 음성대조군으로추출물을처리하지않은균주의생장곡선을비교하였고양성대조군으로 tetracycline 과 streptomycin 을사용하였다. 통계분석 본연구의실험은 3 회반복하여측정하였고각데이터는평균 ± 표준편차로나타냈다. 각추출물의유의적인차이는 SPSS (Statistical Package for the Social Sciences, ver. 18.0) 로일원분산분석과 Tukey 의다중범위검정 (Tukey Multiple Range Test, TMRT) 방법으로유의적인차이를검정하였다 (p < 0.05). 결과및고찰 총페놀및플라보노이드함량 식물추출물에있는페놀성물질은항산화활성과밀접하게관련되어있다 (Rice-Evans et al. 1997). 개별성분에따른활성의차이는나타나지만추출물의총페놀및플라보노이드의함량이높을수록생리활성측면에서유리하게작용할수있다. 돌외차추출물의총페놀함량은평균 35.54 ~ 71.52 mg GAE/g 으로추출에사용한에탄올농도의존적으로증가하는경향이확인되었다 (Table 1). 그러나 80% 에탄올추출물과 99.5% 에탄올추출물의총페놀함량에서통계적유의성은확인되지않았다. 총플라보노이드함량은페놀함량과비슷한경향을보였다 (Table 1). 5.37 ~ 28.91 mg QE/g 의범위로나타났으며추출용매로사용한에탄올농도에영향을받 Table 1 Total phenol and flavonoid contents of the extract from Dolwoe (Gynostemma pentaphyllum Makino) leaves tea with different ethanol concentrations Samples Total phenol (mg GAE/g) a Total flavonoid (mg QE/g) b Distilled water extract 35.54±0.75 e 5.37±0.21 f 20% ethanolic extract 47.83±0.93 d 7.65±0.17 e 40% ethanolic extract 59.50±1.09 c 14.42±0.07 d 60% ethanolic extract 64.86±1.49 b 20.00±0.04 c 80% ethanolic extract 68.80±1.66 a 23.86±0.14 b 99.5% ethanolic extract 71.52±1.01 a 28.91±0.05 a Means with different letters (a-f) in the same column are significantly different at p<0.05 (SPSS, Tukey) a Total phenolic content analyzed as gallic acid equivalent (GAE) mg/g of extract; values are the average of triplicates b Total flavonoid content analyzed as quercetin equivalent (QE) mg/g of extract; values are the average of triplicates
40 J Plant Biotechnol (2019) 46:37 44 아 99.5% 에탄올로추출하였을때 28.91 mg QE/g 으로가장높은함량이확인되었다. Kim and Kim (2018) 의연구에서가공되지않은건조돌외잎의경우추출용매로사용한에탄올농도에따라총페놀함량이농도의존적으로증가하여본실험의결과와추출경향이유사하였다. 반면총플라보노이드함량은 99.5% 에탄올보다는 60 ~ 80% 에탄올로추출하였을때더높다고보고하였다. 이러한결과는식물체에대한열처리로결합형폴리페놀화합물이유리형폴리페놀로전환되어추출물의페놀성화합물함량이증가되었다는보고처럼건조돌외잎과돌외잎을덖음처리하여가공하는과정에서플라보노이드성분의변화가나타난것으로사료된다 (Hwang et al., 2011). 일반적으로식물추출물제조시에물과에탄올이혼합된에탄올수용액형태가침투용이성이높아페놀성화합물추출에유리하다고보고되고있다 (Won et al. 2015). 하지만덖음공정을처리한돌외잎차는열처리로추출효율이증가하여에탄올과같은유기용매를사용하였을경우높은페놀및플라보노이드가관찰된것으로판단된다. 또한 Kim and Kim (2018) 의연구에서건조돌외잎에탄올추출물의총페놀및플라보노이드함량은각각 66.34mg GAE/g, 6.98mg QE/g 인반면덖음처리를통하여추출되는페놀성물질의양은그보다증가된것을확인하였다. Radical 소거활성 항산화활성측정방법에따라서시료의항산화활성이다르게나타나기때문에다양한검색방법을이용해야한다 (Moon et al. 2003). 돌외차추출물의다양한 radical 소거능의실험결과 radical 종류에따라활성이각기다른경향이관찰되었다 (Table 2). DPPH radical 소거능은 polyhydroxy aromatic compounds, aminophenol 등의 aromatic amine 등에환원되어보라색에서노란색으로탈색이나타나는원리로수소공여능측정과자유라디칼측정에사용되는실험이다 (Blois 1958). 결과로는추출용매와관련된경향은확인되지않았으나 80% 에탄올추출물에서 190.56 µg/ml 으로가장높은활성이 확인되었다. 그리고물추출물에서 294.07 µg/ml 로가장낮은활성이나타났다. Nitric oxide 는 superoxide 와반응하게되면 peroxynitrite 를형성하게되는데이화합물은독성을가지며강한산화제의특징이있어단백질, DNA 등의손상과노화, 암, 염증등의중요한요인으로작용한다 (Althaus et al. 1994). 이에따라돌외차추출물의소거능을측정하였고, 실험결과 superoxide radical 소거능은 20, 40% 에탄올추출물이각각 210.47, 204.38 µg/ml 로유의적으로높은활성이나타났다. Nitric oxide radical 소거능에서는 40, 60% 에탄올추출물에서 255.42, 253.07 µg/ml 로유의적으로활성이높았다. 자유라디칼중에서가장강한독성을가진것으로알려진 hydroxyl radical 은반응속도와반응성이매우큰특징을가지고있다 (Halliwell and Aruoma 1991). 이러한특징은지질의산화와 DNA 손상을야기하여다양한질환에원인이된다. 돌외차추출물의 hydroxyl radical 은소거능은물추출물과 20% 에탄올추출물에서유의적인차이는보이지않았으나그이후 80% 에탄올추출물까지활성이증가하다가 99.5% 에탄올추출물에서약간감소하는결과를보였다. Hydroxyl radical 소거능은추출물의총페놀함량및플라보노이드함량이높은 80, 99.5% 에탄올이활성이우수하였다. 이러한결과는유기용매로추출된페놀성화합물이 hydroxyl radical 소거능에영향을미친것으로생각된다. 실험결과를종합하여볼때 radical 소거능실험은각기다른경향이나타났다. 이는 radical 에따라효과적으로작용하는성분이다를수있으며용매에따라추출된성분이차이를보인것으로사료된다. 항산화지수 돌외차추출물의항산화지수를계산한결과는 Table 3 과같다. TEAC 값은 ABTS radical 소거능을 trolox 에대한함량으로계산하여나타낸지수로다양한식물추출물의항산화능을측정하기위한방법으로이용되고있다. TEAC 는 Rice- Evans et al. (1997) 의연구에서폴리페놀구조와활성관계를비교분석하기위하여고안된실험으로 ABTS radical 이물과 Table 2 The radical scavenging activity of the extract from Dolwoe (Gynostemma pentaphyllum Makino) leaves tea with different ethanol concentrations Samples RC 50 (µg/ml) a DPPH Nitric oxide Superoxide Hydroxyl Distilled water extract 294.07±4.32 e 335.47±0.76 c 302.15±7.32 b 652.70±65.36 d 20% ethanolic extract 227.04±3.01 c 313.63±3.95 b 210.47±5.54 a 644.08±25.07 d 40% ethanolic extract 202.85±6.18 b 255.42±1.70 a 204.38±13.81 a 489.56±13.22 bc 60% ethanolic extract 220.88±0.46 c 253.07±3.06 a 366.61±12.57 c 502.93±9.40 c 80% ethanolic extract 190.56±0.87 a 398.44±3.16 d >1000 d 364.14±3.49 a 99.5% ethanolic extract 265.20±0.95 d >1000 e >1000 d 378.66±4.73 ab Means with different letters (a-e) in the same column are significantly different at p<0.05 (SPSS, Tukey) a RC 50 (µg/ml) Amount required for a 50% reduction of radicals
J Plant Biotechnol (2019) 46:37 44 41 Table 3 Antioxidant capacity of the extract from Dolwoe (Gynostemma pentaphyllum Makino) leaves tea with different ethanol concentrations Samples TEAC (mm TE/g) a FRAP (mm FE/g) b ORAC (mm TE/g) c distilled water extract 85.79±0.87 d 131.78±4.89 e 588.36±89.16 b 20% ethanolic extract 126.41±2.49 c 183.57±4.09 d 870.82± 1.22 ab 40% ethanolic extract 146.85±7.87 ab 288.23±3.36 b 1137.80±32.42 a 60% ethanolic extract 154.85±2.36 a 262.17±2.52 c 1137.19±28.70 a 80% ethanolic extract 141.11±1.67 b 318.62±2.68 a 1019.36±40.18 a 99.5% ethanolic extract 153.90±1.72 a 320.78±1.44 a 658.66±168.83 b Means with different letters (a-e) in the same column are significantly different at p<0.05 (SPSS, Tukey) a TEAC analyzed as trolox equivalent (TE) mm/g of extract; values are the average of triplicates b FRAP analyzed as ferrous sulfate equivalent (FE) mm/g of extract; values are the average of triplicates c ORAC analyzed as trolox equivalent (TE) mm/g of extract; values are the average of triplicates 유기용매에용해가가능하여극성과무관하게항산화능측정이가능하다고알려져있다. 돌외차추출물의 TEAC 값은물추출물에비해추출용매에에탄올이포함되어있을때증가하는경향을보였다. 또한용매의에탄올함량이 40% 이상일때활성이증가한것으로확인되었다. 특히 TEAC 값이유의적으로높은 99.5% 에탄올 (153.90 ± 1.72 mm TE/g) 은물추출물 (85.79 ± 0.87 mm TE/g) 보다 1.8 배더활성이높았다. FRAP 법은대부분의항산화제가환원력을가지고있다는점에착안하여항산화능을측정하기위해항산화물질과반응하여철이온이환원되는원리로고안된실험방법이다 (Benzie and Strain 1996). FRAP 값은 80%, 99.5% 에탄올추출물이유의적으로가장높게나타났다. 이러한결과는 TEAC 와비슷한경향이었고물추출물 (131.78 ± 4.89 mm FE/g) 과 99.5% 에탄올추출물 (320.78 ± 1.44 mm FE/g) 의활성은 2.4 배이상차이를보였다. ORAC 법은추출물의과산화물에대한전반적인항산화능을측정할수있는실험방법으로돌외차추출물의 ORAC 값의범위는 588.36 ~ 1137.80 mm TE/g 로 40 ~ 80% 에탄올수용액용매로추출하였을때더높은값을보였다. 물추출물 (588.36 ± 89.16 mm TE/g) 보다 20 ~ 80% 에탄올수용액추출물 (870.82 ~ 1137.80 mm TE/g) 에서 ORAC 활성이증가하였다가 99.5% 에탄올추출물 (658.66 ± 168.83 mm TE/g) 에서활성이감소하는결과를보였다. 돌외차추출물의각항산화지수결과는 TEAC, FRAP 과 ORAC 값의경향이상이하게나타났다. Kim et al. (2014) 의연구에서산국대추출물의 TEAC, FRAP, ORAC 실험을 BHT 와비교하여측정하였다. BHT 의활성은산국대추출물보다 TEAC 와 FRAP 의활성은더높게나타났으나 ORAC 는낮게나타났다고보고하였다. 이러한결과는추출물에서작용하는물질에따라항산화활성에차이가나타날수있다고추측할수있다. 에탄올은소수성및친수성을모두가진효과적인용매로에탄올수용액의경우물과혼합정도에따라용매성질인극성과밀도가변화하게되고, 삼투압에도영향을준다. 따라서용매특성에따라용출되는주성분에도변화가나타나게되고항산화 지수에도유의인자로작용한것으로사료된다. α-glucosidase 저해활성 ɑ-glucosidase 는글루코시드를가수분해하여단당과아클리콘을생성하는반응에촉매효소를일컫는다. 이러한효소는인간이식품을섭취하였을때 amylase 와함께당분해효소로관여하여혈당을높이게된다. 그러나체내혈당대사를조절하기어려운당뇨환자의경우고혈당으로인한위험성이있어 acarbose 와같은혈당강하제의복용이필요하다. 하지만 acarbose 의경우장기간복용에따른일부부작용사례가보고되어비교적안전한천연물에서새로운소재개발연구가진행되고있다. 특히 Megalli et al. (2006) 연구에서당뇨병모델쥐에게돌외추출물 gepenoside 를제형화시켜투여한경우고혈당을낮추는데유의한효과가나타났다고보고하였다. 이에따라서추출용매에따른 ɑ-glucosidase 저해활성의차이를비교분석하여적정농도의에탄올용매를선정하기위해수행하였다. 돌외잎차추출물의 ɑ-glucosidase 저해활성은 Figure 1 과같다. 모든추출물에서양성대조군으로사용한 acarbose 보다는유의적으로낮은활성을가지고있었다. 그러나정제되지않은추출물임을감안한다면단일물질화되었을때더높은저해활성을가질수있다고사료된다. 각에탄올추출물에따른활성을비교하였을때 1000 µg/ml 농도에서총페놀및플라보노이드함량이높았던 80%, 99.5% 에탄올추출물이가장높은활성을가진것으로확인되었다. 250, 500 µg/ml 의농도에서는 99.5% 에탄올추출물의 ɑ-glucosidase 저해활성이가장우수한것으로나타났다. 항당뇨활성에대하여마전자와토후박추출물에대한 ɑ-glucosidase 저해활성이연구되었는데, 이러한추출물들의 ɑ-glucosidase 저해활성은총페놀함량이높을수록더높은활성을나타냈고페놀성물질에의하여효소가저해되는것으로보고하였다 (Lee et al., 2010; Xu et al., 2010). 이에따라본실험의총페놀함량이높았던 80%, 99.5% 에탄올추출물이
42 J Plant Biotechnol (2019) 46:37 44 Fig. 1 α-glucosidase inhibitory effects of extract from Dolwoe (Gynostemma pentaphyllum Makino) leaves tea with different ethanol concentrations Means with different letters (a-g) in the same column are significantly different at p<0.05 (SPSS, Tukey) 높은활성을보인것은추출물에포함되어있던페놀성물질에기인하여나타난결과로생각된다. 미생물저해활성 에탄올농도별돌외차추출물의그람양성균 2 종 (Bacillus cereus, Micrococcus luteus) 과그람음성균 2 종 (Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae) 에대한생육저해활성은 Figure 2 와같다. 그람양성균인 Bacillus cereus 의생장저해능은 0, 20% 에탄올추출물에서는저해활성이거의나타나지않았으나 40 ~ 99.5% 에탄올추출물에서는 12 시간까지생장이억제되다가시간이경과함에따라생장이다소나타나는것으로확인되었다 (Fig. 2A). Micrococcus luteus 에서도 0, 20% 에탄올추출물은생장저해활성이나타나지않았으나 40 ~ 99.5% 에탄올추출물은해당균주에대한생장이억제되는것으로나타났다. 그러나 40% 에탄올추출물에서 12 시간이후다소생장하는반면 60 ~ 99.5% 에탄올추출물은 24 시간까지생장저해활성이유지되었다 (Fig. 2B). 그람음성균의생장저해능은그람음성균에비해다소낮은활성을보였다. Pseudomonas aeruginosa 의저해활성은양성대조군으로사용한 tetracycline 과 streptomycin 에비해낮은활성이었으나추출물의총페놀함량과플라보노이드함량과비슷한경향으로단계적으로생장저해활성이나타났다 (Fig. 2C). Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae 또한 Pseudomonas aeruginosa 의저해활성과비슷한경향이확인되었다 (Fig. 2D). 식물의 2 차대사산물이나그유도체는미생물생장을제어할수있다고보고하였다 (Mitscher et al. 1980). 본실험에서는돌외차추출물의페놀및플라보노이드함량에의존한생장저해활성을보였고 2 차대사산물중에서도 페놀성화합물에의해생장억제가나타난것으로사료된다. An (2001) 과 Kim and Kim (2016) 의연구에서페놀성화합물이높을경우항균활성이더높게나타난다는연구와일치하는결과였다. Lee and Shin (1991) 은여러식물들의물과에탄올추출물의항균활성을비교하였을때대부분의에탄올추출물이더높은항균활성을가진것으로보고하였다. 이러한결과는에탄올용매가페놀성물질추출에유리하기때문에나타난결과로판단된다. 적요 본연구는페놀및플라보노이드의총함량과생리활성에대한다양한농도의에탄올추출효과를비교하기위해수행하였다. 추출물의총페놀함량은 35.54 ~ 71.52 mg GAE / g 범위였다. 용매의에탄올농도가증가함에따라페놀함량이높았고 80% 와 99.5% 의에탄올추출물에서최고함량이확인되었다. 추출물의총플라보노이드함량은페놀함량의경향과유사하였다. 항산화실험으로 DPPH, nitric oxide, superoxide, hydroxyl radical 소거능과 TEAC, FRAP, ORAC 를측정하였다. Radical 소거능은물이나 99.5% 에탄올추출물보다에탄올수용액추출물의활성이우수하였다. TEAC 와 FRAP 은에탄올농도의존적인경향으로높은값이나타났고 ORAC 는 40 ~ 80% 에탄올추출물이높은활성을보였다. 돌외잎차의항산화능을검토한결과측정방식에따라다른경향이확인되었다. 그리고대부분의실험에서물또는 99.5% 에탄올추출물의활성이상대적으로낮았다. α-glucosidase 저해활성은 80%, 99.5% 에탄올추출물에서가장높은활성이확인되었고, 미생물저해활성또한동일한결과
J Plant Biotechnol (2019) 46:37 44 43 Fig. 2 Bacterial growth inhibition activity of the extract from Dolwoe (Gynostemma pentaphyllum Makino) leaves tea with different ethanol concentrations (A) the growth curve of Bacillus cereus, (B) the growth curve of Micrococcus luteus, (C) the growth curve of Pseudomonas aeruginosa, (D) the growth curve of Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae 를보였다. 따라서차의항산화활성과생리활성을복합적으로고려할때 80% 에탄올로추출하는것이적절한것으로사료된다. 이러한결과를토대로돌외차의식품개발에있어기초자료로활용될수있다고생각된다. 사사 본연구는중소벤처기업부와한국산업기술진흥원이지원하는지역특화산업육성사업 (R0003895) 으로수행된연구결과입니다. References An BJ (2001) Effect of inhibition on glucosyltransferase and antimicrobial activity of polyphenol fraction of gallnut and red grape husk. Korean J Food Preserv 8:217-223 Althaus JS, Oien TT, Fici GJ, Scherch HM, Sethy VH and VonVoigtlander PF (1994) Structure activity relationships of peroxynitrite scavengers an approach to nitric oxide neurotoxicity. Res Commun Chem Patho Pharmacol 83:243-254 Beckman KB, Ames BN (1998) The free radical theory of aging matures. Physiol Rev 78(2):547-581 Benzie IFF, Strain JJ (1996) The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of antioxidant power : the FRAP assay. Anal Bio Chem 39:70-76 Blois MS (1958) Antioxidant determinations by use of a stable free radical. Nature 181:1199-1200 Halliwell B, Aruoma OI (1991) DNA damage by oxygen-derived species. Its mechanism and measurement in mammalian systems. FEBS Lett 281:9-19 Huang WY, Cai YZ and Zhang Y (2009) Natural phenolic compounds from medicinal herbs and dietary plants: potential use for cancer prevention. Nutr cancer 62(1):1-20 Hwang CR, Oh SH, Kim HY, Lee SH, Hwang IG, Shin YS, Lee JS and Jeong HS (2011) Chemical composition and antioxidant activity of Deoduk (Codonopsis lanceolata) and Doragi (Platycodon grandiflorum) according to temperature. J Korean Soc Food Sci Nutr 40(6):798-803 Kim JS, Kim KC (2016) Antioxidant and α-glucosidase inhibitory activities of Tradescantia pallida(rose) Hunt leaf extract and
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