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- Appl. Chem. Eng., Vol. 22, No. 2, April 2011, 178-184 김정은 김아름 김민지 박수남 서울과학기술대학교자연생명과학대학정밀화학과 (2010 년 12 월 7 일접수, 2011 년 1 월 13 일채택 ) Antibacterial, Antioxidative and Antiaging Effects of Allium cepa Peel Extracts Jung Eun Kim, A Reum Kim, Min Ji Kim, and Soo Nam Park Department of Fine Chemistry, College of Nature and Life Science, Seoul National University of Science and Technology, Seoul 139-743, Korea (Received December 7, 2010; Accepted January 13, 2011) 본연구에서는양파껍질추출물의항균, 항산화활성과 tyrosinase 및 elastase 저해활성을측정하였다. 피부상재균에대한양파껍질추출물의항균활성측정결과, 황색포도상구균 (S. aureus) 에대한에틸아세테이트분획의 MIC 는 0.06% 로매우큰항균활성을나타내었다. 에틸아세테이트분획중 aglycone 분획은우수한 free raical [1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)] 소거활성 (FSC 50 = 5.05 µg/ml) 을나타내었다. Luminol- 의존성화학발광법을이용한 Fe 3+ -EDTA/H 2O 2 계에서에틸아세테이트분획과 aglycone 분획의총항산화능 (OSC 50) 은각각 0.05 및 0.03 µg/ml 이었다. Rose-bengal 로증감된사람적혈구의용혈실험에서 aglycone 분획은 25 µg/ml 의농도에서매우큰세포보호활성 (τ 50 = 480.3 ± 0.2 min) 을나타냈다. 양파껍질추출물중에틸아세테이트분획과 aglycone 분획은 tyrosinase 저해활성 (IC 50) 이각각 9.16, 8.68 µg/ml 이었고, aglycone 분획의 elastase 의저해활성은 14.12 µg/ml 이었다. 양파껍질추출물중 ethyl acetate 분획 0.1% 함유하는크림의경표피수분손실량은추출물함유크림이 6.8 g/m 2 h 로대조군 (8.3 g/m 2 h) 에비해경표피수분손실량감소효과를나타내었다. 이상의결과들은양파껍질추출물이 1 O 2 혹은다른 ROS 를소광시키거나소거함으로써그리고 ROS 에대항하여세포막을보호함으로써생체계, 특히, 태양자외선에노출된피부에서항산화제로서그리고항노화제로서작용할수있음을가리킨다. 따라서양파껍질추출물은미백이나항주름관련새로운기능성화장품에의응용이가능함을나타낸다. In this study, the antibacterial, antioxidative and inhibitory effects of Allium cepa peel extracts on tyrosinase and elastase were investigated. MIC values of the ethyl acetate fraction of Allium cepa peel on especially, S. aureus among the skin resident flora (Staphylococcus aureus, S. aureus; Propionibacterium acnes, P. acnes; Pityrosporum ovale, P. ovale; Escherichia coli, E. coli) were 0.06%. The aglycone fraction showed more excellent free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, DPPH) scavenging activity (FSC 50 = 5.05 µg/ml). Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities (OSC 50) of the ethyl acetate fraction and aglycone fraction in the luminol-dependent Fe 3+ -EDTA/H 2O 2 system were 0.05 and 0.03 µg/ml, respectively. The cellular protective effect of the aglycone fraction on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes exhibited more prominent (τ 50, 480 min at 25 µg/ml). The inhibitory effects (IC 50) of the ethyl acetate fraction and aglycone fraction on tyrosinase were 9.16 and 8.68 µg/ml, the inhibitory effect (IC 50) of the aglycone fraction on elastase was 14.12 µg/ml The transepidermal water loss of the cream containing 0.1% ethyl acetate fraction was decreased from 8.3 g/m 2 h in control to 6.8 g/m 2 h in the subjects applied with cream containing the ethyl acetate fraction. These results indicate that extract/fractions of Allium cepa peel can function as antioxidant in biological systems, particularly skin exposed to UV radiation by scavenging 1 O 2 and other ROS, and protect cellular membranes against ROS, and possibly as antiaging agents. Allium cepa peel extract could be used as a new cosmeceutical for whitening and anti-wrinkle products. Keywords: Allium cepa peel, antibacterial activity, antioxidant, antiaging, cosmetics 1. 서론 1) 피부는다양한환경적요인 ( 오염물질, 세균, 스트레스등 ) 뿐만아니라특히태양자외선에노출됨으로써반응성이매우큰활성산소종 교신저자 (e-mail: snpark@snut.ac.kr) (reactive oxygen species, ROS) 으로유도된광산화적손상을지속적으로받게된다. 활성산소종이란 1 O 2 (singlet oxygen) 및 OH (hydroxy ㆍ- radical) 를비롯하여 O 2 (superoxide anion radical), H 2O 2 (hydrogen peroxide) 가있고, 그외에 ROO, RO, ROOH 및 HOCl 등을포함한다 [1,2]. 이들은고에너지복사선, 광증감반응및몇가지효소반응을포함하는다양한과정을거쳐서세포및조직중에서생성될수도 178

179 있다 [3]. 이들활성산소종중에서 1 O 2 및 OH은피부광손상에있어서중요한역할을하는것으로알려져있다. 이들은피부항산화제파괴, 지질과산화반응의개시, 단백질및 DNA 산화, 결합조직성분 ( 콜라젠, 히아루론산등 ) 의사슬절단및비정상적인교차결합에의한주름생성, 멜라닌생성과정등에참여하여피부노화를가속시킨다 [4-7]. 사람피부세포에있어서지질, 단백질및 DNA 등생체구성성분의산화손상뿐만아니라 UVA (320 380 nm) 의존성세포사멸이나유전자활성화에도활성산소종이포함되는것으로기술되고있다. 콜라젠은피부진피층의매트릭스를이루는성분중가장많은성분이기때문에콜라젠의생합성과분해의조절은피부노화과정중에서핵심이되고있다. 사람피부섬유아세포에서 1 O 2 을비롯한 ROS가 matrix metalloproteinases (MMPs) 의발현을유발시키며, UVA로유도된 MMP-1 (collagenase) 의합성을 1 O 2 이매개할수있다는보고도있다 [8-12]. 이는광노화를방어하고자외선으로부터보호제를개발하는데있어서 1 O 2 을비롯한 ROS의중요한역할을시사하는것이다. 1 O 2 을비롯한 ROS가광노화와연관되기때문에항산화제에의한자외선노출후 ROS의감소 [13-16] 는광노화를예방하고최소화시키기위한촉망되는전략임은분명하다 [17-20]. 활성산소를조절할수있는항산화제에는일반적으로흔히사용되는페놀계합성항산화제인 butylated hydroxyanisole (BHA) 와 butylated hydroxytoluene (BHT) 등이탁월한항산화력과경제성등으로널리이용되어왔으나안정성논란으로인하여대부분사용규제를받고있는실정이다. 화장품에서는주로 (+)-α-tocopherol 및 L-ascorbic acid가주목받고있으며, 제품중에서의안정성때문에이들대신 (+)- α-tocopherol 유도체나 L-ascorbic acid 유도체가많이사용되고있다. 그러나이들또한항산화효과측면에서미흡한점이많아새로운천연항산화제를개발하여응용하고자하는연구가많이진행되고있다. 이와함께자연지향적이고환경친화적인소비추세에따라다양한천연소재를이용한미백, 항노화 ( 주름 ), 자외선차단기능을가진기능성화장품의개발도활발히이루어지고있다 [21,22]. 양파 (Allium cepa) 는용도가넓은식물중하나로, 최근에는함유되어있는항산화제로인해새롭게주목을받고있다. 음식에서양파의규칙적인소비는신경퇴행성장애, 암, 백내장형성, 궤양의위험을줄이고골다공증과관련된증상의감소, 혈관및심장질환의예방등과관련이있다 [21-24]. 양파는 phenolic acids, flavonoids, cepaenes, thiosulfinates 그리고 anthocyanins 같은다양한생물학적활성분자의주된식물중의하나로 [25] 보통폐기물로인식되어지는건조된양파껍질에서는효과적인항산화제로작용하는플라보노이드배당체등이있는것으로알려져있다 [26-29]. 이들플라보노이드배당체들은간보호효과, 면역향상가능성그리고항감염, 항스트레스, 항암등과같은약리작용의성질을가지고있다고보고되어있다 [30,31]. 양파껍ㆍ질에는 superoxide anion radical (O - 2 ) 의소거활성등의항산화효과와항돌연변이성효과가있다고보고되어있다 [29]. 상기에서와같이양파껍질추출물을이용한일부의항산화작용에관해서는연구가이루어졌으나, 피부노화과정에깊이관여하는활성산소인 1 O 2 으로유도된세포손상에대한항산화적보호작용이나ㆍ생체에서와같이다양한활성산소종 (H 2O 2, O - 2, OH 등 ) 이생성되는계 (Fe 3+ -EDTA/H 2O 2 계 ) 에서의각종 ROS에대한총항산화능에관한연구는아직되어있지않다. 따라서본연구에서는화장품원료로서사용가능한양파껍질추출물 ( 혹은분획 ) 을제조하고이들추출물 ( 혹은분획 ) 의 1 O 2 으로유도된세포손상에대한보호활성, Fe 3+ -EDTA/ H 2O 2 계에서의총항산화능, 이들추출물 ( 혹은분획 ) 의성분분석, 그 Figure 1. Scheme for preparation of extract/fractions obtained from Allium cepa peel. 리고피부주름생성에서중요한역할을하는 elastase 저해활성및멜라닌생성에핵심효소인 tyrosinase 저해활성을알아보고자하였다. 또한몇가지다른항산화제들을대조군으로하여양파껍질의항산화능을비교평가하고활성산소에의한피부노화를방지하는데효과가있는기능성화장품소재로서가능성이있는지를검토하였다. 2.1. 기기및시약 2. 재료및실험 UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia) 의 Cary 50, 적혈구광용혈에사용한 Spectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA) 제품, 화학발광기는 Berthold (Germany) 의 6-channel LB9505 LT를, ph meter는 Istek (Korea) 제품을사용하였다. (+)-α-tocopherol (1000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), luminol, heparin, 증감제로사용된 rose-bengal, free radical 소거활성에사용한 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) radical은 Sigma Chemical Co. (USA) 에서구입하여사용하였다. 기타 FeCl 3 6H 2O는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을, H 2O 2 는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea) 제품을사용하였다. 완충용액제조에사용된 Na 2HPO 4 12H 2O, NaH 2PO 4 2H 2O, NaCl, 그리고 trizma base, HCl, 에탄올 (EtOH), 메탄올 (MeOH), ethyl acetate (EtOAc) 등각종용매는시판특급시약을사용하였다. 기질로사용된 N-succinyl-(Ala) 3-p-nitroanilide, 효소로사용된 elastase (0.35 mg protein/ml, 7.8 units/mg protein) 는 Sigma Chemical Co. (USA) 에서구입하여사용하였다. 또한인체실험을위하여 CK electronic (Germany) 제품인 Tewameter (TM210) 를사용하였다. 실험에사용한양파껍질 (A. cepa peel) 은가락동농수산물시장에서구입하여사용하였다. 2.2. 양파껍질추출물의제조 실험에사용된양파껍질은 Figure 1과같은방법으로추출하였다. 양파껍질중량당 50% 에탄올을 1 : 30의비율로일주일동안침적시킨후여과하였다. 이여액의일부는감압 농축하여 50% 에탄올추출물로사용하였고, 일부는 n-헥산으로비극성성분을제거한후에틸아세테이트로추출하여얻은추출액을감압 농축하여파우더를얻어실험에사용하였다. 또한에틸아세테이트분획의일부는산가수분해반응으로당을제거시켜얻은아글리콘 (aglycone) 분획을만들어 Appl. Chem. Eng., Vol. 22, No. 2, 2011

180 김정은 김아름 김민지 박수남 사용하였다. 일반적으로에틸아세테이트분획은주로플라보노이드배당체형태로극성이커서피부흡수가용이하지못한반면, 산가수분해로얻은 aglycone 분획은피부또는세포막에대한투과성이양호하여이를제품에응용할목적으로실험에사용하였다. 실험방법은에틸아세테이트분획일정량에 10 ml의 5% H 2SO 4-50% 아세톤용액을넣고, 4 h 동안중탕가열하면서환류 냉각시켰다. 환류시킨용액을 5% KOH 용액으로중화시킨후, 에틸아세테이트분획을얻어이를감압 농축하여실험에사용하였다. 2.3. 양파껍질추출물의항균활성측정 2.3.1. 사용균주본실험에사용된균주는여드름의원인균인 Propionibacterium acnes (P. acnes) ATCC6919와비듬균인 Pityrosporum ovale (P. ovale) ATCC12078, 호기성그람양성균주인 Staphylococcus aureus (S. aureus) ATCC6538, Escherichia coli (E. coli) ATCC23736는한국미생물보존센터에서분양받아사용하였다. 2.3.2. 배지및배양조건 P. acnes의배양배지는 Reinforced clostridial (RC) 배지 (Merck, Germany) 를사용하였으며 P. acnes는 4 에서보관하면서실험 72 h 전에활성화시켰으며, 균을배양배지에접종한후 anaerobic jar에서 Gaspack system (Merck AnaerocultR Gaspack system, Germany) 을이용하여밀봉하여 37 에서 72 h 동안혐기성배양하였다. 호기성균주인 S. aureus와 E. coli는 Mueller-Hinton 배지 (Merck, Germany) 를사용하였으며균을접종한후 37 incubator에서 24 h 배양하면서사용하였다. 또한 P. ovale는 Pityrosporum 배지 (Malt extract agar : 6%, ox-bile : 2%, tween 40 : 1%, glycerol mono-oleate : 0.25%) 를사용하였으며균을접종한뒤 30 에서 24 h 동안배양하여사용하였다. 2.3.3. 최소억제농도 (Minimum Inhibitory Concentration: MIC) 최소억제농도 (MIC) 는한천배지확산법을이용하여다음과같이측정하였다. 즉, 각각의분획물들을 2 ml씩함유한배지 20 ml를 petri dish에주입하였고, 시험균을평판배지위에 0.1 ml 접종하였다. P. acnes는 37 에서 72 h 후에, S. aureus와 E. coli는 37 에서 24 h 후에, P. ovale는 30 에서 48 h 후에육안으로관찰하였을때, 각각의균들이증식되지않는농도를 MIC로결정하였다. 2.4. 양파껍질추출물의항산화효과측정 2.4.1. DPPH법을이용한 Free Radical 소거활성 DPPH법은메탄올에용해시킨 0.2 mm DPPH 용액 1 ml에에탄올과추출물을각각 1 ml씩첨가한다음실온에서 10 min 동안방치후 spectrophotometer로 517 nm에서흡광도를측정하였다. 소거활성은 DPPH의농도가 50% 감소되는데필요한시료의농도 (free radical scavenging activity, FSC 50, µg/ml) 로서표기하였다. 2.4.2. Luminol 발광법을이용한 Fe 3+ -EDTA/H 2O 2 계에있어서활성산소소거활성 ( 총항산화능 ) 총항산화능은 luminol이 ROS에의해산화되어나타나는빛을화학발광기로검출하여측정하였다. 먼저화학발광측정용튜브에증류수 1.78 ml를넣고추출물을농도별로넣는다. 여기에 2.5 mm EDTA 40 µl 및 5 mm FeCl 3 6H 2O 10 µl를가한후 35 mm luminol 80 µl를넣고섞어주었다. 이어서화학발광기의 cell holder에튜브를넣고 5 min 동안항온시킨후 150 mm H 2O 2 40 µl를넣고화학발광을 25 min 동안측정하였다. 화학발광기의 6개의채널은실험전에보정하여채널간의차이가거의없도록하였다. 활성산소소거활성의크기는화학발광의세기가 50% 감소되는데필요한시료의농도 (reactive oxygen species scavenging activity, OSC 50, µg/ml) 로서표기하였다. 2.5. Photohemolysis 법을이용한세포보호효과측정사람적혈구를대상으로활성산소에의한세포막파괴실험은활성산소에의한세포손상모델로적합한점이많다. 이실험법을이용하여천연물을대상으로활성산소에의한세포손상 ( 파괴 ) 에대한보호효과를측정할수있다. 2.5.1. 적혈구현탁액제조적혈구는건강한성인남녀로부터얻었다. 채혈즉시 heparin이첨가된시험관에넣은후, 3000 rpm으로 5 min 동안원심분리하여적혈구와혈장을분리하고, 분리한적혈구는 0.9% saline phosphate buffer로세척하여원심분리하고흰색의백혈구층은제거하였다. 모든실험은채혈후 12 h 이내에행하였다. 2.5.2. Photohemolysis 법을이용한세포보호효과적혈구현탁액 3.5 ml에추출물을농도별로 50 µl씩첨가하였다. 암소에서 30 min 동안 pre-incubation 시킨후, 광증감제 rose-bengal (10.0 µm) 0.5 ml를가하고 15 min 동안광조사하였다. 광용혈에필요한광조사는내부를검게칠한 50 cm 20 cm 25 cm 크기의상자안에 20 W 형광등을장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에적혈구현탁액이담긴파이렉스시험관을형광등과평행이되도록배열한후 15 min 동안광조사하였다. 광조사가끝난후암반응 (post-incubation) 시간에따른적혈구의파괴정도를 15 min 간격으로 700 nm에서투광도 (transmittance, %) 로부터구하였다. 이파장에서적혈구현탁액의투광도의증가는적혈구의용혈정도에비례하기때문에양파껍질추출물의광용혈에미치는효과를투광도로부터구할수있다. 결과는적혈구의 50% 가용혈되는시간인 τ 50 로나타내었다. 대조군 (control) 은 τ 50 이 30.27 min으로오차범위 ± 0.37 min 이내로모든경우의실험에서재현성이양호하게나타났다. 2.6. Tyrosinase 저해활성측정멜라닌은 L-tyrosine을기질로하여 tyrosinase가핵심효소로작용하여생성되기때문에 tyrosinase의활성을저해하는능력을측정하였다. 실험방법은 potassium phosphate buffer (ph 6.8) 0.1 M에 L-tyrosine (0.3 mg/ml) 을용해시킨용액 1.9 ml에추출물 0.1 ml과 tyrosinase (1250 units/ml) 0.1 ml를가한후 37 에서 10 min 동안항온배양시킨다. 10 min 후반응혼합물을얼음수조에넣어반응을종결시키고, 475 nm에서흡광도를측정한다. Tyrosinase 저해활성은 tyrosinase의활성을 50% 감소시키는데필요한시료의농도 (inhibition concentration, IC 50, µg/ml) 로표기하였다. 2.7. Elastase 저해활성측정피부노화, 특히주름생성에있어주된역할을하는 matrix metalloproteinases (MMPs) 중하니인 elastase의활성저해능력을다음과같이측정하였다. 0.13 M (ph 8.0) Tris-Cl buffer에 N-succinyl- (Ala) 3-p-nitroanilide 1.0 mm을용해시킨용액 1.9 ml에추출물 0.1 공업화학, 제 22 권제 2 호, 2011

181 Table 1. Formulation of Cream Containing EtOAc Fraction of Allium cepa Peel Extract Commercial name Content (%) Distilled water Up to 100 Glycerine 7.0 1,3-Butylene glycol 5.0 Xanthan gum (Keltrol-F) 0.1 TEA 0.2 Methyl paraben 0.1 Ceto-stearyl alcohol (Lanette-o) 2.0 Stearic acid 1.0 Glyceryl stearate / PEG-100 stearate (Alracel #165) 1.5 Bees wax 1.0 Glyceryl monostearate (GMS-205) 1.0 Squalane (Pripure R 3759) 8.0 Caprylic capric triglyceride 5.0 Paraffin wax 2.5 Dimethicone (Si-200 / 100 CS) 0.3 Allium cepa peel extract (EtOAc fraction) 0.25 ml를첨가하여 25 에서 10 min 동안 pre-incubation 시킨다. 10 min 후 elastase 용액을 100 µl 첨가하고, 다시 25 에서 10 min 동안 post-incubation 한뒤 410 nm에서흡광도를측정하였다. Elastase 저해활성은 elastase의활성을 50% 감소되는데필요한시료의농도 (inhibition concentration, IC 50, µg/ml) 로서표기하였다. 2.8. 인체시험 2.8.1. 양파껍질추출물함유크림의제조 인체실험에사용된양파껍질추출물은높은항산화활성을나타내는에틸아세테이트분획을사용하였다. 실험에사용한크림은 Table 1의처방을사용하여제조하였다. 양파껍질추출물은 EtOH : 1,3-butylene glycol (1,3-BG) = 1 : 4 비율의용액에 10% 가되도록 stock solution 용액을만들고처방에는이 stock solution이 0.1% 가되도록가하여최종양파껍질추출물 ( 건조중량기준 ) 이 0.25% 함유한크림을제조하여실험군 (experimental) 으로사용하였다. 대조군 (placebo) 은양파껍질추출물없이크림에 EtOH : 1,3-BG = 1 : 4 비율인용액을 0.1% 함유하는처방으로하였다. 2.8.2. 피부경표피수분손실량측정 양파껍질추출물중에틸아세테이트분획을포함하여제조된크림의효능시험을위하여 20대의피시험자 14명을선정하여평가를실시하였다. 평가는 Tewameter (TM210) 를이용하여경표피수분손실량 (transepidermal waterloss, TEWL) 을측정하였다. 시험시작 30 min 전부터항온항습조건 (20 22, 40 60%) 의실내에서대기하고피시험자들에게주의사항과사용방법을설명하여숙지시켰다. 양파껍질추출물함유크림과대조군을도포하기전의피부수분보유량과경표피수분손실량을측정하고팔안쪽에도포한후, 60 min 간격으로총 180 min 동안측정하였다. Table 2. Minimum Inhibitory Concentrations (MIC. w/v%) of 50% Ethanol Extract and Ethyl Acetate Fraction from A. cepa Peel Against Various Bacteria Strains AC extract (50% EtOH) AC extract (EtOAc fraction) Methyl paraben P. ovale 0.50 0.25 0.13 P. acnes 0.50 0.25 0.25 S. aureus 0.03 0.06 0.25 E. coli 0.50 0.25 0.13 2.9. 통계처리 모든실험은 3회반복하였고통계분석은 5% 유의수준에서 Student s t-test를행하였다. 3. 결과및고찰 3.1. 양파껍질 (A. cepa Peel) 추출물의수득률 건조한양파껍질 100 g을 50% 에탄올 3 L에일주일동안침적시킨후여과 갑압하여파우더를얻었다. 이때수득률은 8.26% 이었으며, 에틸아세테이트분획은 50% 에탄올로추출한것을 1차 n-헥산으로비극성물질을제거한뒤에틸아세테이트분획을추출하여감압 농축한결과수득률이 2.44% 이었다. 에틸아세테이트분획을산가수분해시켜당을제거하고얻은 aglycone 분획의수득률은 1.26% 이었다. 에틸아세테이트분획은주로플라보노이드배당체가많이함유되어있다. 이들양파껍질추출물은이들을화장품소재로이용하기에적합한수득률을보여주었다. 본연구에서는 50% 에탄올추출물, 아글리콘분획, aglycone 분획을실험에사용하였다. 3.2. 양파껍질추출물의항균활성측정 피부상재균인 P. ovale, P. acnes, S. aureus 및 E. coli에대한양파껍질추출물의항균활성은 Table 2와같다. 50% 에탄올추출물의항균활성보다도에틸아세테이트분획 (MIC : 0.25%) 에서보다높은활성을나타내었다. 이는화장품에서방부제로사용하고있는 methyl paraben (MP, MIC : 0.25%) 과비교하였을때비슷한항균활성을나타냄을알수있다. 황색포도상구균인 S. aureus에대한양파껍질추출물의항균활성은매우큰것으로나타났다. 50% 에탄올추출물의 MIC는 0.03%, 에틸아세테이트분획은 0.06% 로나타났다. 이는 MP (MIC : 0.25%) 와비교하였을때, 황색포도상구균에대해서항균활성이매우큼을보여주고있으며, 양파껍질분획물이황색포도상구균에유효한소재및화장품개발에응용가능성이높음을시사한다. 현재사용되고있는방부제나항균제가평균적으로 0.2 0.4% 정도의농도범위내에서사용하고있는것을감안하면양파껍질분획물은비교적낮은농도에서도천연방부제, 항균제로서역할이충분히기대된다. 3.3. 양파껍질추출물의항산화활성 3.3.1. DPPH 법을이용한 Free Radical 소거활성 양파껍질추출물및분획에대한 free radical 소거활성측정결과는 Figure 2에나타내었다. Free radical 소거활성 (FSC 50) 은, 양파껍질의 50% 에탄올추출물은 16.09 µg/ml, 에틸아세테이트분획은 7.57 µg/ml, aglycone 분획은 5.05 µg/ml로나타났다. 이는비교물질로사용한 (+)-α-tocopherol보다도더큰라디칼소거활성이있음을보여준다. Appl. Chem. Eng., Vol. 22, No. 2, 2011

182 김정은 김아름 김민지 박수남 Figure 2. Free radical scavenging activities of extract/fractions of Allium cepa peel and (+)-α-tocopherol. Table 3. The Protective Effect of Allium cepa Peel Extract/Fractions on the Rose-bengal Sensitized Photohemolysis of Human Erythrocytes τ 50 (Half time of hemolysis a) ) Concentration (µg/ml) 1 5 10 25 Extract/fractions a) 50% Ethanol extract Ethyl acetate fraction Aglycone fraction 53.9 ± 0.1 72.5 ± 0.7 56.0 ± 2.2 115.7 ± 0.9 100.5 ± 9.5 102.1 ± 2.8 (+)-α-tocopherol - - Control, τ50 = 30.27 ± 0.37 min 189.2 ± 6.3 158.1 ± 2.5 220.7 ± 7.5 38.00 ± 1.8 229.1 ± 1.3 328.0 ± 21.1 480.3 ± 0.2 Figure 3. Reactive oxygen species scavenging activities of Allium cepa peel extracts and L-ascorbic acid in Fe 3+ -EDTA/H 2O 2 system by luminol-dependent chemiluminescence assay. Figure 4. The protective effect of extract/fractions from Allium cepa peel and (+)-α-tocopherol at 10 µg/ml on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes, Relative protective effect = sample τ 50/control τ 50. 3.3.2. Luminol 발광법을이용한 Fe 3+ -EDTA/H 2O 2 계에있어서활성산소소거활성 ( 총항산화능 ) Luminol은 ROS에의해산화되어들뜬상태의아미노프탈산이된후발광 (420 450 nm) 을하는것으로알려져있다. Luminol 발광법을이용한 Fe 3+ -EDTA/H 2O 2 계에서생성된 ROS 소거활성에서양파껍질추출물이화학발광을감소시킴을 Figure 3에서알수있다. 활성산소소거활성 ( 총항산화능, OSC 50) 은양파껍질 50% 에탄올추출물이 0.09 µg/ml, 에틸아세테이트분획이 0.05 µg/ml, aglycone 분획이 0.03 µg/ml로나타났다. 따라서총항산화능은 aglycone 분획, 에틸아세테이트분획및 50% 추출물모두비교물질로사용한 L-ascorbic acid (1.50 µg/ml) 보다도매우큼을보여주었다. 3.4. 1 O 2 으로유도된사람적혈구의파괴에대한세포보호활성활성산소에대한추출물의세포보호활성은 rose-bengal 존재하에서사람적혈구현탁액에 15 min 동안광조사후 1 O 2 등의활성산소종으로유도된적혈구의용혈정도를암반응시간에따라측정함으로구하였다. 대조군의경우적혈구세포가 50% 파괴되는데걸리는시간 (τ 50) 은약 30.27 ± 0.37 min으로나타났다. 양파껍질추출물의용혈억제효과를측정한결과를 Table 3 및 Figure 4에나타내었다. 적혈구세포가 50% 파괴되는데걸리는시간 (τ 50) 은세포보호활성이클수록 크게나타난다. 양파껍질의 50% 에탄올추출물과에틸아세테이트분획은농도의존적으로세포보호활성이다른추출물및분획에비해상당히큰것으로나타났다. 이그림에서와같이양파껍질추출물및분획에서세포보호활성은 aglycone 분획 > 에틸아세테이트분획 > 50% 에탄올추출물순으로나타난다. 3.5. Tyrosinase 저해활성멜라닌생성에있어서핵심효소는 tyrosinase이다. 이효소는 tyrosine 으로부터시작되는멜라닌생합성과정중, tyrosine에서 DOPA, DOPA 에서 DOPAquinone, 그리고 DHI로부터 eumelanin으로의전환을촉매하는데관여한다. 양파껍질추출물중 tyrosinase 저해활성 (IC 50) 은에틸아세테이트분획중당을제거한 aglycone 분획이 8.68 µg/ml, 50% 에탄올추출물이 8.79 µg/ml, 에틸아세테이트분획이 9.16 µg/ml의순서로나타났으며, 비교물질로사용한기능성화장품의미백제로잘알려진 arbutin의저해활성 226.88 µg/ml에비해서도월등히큰 tyrosinase 저해활성을보였다. 따라서당이제거된추출물과에틸아세테이트분획등을화장품에응용할경우미백효과가있을것으로사료된다 (Figure 5). 공업화학, 제 22 권제 2 호, 2011

183 Figure 5. The inhibitory effect of extract/fractions from Allium cepa peel and reference on tyrosinase. Figure 7. Representation of TEWL by Tewameter (TM 300) measurement. The zero is before use and at intervals of 60 min was measured after use of cream containing the ethyl acetate fraction of Allium cepa peel extract. (0 = before application) 알수있었다. 4. 결론 Figure 6. The inhibitory effect of extract/fractions from of Allium cepa peel and reference on elastase. 3.6. Elastase 저해활성 자외선및활성산소등에의해유발되는피부진피층에존재하는 matrix-metalloproteinases (MMPs) 는피부노화, 특히주름생성과밀접한관계가있다. MMPs를이루는주요성분으로 collagenase, gelatinase 및 elastase 등이있으며, 피부의탄력감소및주름생성에있어서 elastase의활성감소는매우중요하다. 양파껍질추출물은 elastase 저해활성 (IC 50) 이에틸아세테이트분획에서 46.41 µg/ml, aglycone 분획은 14.12 µg/ml을나타냈으며, 비교물질로사용한 oleanolic acid의저해활성 13.70 µg/ml과비교하여보았을때, ethyl acetate 분획에서당을제거한 aglycone 분획이 oleanolic acid와비슷한 elastase 저해활성을보였다 (Figure 6). 3.7. 인체시험 3.7.1. Tewameter를이용한경표피수분손실량측정 경표피수분손실량 (TEWL) 은추출물함유크림도포후, 60 min 간격으로 180 min 동안측정하였다 (Figure 7). 그결과 180 min이지난후무도포한부분의수분손실량은 8.3 g/m 2 h, placebo 크림은 7.3 g/m 2 h, 양파껍질추출물을함유한크림은 6.8 g/m 2 h으로, 추출물함유크림은무도포대조군보다는 18.1%, placebo 크림보다는 6.8% 경표피수분손실량의감소를나타내었다. 따라서양파껍질추출물을함유한크림은경표피수분손실량을유의적으로감소시키는보습효과가있음을 1) 양파껍질의 50% 에탄올추출물의수득률은 8.26%, 에틸아세테이트분획은 2.44%, aglycone 분획은 1.26% 이었다. 2) 피부상재균인 P. ovale, P. acnes, S. aureus 및 E. coli에대한양파껍질추출물의항균활성은에틸아세테이트분획 (MIC : 0.25%) 에서보다높은활성을나타내었다. 황색포도상구균인 S. aureus에대한양파껍질추출물의항균활성은 50% 에탄올추출물 (MIC = 0.03%), 에틸아세테이트분획 (0.06%) 에서큰항균활성을나타내었다. 3) Free radical 소거활성 (FSC 50) 은양파껍질의 50% 에탄올추출물이 16.09 µg/ml, 에틸아세테이트분획 7.57 µg/ml, aglycone 분획은 5.05 µg/ml로나타났다. 에틸아세테이트분획및 aglycone 분획은비교물질로사용한 (+)-α-tocopherol보다도더큰소거활성을나타내었다. 4) 양파껍질추출물의총항산화능 (OSC 50) 은양파껍질에탄올추출물이 0.09 µg/ml, 에틸아세테이트분획이 0.05 µg/ml, aglycone은 0.03 µg/ml로비교물질로사용한 L-ascorbic acid (1.50 µg/ml) 보다도추출물모두매우큰항산화능을보여주었다. 5) 1 O 2 으로유도된적혈구의광용혈현상에있어서, 양파껍질추출물은 µg/ml의농도범위 (1 25 µg/ml) 에서농도- 의존적으로 1 O 2 으로유도된용혈에서세포보호활성을나타내었다. 특히양파껍질 aglycone 분획은 25 µg/ml 농도에서 480.3 min으로매우큰세포보호활성을나타내었다. 세포보호활성은 aglycone 분획 > 에틸아세테이트분획 > 50% ethanol 추출물 > (+)-α-tocopherol 순으로나타났다. 6) 양파껍질추출물중에틸아세테이트분획과 aglycone 분획은 tyrosinase 저해활성 (IC 50) 이각각 9.16 µg/ml, 8.68 µg/ml로미백제로알려진 arbutin (IC 50: 226.88 µg/ml) 에비하여매우큰활성을나타내었다. 7) 양파껍질추출물중 aglycone 분획은 elastase 저해활성 (IC 50) 이 14.12 µg/ml로큰활성을나타내었다. 8) 양파껍질추출물중에틸아세테이트분획을함유하고있는크림 (6.8 g/m 2 h) 은무도포대조군크림 (8.3 g/m 2 h) 이나 placebo 크림 (7.3 g/m 2 h) 보다경표피수분손실량이감소하였다. 즉, 추출물함유크림은무도포대조군보다는 18.1%, placebo 크림보다는 6.8% 경표피수분손실량의감소를나타내었다. 따라서양파껍질추출물을함 Appl. Chem. Eng., Vol. 22, No. 2, 2011

184 김정은 김아름 김민지 박수남 유한크림은경표피수분손실량을유의적으로감소시키는보습효과가있음을알수있었다. 이상의결과들로부터양파껍질의에틸아세테이트분획및 aglycone 분획들은총항산화능과세포보호활성이매우큰것으로나타났으며, tyrosinase와 elastase 저해활성도크다는것을확인하였다. 따라서이들추출물은항산화작용등기능성소재로서화장품에응용가능성이있는만큼보다광범위한연구가필요한것으로사료된다. 참고문헌 1. E. H. Witt, P. Motchnik, and L. Packer, Evidence for UV light as an oxidative stressor in skin, eds. J. Fuchs and L. Packer, Oxidative Stress in Dermatology. 29, New York, Dekker (1993). 2. I. Emerit, Free radicals and aging of the skin, eds. L. Emerit and B. Chance, Free radicals and aging, 328, Basel, Birkhauser (1992). 3. C. S. Foote, Photosensitized oxidation and singlet oxygen; consequences in biological systems, ed. W. A. Pryor, 2, 85, Acdemic press, New York (1976). 4. S. N. Park, Ph. D. Dissertation, Seoul National Univ., Seoul, Korea (1989). 5. S. N. Park, J. Soc. Cosmet. Scientists Korea, 23, 75 (1997). 6. S. N. Park, Korean J. Food Sci. Technol., 35, 510 (2003). 7. S. N. Park, J. Korean Ind. Eng. Chem., 14, 657 (2003). 8. K. Scharffetter-Kochanek, Photoaging of the connective tissue of skin: its prevention and therapy, antioxidants in disease mechanism and therapy, ed. H. Sies, 38, 639 (1997). 9. R. M. Tyrrell and M. Pidoux, Photochem. Photobiol., 49, 407 (1989). 10. G. F. Vile and R. M. Tyrrell, Free Radical Biology & Medicine, 18, 721 (1995). 11. K. Scharffetter-Kochanek, M. Wlaschek, K. Briviba, and H. Sies, FEBS Lett., 331, 304 (1993). 12. M. Wlaschek, K. Briviba, G. P. Stricklin, H. Sies, and K. Scharffetter-Kochanek, J. Invest. Dermatol., 104, 194 (1995). 13. A. Oikarinen, J. Karvonen, J. Uitto, and M. Hannuksela, Photodermatology, 2, 15 (1985). 14. A. Oikarinen and M. Kallioinen, Photodermatology, 6, 24 (1989). 15. L. H. Kligman, UVA induced biochemical changes in hairless mouse skin collagen : a contrast to UVB effects, ed. F. Urbach, 209, Valdemar, Overland Park (1992). 16. J. W. Choi, S. I. Kim, J. Y. Kim, H. J. Yang, K. H. Lee, and S. N. Park, J. Soc. Cosmet. Scientists Korea, 32, 181 (2006). 17. H. J. Yang and S. N. Park, J. Soc. Cosmet. Scientists Korea, 33, 61 (2007). 18. H. J. Yang and S. N. Park, J. Soc. Cosmet. Scientists Korea, 33, 139 (2007). 19. S. M. Jeon, S. I. Kim, J. Y. Ahn, and S. N. Park, J. Soc. Cosmet. Scientists Korea, 33, 145 (2007). 20. J. Y. Kim, H. J. Yang, K. H. Le, S. M. Jeon, Y. J. Ahn, B. R Won, and S. N. Park, J. Soc. Cosmet. Scientists Korea, 32, 181 (2006). 21. Y. J. Cho, I. S. Ju, O. J. Kwon, S. S. Chun, B. J. An, and J. H. Kim, J. Korea Soc. Appl. Biol. Chem., 51, 49 (2008). 22. D. Y. Kang, M. O. Shin, J. H. Shon, and S. J. Bae, J. Life Science, 19, 52 (2009). 21. T. Kaneko and N. Baba, Biosci. Biotechnol. Biochem., 63, 323 (1999). 22. S. Kawaii, Y. Tomono, E. Katase, K. Ogawa, and M. Yano, Biosci. Biotechnol. Biochem., 63, 896 (1999). 23. J. Sanderson, W. Mclauchlin, and G. Williamson, Free Rad. Biol. Med., 26, 639 (1999). 24. Z. Shutenko, Y. Henry, E. Pinard, J. Seylaz, P. Potier, F. Berthet, P. Girard, and R. Sercombe, Biochem. Pharmacol., 57, 199 (1999). 25. I. Goldman, M. Kopelberg, J. Devaene, and B. Schwartz, Throm. Haemo., 450 (1996). 26. A. Gulsen, D. P. Makris, and P. Kefalas, Food Res. Int., 40, 7 (2007). 27. D. Prakash, G. Upadhyay, B. N. Singh, and H. B. Singh, Food Chem., 104, 783 (2007). 28. T. C. Lines and M. Ono, Phytomedicine, 13, 236 (2006). 29. Brahma N. Singh, B. R. Singh, R. L. Singh, D. Prakash, D. P. Singh, B. K. Sarma, G. Upadhyay, and H. B. Singh, Food Chem. Toxi., 47, 1161 (2009). 30. S. Balasenthil, S. Arivazhagan, C. R. Ramachandran, V. Ramachandran, and S. Nagini, J. Ethnopharmacol., 67, 189 (1999). 31. M. Valko, D. Leibfritz, J. Moncola, M. T. D. Cronin, M. Mazura, and J. Telser, Int. J. Biochem. Cell Biol., 39, 44 (2007). 공업화학, 제 22 권제 2 호, 2011