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한국환경농학회지제25권제3 호 (2006) Korean Journal of Environmental Agriculture Vol. 25, No. 3, pp. 211-216 연구보문 백색부후균 Coriolus hirsutus LD-1의리그닌분해효소활성과염료탈색에관한연구 남은숙 하상우 1) 박신인 * 경원대학교식품영양학과, 1) 우진중앙연구소 (2006년 7월 10 일접수, 2006년 8월 23 일수리) Production of Lignin Degrading Enzymes and Decolorization of Dye Compounds by White-rotting Fungi Coriolus hirsutus LD-1 Eun-Sook Nam, Sang-Woo Ha 1),andShin-InPark * (Department of Food and Nutrition, Kyungwon University, 1) Woogene Central Research Lab.) ABSTRACT: The present research was undertaken to investigate the activities of ligninolytic enzymes and dye-decolorization capabilities of white-rotting fungi Coriolus hirsutus LD-1. The isolated white-rotting fungi (Coriolus hirsutus LD-1) produced laccase (16,388.9 U/L) and manganese-dependent peroxidase (19.81 U/L) but it did not produce lignin peroxidase. When the isolated fungi was incubated with the treatment of dyes for 8 days, the rates of decolorization of remazol brilliant blue R and bromophenol blue were 70.2% and 98%, respectively. The activity for manganese-dependent peroxidase was low, whereas that for laccase was very high. Moreover, the laccase was more effective to decolor when compared to manganese-dependent peroxidase. The results suggested that laccase of Coriolus hirsutus LD-1 might be playing an important role in the decolorization of the dyes. Key Words: White-rotting fungi, Laccase, Manganese-dependent peroxidase, Decolorization 서 자연생태계의미생물은다양한천연또는합성유기물을변화, 분해시켜생장할수있는능력이있어자연계물질의재순환에매우중요한역할을담당하고있다. 따라서자연과환경의보존적인차원에서미생물의이러한생분해능 (biodegradative activity) 을증가시키기위한연구가활발히진행되고있다. 미생물에의한리그닌분해기작의규명은지구상의탄소사이클을해결하는데큰의의가있을뿐아니라유효한펄프화법의개발을비롯, 펄프표백폐액의생화학적처리, 염색공장폐수, 축산폐수의처리등산업적으로이용가능성이있다고하였다 1). 리그닌을분해하는능력을가진미생물로는 wood-rotting 론 * 연락저자 : Tel: +82-31-750-5969 Fax: +82-31-750-5974 E-mail: psin@kyungwon.ac.kr fungi로 Phanerochaete chrysosporium 2), Tinctporis sp. 3), Schizophyllum commune 4), Mycelia sterilia 등의곰팡이에대한연구와몇몇의방선균, 또는 Rhodococcus 5), Bacillus cereus 6), Aeromonas hydrophilia 7), Pseudomonas 8) 등의세균및효모에대한연구가진행되고있다. 특히이들미생물중백색부후균이분비하는리그닌분해효소가주요한역할을하고있으며, 이들이생성하는 extracellular 효소로는 laccase, lignin peroxidase(lip), manganese-dependent peroxidase(mnp) 등으로알려져있으며, 이들은모두색소 depolymerization에관여한다고알려져있다 9). 미생물에의한탈색은주로 Phanerochaete chrysosporium 을이용하여연구가진행되고있으며 10), 특히세포외효소에의하여분해가진행되는것으로알려져있다 11). 또한이균은 azo계염료의탈색이가능하여방향족의고리를분해시키는것으로보고되고있다 12). Flavobacterium sp. ATCC 39723 의경우에는세포내효소를분비하여 azo 염료를산화효소에의하여분해시키는것으로보고되고있으며 13), 방선균에의해서도탈색효율을검토하여보고하고있다 14). 이외에도 211

212 남은숙 하상우 박신인 Coriolus versicolor 15), Bjerkandera austa 16) 의미생물이탈색능을가지고있는것으로보고되고있다. 그러나세포내효소를생성하는미생물에비해세포외효소를생성하는담자균류 (Basidiomy cetes) 에속하는백색부후균은리그닌분해효소군 (ligninolytic enzymes) 에의해다양한범주의난분해성화합물을비특이적으로분해할수있기때문에이를환경에응용하려는연구가활발히진행되고있다. 그중 Coriolus versicolor, Phanerochaete chrysosporium 등이리그닌분해미생물로가장잘알려져있다. 그러나같은 fungi라도리그닌분해능이나세포외효소의특성이다르게나타난다고하였다 17). 따라서본연구는리그닌분해능이있는 wood-rotting fungi를선발하여이들의염료탈색율과효소활성을비교함으로써향후난분해성물질의생물학적처리에대한이용가능성을검토하고자하였다. 재료및방법 균주및배양조건목재부후균 23균주를농업과학연구원에서분양받아사용하였다. 동결건조상태의균주를증류수에 30분이상현탁시킨후에실험을위해wood powder로 0.05% lignin(kraft indulin) 과 0.01% guaiacol 이들어있는 glucose-peptone(gp) 액체배지 (glucose 30 g/l, peptone 10 g/l, KH 2PO 4 1.4 g/l, MgSO 4 7H2O 0.05g/L,Thiamine-HCl0.002g/L, CuSO 4 5H 2O0.02g/L,MnSO 4 0.02 g/l, Agar 15 g/l, ph 5.0) 에접종하여 28 에서 7일간배양하여 red colored 18) zone width 로선발하였다. 효소분석을위해 glucose-peptone 액체배지에코르크보러로절단된균사조각을접종하여 28 에서 10일간배양한후 15,000 rpm에서 5분간원심분리하여배양상등액으로세포의효소활성도를측정하였다. 균주 의활성을유지하기위해 2주마다계대배양을하고 4 의냉 장고에서보관하였다. 시약및분석 본연구에사용한염료는아조계인 bromophenol blue ( 이하 BB 로약함 ), 반응성염료인안트라퀴논계 remazol brilliant blue R( 이하 RBBR 로약함 ) 을 Sigma 사에서구입 하였고, 기타실험에는특급및일급시약을사용하였다. 이들성분은 UV-3100 Spectrophotometer(Shimadzu, Japan) 를이용하여정량분석하였다. 염료탈색분석염료탈색능을관찰하기위해 0.2% 의염료 BB와염료 RBBR을각각첨가한 GP 고체배지에서균사체가생장하면 서나타나는염료탈색영역의크기로측정하였다. 염료의탈 색율을조사하기위해서는균사체의상단을코르크보러로취 하여곰팡이배지인 Potato dextrose agar(potato infusion 200 g/l, Bacto dextrose 20 g/l, Agar 15 g/l, ph 6.8) 평판배지의중앙에접종하여 25-28 의항온기에서 7일동안 배양하였다. 그후종균용평판배지에서배양된균사체를코르 크보러로절단하여취하여 250 ml 플라스크에 50 ml의 PDA 액체배지에접종하여 28, 150 rpm으로 10일간배 양한후, 배양액을 4 에서 5,000 rpm으로원심분리하여상등액을제거한후증류수로 2 회세척하여사용하였다. 세척 된균액 5% 와 0.2% 염료를 GP 액체배지에접종한후 28 에서 10일간 150 rpm으로진탕배양한다음배양액을 4 에서 15,000 rpm으로원심분리하여상등액을채취하여탈색 정도를염료의최대흡수파장에서흡광도를측정하였다 2). 효소의활성측정 Laccase 효소활성은 Eggert 등 19) 의방법에따라 ABTS (2,2 -azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonate)) 를기질로사용하여 ABTS의산화량을 420 nm 에서측정하였다. 반응용액은 0.1 mm ABTS, 20 mm 의초산완충용액(pH 4.0) 을섞어 3mL되게하여 1분간반응시키면서 420nm에서흡광도의차이를측정하였다 (molar extinction coefficient= 36,000 M -1 cm -1 ). 효소활성단위는분당 1 μmol 의 ABTS 를 산화시키는효소의양을 1unit 로정의하였다. 한편,manganese- dependent peroxidase(mnp) 의활성은 de Jong 등 20) 의방법을이용하여 2,6-dimethoxyphenol(DMP) 을기질로, 효소반응액은 1mMDMP와 1mMEDTA,20mM초산완충용액(pH 4.5) 을혼합한후 0.1 mm H 2O 2 를첨가하여 1 분간반응시키면서 470 nm에서흡광도의차이를측정하였다 (molar extinction coefficient=65,000 M -1 cm -1 ). 효소의활성단위는분당 1 μmol의 Mn(II) 를산화시키는효소의 양을 1unit 로정의하였다. Lignin peroxidase(lip) 는 Kirk와 Connors 21) 의방법을사용하였으며, 효소활성은기질로 10 mm veratryl alcohol, 0.1 M sodium tartrate buffer(ph 3.0), 효소용액을첨가하고 5mMH 2O 2 를혼합하여최종부피가 3mL가되게한후 1분간반응시키면서 310 nm에서흡광도의차이를측정하였다 (molar extinction coefficient=9,300 M -1 cm -1 ). 효소의활성단위는분당 1 μmole의veratryl alcohol을veratryl aldehyde로산화시키는효소의양을 1 unit 로정의하였다. 단백질정량은 Lowry 방법 22) 을이용하여측정하였으며, 표준단백질로는 bovine serum albumin(sigma Chemical Co.) 을사용하였다. 결과및고찰 리그닌분해균의선발목재부후균중리그닌분해능이있는균주를선발하기위해서 wood meal(kraft indulin) 배지에 guaiacol을넣어배지상에서갈색환(brown zone) 형성유무를조사하였다 23).

백색부후균 Coriolus hirsutus LD-1의리그닌분해효소활성과염료탈색에관한연구 213 Table 1은갈색환의크기를측정한것으로서 23균주중형 성된갈색환의크기가 70 mm 이상인균주 2 균주, 30-50 mm 는 3 균주,10-30mm은 8 균주,10mm이하는 3 균주. 갈색 환을전혀생성하지못한균주는 7 균주로나타났다. Figure 1은 0.05% lignin을함유한리그닌배지에서갈색환이형성된것을나타내었다.nishida등 24) 의보고에의하면갈색환의크기는리그닌분해능과관계가있다고하였으므로갈색환을형성한 16균주는크기에차이가있기는하지만리그닌분해능이있는것으로보이며, 그중에서크기가 70 mm 이상인것은 LD-1과 LD-4로리그닌분해능이가장큰것으로추정되었다. Fig. 1. The formation of brown-zone by ligninolytic enzyme in guaiacol medium*. (* Induline 0.2%, Guaiacol 0.01%, Agar 1.5%/ L) Table 1. Colored zone width(czw) of 23 species of wood-rotting fungi No. Strains isolated CZW (mm) LD- 1 Coriolus hirsutus KACC 500148 78 LD- 2 Phallus sp. 14 LD- 3 Volvariella bombycina KACC 7736 - LD- 4 Daedalea dickinsii KACC 500118 70 LD- 5 Pleurotus abalonus KACC 28 LD- 6 Morchella esculenta KACC 500271 - LD- 7 Cordyceps nutans KACC 500169 - LD- 8 Hericium erinaceum KACC 7528 20 LD- 9 Pholiota adiposa KACC 7969 45 LD-10 Hydropus sp. KACC 7636 25 LD-11 Stropharia rugosoannulate KACC 7674 32 LD-12 Callistosporium sp. KACC 7607 16 LD-13 Phellinus sp. KACC 7537 34 LD-14 Leucoagricus bresadolae KACC 7675 25 LD-15 Cordyceps militarius KACC 7845 - LD-16 Lentinus edodes KACC 500044 10 LD-17 Fomes fomentarius KACC 500023 - LD-18 Coriolus brevis KACC 500061 7 LD-19 Laetiporus sulphureus var. miniatus KACC 500048 - LD-20 Microporus affinis KACC 500099 - LD-21 Fomitella fraxinea KACC 500020 14 LD-22 Lampteromyces japomicus KACC 500057 12 LD-23 Coriolus hirstus KACC 500066 8 -: No detect 효소활성측정갈색환을형성하는의관계를조사하기위하여 에서 대부분 16균주의리그닌분해능과효소활성 GP 액체배지에접종하여 28 7 일간배양하여효소활성을측정하였다. 선발된균주는 GP 액체배지에서잘자랐으며, 그중 LD-1, LD-11, LD-18과 LD-21은 Laccase와 MnP 활성을모두가지고있 는것으로나타났으며, LD-4와 LD-20은 laccase활성만있는것으로나타났다. 나머지 10균주는갈색환을형성하였지 만리그닌분해효소활성은거의없는것으로나타났으며, LiP 효소활성은 Laccase나 MnP 효소활성이있는균주에서 모두없는것으로나타났다(Table 2). LiP, MnP 및 laccase 는자연계리그닌을분해할수있는효소로알려져있으나배양중에생산되는효소양과갈색환의크기에따른리그닌분해정도는비례적으로증가하지않는것으로나타났다. 정등 25) 의보고에의하면리그닌분해력이높다고해서 laccase나 MnP 의활성이높은것은아니라고하였으며, Kim 등 26) 은리그닌분해에관련된효소는 laccase보다는 MnP라고보고하였으나본실험에서는효소활성을갖는 6 균주모두 MnP보다는 laccase 효소활성이더높게나타났으며, 특히 LD-1의 laccase 효소활성은 16,388.9 U/L, MnP의효소활성은 19.81 U/L로각각나타났으며 LiP의활성은나타나지않았다. 따라서갈색환의크기가 70 mm 이상이고높은리그닌분해효소활성을가지고있는 LD-1 Table 2. Extracellular enzyme activities of the strains of wood-rotting fungi No. LD- 1 LD- 4 LD-11 LD-18 LD-20 LD-21 Strains Coriolus hirsutus KACC 500148 Daedalea dickinsii KACC 500118 Stropharia rugosoannulate KACC 7674 Coriolus brevis KACC 50006 Microporus affinis KACC 500099 Fomitella fraxinea KACC 500020 Laccase (U/L) MnP LiP (U/L) (U/L) 16,388.9 19.81 0 1,611.1 0 0 2,150 41.55 0 132.81 0.080 0 11.95 0 0 1.33 0.016 0

214 남은숙 하상우 박신인 을이용하여염료탈색율조사하였다. 염료탈색율측정 LD-1의염료탈색능을조사하기위해염료 BB와염료 RBBR를각각 0.2% 씩첨가한 GP 고체배지에배양하여형성 된투명환의크기로색도제거능을확인하였다.Figure2에 서보면 LD-1은염료 BB와염료 RBBR에대해염료탈색능이 뚜렷한것으로나타났다. 따라서 LD-1의색소탈색율을조사하기위해액체배지에서배양하면서각색소의최대흡수파장에서의흡광도의변화를조사하였고, 탈색율 (%) 과효소활성과의관계를조사하기위해 laccase 및 MnP 효소활성을측정하였다. Figure 3은염료 RBBR의최대흡수파장 595 nm에서배양에따른흡광도의변화를나타낸것으로배양 4일까지는흡광도의변화가없다가배양 6일째에 O.D. 가 0.68로떨어지기시작하여 7일째는 O.D. 가 0.2 로떨어지는것으로나타났다. Figure 4는염료탈색율과효소활성을나타낸것으로 Figure 3의흡광도의변화와같이배양 4일까지는탈색율에전혀변화가없다가배양 6일째에 23% 감소하기시작하여배양 7일째는 70%, 8일째는또한 71.2% 의탈색율을나타내었고, 효소활 성의경우 laccase의활성은배양 4일부터나타나배양 8일째는 1,380 U/L로급격히증가한반면,MnP의경우는배양 6일째에활성을나타내어배양 8일째는 20 U/L 로나타났다. 따라서 LD-1을이용한염료 RBBR의색도제거에관여하는효소는 MnP보다는 laccase 인것으로나타났다. Figure 5는 LD-1을이용한염료 BB의최대흡수파장 592 nm에서배양에따른흡광도의변화를나타낸것으로배양 2 일까지는흡광도의변화가없다가배양 4일째에 O.D. 가 0.75 로떨어지기시작하여 8일째는 O.D. 가 0에가깝게떨어지는것으로나타났다.Figure6은색도제거율과효소활성을나타낸것으로 Figure 5의흡광도의변화와같이배양 2일까지는제거율에전혀변화가없었으나배양 4일째에 42.4% 가감소하였고배양 6일째는 98% 의탈색율을나타내었으며, 효소활성의경우 laccase의활성은배양 2일부터서서히증가하여배양 8일째는 1,200 U/L 로급격히증가한반면, MnP의경우는배양 2일째부터서서히증가하여배양 8일째는 18 U/L 로나타났다. LD-1은색도제거능에있어염료 RBBR보다염료BB에더효과적인것을알수있었으며, 색도제거에관여하는효 (A) (B) Fig. 2. Decolorization of bromophenol blue(a) and remazol brilliant blue R(B) by LD-1. Note the halo-zone formed after mycelial growth. Fig. 4. Dependence of dye decolorization on the laccase and MnP activities of LD-1. Cultures were collected and the decolorization of RBBR( ), and the activities of laccase( ) and MnP( ) were determined as described in the text. Fig. 3. UV-visible spectra of RBBR according to the culture ages of LD-1. The spectra were taken with a Shimadzu UV-3100 spectrophotometer. Fig. 5. UV-visible spectra of BB according to the culture age of LD-1. The spectra were taken with a Shimadzu UV-3100 spectrophotometer.

백색부후균 Coriolus hirsutus LD-1의리그닌분해효소활성과염료탈색에관한연구 215 Fig. 6. Dependence of dye decolorization on the laccase and MnP activities of LD-1. Cultures were collected and the decolorization of BB( ), and the activity of laccase ( ) and Mn-peroxidase( ) were determined as described in the text. 소는MnP보다는 laccase에의한다는것을알수있었다. Glenn과 Gold 9) 는 Phanerochaete chrysosporium을이용한염료의탈색과리그닌분해효소활성과의상관관계에대해보고하였으며, Manzanders 등 27) 은리그닌분해에관여하는효소로 Coriolus versicolor의경우는 MnP와 laccase 등이관여한다고하였다. 또한 Hatakka 28) 는담자균류가생산하는리그닌분해효소의종류를조합하여 LiP-MnP MnP-laccase 및 LiP-laccase군으로분류하였으며 MnP-laccase 군이가장분해활성이높다고하였다. 따라서목재부후균이생성하는리그닌분해효소는미생물의종류에따라효소의종류및효소활성도다른것으로나타났으며,LD-1인 Corioulus hertisus의경우는염료의탈색에는 laccase 가더효과적임을알수있었다. 요 Coriolus hirsutus LD-1 균주의리그닌분해효소활성과몇몇염료의탈색능을조사하였다. 백색부후균인 LD-1 균주는 laccase(16,388.9 U/L) 와 manganese-dependent peroxidase ( 19.81 U/L) 는생산하였으나 lignin peroxidase를생산하지않았다. 균주를염료와함께 8일간배양했을때염료 RBBR과염료 BB의탈색율은각각 70.2% 와 98% 로나타났다. Manganese -dependent peroxidase는8일간배양중효소활성은매우낮은반면 laccase는지속적으로생산되어대단히높은활성을나타내었다. 백색부후균인 Coriolus hirsutus LD-1에의 한염료의탈색은주로 약 laccase 에의한것으로사료되었다. 참고문헌 1. Belsare, D. K. and Prasad, D. Y. (1988) Decolorization of effluent from the bagasse-base pulp mills by white-rot fungus, Schizophyllum commune. Appl. Microbiol. Biotechnol. 28, 301-309. 2. Cripps, C., Bumpus, J. A. and Aust S. D. (1990) Biodegradation of azo and heterocyclic dyes by Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ. Microbiol. 56, 1114-1118. 3. Fukuzumi, T. (1982) Microbial decolorization and defoamingofpulpingwasteliquors.in:kirk,t.k., Higuchi, T. and Chang, H. M. (eds) Lignin degradation : microbiology, chemistry and potential applications, Vol. 1, RC Press, Boca Raton, Fla., p.215. 4. Blanchette, R. A. (1984) Screening wood decayed by white rot fungi for preferntial lignin degradation. Appl.Environ.Microbiol.46, 647-653. 5. Heiss, G. S., Gowan, B. and Dabbs, E. R. (1992) Cloning of DNA from Rhodococcus strain conferring the ability to decolorize sulfonated azo dyes. FEMS Microbiol. Lett. 99, 221-226. 6. Han, S. and Yang, H. (1988) Decolorization of acid red B by immobilized cells of Bacillus cereus No.45. Huanjing Kexue Xuebao. 8, 93-98. 7. Idaka, E., Ogawa, T., Horitsu, H. and Tomoyeda, M. (1978) Degradation of azo compounds by Aeromonas hydrophilia var. 24B. J. Soc. Dyes Colour. 94, 91-94. 8. Zimmermann, T., Kulla, H. G. and Leisinger, T. (1982) Properties of purifies orange II azo reductase, the enzyme initating azo dye degradation by Pseudomonas KF46. J. Biochem. 129, 197-203. 9. Glenn, J. K. and Gold, M. H. (1983) Decolorization of several polymeric dyes by the lignin-degradation basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1741-1747. 10.Pauli,O.,Kirsi,A.,Veli-Matti,L.,Tuomo,G.,Timo, R. and Ilari, S. (1993) Decolorization of azo, triphenyl methane, heterocyclic and polymeric dyes by lignin peroxidase isoenzymes from Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ. Microbiol. 59, 4010-4016. 11.Colleen,C.,John,A.B.andSteven,D.A.(1990) Biodegradation of azo and heterocyclic dyes by Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ. Microbiol. 56, 1114-1118. 12. Griselda, G. D. and Eduardo, A. T. (1990) Screening of white-rot fungi for efficient decolorization of bleach pulp effluents. Biotechnol. Lett. 12, 869-872. 13. Cao, W., Mahadevan, B., Crawford, D. L., Goszczynski, S., Crawford, D. L. and Crawford, R. L. (1992)

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