(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2010-0116558 (43) 공개일자 2010년11월01일 (51) Int. Cl. C07K 19/00 (2006.01) C07K 14/475 (2006.01) C07K 14/81 (2006.01) (21) 출원번호 10-2010-0037496 (22) 출원일자 2010 년 04 월 22 일 심사청구일자 (30) 우선권주장 2010 년 04 월 22 일 1020090035190 2009 년 04 월 22 일대한민국 (KR) 전체청구항수 : 총 21 항 (71) 출원인 ( 주 ) 알테오젠 대전광역시유성구도룡동 3-1 엑스포과학공원경비동 2 층 (72) 발명자 정혜신 대전광역시유성구하기동송림마을 605 동 1002 호 유승범 대전광역시서구탄방동한우리아파트 105 동 605 호 이상미 대전광역시유성구도룡동로얄밸리 306 호 (74) 대리인 특허법인이룸 (54) 체내지속성을유지함으로체내반감기가증가된단백질또는펩티드융합체, 및이를이용하여체내반감기를증가시키는방법 (57) 요약 본발명은체내지속성을유지함으로체내반감기가증가된단백질또는펩티드융합체, 및이를이용하여체내반감기를증가시키는방법에관한것이다. 본발명에따른단백질또는펩티드융합체는, 생리활성단백질또는생리활성펩티드를알파 -1 안티트립신또는하나이상의아미노산을변이시킨알파 -1 안티트립신변이체에결합시켜체내지속성을유지함으로혈중반감기 (T 1/2 ) 가고유의생리활성단백질또는생리활성펩티드보다현저히증 가하여체내안정성이우수하다. 따라서, 본발명에따른단백질또는펩티드융합체는단백질또는펩티드약물의지속성제제개발에유용하게사용될수있다. 대표도 - 도 1-1 -
특허청구의범위청구항 1 생리활성단백질또는생리활성펩티드를알파-1 안티트립신과결합시켜, 체내지속성을유지함으로체내반감기가증가된단백질또는펩티드융합체. 청구항 2 제 1항에있어서, 상기융합체는생리활성단백질또는생리활성펩티드가직접또는아미노산으로구성된링커를이용하여알파-1 안티트립신에결합된것을특징으로하는단백질또는펩티드융합체. 청구항 3 제 1항에있어서, 상기생리활성단백질은호르몬류및이의수용체, 생물학적반응조절물질 (biological response modifier) 및이의수용체, 사이토카인류및이의수용체, 효소류, 항체류및항체단편류로이루어진군으로부터선택된것임을특징으로하는단백질또는펩티드융합체. 청구항 4 제 3항에있어서, 상기생리활성단백질은인간성장호르몬 (hgh), 인슐린, 난포자극호르몬 (follicle-stimulating hormone, FSH), 인간융모성성선자극호르몬 (human chorionic gonadotropin), 부갑상선호르몬 (parathyroid hormone, PTH), 적혈구촉진인자 (EPO), 혈소판생성촉진인자 (TPO), 과립구콜로니자극인자 (G-CSF), 과립구대식세포콜로니자극인자 (GM-CSF), 인터페론알파, 인터페론베타, 인터페론감마, 인터루킨, 대식세포 (marophage) 활성화인자, 종양괴사인자 (tumor necrosis factor), 조직플라스미노겐활성체 (tissue plasminogen activator), 혈액응고인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, hbmp2(human bone morphogenic protein 2), KGF (keratinocyte growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor), 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), 알파-갈락토시다제 A(α-galactosidase A), 알파이두로니다제 (α-l-iduronidase), 이두로네이트-2-설파타제 (iduronate-2-sulfatase), 락타제 (lactase), 아데노신데아미나제 (adenosine deaminase), 부티릴콜린에스터라제 (butyrylcholinesterase), 키티나제 (chitinase), 글루타메이트디카복실라제 (glutamate decarboxylase), 이미글루세라제 (imiglucerase), 리파제 (lipase), 유리카제 (uricase), 혈소판-활성인자아세틸하이드롤라제 (platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성엔도펩티다제 (neutral endopeptidase), 유로키나제, 스트렙토키나제, 마이엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase), 수퍼옥사이드디스뮤타제 (superoxide dismutase), 보톨리늄독소, 콜라게나제, 히알루로니다제 (hyaluronidase), L-아스파라기나제 (Lasparaginase), 단일클론항체, 다클론항체, scfv, Fab, Fab', F(ab') 2 및 Fd로이루어진군으로부터선택된 1종이상인것을특징으로하는단백질또는펩티드융합체. 청구항 5 제 1항에있어서, 상기생리활성펩티드는글루카곤-유사펩티드-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1) 및이의유사체, 엑센딘및이의유사체, 소마토스타틴 (somatostatin) 및이의유사체, LHRH(luteinizing hormonereleasing hormone) 작용제및길항제, 아드레노코티코트로픽호르몬 (adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출호르몬 (growth hormone-releasing hormone), 옥시토신 (oxytocin), 티모신알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자 (corticotropin-releasing factor), 칼시토닌 (calcitonin), 비발리루딘 (bivalirudin), 바소프레신유사체 (vasopressin analogues), 및생리활성단백질의단편으로이루어진군으로부터선택된 1종이상인것을특징으로하는단백질또는펩티드융합체. 청구항 6 제 1항에있어서, 상기융합체는서열번호 1로표시되는인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α 1AT/hGH] 인것을특징으로하는단백질또는펩티드융합체. 청구항 7 생리활성단백질또는생리활성펩티드를, 하나이상의아미노산을변이시킨알파-1 안티트립신변이체와결합 - 2 -
시켜, 체내지속성을유지함으로체내반감기가증가된단백질또는펩티드융합체. 청구항 8 제 7항에있어서, 상기융합체는생리활성단백질또는생리활성펩티드가직접또는아미노산으로구성된링커를이용하여하나이상의아미노산을변이시킨알파-1 안티트립신변이체에결합된것을특징으로하는단백질또는펩티드융합체. 청구항 9 제 7항에있어서, 상기생리활성단백질은호르몬류및이의수용체, 생물학적반응조절물질및이의수용체, 사이토카인류및이의수용체, 효소류, 항체류및항체단편류로이루어진군으로부터선택된것임을특징으로하는단백질또는펩티드융합체. 청구항 10 제 9항에있어서, 상기생리활성단백질은인간성장호르몬 (hgh), 인슐린, 난포자극호르몬 (follicle-stimulating hormone, FSH), 인간융모성성선자극호르몬 (human chorionic gonadotropin), 부갑상선호르몬 (parathyroid hormone, PTH), 적혈구촉진인자 (EPO), 혈소판생성촉진인자 (TPO), 과립구콜로니자극인자 (G-CSF), 과립구대식세포콜로니자극인자 (GM-CSF), 인터페론알파, 인터페론베타, 인터페론감마, 인터루킨, 대식세포 (marophage) 활성화인자, 종양괴사인자 (tumor necrosis factor), 조직플라스미노겐활성체 (tissue plasminogen activator), 혈액응고인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, hbmp2(human bone morphogenic protein 2), KGF (keratinocyte growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor), 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), 알파-갈락토시다제 A(α-galactosidase A), 알파이두로니다제 (α-l-iduronidase), 이두로네이트-2-설파타제 (iduronate-2-sulfatase), 락타제 (lactase), 아데노신데아미나제 (adenosine deaminase), 부티릴콜린에스터라제 (butyrylcholinesterase), 키티나제 (chitinase), 글루타메이트디카복실라제 (glutamate decarboxylase), 이미글루세라제 (imiglucerase), 리파제 (lipase), 유리카제 (uricase), 혈소판-활성인자아세틸하이드롤라제 (platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성엔도펩티다제 (neutral endopeptidase), 유로키나제, 스트렙토키나제, 마이엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase), 수퍼옥사이드디스뮤타제 (superoxide dismutase), 보톨리늄독소, 콜라게나제, 히알루로니다제 (hyaluronidase), L-아스파라기나제 (Lasparaginase), 단일클론항체, 다클론항체, scfv, Fab, Fab', F(ab') 2 및 Fd로이루어진군으로부터선택된 1종이상인것을특징으로하는단백질또는펩티드융합체. 청구항 11 제 7항에있어서, 상기생리활성펩티드는글루카곤-유사펩티드-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1) 및이의유사체, 엑센딘및이의유사체, 소마토스타틴 (somatostatin) 및이의유사체, LHRH(luteinizing hormonereleasing hormone) 작용제및길항제, 아드레노코티코트로픽호르몬 (adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출호르몬 (growth hormone-releasing hormone), 옥시토신 (oxytocin), 티모신알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자 (corticotropin-releasing factor), 칼시토닌 (calcitonin), 비발리루딘 (bivalirudin), 바소프레신유사체 (vasopressin analogues), 및생리활성단백질의단편으로이루어진군으로부터선택된 1종이상인것을특징으로하는단백질또는펩티드융합체. 청구항 12 제 7항에있어서, 상기하나이상의아미노산의변이는 P2 위치인 357번째아미노산인프롤린이아스파라진으로변이된것을특징으로하는단백질또는펩티드융합체. 청구항 13 제 7항에있어서, 상기하나이상의아미노산의변이는 P2 위치인 357번째아미노산인프롤린이아스파라진으로변이된것을포함하고, 다른위치에있는하나이상의아미노산을변이시킨것을포함하는단백질또는펩티드융합체. 청구항 14 제 13항에있어서, 상기다른위치에있는하나이상의아미노산의변이는 359번째아미노산인세린이트레오닌 - 3 -
으로변이되거나또는 232번째아미노산인시스테인이세린으로변이된것을특징으로하는단백질또는펩티드융합체. 청구항 15 제 13항에있어서, 상기다른위치에있는하나이상의아미노산의변이는 359번째아미노산인세린이트레오닌으로변이되고 232번째아미노산인시스테인이세린으로변이된것을특징으로하는단백질또는펩티드융합체. 청구항 16 제 7항에있어서, 상기융합체는인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh]( 서열번호 2), 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α1at(p357n, S359T)/hGH]( 서열번호 3), 인간인터페론알파 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T502: α1at(p357n)/ifn-α]( 서열번호 4), 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF] ( 서열번호 5), 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF]( 서열번호 6), 및엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]( 서열번호 7) 로이루어진군으로부터선택된 1종인것을특징으로하는단백질또는펩티드융합체. 청구항 17 생리활성단백질또는생리활성펩티드를, 알파-1 안티트립신또는하나이상의아미노산을변이시킨알파-1 안티트립신변이체와결합시켜, 체내지속성을유지함으로체내반감기를증가시키는방법. 청구항 18 제 17항에있어서, 상기하나이상의아미노산의변이는 P2 위치인 357번째아미노산인프롤린이아스파라진으로변이된것을특징으로하는, 체내지속성을유지함으로체내반감기를증가시키는방법. 청구항 19 제 17항에있어서, 상기하나이상의아미노산의변이는 P2 위치인 357번째아미노산인프롤린이아스파라진으로변이된것을포함하고, 다른위치에있는하나이상의아미노산을변이시킨것을포함하는, 체내지속성을유지함으로체내반감기를증가시키는방법. 청구항 20 제 19항에있어서, 상기다른위치에있는하나이상의아미노산의변이는 359번째아미노산인세린이트레오닌으로변이되거나또는 232번째아미노산인시스테인이세린으로변이된것을특징으로하는, 체내지속성을유지함으로체내반감기를증가시키는방법. 청구항 21 제 19항에있어서, 상기다른위치에있는하나이상의아미노산의변이는 359번째아미노산인세린이트레오닌으로변이되고 232번째아미노산인시스테인이세린으로변이된것을특징으로하는, 체내지속성을유지함으로체내반감기를증가시키는방법. 명세서 [0001] 기술분야 본발명은체내지속성을유지함으로체내반감기가증가된단백질또는펩티드융합체, 및이를이용하여체내 반감기를증가시키는방법에관한것이다. [0002] 배경기술기존의단백질및펩티드의약품들은일반화학합성의약이제공하지못하는치료효과를나타내고뛰어난효능을발휘하여서의약치료제분야에서중요한영역을차지하고있다. 예를들어, 유전자재조합인간성장호르몬 (hgh, recombinant human growth hormone) 은성장호르몬결핍증의효과적인치료제로서유일하게사용되고 - 4 -
있으며, 유전자재조합적혈구촉진인자 (EPO, recombinant human erythropoietin) 는신장이상에의한빈혈환자의적혈구농도를상승시키는약으로사용되고있고, 유전자재조합과립구콜로니자극인자 (G-CSF, recombinant granulocyte colony stimulating hormone) 는화학적치료를받는암환자의백혈구를증가시키는유일한약으로사용되고있다. 이외에도인체에존재하는다양한종류의사이토카인 (cytokine), 호르몬, 펩티드등이대체치료제가없는경우유일한치료제로서광범위하게사용되고있다. [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] 그러나, 이들단백질또는펩티드치료제들은체내에서뛰어난치료효과를발휘하지만일반적으로혈액내의가수분해효소에의하여분해되어주사후치료효과가바로소실되거나, 신장이나간을통하여쉽게체내에서제거되기때문에짧은반감기를가지고있다. 따라서, 이들단백질또는펩티드치료제들은체내에서일정한혈중농도및역가를유지하기위해서는자주주사를해야하는취약점을가지고있다. 단백질치료제또는펩티드치료제의잦은주사는주사의공포심, 주사시의통증등환자의약물순응도를감소시켜서장기간치료를요하는경우제한적으로사용되며, 이에따라치료효과도떨어지는단점이있다. 따라서, 단백질 / 펩티드약물의혈중안정성을증가시키고혈중약물농도를오래유지하기위한연구가꾸준히진행되어왔다. 이러한연구의일예로, 단백질또는펩티드를체내에서자연분해시키는폴리머를이용하여봉합한후피하또는근육주사하여체내에서서서히방출시키는서방형 (sustained release) 치료제가개발되었다 (M. Chasin & R. Langer, et al., Biodegradable polymer as drug delivery system, Marcel Dekker (1990); J. Heller, et al., Adv. Drug Del Rev., 10, 163 (1993)). 생체내분해되는폴리머로는 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)) 가가장많이사용되며, 상기서방형치료제의대표적인예로는 LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone) 작용제 (agonist) 펩티드를서방출성펩티드로제조한제품이있으며, 이제품은 1개월또는 3개월이상체내에서펩티드를방출하기도한다. 또한, 이러한연구는분자량이큰단백질에도적용되었으며, 이의일예로, 미국등록특허제 6,500,448호에는생분해성고분자와금속이온을통해인간성장호르몬의서방성미세입자를제조하는기술에대해기재되어있다. 대한민국등록특허제 10-0236771호및제 10-0329336호에는재조합인간성장호르몬을체내에서분해시키는히아루론산을이용한단백질약물의서방성미세입자제형에관하여기재되어있다. 그러나, 생체분해성폴리머를이용한서방형치료제는아미노산의숫자가적은분자량을가진펩티드에서는어느정도성공을거두었으나, 분자량이큰단백질치료제의경우는성공이제한적이었다. 그이유는서방출성봉합체를만드는과정에서단백질의변성이쉽게일어나서아미노산의변형이단백질의역가를저하시키고아울러인체에서원하지않는면역반응을야기하기때문이다. 또한, 일반적으로단백질또는펩티드서방출성봉합체의미세입자의경우입자의크기가커서인체에주사할때주사바늘이굵은주사기를사용하여야하는단점이있고, 제조과정에서의낮은생산수율이경제성에서문제가되기도한다. 상기와같은문제점을극복하기위하여, 단백질또는펩티드의신장투과를지연시키기위한방법이연구되었다. 일반적으로, 분자량이 60,000 달톤이하의단백질들은체내에서신장의여과체에서걸러지지않고그대로통과하게된다. 따라서, 이보다적은분자량을가진펩티드또는단백질치료제의크기를증가시켜서체내잔류시간을증가시킴으로써주사횟수를줄이고자하는방법이연구되었다. 이러한방법에의하면, 생리활성이있는단백질 / 펩티드는체내에서서서히방출 (sustained release) 되는형태가아니라지속성 (longacting) 의작용을할수있을것으로생각된다. 주사횟수를줄이는방법중가장보편적으로사용되는방법으로는, 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol; 이하 'PEG' 라약칭함 ) 과같이용해도가높은고분자물질을단백질또는약리활성을가진펩티드의표면에부착시키는방법이있다. PEG는단백질또는펩티드의아민기를가진아미노산에비특이적으로부착되며, PEG가부착된단백질은용해도가증가하고수용액상태에서유체역학적부피 (hydrodynamic volume) 가증가하여인체에주사시체내에오래머무르는효과가있다 (Sada et al., J. Ferment Bioeng 71, 137-139, 1991). 최근에는인터페론알파에 PEG를부착시켜서주사횟수를줄이고자하는방법이상용화되었다. 또한, 킨스틀러등은과립구콜로니자극인자 (G-CSF) 에 PEG를부착시켜서일주일에한번주사해도주 3회주사하는과립구콜로니자극인자와약효가동일함을입증하였으며 (Kinstler et al., Pharm Res 12, 1883~1888, 1995), 상기 PEG- GCSF는 "Neulast" 라는상품명으로허가를받아사용되고있다. 그러나, 단백질에 PEG가부착되면 PEG의단백질표면에 PEG가비특이적으로화학결합을이루기때문에 PEG가부착된단백질의부분이수용체와결합을방해하여단백질의생체내역가가현저히저하되는문제가있다. 또한, - 5 -
생리활성을일으키는부위에비특이적으로부착된 PEG-단백질들을정제과정에서분리해서생체내활성저하를최소화하게결합된 PEG-단백질을얻어내야하는번거로움이있다. 이과정에서원하는 PEG-단백질결합체를얻기위해서는생산수율이현저히저하되어서경제성이낮고, 특정단백질들의경우수용액상태에서의안정성이낮은경우에는 PEG를부착시키고자하는시도가실패하기도하였다. [0011] [0012] [0013] [0014] 또한, 당쇄공학 (glycoengineering) 을이용하여주사횟수를줄이고자하는방법이개발되어상용화되었다. Elliot 등은적혈구촉진인자 (EPO) 의아미노산을치환하는방법을이용하여당쇄를추가하는방법에대해보고하였다 (Nat Biotechnol 21, 414~421, 2003; 미국등록특허제 7,217,689호 ). 당쇄공학적방법이적용된적혈구촉진인자는 "Aranesp" 라는상품명으로허가를받아시판되고있으며, 당쇄, 시알산 (sialic acid) 및분자량증가로인해혈류로의흡수및대사와배설이지연되는효과를가지게되는것으로알려져있다. 그러나, 이기술은생리활성물질의당쇄부착또는추가로인해활성저하가유발될수있고, 체내안정성의지속여부가여러단백질에대해검증되지않았으며, 생리활성단백질에추가로부착되는당쇄의위치가매우제한적이고, 저분자펩티드에는적용시키기쉽지않은등그사용이매우제한적일수밖에없다. 유전공학적인방법이발달한이후생리활성을가진단백질을큰분자량을갖는다른단백질과융합시켜단백질의크기를증가시키는방법이연구되었다 (Curr Opin Drug Discov Devel 12, 284~95, 2009). 예를들어, 생리활성을가진단백질의유전자와인간알부민 (human albumin) 유전자를융합한후효모세포에서발현시킨융합단백질이알려져있다 ( 국제출원공개 WO 93/15199호및 WO 93/15200호 ). 상기의알부민과생리활성단백질의융합에관한예로는, 과립구자극인자 (Halpern et al., Pharm Res 19, 1720~1729, 2002), 인간성장호르몬 (Osborn et al., Eur J Pharmacol 456, 149~158, 2002), 글루카곤유사펩티드-1(Baggio et al., Diabetes 53, 2492~2500, 2004), 인터페론알파 (Osborn et al., J Pharmacol Exp Ther 303, 540~548, 2002) 등이알려져있다. 유전자재조합방법을이용한융합단백질의다른예로는, 트랜스페린 (transferrin) 융합단백질이알려져있다. 예를들어, 미국등록특허제 7,176,278호에서는천연형트랜스페린및당화가되지않는트랜스페린변이체와글루카곤유사펩티드-1 등의융합체 (fusion molecule) 를만들어체내반감기를증가시키고자하였다. 한편, 면역글로불린 (Immunoglobulin, Ig) 의 Fc 부분을특정단백질과융합시켜서체내반감기를증가시키는방법이개발되었다 ( 미국등록특허제 5,116,964호및제 5,605,690호 ). TNF-α 수용체 (TNF-α receptor) 절편을 IgG1의 Fc 부분과결합시킨유전자를동물세포 (chinese hamster ovary, CHO) 에서발현시킨물질 ( 상품명 : Enbrel) 은류마티스관절염치료제로미국 FDA 허가를받아서현재치료제로사용되고있다. 또한, 왕 (Qinghua Wang; WO 2007/012188) 은체내반감기가짧은생리활성펩티드인 GLP-1(t 1/2 < 2분 ) 또는엑센딘-4를 Ig의 Fc 부분과융합체 (fusion molecule) 를만들어서체내반감기를증가시키고자하였다. [0015] [0016] [0017] [0018] 이와같이, 면역글로불린 Fc는융합단백질의운반체 (carrier) 로서많이이용되고있으나, IgG Fc가가지는항체의존성세포독성 (antibody-dependent cell cytotoxicity; ADCC) 또는보체-의존성세포독성 (complement dependent cytotoxicity; CDC) 효과는그대로유지하게된다. 따라서, 생리활성물질과 Fc를융합한물질을인체에투여할경우단순한체내반감기를유지시키고자하는목적외에도복잡한면역반응에노출이될뿐만아니라장기반복투여시원하지않는항체를생성시키기도한다. 따라서, Fc가융합된상기방법은사용이제한적이될수밖에없다. 또한, 대한민국등록특허제 10-0725315호에는면역글로불린단편을이용한단백질결합체및그의제조방법, 즉생리활성을가진단백질과 Fc 부분을 PEG로연결시켜서체내반감기를증가시키는방법에관하여기재되어있다. 상기방법의경우, 생리활성단백질-PEG-Fc의구조를가진 " 단백질결합체 " 는약물동력학조사에서구조가변형되지않은생리활성단백질보다더긴체내반감기를가지는것을보여주었다. 그러나, 상기 " 단백질결합체 " 도두생리활성단백질과 Fc를 PEG로화학반응을통하여연결시킨다는점에서 PEG 융합단백질제조에서발생할수있는문제가상존한다. 면역글로불린을이용한다른예로, IgG 항체전체분자와저분자화합물을화학적으로연결시켜펩티드약물의체내안정성을증가시키고자하였다 (Rader et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5396~5400, 2003, Doppalapudi et al., Bioorg & Med Chem 17, 501~506, 2007). 그러나, "CovX-Body" 라고명명된이기술은생리활성단백질과같은분자량이큰단백질에는사용할수없고, 또한상기 Fc 융합단백질과 PEG 단백질제조에서발생하는문제점들로인해사용이제한적일수밖에없다. 상기한바와같이, 생리활성단백질치료제또는펩티드치료제에고분자를융합시키는다양한방법이시도되어 - 6 -
왔지만, 이러한방법들은특정생리활성단백질또는생리활성펩티드와결합시킬경우체내지속시간이의약용으로개발하기에적합하지못하고, 제조과정에서수율이현저히낮아서경제성이결여되며, 장기간사용시체내에서불필요한면역반응을야기하고, 단백질또는펩티드결합과정에서사용되는화학물질잔기가체내주입시독성을야기하는등다양한이유에의하여모든생리활성단백질또는생리활성펩티드에적용하지못한다는단점이있다. 따라서, 생리활성단백질또는생리활성펩티드의체내활성감소를최소화하면서혈중반감기를연장시킬수있는새로운단백질또는펩티드융합체에대한개발의필요성이요구되고있다. 발명의내용 [0019] 해결하려는과제본발명자들은생리활성단백질또는생리활성펩티드의체내활성감소를최소화하면서혈중반감기를연장시킬수있는단백질또는펩티드융합체에대하여연구하던중, 생리활성단백질또는생리활성펩티드를알파-1 안티트립신또는알파-1 안티트립신변이체와결합시켜새로운단백질또는펩티드융합체를제조하였으며, 상기단백질또는펩티드융합체가체내지속성을유지함으로혈중반감기 (T 1/2 ) 가고유의생리활성단백질또는 생리활성펩티드보다현저히증가하여체내안정성이우수함을확인하고, 본발명을완성하였다. [0020] 과제의해결수단 본발명은체내지속성을유지함으로체내반감기가증가된단백질또는펩티드융합체, 및이를이용하여체내 반감기를증가시키는방법을제공하고자한다. [0021] 도면의간단한설명도 1은본발명에따른인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α 1AT(P357N, S359T)/hGH] 의약물동태그래프를나타낸도이다. 도 2는본발명에따른인간인터페론알파 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T502: α1at(p357n)/ifn-α] 의약물동태그래프를나타낸도이다. 도 3은본발명에따른과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G- CSF], 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF] 의약물동태그래프를나타낸도이다. 도 4는본발명에따른엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 의약물동태그래프를나타낸도이다. 도 5는본발명의인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 의생체내활성 ( 뇌하수체가제거된랫트의무게증가 ) 분석결과를나타낸도이다. 도 6은본발명의과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF], 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF] 의생체내활성 ( 백혈구수증가 ) 분석결과를나타낸도이다. 도 7은본발명의엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 의복강내당부하검사결과를나타낸도이다. 도 8은본발명의엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 가당뇨모델마우스에서혈당감소에미치는영향을나타낸도이다. 도 9는본발명의인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α 1AT(P357N, S359T)/hGH] 의세포내활성분석결과를나타낸도이다. 도 10은본발명의과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF], 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF] 의세포내활성분석결과를나타낸도이다. - 7 -
도 11은본발명에따른인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 의트립신활성억제를나타낸도이다. 도 12는본발명에따른인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 의인간호중구엘라스타제활성억제를나타낸도이다. 도 13은본발명에따른인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh], 인간성장호르몬 / 알파- 1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α1at(p357n, S359T)/hGH] 의 SDS-폴리아크릴아미드겔전기영동수행결과를나타낸도이다. [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] 발명을실시하기위한구체적인내용본발명은생리활성단백질또는생리활성펩티드를알파-1 안티트립신과결합시켜, 체내지속성을유지함으로체내반감기가증가된단백질또는펩티드융합체를제공한다. 또한, 본발명은생리활성단백질또는생리활성펩티드를, 하나이상의아미노산을변이시킨알파-1 안티트립신변이체와결합시켜, 체내지속성을유지함으로체내반감기가증가된단백질또는펩티드융합체를제공한다. 또한, 본발명은생리활성단백질또는생리활성펩티드를, 알파-1 안티트립신또는하나이상의아미노산을변이시킨알파-1 안티트립신변이체와결합시켜, 체내지속성을유지함으로체내반감기를증가시키는방법을제공한다. 이하, 본발명에대해상세히설명한다. 본발명에따른단백질또는펩티드융합체는, 생리활성단백질또는생리활성펩티드를알파-1 안티트립신또는하나이상의아미노산을변이시킨알파-1 안티트립신변이체와결합시켜, 체내지속성을유지함으로체내반감기를증가시킨것을특징으로한다. 본발명에서 " 단백질융합체 (fusion protein/fusion polypeptide)" 는하나이상의생리활성을가진단백질을알파-1 안티트립신또는하나이상의아미노산을변이시킨알파-1 안티트립신변이체의 N-말단또는 C-말단에결합시킨새로운분자구성을가진단백질융합체를의미한다. 또한 " 펩티드융합체 (fusion peptide)" 는하나이상의생리활성을가진저분자량의펩티드를알파-1 안티트립신또는하나이상의아미노산을변이시킨알파-1 안티트립신변이체의 N-말단또는 C-말단에결합시킨새로운분자구성을가진펩티드융합체를의미한다. 상기생리활성단백질또는생리활성펩티드는직접또는아미노산으로구성된링커를이용하여알파-1 안티트립신또는하나이상의아미노산을변이시킨알파-1 안티트립신변이체에결합될수있다. 상기생리활성단백질또는생리활성펩티드와알파-1 안티트립신또는하나이상의아미노산을변이시킨알파- 1 안티트립신변이체는유전자재조합기술을이용하여결합시키는것이바람직하나, 당업계에알려져있는가교제를사용하여알파-1 안티트립신또는하나이상의아미노산을변이시킨알파-1 안티트립신변이체의 N-말단, C-말단또는유리기에결합시킬수있다. 상기생리활성단백질은호르몬류및이의수용체, 생물학적반응조절물질 (biological response modifier) 및이의수용체, 사이토카인류및이의수용체, 효소류, 항체류, 항체단편류등을포함할수있다. 구체적으로는, 상기생리활성단백질은인간성장호르몬 (hgh), 인슐린, 난포자극호르몬 (follicle-stimulating hormone, FSH), 인간융모성성선자극호르몬 (human chorionic gonadotropin), 부갑상선호르몬 (parathyroid hormone, PTH), 적혈구촉진인자 (EPO), 혈소판생성촉진인자 (TPO), 과립구콜로니자극인자 (G-CSF), 과립구대식세포콜로니자극인자 (GM-CSF), 인터페론알파, 인터페론베타, 인터페론감마, 인터루킨, 대식세포 (marophage) 활성화인자, 종양괴사인자 (tumor necrosis factor), 조직플라스미노겐활성체 (tissue plasminogen activator), 혈액응고인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, hbmp2 (human bone morphogenic protein 2), KGF(keratinocyte growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), 알파-갈락토시다제 A(αgalactosidase A), 알파이두로니다제 (α-l-iduronidase), 이두로네이트-2-설파타제 (iduronate-2-sulfatase), 락타제 (lactase), 아데노신데아미나제 (adenosine deaminase), 부티릴콜린에스터라제 (butyrylcholinesterase), 키티나제 (chitinase), 글루타메이트디카복실라제 (glutamate decarboxylase), 이미글루세라제 (imiglucerase), 리파제 (lipase), 유리카제 (uricase), 혈소판-활성인자아세틸하이드롤라제 (platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성엔도펩티다제 (neutral endopeptidase), 유로키나제, 스트렙토키나제, 마이엘로퍼옥시 - 8 -
다제 (myeloperoxidase), 수퍼옥사이드디스뮤타제 (superoxide dismutase), 보톨리늄독소, 콜라게나제, 히알루 로니다제 (hyaluronidase), L- 아스파라기나제 (L-asparaginase), 단일클론항체, 다클론항체, scfv, Fab, Fab', F(ab') 2 및 Fd 등을포함하나, 이에한정되지않는다. [0031] [0032] 상기생리활성펩티드는글루카곤-유사펩티드-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1) 및이의유사체, 엑센딘및이의유사체, 소마토스타틴 (somatostatin) 및이의유사체, LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone) 작용제및길항제, 아드레노코티코트로픽호르몬 (adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출호르몬 (growth hormone-releasing hormone), 옥시토신 (oxytocin), 티모신알파-1 (thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자 (corticotropin-releasing factor), 칼시토닌 (calcitonin), 비발리루딘 (bivalirudin), 바소프레신유사체 (vasopressin analogues), 및생리활성단백질의단편등을포함하나, 이에한정되지않는다. 상기알파-1 안티트립신은분자량이약 50,000 달톤의포유류의혈액내에존재하는단백질중의하나로서, 혈액내농도는약 2mg / ml에달하는주혈액단백질중의하나이며 (Robin W.C. et al., Nature 298, 329-334, 1982), 알파-1 프로테아제억제제 (alpha-1 protease inhibitor) 라고도불리운다. 이단백질은단백질분해효소와의시험시여러종류의단백질분해효소를억제한다. 그러나, 현재알려진질환과관련된생체내주된기능은호중구엘라스타제 (neutrophil elastase) 의억제제로알려져있다 (Beatty et al., J Biol Chem 255, 3931~3934, 1980). 알파-1 안티트립신이결핍되면폐의기능이저하되고심각한유전적질환을일으키기도한다. 따라서, 혈액내에서추출한알파-1 안티트립신은 FDA의허가를거쳐서프로라스틴 (Prolastin) 이라는상품명으로폐기종 (emphysema) 치료제로판매되고있다. 프로라스틴은통상적으로 60mg / kg의용량으로 1주간격으로정맥주사로인체에투여되며, 인체에서의안전성및유해성이입증이된단백질이다. 또한, 알파-1 안티트립신의체내반감기는약 5~6일정도로알려져있다 (Weweres, MD, et al., N. Engl J med 316, 1055-1062, 1987). 따라서, 인체에과량투여해도안정성등이이미입증된알파-1 안티트립신을생리활성을가진단백질또는펩티드와융합하여체내반감기가증가된지속성물질로만들고자하는논리적인근거가제공된다. 알파-1 안티트립신의프로테아제억제제로의역할및구조등은이미잘알려져있다 (Elliott, P. et al., JMB 275, 419-425, 1998). 알파-1 안티트립신의 P1(N-말단에서부터 358번위치 ) 아미노산은메티오닌기이지만, 이단백질은트립신, 키모트립신 (chymotrpsin), 트롬빈및엘라스타제등의다양한프로테아제등의활성을저해하는것으로알려져있다. 또한, 알파-1 안티트립신은자연계에 100여종이상의대립유전자 (allele) 가존재하고, 표현형 (phenotype) 은 IEF(isoelectric focusing) 유형에따라 A에서 Z로구분한다 (Stoller et al., The Lancet, 365, 2225-2236, 2005). 이중가장많은 M 대립유전자는정상형으로아미노산서열변이에의해다시 M1(Val 213 ), M1(Ala 213 ), M2, M3 와같이여러가지아형 (subtype) 으로구분된다. 따라서, 본발명에사용된알파 - 1 안티트립신은자연계에존재하는특정아형이며, 다른아형에대하여도동일한효과를얻을수있다. [0033] [0034] [0035] 상기알파-1 안티트립신변이체는하나이상의아미노산을변이시켜특정부위돌연변이유발 (site-directed mutagenesis) 방법을이용하여제조된다. 예를들어, 알파-1 안티트립신변이체에서하나이상의아미노산의변이는 P2 위치인 357번째아미노산인프롤린이아스파라진으로변이된것을특징으로한다. 또한, 알파-1 안티트립신변이체에서하나이상의아미노산의변이는 P2 위치인 357번째아미노산인프롤린이아스파라진으로변이된것을포함하고다른위치에있는하나이상의아미노산을변이시킨것을포함한다. 상기다른위치에있는하나이상의아미노산의변이는 359번째아미노산인세린이트레오닌으로변이되거나또는 232번째아미노산인시스테인이세린으로변이된것을포함한다. 또는상기다른위치에있는하나이상의아미노산의변이는 359번째아미노산인세린이트레오닌으로변이되고 232번째아미노산인시스테인이세린으로변이된것을포함한다. 즉, 알파-1 안티트립신변이체는알파-1 안티트립신변이체 [α1at(p357n)], 알파-1 안티트립신이중변이체 [α 1AT(P357N, S359T)], 알파-1 안티트립신이중변이체 2[α1AT(P357N, C232S)], 알파-1 안티트립신삼중변이체 [α1at(p357n, C232S, S359T)] 를포함한다. 상기알파-1 안티트립신변이체 [α1at(p357n)] 는 N-말단으로부터 P2 위치인 357번째아미노산인프롤린 (proline) 을아스파라진 (Asn) 으로변이시킨것을특징으로한다. 이러한알파-1 안티트립신변이체는 Asn-X-Ser 의새로운 N-당화부위가생성되어알파-1 안티트립신의프로테아제억제제의활성을중화시키는동시에체내주입시에아미노산치환에의한면역원성가능성을최소화할수있다. 상기알파-1 안티트립신이중변이체 [α1at(p357n, S359T)] 는 P2 위치인 357번째아미노산인프롤린을아스파라진으로변이시키고 359번째아미노산인세린을트레오닌으로변이시킨것을특징으로한다. 이러한알파-1 안티트립신변이체는 Asn-X-Thr의새로운 N-당화부위가생성되어알파-1 안티트립신의프로테아제억제제의활성을중화시키는동시에체내주입시에아미노산치환에의한면역원성가능성을최소화할수있다. - 9 -
[0036] [0037] [0038] [0039] 상기알파-1 안티트립신이중변이체 2[α1AT(P357N, C232S)] 는 P2 위치인 357번째아미노산인프롤린을아스파라진으로변이시키고 232번째아미노산인시스테인을세린으로변이시킨것을특징으로한다. 이러한알파-1 안티트립신이중변이체 2는 Asn-X-Ser의새로운 N-당화부위가생성되어알파-1 안티트립신의프로테아제억제제의활성을중화시키는동시에체내주입시에아미노산치환에의한면역원성가능성을최소화할수있으며, 유리시스테인에의한이중체형성등을제거할수있다. 상기알파-1 안티트립신삼중변이체 [α1at(p357n, C232S, S359T)] 는 P2 위치인 357번째아미노산인프롤린을아스파라진으로변이시키고, 232번째아미노산인시스테인을세린으로변이시키며, 359번째아미노산인세린을트레오닌으로변이시킨것을특징으로한다. 이러한알파-1 안티트립신변이체는 Asn-X-Thr의새로운 N-당화부위가생성되어알파-1 안티트립신의프로테아제억제제의활성을중화시키는동시에체내주입시에아미노산치환에의한면역원성가능성을최소화할수있으며, 유리시스테인기에의한이중체형성등을제거할수있다. 본발명의단백질또는펩티드융합체는인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh]( 서열번호 1), 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh]( 서열번호 2), 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α1at(p357n, S359T)/hGH]( 서열번호 3), 인간인터페론알파 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T502: α1at(p357n)/ifn-α]( 서열번호 4), 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF]( 서열번호 5), 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF]( 서열번호 6), 및엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]( 서열번호 7) 를포함한다. 본발명의인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α1at(p357n, S359T)/hGH], 인간인터페론알파 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T502: α1at(p357n)/ifn-α], 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF], 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF], 및엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 의혈중반감기 (t 1/2 ) 는고유의생리활성단백질또는생리활성펩티드보다현저 히증가하여체내안정성이우수하다. [0040] [0041] 또한, 본발명의인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 를주사한뇌하수체가제거된랫트의경우체중증가를나타내고, 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α 1AT(P357N, C232S)/G-CSF] 및과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF] 를주사한랫트의경우백혈구수가증가된다. 또한, 엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 를투여한군은엑센딘-4를투여한군보다혈당감소효과가우수하고, 24시간후에도혈당이낮게유지되어혈당감소효과가오랜시간동안지속된다. 따라서, 본발명에따른단백질또는펩티드융합체는효과적으로생체내활성을오래도록유지함을알수있다. 또한, 본발명의인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α 1AT(P357N, S359T)/hGH], 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G- CSF] 및과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF] 의세포내활성 (EC 50 ) 은알파-1 안티트립신및알파-1 안티트립신변이체의종류에상관없이큰차이가없이유사하 게나타난다. [0042] [0043] 또한, 본발명의인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh] 는트립신억제활성및인간호중구엘라스타제에대한억제활성이우수하게나타나고, 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 는트립신억제활성및인간호중구엘라스타제에대한억제활성이낮게나타난다. 따라서, 본발명의인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh] 및인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 가체내에서활성을지속적으로유지함으로체내반감기가증가하는것이알파-1 안티트립신의고유성질에의한것이아님을알수있다. 상기한바와같이, 본발명에따른단백질또는펩티드융합체는체내지속성을유지함으로혈중반감기 (T 1/2 ) 가 고유의생리활성단백질또는생리활성펩티드보다현저히증가하여체내안정성이우수하다. 따라서, 본발명 에따른단백질또는펩티드융합체는단백질또는펩티드약물의지속성제제개발에유용하게사용될수 있다. - 10 -
[0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] 이하, 본발명의이해를돕기위하여바람직한실시예를제시한다. 그러나하기의실시예는본발명을보다쉽게이해하기위하여제공되는것일뿐, 실시예에의해본발명의내용이한정되는것은아니다. 실시예 1 : 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체의제조 [T109wt: α1at/hgh] 1. 발현벡터 psnat의제조인간성장호르몬을알파-1 안티트립신의 C-말단에융합시켜발현하기위하여, 알파-1 안티트립신만을발현하는벡터인 psnat를제조하였다. 구체적으로는, C-말단에인간성장호르몬을삽입하기위해알파-1 안티트립신을코딩하는벡터인 hmu001448(kribb) 를두개의프라이머인 ALT21( 서열번호 8) 과 ALT30( 서열번호 9) 을이용하여 PCR 로증폭하였다. 이때사용된프라이머중 ALT30은융합된단백질의활성을유지하기위하여유연성을극대화하기위한링커를포함하고있다. 상기증폭된뉴클레오티드를말단에존재하는두개의제한효소인 XhoI과 BamHI 으로절단하여모벡터인 psghv0(genbank Accession No. AF285183) 에결합하여클로닝하였으며, 이를 psnat로명명하였다. 2. 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신벡터의제조 [T109wt, α1at/hgh] 인간성장호르몬 (hgh) 을엔코딩하는 IOH45734(invitrogen) 벡터를모체로하여두개의프라이머인 DH22( 서열번호 10) 와 ALT12( 서열번호 11) 를사용하여 PCR로인간성장호르몬을증폭하였다. 상기증폭된뉴클레오티드를말단에존재하는두개의제한효소인 BamHI과 NotI으로절단하고, BamHI/NotI 절단부를가지고있는 psnat에결합하여발현벡터인 T109wt( 서열번호 1) 를제조하였다. 3. 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 (T109wt) 의발현차이니즈햄스터난소세포 (CHO-K1) 를이용하여상기 2에서제조한인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 (T109wt) 의발현을확인하였다. CHO-K1은 10% FBS (Fetal Bovine Serum) 와항생제를포함한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media) 에 5% CO 2 와 37 조건으로배양하여유지하였다. 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융 합체 (T109wt) 를도입하기하루전, 100mm배양접시에세포를 1 10 6 농도로접종하여배양한후, FBS와항생제가없는 800μl의 DMEM과 5μg의인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 (T109wt) 를혼합하여상온에서 1분동안유지한후, 20μg의 PEI(Polyethylenimine, linear, Polysciences Inc (Cat. no: 23966, MW~25,000)) 와혼합하여 10~15분정도상온에서방치하였다. 이때하루전배양하였던세포를 PBS로씻어내고새로운배양액 6ml의 DMEM을첨가하였다. 10~15분후, 상온에방치한인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 (T109wt) 를이배양접시에첨가하였다. 다음날 PBS로씻어내고 FBS가없는 IMDM(Cat. No 12200-028, Gibco, Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지를첨가하여단백질발현을확인하였다. [0052] [0053] 4. 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 (T109wt) 의정제상기 3에의하여차이니즈햄스터난소세포 (CHO-K1) 에서발현한 T109wt 단백질을하기와같이정제하였다. 구체적으로는, 세포배양액으로분비된인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 (T109wt) 를정제하기위하여, 배양액을원심분리하여세포를제거한후상등액만을취하였다. 세포상등액을평형완충용액 (20mM sodium phosphate, ph 8.0) 으로희석하여평형완충용액으로평형화된 Q-Sepharose (GE Healthcare, 미국 ) 컬럼에주입한후평형완충용액으로충분히세척한후염의농도를증가 (0~400mM NaCl, 20mM sodium phosphate, ph8. 0) 시켜용출하였다. 용출된상기단백질용액에염을가하여평형화되어있는 Phenyl-Sepharose(GE Healthcare, 미국 ) 컬럼에주입한후평형완충용액으로충분히세척하고염의농도를감소 (2~0M NaCl, 20mM sodium phosphate, ph6.8) 시켜용출하였다. 상기용액을 Vivaspin20(GE Healthcare, 미국 ) 을사용하여농축하고고순도로정제된 T109wt 단백질을얻었다. [0054] [0055] [0056] 실시예 2 : 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체의제조 [T109: α1at(p357n)/hgh] 1. 알파-1 안티트립신변이체의제조 (pdht3n 클로닝벡터 ) 단백질치료제또는펩티드치료제의융합체의제조에사용되는알파-1 안티트립신의활성을감소시키기위하여, 알파-1 안티트립신변이체를제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신을코딩하는벡터 hmu001448(kribb) 를 PCR로증폭하고 yt&a 벡터에클로닝하여 pdht3 벡터를제조하였다. 그다음두개의프라이머 ALT1( 서열번호 12) 및 ALT2( 서열번호 13) 와변이체생성키트 (Stratagene, QuikChange Ⅱ Cat No. 200523-5) 를사용하여알파-1 안티트립신활성에영향을주는 P2 위치인 357번째아미노산프롤린을아스파라진으로변 - 11 -
이시켜활성을감소시키고 N- 당화를유도한 pdht3n 클로닝벡터를제조하였다. [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] 2. 발현벡터 psnatn의제조인간성장호르몬을, 활성이감소된알파-1 안티트립신변이체의 C-말단에융합시켜발현하기위하여, psnatn 벡터를제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신변이체의 C-말단에인간성장호르몬을삽입하기위해, 활성이감소된알파-1 안티트립신변이체를코딩하는벡터인 pdht3n을두개의프라이머인 ALT14( 서열번호 14) 와 ALT30( 서열번호 9) 을이용하여 PCR로증폭하고 psnat와두개의제한효소인 EcoRV와 BamHI을이용하여클로닝하였으며, 이를 psnatn으로명명하였다. 3. 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이체벡터의제조 [T109, α1at(p357n)/hgh] 상기실시예 1의 2와동일한방법으로증폭된인간성장호르몬뉴클레오티드를 BamHI/NotI 절단부를가지고있는 psnatn에결합하여발현벡터인 T109( 서열번호 2) 를제조하였다. 4. 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 (T109) 의발현상기실시예 1의 3과동일한방법으로차이니즈햄스터난소세포 (CHO-K1) 를이용하여인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 (T109) 의발현을확인하였다. 5. 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 (T109) 의정제상기실시예 1의 4와동일한방법으로인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 (T109) 를정제하였다. [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] [0073] [0074] [0075] 실시예 3 : 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체의제조 [T109T: α1at(p357n, S359T)/hGH] 1. 알파-1 안티트립신이중변이체의제조 (pdht3nt 클로닝벡터 ) 단백질치료제또는펩티드치료제의융합체의제조에사용되는알파-1 안티트립신변이체의당화의균질성을위하여, 알파-1 안티트립신이중변이체를제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신활성에영향을주는 P2 위치인 357번째아미노산프롤린을아스파라진으로변이시켜활성을감소시키고, N-당화를유도한 pdht3n 클로닝벡터를모체로하여, 2개의프라이머 ALT82( 서열번호 15) 및 ALT83 ( 서열번호 16) 과변이체생성키트 ( 엔지노믹스, EZchange Cat No. EM020) 를사용하여 359번째아미노산세린을트레오닌으로변이시켜 pdht3nt 클로닝벡터를제조하였다. 2. 발현벡터 psnatnt의제조인간성장호르몬을, 당화의균질성을가지면서활성이감소된알파-1 안티트립신이중변이체의 C-말단에융합시켜발현하기위하여, psnatnt 벡터를제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신이중변이체의 C-말단에인간성장호르몬을삽입하기위해, 알파-1 안티트립신이중변이체를코딩하는벡터인 pdht3nt를두개의프라이머인 ALT14( 서열번호 14) 와 ALT30( 서열번호 9) 을이용하여 PCR로증폭하고 psnat와두개의제한효소인 EcoRV와 BamHI을이용하여클로닝하였으며, 이를 psnatnt로명명하였다. 3. 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이체벡터의제조 [T109T, α1at(p357n, S359T)/hGH] 상기실시예 1의 2와동일한방법으로증폭된인간성장호르몬뉴클레오티드를 BamHI/NotI 절단부를가지고있는 psnatnt에결합하여발현벡터인 T109T( 서열번호 3) 를제조하였다. 4. 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 (T109T) 의발현상기실시예 1의 3과동일한방법으로차이니즈햄스터난소세포 (CHO-K1) 를이용하여인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 (T109T) 의발현을확인하였다. 5. 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 (T109T) 의정제상기실시예 1의 4와동일한방법으로인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 (T109T) 를정제하였다. [0076] [0077] 실시예 4 : 인간인터페론알파 / 알파 -1 안티트립신변이융합체의제조 [T502: α1at(p357n)/ifn-α] 1. 인간인터페론알파 / 알파 -1 안티트립신변이체벡터의제조 [T502, α1at(p357n)/ifn-α] - 12 -
[0078] [0079] [0080] [0081] [0082] 인간인터페론알파 (IFN-α) 를엔코딩하는 MHS1010-98051913(Open biosystems) 벡터를모체로하고, 두개의프라이머인 ALT45( 서열번호 17) 와 ALT49 ( 서열번호 18) 를사용하여 PCR로인간인터페론알파 (IFN-α) 를증폭하였다. 상기증폭된뉴클레오티드를말단에존재하는두개의제한효소인 BamHI과 NotI으로절단하여 BamHI/NotI 절단부를가지고있는 psnatn에결합하여발현벡터인 T502( 서열번호 4) 를제조하였다. 2. 인간인터페론알파 / 알파-1 안티트립신변이융합체 (T502) 의발현상기실시예 1의 3과동일한방법으로차이니즈햄스터난소세포 (CHO-K1) 를이용하여인간인터페론알파 / 알파- 1 안티트립신변이융합체 (T502) 의발현을확인하였다. 3. 인간인터페론알파 / 알파-1 안티트립신변이융합체 (T502) 의정제상기실시예 1의 4와동일한방법으로인간인터페론알파 / 알파-1 안티트립신변이융합체 (T502) 를정제하였다. [0083] [0084] [0085] [0086] [0087] [0088] [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] 실시예 5 : 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체의제조 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF] 1. 알파-1 안티트립신이중변이체 2의제조 (pdht3ns 클로닝벡터 ) 단백질치료제또는펩티드치료제의융합체의제조에사용되는알파-1 안티트립신의고유한활성을감소시키면서알파-1 안티트립신의시스테인으로인한이중체형성등의단백질변성의가능성을제거하기위하여, 알파-1 안티트립신이중변이체 2를제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신활성에영향을주는 P2 위치인 357 번째아미노산프롤린을아스파라진으로변이시켜활성을감소시키고, N-당화를유도한 pdht3n 클로닝벡터를모체로하여 2개의프라이머 ALT52( 서열번호 19) 및 ALT53( 서열번호 20) 과변이체생성키트 (Stratagene, QuikChange II Cat No. 200523-5) 를사용하여알파-1 안티트립신에존재하는 232번째아미노산시스테인을세린으로변이시켜 pdht3ns 클로닝벡터를제조하였다. 2. 발현벡터 psnatns의제조과립구자극인자를, 활성이감소된알파-1 안티트립신이중변이체 2의 C-말단에융합시켜발현하기위하여, psnatns 벡터를제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신이중변이체 2의 C-말단에과립구자극인자를삽입하기위해, 알파-1 안티트립신이중변이체 2를코딩하는벡터인 pdht3ns를두개의프라이머인 ALT14( 서열번호 14) 와 ALT30( 서열번호 9) 을이용하여 PCR로증폭하고 psnat와두개의제한효소인 BstEII와 BamHI을이용하여클로닝하였으며, 이를 psnatns로명명하였다. 3. 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이체 2 벡터의제조 [T602S, α1at(p357n, C232S)/G-CSF] 과립구자극인자 (G-CSF) 를엔코딩하는 IHS1380-97652343(Open biosystems) 벡터를모체로하고, 두개의프라이머인 ALT56( 서열번호 21) 와 ALT57( 서열번호 22) 을사용하여 PCR로과립구자극인자 (G-CSF) 를증폭하였다. 상기증폭된뉴클레오티드를말단에존재하는두개의제한효소인 BamHI과 NotI으로절단하여 BamHI/NotI 절단부를가지고있는 psnatns에결합하여발현벡터인 T602S( 서열번호 5) 를제조하였다. 4. 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 (T602S) 의발현상기실시예 1의 3과동일한방법으로차이니즈햄스터난소세포 (CHO-K1) 를이용하여과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 (T602S) 의발현을확인하였다. 5. 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 (T602S) 의정제상기실시예 1의 4와동일한방법으로과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 (T602S) 를정제하였다. [0094] [0095] [0096] 실시예 6 : 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체의제조 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF] 1. 알파-1 안티트립신삼중변이체의제조 (pdht3nst 클로닝벡터 ) 단백질치료제또는펩티드치료제의융합체의제조에사용되는알파-1 안티트립신이중변이체의당화의균질성을위하여, 알파-1 안티트립신삼중변이체를제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신활성에영향을 - 13 -
주는 P2 위치인 357번째아미노산프롤린을아스파라진으로변이시켜활성을감소시키고, N-당화를유도하고알파-1 안티트립신의시스테인으로인한이중체형성등의단백질변성의가능성을제거하기위하여 232번째아미노산시스테인을세린으로변이시킨알파-1 안티트립신이중변이체 2 pdht3ns 클로닝벡터를모체로하여, 2개의프라이머 ALT82( 서열번호 15) 및 ALT83( 서열번호 16) 과변이체생성키트 ( 엔지노믹스, EZchange Cat No. EM020) 를사용하여 359번째아미노산세린을트레오닌으로변이시켜 pdht3nst 클로닝벡터를제조하였다. [0097] [0098] [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] 2. 발현벡터 psnatnst의제조과립구자극인자를, 활성이감소된알파-1 안티트립신삼중변이체의 C-말단에융합시켜발현하기위하여, psnatnst 벡터를제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신삼중변이체의 C-말단에과립구자극인자를삽입하기위해, 알파-1 안티트립신삼중변이체를코딩하는벡터인 pdht3nst를두개의프라이머인 ALT14( 서열번호 14) 와 ALT30( 서열번호 9) 을이용하여 PCR로증폭하고 psnat와두개의제한효소인 BstEII와 BamHI을이용하여클로닝하였으며, 이를 psnatnst로명명하였다. 3. 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이체벡터의제조 [T602ST, α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF] 과립구자극인자 (G-CSF) 를엔코딩하는 IHS1380-97652343(Open biosystems) 벡터를모체로하고, 두개의프라이머인 ALT56( 서열번호 21) 와 ALT57( 서열번호 22) 을사용하여 PCR로과립구자극인자 (G-CSF) 를증폭하였다. 상기증폭된뉴클레오티드를말단에존재하는두개의제한효소인 BamHI과 NotI으로절단하여 BamHI/NotI 절단부를가지고있는 psnatnst에결합하여발현벡터인 T602ST ( 서열번호 6) 를제조하였다. 4. 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 (T602ST) 의발현상기실시예 1의 3과동일한방법으로차이니즈햄스터난소세포 (CHO-K1) 를이용하여과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 (T602ST) 의발현을확인하였다. 5. 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 (T602ST) 의정제상기실시예 1의 4와동일한방법으로과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 (T602ST) 를정제하였다. [0105] [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] 실시예 7 : 엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체의제조 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 1. 발현벡터 pscat의제조엑센딘-4를알파-1 안티트립신의 N-말단에융합시켜발현하기위하여, pscat 벡터를제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신의 N-말단에엑센딘-4를삽입하기위해, 알파-1 안티트립신을코딩하는벡터인 hmu001448(kribb) 를두개의프라이머인 ALT21( 서열번호 8) 과 ALT5( 서열번호 23) 를이용하여 PCR로증폭하였다. 상기증폭된뉴클레오티드를말단에존재하는두개의제한효소인 XhoI과 NotI으로절단하여모벡터인 psghv0(genbank Accession No. AF285183) 에결합하여클로닝하였으며, 이를 pscat로명명하였다. 2. 발현벡터 pscatn의제조엑센딘-4를, 활성이감소된알파-1 안티트립신변이체의 N-말단에융합시켜발현하기위하여, pscatn 벡터를제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신변이체의 N-말단에엑센딘-4를삽입하기위해, 활성이감소된알파 -1 안티트립신변이체를코딩하는벡터인 pdht3n을두개의제한효소인 EcoRV와 NotI을이용하여 pscat와클로닝하였으며, 이를 pscatn으로명명하였다. 3. 엑센딘-4의제조엑센딘-4를엔코딩하는폴리뉴클레오티드를제조하기위하여, DH15(sense codon, 서열번호 24) 와 DH16(antisensecodon, 서열번호 25) 을이용하여 PCR로증폭하였다. 4. 엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이체벡터의제조 [T304, Exendin-4/α1AT(P357N)] 엑센딘-4를엔코딩하는폴리뉴클레오티드는상기 3에서제조된것을주형으로하여두개의프라이머인 ALT44( 서열번호 26) 와 ALT41( 서열번호 27) 을사용하여 PCR로증폭하였다. 상기증폭된뉴클레오티드를말단에존재하는두개의제한효소인 XhoI과 BamHI으로절단하여 XhoI/BamHI 절단부를가지고있는 pscatn에결합하여엑센딘- 4/ 알파-1 안티트립신변이체벡터 (T304, 서열번호 7) 를제조하였다. - 14 -
[0114] [0115] [0116] [0117] 5. 엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 (T304) 의발현상기실시예 1의 3과동일한방법으로차이니즈햄스터난소세포 (CHO-K1) 를이용하여엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 (T304) 의발현을확인하였다. 6. 엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 (T304) 의정제상기실시예 1의 4와동일한방법으로엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 (T304) 를정제하였다. [0118] [0119] [0120] [0121] [0122] [0123] [0124] [0125] [0126] [0127] [0128] 실험예 1 : 본발명에따른단백질또는펩티드융합체의효소면역분석법본발명에따른단백질또는펩티드융합체의분석을위해하기와같은효소면역분석법을수행하였다. 1. 인간성장호르몬 (hgh), 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh], 인간성장호르몬 / 알파 -1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α1at(p357n, S359T)/hGH] 의효소면역분석법인간성장호르몬에대한단클론항체 (Medix Biochemica, 핀란드 ) 를인산염완충용액에 1~5μg / ml의농도로희석하여 100μl를 96웰플레이트 (Nunc, 덴마크 ) 에분주한후상온에서 15~18시간동안방치하였다. 웰플레이트에부착되지않고남아있는항체를제거한후 1% 소혈청알부민이용해된인산염완충용액 250μl를분주하여상온에서 2시간방치시키고세척용액 (0.05% 트윈 20, 인산염완충용액 ) 으로 3회세척한후용액을제거하였다. 시료는 1% 소혈청알부민이용해된인산염완충용액으로희석하였으며, 96웰플레이트에첨가하여상온에서 2시간동안반응시켰다. 96웰플레이트를세척용액으로 5회세척한후 sulfo-nhs-biotin(pierce biotechnology, 미국 ) 을이용하여접합시킨인간성장호르몬단클론항체-biotin 접합체를희석용액에희석하여 96웰플레이트에 100μl씩분주하였다. 이어서플레이트를상온에서 2시간반응시킨다음세척용액으로 5회세척한후스트렙타비딘-HRP 용액을가하여상온에서 30분간반응시켰다. 세척용액으로 5회세척하고 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 와과산화수소수발색용액 100μl를각웰에첨가한후암소에서 30분간반응시켰다. 1M 황산 100μl를각웰에첨가하여반응을종료시키고, VersaMax microplate reader(molecular Device, 미국 ) 로 450nm에서흡광도를측정하였다. 각시료의정량값은표준물질에대한표준곡선을작성한후회귀분석을통해구하였다. 2. 인간인터페론알파 (IFN-α), 인간인터페론알파 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T502: α1at(p357n)/ifn-α] 의효소면역분석법인간인터페론알파 (IFN-α) 및인간인터페론알파 / 알파-1 안티트립신변이융합체의효소면역분석법은 Bender Medsystems( 오스트리아 ) 사의 Human IFN-α Matched Antibody Pairs for ELISA의항체를사용하였다. 10μg / ml의 IFN-α 항체를상기 1의방법에따라코팅및차단 (blocking) 하고, 시료는희석후상온에서 2시간동안쉐이킹 (shaking) 하여반응시켰으며, Anti-IFN-α-HRP 접합체는 50μl를사용하여상온에서 2시간동안쉐이킹하여반응시켰다. 이후과정은상기 1의방법에따라수행하였다. 3. 과립구자극인자 (G-CSF), 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF], 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G- CSF] 의효소면역분석법상기 1에서인간성장호르몬항체대신과립구자극인자 (G-CSF) 에대한단클론항체 (RND systems, 미국 ) 를인산염완충용액에 1~5μg / ml의농도로희석하여사용하고, 인간성장호르몬단클론항체-biotin 접합체대신과립구자극인자다클론항체-biotin 접합체 (RND systems, 미국 ) 를사용한것을제외하고는상기 1의방법에따라수행하였다. 4. 엑센딘-4, 엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 의효소면역분석법엑센딘-4의경우, 상기 1에서인간성장호르몬대신엑센딘-4에대한다클론항체 ( 펩트론, 한국 ) 를인산염완충용액에 5~10μg / ml의농도로희석하여사용하고, 인간성장호르몬단클론항체-biotin 접합체대신엑센딘-4 단클론항체-biotin 접합체를사용한것을제외하고는상기 1과동일한과정을수행하였다. 엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 (T304) 의경우, 상기실시예 7에서제조한엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 (T304) 를 Freund adjuvant(sigma, 미국 ) 와섞어서랫트에주사하여항혈청을생성시켰으며, Protein G-Sepharose(GE Healthcare, 미국 ) 를이용하여정제하였다. 상기정제된항체를인산염완충용액에 10~20μl / ml의 - 15 -
농도로희석하여 96 웰플레이트에코팅하였고, sulfo-nhs-biotin (Pierce biotechnology, 미국 ) 을이용하여접 합시킨엑센딘 -4/ 알파 -1 안티트립신변이융합체 (T304) 다클론항체 -biotin 접합체를사용하여상기 1 의방법에 따라수행하였으며, 시료반응과접합체반응은플레이트를쉐이킹하여수행하였다. [0129] [0130] [0131] [0132] [0133] [0134] 실험예 2 : 본발명에따른단백질또는펩티드융합체의약물동태실험본발명에따른단백질또는펩티드융합체의약물동태를확인하기위하여, 하기와같은실험을수행하였다. 1. 인간성장호르몬 (hgh), 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh], 인간성장호르몬 / 알파 -1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α1at(p357n, S359T)/hGH] 의약물동태실험동물로 Sprague-Dawley 랫트를사용하였으며, 인간성장호르몬투여군에는 3마리를할당하였고, 나머지융합체투여군에는각각 5마리씩할당하였다. 각군의 Sprague-Dawley 랫트에상기실시예 1~3에서제조한인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α 1AT(P357N)/hGH], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α1at(p357n, S359T)/hGH] 를각각랫트kg당 720μg의투여량으로피하주사하였고, 희석액은인산염완충용액을사용하였으며, 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 24, 30, 48시간후채혈하여원심분리후혈청을얻었다. 대조군으로는인간성장호르몬인 Scitropin(SciGen, 싱가포르 ) 을랫트kg당 200μg의투여량으로피하주사하였고, 희석액은인산염완충용액을사용하였으며, 0, 0.33, 1, 2, 5, 8, 12, 18, 24, 30, 48시간후채혈하여원심분리후혈청을얻었다. 각시료에대해서는상기실험예 1의효소면역분석방법을이용하여분석하였다. 본발명에따른인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α 1AT(P357N, S359T)/hGH] 의약물동태그래프는도 1에나타내었다. 도 1에나타난바와같이, 본발명의인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh] 의혈중반감기 (t 1/2 ) 는 5.3시간이고혈중최고농도도달시간 (T max ) 은 8시간이었으며, 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이 융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 의혈중반감기 (t 1/2 ) 는 5.4시간이고혈중최고농도도달시간 (T max ) 은 12시간이었으며, 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α1at(p357n, S359T)/hGH] 의혈중반감기 (t 1/2 ) 는 4.9시간이고혈중최고농도도달시간 (T max ) 은 12.8시간이었다. 반면, 인간성장호르몬 (hgh) 의혈중반감기 (t 1/2 ) 는 0.8시간이고혈중최고농도도달시간 (T max ) 은 1시간이었다. 따라서, 본발명에따른인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh], 및인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α1at(p357n, S359T)/hGH] 는인간성장호르몬에비해현저히증가된체내안정성을갖는다는것을확인할수있었다. [0135] [0136] [0137] [0138] 2. 인간인터페론알파 (IFN-α), 인간인터페론알파 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T502: α1at(p357n)/ifn-α] 의약물동태실험동물로 Sprague-Dawley 랫트를사용하였으며, 각군당 5마리씩할당하였다. 하나의실험군의 Sprague- Dawley 랫트에상기실시예 4에서제조한인간인터페론알파 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T502: α 1AT(P357N)/IFN-α] 를랫트kg당 200μg의투여량으로피하주사하였고, 0, 0.33, 1, 2, 5, 8, 12, 18, 24, 30, 48, 72, 96시간후채혈하여원심분리후혈청을얻었다. 대조군으로는인간인터페론알파 (IFN-α, 인터맥스알파, LG 생명과학 ) 를사용하여랫트kg당 60μg의투여량으로피하주사하였고, 0, 0.33, 1, 2, 5, 8, 12, 18, 24시간후채혈하여원심분리후혈청을얻었다. 각시료에대해서는상기실험예 1의효소면역분석방법을이용하여분석하였다. 본발명에따른인간인터페론알파 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T502: α1at(p357n)/ifn-α] 의약물동태그래프는도 2에나타내었다. 도 2에나타난바와같이, 본발명의인간인터페론알파 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T502: α 1AT(P357N)/IFN-α] 의혈중반감기 (t 1/2 ) 는 18.5시간이고혈중최고농도도달시간 (T max ) 은 12시간이었으며, 인간인 터페론알파의혈중반감기 (t 1/2 ) 는 3.4 시간이고혈중최고농도도달시간 (T max ) 은 1.4 시간이었다. 따라서, 본발명 - 16 -
에따른인간인터페론알파 / 알파 -1 안티트립신변이융합체 [T502: α1at(p357n)/ifn-α] 는인간인터페론알파 에비해현저히증가된체내안정성을갖는다는것을확인할수있었다. [0139] [0140] [0141] [0142] 3. 과립구자극인자 (G-CSF), 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF], 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G- CSF] 의약물동태실험동물로 Sprague-Dawley 랫트를사용하였으며, 과립구자극인자투여군에는 3마리를할당하였고, 나머지융합체투여군에는각각 5마리씩할당하였다. 각군의 Sprague-Dawley 랫트에상기실시예 5~6에서제조한과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF], 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF] 를각각랫트kg당 340μg의투여량으로피하주사하였고, 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 24, 30, 48시간후채혈하여원심분리후혈청을얻었다. 대조군으로는과립구자극인자인 Filgrastim(Gracin, 제일약품 ) 을사용하여랫트kg당 100μg의투여량으로피하주사하였고, 0, 1, 2, 4, 8, 12, 18, 24, 30, 48시간후채혈하여원심분리후혈청을얻었다. 각시료에대해서는상기실험예 1의효소면역분석방법을이용하여분석하였다. 본발명에따른과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF], 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF] 의약물동태그래프는도 3에나타내었다. 도 3에나타난바와같이, 본발명의과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF] 의혈중반감기 (t 1/2 ) 는 5.1시간이고혈중최고농도도달시간 (T max ) 은 13.6시간이었으며, 과립구자극 인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF] 의혈중반감기 (t 1/2 ) 는 4.5시간이고혈중최고농도도달시간 (T max ) 은 16시간이었다. 반면, 과립구자극인자의혈중반감기 (t 1/2 ) 는 1.8시간이고혈중최고농도도달시간 (T max ) 은 1.8시간이었다. 따라서, 본발명에따른과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF], 및과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF] 는과립구자극인자에비해현저히증가된체내안정성을갖는다는것을확인할수있었다. [0143] [0144] [0145] [0146] 4. 엑센딘-4, 엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 의약물동태실험동물로 Sprague-Dawley 랫트를사용하였으며, 각군당 5마리씩할당하였다. 하나의실험군의 Sprague- Dawley 랫트에상기실시예 7에서제조한엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α 1AT(P357N)] 를랫트kg당 520μg의투여량으로피하주사하였고, 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 24, 30, 48, 72시간후채혈하여원심분리후혈청을얻었다. 대조군으로는엑센딘-4를사용하여랫트kg당 40μg의투여량으로피하주사하였고, 0, 10, 20, 30, 40, 60, 120, 180, 240, 300, 360분후헤파린이처리된튜브에채혈하여원심분리후혈청을얻었다. 각시료에대해서는상기실험예 1의효소면역분석방법을이용하여분석하였다. 본발명에따른엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 의약물동태그래프는도 4에나타내었다. 도 4에나타난바와같이, 본발명의엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 의혈중반감기 (t 1/2 ) 는 19.1시간이고혈중최고농도도달시간 (T max ) 은 10.4시간인반면, 엑센딘-4의혈중반감기 (t 1/2 ) 는 0.8 시간이고혈중최고농도도달시간 (T max ) 은 0.4 시간이었다. 따라서, 본발명에따른엑센딘 -4/ 알파 -1 안티트 립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 는엑센딘 -4 에비해현저히증가된체내안정성을갖는다는것 을확인할수있었다. [0147] [0148] [0149] 실험예 3 : 본발명에따른단백질또는펩티드융합체의생체내활성실험본발명에따른단백질또는펩티드융합체의생체내활성을확인하기위하여, 하기와같은실험을수행하였다. 1. 인간성장호르몬 (hgh), 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 의생체내활성 - 17 -
[0150] [0151] [0152] [0153] [0154] [0155] [0156] [0157] [0158] [0159] [0160] [0161] 실험동물로뇌하수체가제거된 Sprague-Dawley 랫트를사용하였으며, 실험군을 3개군으로나누어각군당 7마리씩할당하였다. 각군의뇌하수체가제거된 Sprague-Dawley 랫트에상기실시예 2에서제조한인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 를랫트당 18μg, 인간성장호르몬 (Eutropin, LG 생명과학 ) 을랫트당 5μg, 대조군으로인산염완충용액을사용하여매일피하주사하였고, 주사후랫트의무게를매일측정하였다. 본발명의인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 의생체내활성 ( 뇌하수체가제거된랫트의무게증가 ) 분석결과는도 5에나타내었다. 도 5에나타난바와같이, 인산염완충용액을주사한뇌하수체가제거된랫트의경우체중증가가거의일어나지않았으나, 인간성장호르몬과인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 를주사한뇌하수체가제거된랫트의경우 7일째에각각약 10.2% 와 9.4% 의체중증가를나타내었다. 따라서, 본발명의인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 는인간성장호르몬과마찬가지로뇌하수체가제거된랫트에서효과적으로생체내활성을나타냄을알수있다. 2. 과립구자극인자 (G-CSF), 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF], 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G- CSF] 의생체내활성실험동물로 Sprague-Dawley 랫트를사용하였으며, 실험군을 5개군으로나누어각군당 5마리씩할당하였다. 각군의 Sprague-Dawley 랫트에상기실시예 5에서제조한과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF] 를랫트kg당 340μg과 1,700μg, 상기실시예 6에서제조한과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF] 를랫트kg당 1,700μg, 및과립구자극인자인 Filgrastim (Gracin, 제일약품 ) 을랫트kg당 100μg의투여량으로피하주사하였고, 실험 3 일전, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일째에미정맥채혈하여 Hematology Analyzer(Pentra 120) 를이용하여백혈구수를측정하였다. 본발명의과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF], 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF] 의생체내활성 ( 백혈구수증가 ) 분석결과는도 6에나타내었다. 도 6에나타난바와같이, 과립구자극인자인 Filgrastim의투여군에서는백혈구수의증가가주사후 1일차에최고치에도달한다음 2일차부터는기저상태에그쳤으나, 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF] 의랫트kg당 340μg투여군에서는백혈구수의증가가주사후 2일차에최고치에도달한다음 3일차부터감소하였고, 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α 1AT(P357N, C232S)/G-CSF] 및과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF] 를각각랫트kg당 1,700μg투여군에서는백혈구수의증가가주사후 3일차까지유지되다가 4일차부터감소되었다. 따라서, 본발명의과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α 1AT(P357N, C232S)/G-CSF] 및과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF] 는과립구자극인자에비해생체내활성을더오래도록유지한다는것을확인할수있었다. 3. 엑센딘-4, 엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 의생체내활성본발명에따른엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 의생체내활성을확인하기위하여, 하기와같이복강내당부하검사및당뇨모델마우스에서의혈당감소실험을수행하였다. 3-1. 복강내당부하검사 8주령의 C57BL/6 마우스에 4주간고지방사료를먹여서비만을유도하였으며, 실험개시 15시간전에절식시킨상태에서복강내당부하검사를실시하였다. 구체적으로는, 상기실시예 7에서제조한엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 와엑센딘-4를각각 10nmol/ kg의투여량으로마우스의복강내에단회투여하였다. 시험물질투여후각각 30분, 12시간, 24시간이경과한다음포도당을 1.5g/5ml / kg복강투여하였고, 0, 10, 20, 30, 60, 90, 120분에혈당계 ( 올메디쿠스, 대한민국 ) 를이용하여혈당을측정하였다. 본발명의엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 의복강내당부하검사결과는도 7에나타내었다. - 18 -
[0162] [0163] [0164] [0165] [0166] 도 7에나타난바와같이, 엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 의투여군은엑센딘-4의투여군보다혈당감소효과가오래지속되어혈당감소효과가우수함을확인하였다. 3-2. 당뇨모델마우스에서의혈당감소실험실험동물로 9주령의 db/db 마우스를사용하였으며, 실험군을 3개군으로나누어각군당 6마리씩할당하였다. 9 주령의 db/db 마우스에사료제한을가하지않은상태에서상기실시예 7에서제조한엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 와엑센딘-4를각각 100nmol/ kg의투여량으로각실험군의마우스에피하주사하였고, 시험물질투여후 0, 1, 3, 6, 24, 43, 48, 52시간경과후혈당계 ( 올메디쿠스, 대한민국 ) 를이용하여혈당을측정하였다. 본발명의엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 가당뇨모델마우스에서혈당감소에미치는영향을나타낸결과는도 8에나타내었다. 도 8에나타난바와같이, 엑센딘-4 투여군은 24시간이후혈당이대조군과유사하게나타났으나, 엑센딘-4/ 알파-1 안티트립신변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 투여군은 24시간후에도혈당이낮게유지되어혈당감소효과가오랜시간동안지속되었다. [0167] [0168] [0169] [0170] 실험예 4 : 본발명에따른단백질또는펩티드융합체의세포내활성실험본발명에따른단백질또는펩티드융합체의세포내활성을확인하기위하여, 하기와같은실험을수행하였다. 1. 인간성장호르몬 (hgh), 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh], 인간성장호르몬 / 알파 -1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α1at(p357n, S359T)/hGH] 의세포내활성마우스림프종세포 (NB2 cell) 는 RPMI1640에 10% HS(Horse serum), 10% FBS, 2-머캅토에탄올과항생제를포함한배지를사용하여 5% CO 2, 37 조건으로배양하였다. 실험에사용하는 NB2 세포를사용하기 24시간전에 RPMI1640에 10% HS가들어있는배지에넣어배양하였다. 배양 24시간후 NB2 세포를 1 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) 로한번세척하였다. 그다음 5% HS 조성의 RPMI 1640 배지에세포수가 2 10 4 /100 μl /well 상태가되도록준비하여 96웰플레이트 (Corning, 미국 ) 에각각 100μl씩분주하고, 농도별로희석한시료를웰에 20μl씩접종시켜, 5% CO 2, 37 조건으로 48시간동안배양시켰다. 이어서 MTS 용액 (Promega, 미국 ) 을 96웰플레이트에웰당 20μl씩넣어주고 5% CO 2, 37 배양기에서 3시간동안반응시킨다음, 10% SDS(sodium dodecyl sulfate) 를 20μl씩가하여반응을종료하였다. 흡광도는 VersaMax microplate reader(molecular Device, 미국 ) 를이용하여 490nm에서측정하였고, MTS 검색법으로얻어진흡광도값으로 50% 의세포가살아남도록한약물의농도를 EC 50 (50% effective concentration) 로결정하였다. [0171] 본발명의인간성장호르몬 / 알파 -1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh], 인간성장호르몬 / 알파 -1 안티트립신 변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh], 인간성장호르몬 / 알파 -1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α1at(p357n, S359T)/hGH] 의세포내활성분석결과는표 1 및도 9 에나타내었다. 표 1 [0172] 시료 EC 50 (pm) T109wt 211.8 T109 181.1 T109T 217.1 [0173] 표 1 및도 9 에나타난바와같이, 본발명의인간성장호르몬 / 알파 -1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh], 인간성장호르몬 / 알파 -1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh], 인간성장호르몬 / 알파 -1 안티트립신 이중변이융합체 [T109T: α1at(p357n, S359T)/hGH] 의 EC 50 값은큰차이없이서로유사하게나타났다. 따라서, 본발명의인간성장호르몬 / 알파 -1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh], 인간성장호르몬 / 알파 -1 안티트립신 - 19 -
변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh], 인간성장호르몬 / 알파 -1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α1at(p357n, S359T)/hGH] 의세포내활성 (EC 50 ) 은알파 -1 안티트립신의아미노산변이에상관없이서로유사하다는것을확인 할수있었다. [0174] [0175] 2. 과립구자극인자 (G-CSF), 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF], 과립구자극인자 / 알파-1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G- CSF] 의세포내활성쥐골수아세포 (Murine myeloblastic NFS-60 세포 ) 는 RPMI 1640에 10% FBS, mouse IL-3과항생제를포함한배지를사용하여 5% CO 2, 37 조건으로배양하였다. 그다음, 쥐골수아세포를사용하여상기 1의방법과동일하게 수행하여흡광도를 490nm 에서측정하였고, MTS 검색법으로얻어진흡광도값으로 50% 의세포를살아남도록한 약물의농도를 EC 50 (50% effective concentration) 로결정하였다. [0176] 본발명의과립구자극인자 / 알파 -1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF], 과립구자 극인자 / 알파 -1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF] 의세포내활성분석결 과는표 2 및도 10 에나타내었다. 표 2 [0177] 시료 EC 50 (pm) T602S 78.1 T602ST 97.6 [0178] 표 2 및도 10 에나타난바와같이, 과립구자극인자 / 알파 -1 안티트립신이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF] 및과립구자극인자 / 알파 -1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G- CSF] 의 EC 50 값은큰차이없이서로유사하게나타났다. 따라서, 본발명의과립구자극인자 / 알파 -1 안티트립신 이중변이융합체 [T602S: α1at(p357n, C232S)/G-CSF], 과립구자극인자 / 알파 -1 안티트립신삼중변이융합체 [T602ST: α1at(p357n, C232S, S359T)/G-CSF] 의세포내활성 (EC 50 ) 은알파 -1 안티트립신의아미노산변이에상 관없이서로유사하다는것을확인할수있었다. [0179] [0180] [0181] [0182] [0183] 실험예 5 : 본발명에따른단백질또는펩티드융합체의트립신활성억제비교실험본발명에따른인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 의트립신활성억제효과를확인하기위하여, 하기와같은실험을수행하였다. 상기실시예 1에서제조한인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh] 와상기실시예 2에서제조한인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 를각각트립신과섞어주었다. 이때트립신과융합체의농도는 10nM이었고, 1시간동안상온에서반응시킨후기질인 N-Benzoyl-Val-Gly-Arg p-nitroanilide hydrochloride(sigma, 미국 ) 를 0.2mM이되도록가하여 405nm에서흡광도변화를측정하였다. 트립신의효소 unit은 1분당흡광도 0.001을변화시키는기질농도로설정하였고, 효소활성은 units/ mg트립신으로계산하였다. 대조군으로는트립신을사용하였다. 결과는도 11에나타내었다. 도 11에나타난바와같이, 트립신과알파-1 안티트립신의 Ka(association constant) 값을계산한결과, 인간성 장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh] 의 Ka 값은약 7.5 10 8 M -1 이었고, 인간성장호르몬 / 알파 -1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 의 Ka 값은약 8.0 10 6 M -1 이었다. 상기한바와같이, 본발명의인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh] 는트립신억제활성이우수하게나타나고, 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 는트립신억제활성이낮게나타남으로써, 본발명의인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh] 및인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 가체내에서활성을지속적으로유지함으로체내반감기가 - 20 -
증가하는것이알파 -1 안티트립신의고유성질에의한것이아님을알수있었다. [0184] [0185] [0186] [0187] [0188] 실험예 6 : 본발명에따른단백질또는펩티드융합체의인간호중구엘라스타제활성억제비교실험본발명에따른천연형인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh] 와인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 의인간호중구엘라스타제활성억제효과를확인하기위하여, 하기와같은실험을수행하였다. 상기실시예 1에서제조한인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh] 와상기실시예 2에서제조한인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 를각각인간호중구엘라스타제와섞어주었다. 이때엘라스타제와융합체의농도는 40nM이었고, 1시간동안상온에서반응시킨후기질인 MeOSuc-AAPV-pNA(Santa Cruz Biotechnology, Inc., 미국 ) 를 1mM이되도록가하여 405nm에서흡광도변화를측정하였다. 인간호중구엘라스타제의효소 unit은 1분당흡광도 0.001을변화시키는기질농도로설정하였고, 효소활성은 units/ mg엘라스타제로계산하였다. 결과는도 12에나타내었다. 도 12에나타난바와같이, 본발명의인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh] 는인간호중구엘라스타제를거의 100% 억제시켰고, 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α 1AT(P357N)/hGH] 의 Ka 값은약 1.4 10 7 M -1 이었다. 상기한바와같이, 본발명의인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh] 는인간호중구엘라스타제에대한억제활성이우수하게나타나고, 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 는인간호중구엘라스타제에대한억제활성이낮게나타남으로써, 본발명의인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh] 및인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 가체내에서활성을지속적으로유지함으로체내반감기가증가하는것이알파-1 안티트립신의고유성질에의한것이아님을알수있었다. [0189] [0190] [0191] [0192] 실험예 7 : 본발명에따른단백질또는펩티드융합체의전기영동실험본발명에따른천연형인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh], 인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α 1AT(P357N, S359T)/hGH] 의당화부위추가에따른분자량변화를알아보기위하여, SDS-폴리아크릴아미드겔전기영동실험을수행하였다. 결과는도 13에나타내었다. 도 13에나타난바와같이, 당화부위추가가없는천연형인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신융합체 [T109wt: α1at/hgh] 에비해당화부위 (Asn-X-Ser) 가추가된인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α 1AT(P357N)/hGH] 는단백질염색띠가분자량이높은쪽으로더퍼져서나타났으며, 추가당화부위가 Asn-X-Thr 의아미노산서열을갖는인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α1at(p357n, S359T)/hGH] 의경우분자량증가를더욱명확하게확인할수있었다. 따라서본발명에따른인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신변이융합체 [T109: α1at(p357n)/hgh] 와인간성장호르몬 / 알파-1 안티트립신이중변이융합체 [T109T: α 1AT(P357N, S359T)/hGH] 에서당화부위추가에따른분자량변화를확인할수있었다. [0193] 산업상이용가능성 본발명에따른단백질또는펩티드융합체는, 체내지속성을유지함으로혈중반감기 (T 1/2 ) 가고유의생리활성 단백질또는생리활성펩티드보다현저히증가하여체내안정성이우수하다. 따라서, 본발명에따른단백질또 는펩티드융합체는단백질또는펩티드약물의지속성제제개발에유용하게사용될수있다. - 21 -
도면 도면 1-22 -
도면 2 도면 3-23 -
도면 4 도면 5-24 -
도면 6-25 -
도면 7 도면 8-26 -
도면 9 도면 10-27 -
도면 11 도면 12-28 -
도면 13 서열목록 <110> Alteogen, Inc <120> Fusion protein or fusion peptide having enhanced half life in blood, and method for enhancing half life in blood <130> P10-08083 <150> KR10-2009-0035190 <151> 2009-04-22 <160> 27 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 590-29 -
<212> PRT <220><223> T109wt(alpha-1AT/hGH) <400> 1 Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His 1 5 10 15 Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu 20 25 30 Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr 35 40 45 Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu 50 55 60 Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu 65 70 75 80 Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe 85 90 95 Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu 100 105 110 Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp 115 120 125 Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr 130 135 140 Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr 145 150 155 160 Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu 165 170 175 Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly 180 185 190 Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe 195 200 205 His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu 210 215 220-30 -
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