주간건강과질병 1071 강원과제주의참진드기매개질환병원체의분자생물학적조사 Molecular Detection for Tick-borne Pathogens in Hard Ticks Collected in Gangwon and Jeju-do, 2014 질병관리본부국립보건연구

주간건강과질병 1071 강원과제주의참진드기매개질환병원체의분자생물학적조사 Molecular Detection for Tick-borne Pathogens in Hard Ticks Collected in Gangwon and Jeju-do, 2014 질병관리본부국립보건연구원면역병리센터인수공통감염과, 질병매개곤충과 노윤태, 김수연, 이승훈, 송봉구 Abstract Lyme borelliosis, Rickettsiosis, Ehrlichiosis, Bartonellosis, and Anaplasmosis are typical arthropod-borne zoonotic disease transmitting their pathogens, Borrelia sp., Rickettsia sp., Ehrlichia sp., and Bartonella sp., Anaplasma sp., by hard tick vector. In this study, a total of 1,267 ticks (182 pools) were collected by flagging and by picking on the dog in Gangwon and Jeju in 2014. 11 pools were positive for Borrelia sp. (1.6%, 3 pools), Rickettsia sp. (0.5%, 1 pool), Anapalsma phgocytophilum (3.8%, 7 pools) according to PCR for glta or FlaB genes. Positive samples of 11 pools were compared with specific genes of other isolates through DNA star program. Positive 3 pools of Borrelia sp. were homologous to B. garinii N318 (99.8%). Positive 1 pool of Rickettsia sp. was homologous to R. heilongjjangensis (99.5%). Positive 7 pools of A. phagocytophilum. were homologous to A. phagocytophilum NE, A. phagocytophilum BDS and A. phagocytophilum China-C-Tt (from 89.2% to 100%). This report suggests that surveillance of tick vectors and characteristic analysis of Korean isolates are necessary to prevent the spreading of tick-borne diseases. 질병은대부분야생동물, 설치류, 조류및사람까지전파되는절지동물매개인수공통감염질환이다. 이중라임병은미국및유럽에서매년수만명의환자가발생하고있으며 [1], Anaplasmosis과 Ehrlichiosis는수백명이상의환자가발생하고있다 [2]. 최근국내에서중증열성혈소판감소증후군 (Severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS) 의발병이보고되면서참진드기매개질환에대한관심이높아지고있다. 국내에서식하는참진드기는작은소피참진드기 (Haemaphysalis longicornis), 개피참진드기 (H. flava), 산림참진드기 (Ixodes persucaltus), 일본참진드기 (I. nipponensis) 가가장넓게분포하는종이며, 이종들에서 Borrelia sp., Bartonella sp., Rickettsia sp., Ehrlichia sp., Anaplasma sp., 진드기매개뇌염바이러스, SFTS 바이러스유전자가확인및보고되었다 [5, 6, 8, 10]. 이글에서는국내라임병과중증열성혈소판증후군환자발생지역인강원과제주지역의원인병원체실태를파악하고자 2014 년 채집한참진드기에서 Borrelia sp., Rickettsia sp., E. chaffeensis, Ⅰ. 들어가는말 참진드기 (Ixodid, hard tick) 에의해매개되는질병은 B. quintana, A. phagocytophilum 의유전자확인결과를 기술하고자한다. 라임병 (Lyme borreliosis), Anaplasmosis, Ehrlichiosis, Bartnellosis, 홍반열 (Tick-borne relapsing fever), 바베시아증 (Babesiosis) 등으로다양하며, 세계적으로분포하고있다. 원인병원체로는세균인 Borrelia sp., Bartonella sp., 기생성인리케치아 (Rickettsia sp.), Ehrlichia sp., Anaplasma sp., 바이러스인진드기매개뇌염바이러스 (Tick-borne encephalitis virus), SFTS 바이러스 (Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus), 원충인 Babesia sp. 등이있다. 참진드기매개 II. 몸말 채집은참진드기매개질환환자가발생하는제주도와강원도 ( 가평 ( 강원도인접지역 ), 화천, 정선 ) 에서 4-5월에실시하였다. 주로등산로와휴양림에서천끌기 (dragging) 로채집하였고, 제주도의말목장에서기르는개의몸에서직접뜯어서채집하였다.

1072 제 7 권제 48 호 총 1,267 마리가채집되었는데, 강원도지역에서는사슴피참진드기 (H. japonica) 148마리, 개피참진드기 (H. flava) 5마리, 산림참진드기 (I. persucaltus) 74마리였으며, 제주도에서채집된작은소피참진드기는 1,040 마리였다 (Table 1). 동정 분류된참진드기의병원체감염률을조사하기위해서표면을 4% 과산화수소수와 70% 에탄올로세척하고분쇄하였다. 분쇄한참진드기샘플은 DNA 정제를위해 사용하였고, 나머지샘플은 -70 에보관하였다. 프라이머 (primer) 는 Rickettsia sp.(530bp), E. chaffeensis(390bp), B. quintana(290bp), A. phagocytophilum(180bp) 의 glta와 Borrelia sp. FlaB(604bp) 의종특이유전자 (species-specific gene) 를제작하여유전자증폭을수행하였다. 병원체검출실험진행과정은 Figure 1과같다. 병원체유전자가확인된지역및진드기분포를보면, 제주도에서채집한작은소피참진드기 1 pool(0.5%) 에서 Rickettsia sp. 유전자가확인되었고, 가평 ( 강원도인접지역 ) 에서채집된사슴피참진드기 2 pools과정선에서채집된산림참진드기 1 pool, 총 3 pools(1.6%) 에서 Borrelia sp. 유전자가확인되었다. A. phagocytophilum는가평, 화천, 정선지역에서채집된사슴피참진드기와정선에서채집된산림참진드기 7 pools(3.8%) 에서유전자가확인되었다 (Table 1). 확인된 11건의병원체유전자는염기서열을분석하고, DNA star 프로그램을이용하여각병원체의유전자간상동성 (homology) 을비교하였다. Borrelia sp. 로검출되었던유전자는일본에서보고된 B. garinii N318 와 99.8% 로가장높은상동성을나타냈다 (Figure 2). Rickettsia sp. 로검출된유전자는중국에서보고된 R. heilongjjangensis 와 99.5% 로가장높은상동성을보였다 (Figure 3). A. phagocytophilum 으로검출된유전자는일본및중국에서보고된 A. phagocytophilum NE, A. phagocytophilum BDS, A. phagocytophilum China-C-Tt 와 89.2% 에서 100% 까지가장높은상동성을보였다 (Figure 4). III. 맺는말 참진드기매개질환은매년수만명의환자가발생하여사회적, 경제적, 그리고보건학적으로손실을주는세계적인인수공통질환이다. 국내에도해외유입질병들에대한위험을인식하고예방및감시를위한방법들을모색하고있지만많은 Figure 1. Diagram of experiment process for detection of tick-borne pathogens 병원체에대한감시가쉽지않은실정이다. 또한, 많은매개체 전파질환들은대체로초기증상이감기증상과유사하기때문에

주간건강과질병 1073 Table 1. Results of tick-borne pathogen PCR for tick species and stages of development collected in Gangwon and Jeju, 2014 Collection region Species Stage No. of ticks No. of pools Borrelia sp. Rickettsia sp. No. (%) of PCR-positive samples Ehrlichia chaffeensis Bartonella quintana Anaplasma phagocytophilum a Larvae 6 1 0 0 0 0 0 Jeju-do (Jeju) H. longicornis b Nymph 988 51 0 0 0 0 0 c Adults (Male) 9 9 0 0 0 0 0 c Adults (Female) 37 37 0 1 0 0 0 Gangwon-do (Gapyeong, Hwachon, Jeongseon) H. japonica H. flava I. persulcatus Subtotal 1,040 98 0 1 0 0 0 Nymph 2 2 0 0 0 0 0 Adults (Male) 57 19 2 0 0 0 2 Adults (Female) 89 30 0 0 0 0 4 Subtotal 148 51 2 0 0 0 6 Nymph 1 1 0 0 0 0 0 Adults (Male) 1 1 0 0 0 0 0 Adults (Female) 3 3 0 0 0 0 0 Subtotal 5 5 0 0 0 0 0 Nymph 2 1 0 0 0 0 0 Adults (Male) 49 19 1 0 0 0 1 Adults (Female) 23 8 0 0 0 0 0 Subtotal 74 28 1 0 0 0 1 Total 1,267 182 *3(1.6%) *1(0.5%) 0(0.0%) 0(0.0%) *7(3.8%) Abbreviations: No.=Number; H, Haemaphysalis; I, Ixodes No. of pools: a 1-50 larvae/pool; b 1-30 nymphs/pool; c 1-3 adults/pool *pool No. of positive samples: Borrelia sp., tick 110, 130, 131; Rickettsia sp., tick 63; Anaplasma phagocytophilum, tick 109, 129, 146, 149, 158, 159, 160 그차이를임상적으로감별하기어려운경우가많다. 최근참진드기매개질환의인체감염에대한국민보건인식이높아지고진드기매개질환검사의양성율과의심환자신고가증가하고있어서이에대한정확한진단검사및위험군에서의실태조사의필요성이강조되고있는실정이다. 국내에서라임병의병원체인 Borrelia sp. 은 1993 년진드기및야생쥐로부터처음분리되었다. 현재까지환자에서균이분리된보고는없지만, 불명열환자 67검체중 7명 (10.4%) 이항체양성을나타냈고 [3], 다른불명열환자 283명의검체중 8명 (2.8%) 에서유전자가검출된보고가있다 [4]. 라임병은 2010 년제4군법정감염병으로지정된후 2012년강원도에서진드기에물린내원환자에서유주상홍반및발열, 오한을동반한임상증상, 역학조사및진단결과에의한라임병 발생보고가있다 [5]. Bartonellosis 는 Bartonella sp. 균에의해서사람과동물에감염되는것으로알려져있다. 국내에서 Bartonella sp. 확인은 2001 년부터 2003 년까지채집한진드기 1,979 마리 1,305 pools 에서 Bartonella 특이유전자로 5.2% 가검출되었고 [6], 림프절질환을가진 31명의환자를대상으로항체가를조사한결과 21명 (67.7%) 이 B. henselae IgG 항체에양성을나타내었고, 이중 20명 (64.5%) 에서 B. quintana IgG 항체가양성으로보고된바있다 [7]. Anaplasmosis과 Ehrlichiosis는 Anaplasmataceae family( 과 ) 에속하는 Anaplasma phagocytophilum와 Ehrlichia chaffeensis에의해감염되는질병이다. 채집된참진드기 611 pools(1,288 마리 ) 중 E. chaffeensis 유전자가

1074 제 7 권제 48 호 Figure 2. Homology comparison of Borrelia sp. FlaB gene(604bp) fragment sequences with other strains 1, B. garinii 935T; 2, B. burgdorferi 297; 3, B. afzelii 934U; 4, B. burgdorferi B31; 5, B. garinii HP3, 6, B. afzelii Y18; 7, B. afzelii HL J01; 8, B. afzelii PKO; 9, B. duttonii CR2A; 10, B. duttonii WI; 11, B. garinii BgVir; 12, B. garinii BRZ26; 13, B. garinii N318; 14, B. garinii NT29; 15, B. garinii PBi; 16, B. garinii SZ8-1; 17, B. hermsii DAH; 18, B. hermsii HS1; 19, B. miyamotoi FR64b; 20, B. parkeri CA218; 21, B. turicatae 99PE-1807; 22, tick 110; 23, tick 130; 24, tick 131. Figure 3. Homology comparison of Rickettsia sp. glta gene(590bp) fragment sequences with other strains 1, R. aeschlimannii Stavropol; 2, tick 63; 3, R. akari MK(Kaplan); 4, R. bellii; 5, R. conorii; 6, R. endosymbiont of Bemisia tabaci; 7, R. felis LI16; 8, R. felis; 9, R. heilongjjangensis CH8-1; 10, R. heilongjjangensis; 11, R. heilongjjangii; 12, R. honei; 13, R. japonica; 14, R. monacensis IrR/Munich; 15, R. parkeri At24; 16, R. prowazekii; 17, R. raoultii Elanda-23/95; 18, R. raoultii MDJ1; 19, R. rickettsii Itu.

주간건강과질병 1075 Figure 4. Homology comparison of Anaplasma sp. glta gene(180bp) fragment sequences with other strains 1, tick 109; 2, tick 129; 3, tick 146; 4, tick 149; 5, tick 158; 6, tick 159; 7, tick 160; 8, A. marginale Florida; 9, A. phagocytophilum 96HE 158; 10, A. phagocytophilum 97E13; 11, A. phagocytophilum BDS; 12, A. phagocytophilum China-C-Tt; 13, A. phagocytophilum lp11; 14, A. phagocytophilum MDJ-Hc44; 15, A. phagocytophilum NE; 16, A. phagocytophilum R33; 17, A. platys; 18, A. platys Okinawa; 19, A. playts RP. 26 pools(4.2%) 에서검출되었고, 말, 소, 고양이에서도유전자가확인되었다 [8]. 또한, 불명열환자 271명중 5명 (1.8%) 은 A. phagocytophilum 항체가양성으로, 7명 (2.6%) 은 E. chaffeensis 의항체가양성반응이확인된보고가있다 [9]. 2006년조사에의하면 1,638 pools(3,135 ticks) 에서 53 pools (3.2%) 에서 Anaplasma sp. 의유전자가 77 pools(4.7%) 에서 Ehrlichia sp. 의유전자가검출된보고가있으며, 설치류 424마리의지라 (spleen) 조직에서 Anaplasma sp. 178 마리 (41.9%), Ehrlichia sp. 85마리 (20.0%) 에서, Rickettsia sp. A. phagocytophilum China-C-Ct, A. phagocytophilum NE와 89.2% 에서 100% 로상동성이나타났다. 이러한결과는참진드기매개질환병원체들이다양하게진드기매개종내에서식하고있음을보여주는것이며, 국내에서도참진드기매개질환이유행할수있는잠재적인위험요소로여겨진다. 앞으로, 진드기매개질환유행을대비하기위해서는매개체, 병원체및국내환자분리주특성분석에대한기초연구와임상연구의협력이필요하며, 매개질환에대한정보와병원체에대한예방홍보가지속적으로수행되어야할것으로사료된다. 22 마리 (5.2%) 에서유전자가검출된보고가있다 [10]. 본조사에서도강원도와제주도에서참진드기매개질환병원체가확인되었으며, 3 pools 의 Borrelia 유전자는 B. garinii N318과 99.8% 로가장상동성이높았고, 이중 2 pools는 2012년라임병환자가발생한가평에서채집한진드기였다. 제주도에서검출된리케치아유전자는 R. heilongjjangensis 와 99.5% 로가장상동성이높았다. 강원도에서확인된 7 pools 의 A. phagocytophilum 유전자는 A. phagocytophilum BDS, IV. 참고문헌 1. Maria E. Aguero- Rosenfeld, Guiqing Wang, Ira Schwartz, Gary P. Wormser. 2005. Diagnosis of Lyme Borreliosis. Clinical Microbiol Rev. 19(3): 484-509. 2. Philippe Parola, Bernard Davoust, Didier Raoult. 2005. Tick- and Flea-borne rickettsial emerging zoonoses. Vet Res. 36:469-492.

1076 제 7 권제 48 호 3. Sunho Kee, Kyu-Jam Hwang, Hee-Bok Oh, Kyung-Seok Park. 1993. Retrospective Survey of Antibody Response against Borrelia burgdorferi in Febrile Patients in 1990. J. Korean Soc. Microbiol. 463-471. 4. Yeon-joo Choi, Seung-Hoon Han, Jin-Mi Park, Kyung-Min Lee, Eun-Mi Lee, Kyung-Hee Park. 2007. First Molecular Detection of Borrelia afzelii in Cinical Sample in Korea. Microbiol. Immunol. 51(12): 1201-1207. 5. Shinje Moon, Jin Gwack, Kyu Jam Hwang, Donghyuk Kwon, Suyeon Kim, Yoontae Noh, Jongyul Roh, E-hyun Shin, Kungjin Jeong, Wonseok Seok, Seung-Ki Youn. 2013. Autochthonous Lyme Borreliosis in Humans and Ticks in Korea. PHRP. 4(1): 52-56. 6. Chul-Min Kim, Ji-Young Kim, Ying-Hua Yi, Mi-Jin Lee, Mae-rim Cho, Devendra H. Shah, Terry A. Klein, Heung-Chul Kim, Jin-Won Song, Sung-Tae Chong, Monica L. O Guinn, John S. Lee, In-Yong Lee, Jin-Ho Park, Joon-Seok Chae. 2005. Detection of Bartonella species from ticks, mites and small mammals in Korea. J. Vet. Sci. 6(4): 327-334. 7. Chae MB, Lee JY, Kwak YG, Park SH, Lim HJ, Park SW, Chung MH, Kim MK, Kang JS. 2002. Prevalence of antibodies to Bartonella henselae and Bartonella quintana in Korean patients with Lymphadenopathy. Korean J Infect Dis. 34(5): 305-310. 8. Seung-Ok Lee, Dong-Kyeun Na, Chul-Min Kim, Ying-Hua Le, Yoon-Hee Cho, Jin-Ho Park, John-Hwa Lee, Seong-Kug Eo, Terry A.Klein, Joon-Seok Chae. 2005. Identification and prevalence of Ehrlichia chaffeensis infection in Haemaphysalis longicornis ticks from Korea by PCR, sequencing and phylogenetic analysis based on 16S rrna gene. J. Vet.Sci. 6(2): 151-155. 9. Jin-ho Park, Eun-jeong Heo, Kyoung-seong Choi, J.Stephen Dumler, Joon-seok Chae. 2003. Detection of Antibodies to Anaplasma phagocytophilum and Ehrlichia chaffeensis Antigens in Sera of Korean Patients by Western Immunoblotting and Indirect Immunofluorescence Assays. Clin Diagn Lab Immunol. 10(6); 1059-1064. 10. Chul-Min Kim, Ying-Hua Yi, Do-Hyeon Yu, Mi-Jin Lee, Mae-Rim Cho, Atul R. Desai, Smriti Shringi, Terry A. Klein, Heung-Chul Kim, Jin-Won Song, Luck-Ju Baek, Sung-Tae Chong, Monica L. O Guinn, John S. Lee, In-Yong Lee, Jin-Ho Park, Janet Foley, Joon-Seok Chae. 2006. Tick-Borne Rickettsial Pathogens in Ticks and Small Mammals in Korea. Appl Environ Microbiol. 72(9): 5766-5776.