DOI:10.5125/jkaoms.2010.36.6.460 구개형성과정에서간엽내 Smad4 매개신호전달의역할 윤지영 백진아 조의식 고승오전북대학교치의학전문대학원구강악안면외과학교실, 구강생체과학연구소, BK21사업 Abstract (J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg 2010;36:460-5) Mesenchymal Smad4 mediated signaling is essential for palate development Chi-Young Yoon, Jin-A Baek, Eui-Sic Cho, Seung-O Ko Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Institute of Oral Bioscience and BK21 program, School of Dentistry, Chonbuk National University, Jeonju, Korea Introduction: A cleft palate is a common birth defect in humans with an incidence of 1/500 to 1/1,000 births. It appears to be caused by multiple genetic and environmental factors during palatogenesis. Many molecules are involved in palate formation but the biological mechanisms underlying the normal palate formation and cleft palate are unclear. Accumulating evidence suggests that transforming growth factor β/bone morphogenetic proteins (TGF-β/BMP) family members mediate the epithelial-mesenchymal interactions during palate formation. However, their roles in palatal morphogenesis are not completely understood. Materials and Methods: To understand the roles of TGF-β/BMP signaling in vivo during palatogenesis, mice with a palatal mesenchyme- specific deletion of Smad4, a key intracellular mediator of TGF-β/BMP signaling, were generated and analyzed using the Osr2Ires-Cre mice. Results: The mutant mice were alive at the time of birth with open eyelids and complete cleft palate but died within 24 hours after birth. In skeletal preparation, the horizontal processes of the palatine bones in mutants were not formed and resulted in a complete cleft palate. At E13.5, the palatal shelves of the mutants were growing as normally as those of theirwild type littermates. However, the palatal shelves of the mutants were not elevated at E14.5 in contrast to the elevated palatal shelves of the wild type mice. At E15.5, the palatal shelves of the mutants were elevated over the tongue but did not come in contact with each other, resulting in a cleft palate. Conclusion: These results suggest that mesenchymal Smad4 mediated signaling is essential for the growth of palatal processes and suggests that TGF-β/BMP family members are essential regulators during palate development. Key words: Cleft palate, Smad4 protein, Mice, Osr2Ires-Cre [paper submitted 2010. 9. 26 / revised 2010. 12. 14 / accepted 2010. 12. 22] Ⅰ. 서론 두개안면부는인체의다른기관과는달리발생과정에서매우복잡한기관의형성과정을수반한다. 출생후관찰되는선천성기형의반이상에서두개안면부의형성장애를동반하는것으로알려져있고, 특히구순구개열 (cleft palate/lip) 은선천성기형중에가장빈발하는기형중하나이다. 일반적으로구순구개열은신생아 700-1,000 명당 1 명정도의비율로발생한다고알려져있다 1. 실제로는구순열 고승오 561-756 전북전주시덕진동 664-14 전북대학교치의학전문대학원구강악안면외과학교실 Seung-O Ko Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Chonbuk National University School of Dentistry, 664-14 Duckjin-dong, Jeonju 561-756, Korea TEL: +82-63-250-2211 FAX: +82-63-250-2089 E-mail: omfskso@jbnu.ac.kr (cleft lip) 만단독으로생기는경우와구개열 (cleft palate) 단독또는구순구개열을동반하는경우가유전학적으로구분되며역학적으로그발생빈도나남녀의발생비율, 인종간의발생비율등이다르게나타난다 1. 현재까지알려진바에따르면구개의형성은상악돌기로부터구개돌기의수직성장 (growth), 수평거상 (elevation), 구개상피의접촉및융합 (adhesion/fusion) 의단계를거치는것으로알려져있다. 구개형성의각단계에는다양한신호전달물질들이관여하는것으로알려져있으며, 이들은상피와간엽간의상호작용을통하여작용하는것으로알려져있다. Transforming growth factor (TGF)-βsuperfamily 는구개형성과정에서상피와간엽의상호작용을매개하는주요신호전달물질로잘알려져있고 2, 이들은세포의증식, 분화, 기질합성, apoptosis, 면역반응등과같이다양한세포의생리적기능을조절하는 multifunctional regulator 로알려져있다 3. Smad4 는 TGF-βsuperfamily 의세포내신호 * 이논문은 2009년도정부 ( 교육과학기술부 ) 의재원으로한국연구재단의지원을받아수행된기초연구사업임 (No. 2009-0085733). 460
구개형성과정에서간엽내 Smad4 매개신호전달의역할 전달을매개하는중심물질로잘알려져있다. TGF-βsuperfamily member 가세포막에존재하는 serine/threonine kinase 인 type I 과 type II 수용체와결합한후, Smad signaling pathway 를경유하여세포내신호를전달한다. Smad protein 은현재까지 8 종이알려져있는데, 기능에따라다음과같이 3 가지군으로분류된다. Receptor-activated Smad (R-Smad: Smad1, 2, 3, 5 and 8), common Smad (Co-Smad: Smad4), inhibitory Smad (Smad6 and 7). R-Smad 중 Smad2 와 Smad3 은 TGF-β 와 activin 에반응하나 Smad1 과 5, 8 은 bone morphogenetic proteins (BMP) signaling pathway 에서반응한다. TGF-β 나 BMP 에의해활성화된 R-Smad 들은 Smad4 와 heterodimer 를형성한후, 핵내로이동하여각각의 target gene 의발현을유도하거나억제하게된다 4. Smad4 null mouse 는초기발생과정인 E7.5-8.5 일에사망하기때문에기관을형성하는과정에서그기능을연구하는것은불가능하다. 따라서이러한한계를극복하기위해서특정조건하에서만유전자적중이일어나는 Conditional Knockout Strategy 가개발되었다 5. 그동안구개발생과정에서상피와간엽간의상호작용을알아보기위하여, 상피에서특이적으로활성을나타내는 cytokeratin-14 과신경능선기원의외배엽성간엽조직에서특이적으로활성을나타내는 Wnt1 의 promoter 를이용하여제작된 transactivator 인 K14-Cre 와 Wnt1-Cre mouse 을많이이용하고있다. 그러나 K14-Cre 는상피에서특이적으로 Smad4 가유전자를적중시키면출생할때까지살아남지만, Wnt1-Cre 는구개간엽에제한적이지않고신경능선세포기원의외배엽성간엽조직전체에서유전자적중을일으켜서배아가구개형성이전에사망하므로구개형성과정에서 Smad4 의기능을알아보는데부적합하다 6. 최근에구개형성동안구개간엽에서특이적인활성을나타내는 Osr2 를이용하여구개형성과정에서조절되는다양한생체내의조절기전을알아보기위하여, 2.3 kb 의프로모터를갖는 Osr2Ires-Cre transgenic mouse 가제작되었다 7,8. 따라서본연구에서는구개형성과정에서 Smad4 의역할을알아보기위하여, Osr2Ires-cre mouse 를이용하여구개간엽에서 Smad4 를제거한조직특이적유전자적중생쥐를제작하고표현형을분석하였다. 1. 연구대상 Ⅱ. 연구대상및방법 구개간엽에서특이적으로 Smad4에대한유전자적중을실시하기위하여, Smad4 conditional allele mouse인 Smad4 C/C mouse 9 와 Osr2Ires-Cre mouse 8 를사용하였다. Smad4 C/C mouse와 Osr2Ires-Cre mouse를교배하여osr2ires-cre: Smad4 C/+ mouse를얻고이를다시smad4 C/C mouse와교배하여구개간엽에서 Smad4가불활성화된 mutant mouse인 Osr2Ires-Cre:Smad4 C/C mouse를생성하였다. 구개상피에서 Smad4를적중시킨 mouse의표현형과비교분석를실시하기위하여, K14-Cre mouse (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) 를이용하여 K14-Cre:Smad4 C/C mouse를생성하였다. 2. 연구방법 1) Genotyping Mouse 와배아의 genotype 은각각꼬리또는양막으로부터 genomic DNA 를추출하고유전자특이적 primer 를사용한 polymerase chain reaction (PCR) 을시행하여확인하였다 8,9. 2) Skeletal Staining Skeletal stain 은 Martin 등 10 이기술한방법에따라시행하였다. 신생생쥐의머리조직을얻은후에 3 차증류수에하룻밤동안 incubation 하였다. 다음날 70 water bath 에서 5 분간가열한후피부조직을벗겨내고 100% 알코올에서 3 일동안반응후, Alcian blue stain solution (Alcian blue 8GX 15 mg, 95% ethanol 80 ml, glacial acetic acid 20 ml) 으로 8-12 시간염색하였다. 시간이경과한후에 100% 알코올을이용하여하룻밤동안실온에서반응시킨후세척하고 2% KOH 를이용하여 6 시간동안투명화를실시하고 Alizarin Red (50 mg/l of 2% KOH) 를이용하여 3 시간동안연골과뼈의구분을위한대조염색을실시하였다. 대조염색을마친후에 2% KOH 와 glycerol 를이용하여다시투명화과정을실시하고실체현미경으로관찰하였다 11. 3) Histology 유전자적중에따르는구개의조직학적이상유무를확인하기위하여, 생쥐의배아에서구개형성이진행되는시기인 E13.5, E14.5, E15.5 일에해당되는임신된생쥐를희생하여배아를얻었다. 각각배아의유전형은양막으로부터분리한 genomic DNA 를이용한 PCR 을시행하여확인하였다. 배아는어미로부터신속하게분리하고 4% paraformaldehyde 로 4 에서 16 시간동안고정하였다. Genotype 결과 wild type 과 mutant 로확인된배아는 phosphate-buffered saline (PBS) 로수세한후통상적인방법에따라파라핀에포매한후회전식박절기를이용하여 5 μm 두께의연속절편을만들고슬라이드에부착시켜 hematoxylin-eosin 염색을실시하고광학현미경으로관찰하였다. Ⅲ. 결과 Osr2Ires-Cre mouse 를이용하여구개간엽에서 Smad4 를유전자적중시켰을때, mutant mouse 는구개의융합이실패하여 cleft palate 가나타나고출생후 24 시간내에사망하였다. 뿐만아니라 mutant mouse 는크기가작고사지가굽어있었으며 open eyelid 등을표현형으로나타내었다. Skeletal 461
J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg 2010;36:460-5 stain 과조직학적검사를실시하여구개의형태학적특징을관찰한결과, 간엽에서 Smad4 의유전자적중의결과로구개를형성하는뼈중구개골의수평돌기가형성되지못하여 cleft palate 가나타남이확인되었고, 조직학적표본에서도 cleft palate 와 open eyelid 가뚜렷하게관찰되었다.(Fig. 1) 이와같이 Smad4 유전자적중에의해서생기는 cleft palate 가구개형성과정중어느단계에서이상이발생하는지를알아보기위해서, 구개형성시기인 E13.5, E14.5, E15.5 일의배아를대상으로조직학적관찰을실시한결과, 구개선반이성장하는시기인 E13.5 일의배아에서는구개돌기의성장에있어서조직학적으로는 wild type 에서와큰차이를보이지않았다. 그러나구개돌기가수평으로올라가는시기인 E14.5 일의배아에서 wild type mouse 의구개돌기는정상적으로서로를마주보며올라가구개형성에문제가생기지않았지만, mutant 에서는구개돌기가올라가지못하고 E13.5 일의배아에서와같이여전히아래를향해있었다. 또한접합과융합이일어나는시기인 E15.5 일의배아에서 wild type 인경우에는양측의구개돌기의접합과융합이정상적으로이루어져완성된구개를형성한반면에 mutant 에서는구개돌기의올라가지못하고 cleft palate 가생기는것을알수있었다.(Fig. 2) 이와같은소견으로볼때, Osr2Ires-Cre mouse 를이용하여구개간엽에서 Smad4 유전자를적중하였을때구개돌기의거상이정상적으로일어나지못함에따라구개돌기의접합및융합이일어나지못함을확인하였다. 위와같은연구결과로구개간엽에서 Smad4를매개로하는신호전달은구개의형성과정에서필수적인역할을수행하고있다는것을알수있었는데본연구에서는이러한 Smad4의역할이구개간엽에서만특이적인지를확인하고자구개상피에서도특이적으로 Smad4를유전자적중을실시하여비교해보았다. 구개상피에서특이적인활성을나타내는 K14-Cre mouse를이용하여 Smad4를구개상피에서유전자적중을실시한결과, 간엽에서의유전자적중결과와는달리구개가정상적으로형성되었다. 이와같은결과로보아구개형성과정에서 Smad4를매개로하는신호전달은구개상피에서는크지않을것으로판단된다.(Fig. 3) 결과적으로 TGF-βsuperfamily의 mediator인 Smad4 유전자를 Osr2Ires-Cre mouse를이용하여간엽에서유전자적중하였을때, 구개돌기의성장시기인 E13.5일에는변화가없었지만구개돌기가올라가는시기인 E14.5일에는구개선반이올라가지않아 cleft palate가초래되었다. 따라서구개골기의간엽에서 Smad4를매개로하는 TGF-β신호전달은정상적인구개의형성에매우중요한역할을수행함이확인되었다. 또한 K14-Cre를이용하여 Smad4 유전자를상피에서제거하였을때에는정상적으로구개가형성되지만 Osr2Ires-Cre를이용하여간엽에서유전자적중을하였을때에 cleft palate가나타나는것으로보아 TGF-βsuperfamily의 mediator인 Smad4 유전자는구개형성과정에서상피에서보다는간엽에서중요한역할을수행하는것으로생각된다. Fig. 1. Phenotypes of Osr2Ires-Cre mediated Smad4 conditional knockout mouse at birth. In contrast to heterozygous littermates A, B, E, mutant mice were born with open eyelid and complete absence of palatal bone C, D, F. In histological analysis, cleft palate (arrow) and open eyelid (*) was found in the mutant F. 462
구개 형성과정에서 간엽 내 Smad4 매개 신호전달의 역할 Fig. 2. Histological features of palate in Osr2Ires-Cre mediated Smad4 conditional knockout mouse during palatogenesis. At E13.5, palatal shelves both of mutant and heterozygous littermates showed inferomedial direction A, B. At E14.5, palatal shelves of heterozygous mice elevated and fused each other C but those of mutant showed vertical orientation D. At E15.5, palatal processes were fused in heterozygous, whereas complete cleft palate were shown in mutant mice E, F. Fig. 3. Comparison of tissue specific Smad4 conditional knockout mice in the epithelium or mesenchyme of palatal shelves using K14-Cre or Osr2Ires-Cre mice. Palate was formed normally in the wild type and K14-Cre mediated Smad4 conditional knockout mice A, B, D, E but complete cleft palate was found in the Osr2Ires-Cre mediated Smad4 conditional knockout mouse C, F. Note asterisk marked absence of palatal bone and arrows indicate the medial border of palatal bones. 463
J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg 2010;36:460-5 Ⅳ. 고찰 본연구에서는구개형성과정에서상피와간엽의상호작용을매개하는 TGF-βsuperfamily 의역할을알아보기위하여, 구개간엽에서특이적으로 Smad4 유전자를적중시킨생쥐를생성하고유전자적중에따르는구개에서의표현형을확인하였다. 구개의형성과정에서 2 차구개는상악돌기로부터형성되는구개선반의성장, 거상, 그리고구개돌기상피의접촉및융합의단계를거치게된다. 이와같은구개의형성은상피와간엽간의상호작용을통해이루어지는것으로알려져있으며다양한신호전달물질들이구개상피와간엽간의상호작용을조절하는것으로알려져있다 11. 현재까지생쥐를대상으로한유전자적중의결과로 cleft palate 를표현형으로나타내는유전자들이많이보고되어왔으며, 이들은분비단백질또는각각의수용체이거나다른단백질의합성을조절하는전사인자들이대부분이다. 현재까지생쥐에서유전자적중에따라 cleft palate 를표현형으로보고된분비단백질과각각의수용체로는 Bmp, Bmp type1 receptor, Fgf10, Fgfr2b, Shh, Gabrb3, Tgfb3, Tgfbr2, Tgfbr2 등이있고, 전사조절인자로는 Msx1, Osr2, p63, Pitx2, Satb2, Shox2 등이알려져있다. 이들은구개의형성과정에서세포의증식, apoptosis 그리고구개돌기의성장과부착등에영향을주는것으로알려져있다 12-21. 이들중특히 TGF-βsuperfamily 의신호전달이 2 차구개의형성과정에서핵심적인역할을수행하고있는것으로보고되었다 11. 본연구에서는구개의형성과정에서필수적으로일어나는상피와간엽간의상호작용조절과정에서 TGF-βsuperfamily 의신호전달과정을이해하기위하여, 구개간엽과구개상피에서 Smad4 를선택적으로적중한생쥐를제작하여표현형을분석하였다. 연구결과, 구개간엽에서특이적으로 Smad4 유전자를적중한생쥐에서는구개선반의성장과거상이정상적으로일어나지못하여 cleft palate 가유발됨을확인하였다. 그러나이와는달리구개상피에서 Smad4 유전자를적중한생쥐에서는정상적으로구개가형성됨을확인하였다. 이와같은결과는구개형성과정에서구개상피에서보다는구개간엽에서 Smad4 를매개로하는신호전달이정상적인구개의형성에필수적임을시사한다. 일찍이구개형성과정동안에구개상피에서특이적으로발현되는 TGF-β3 유전자를적중한생쥐의구개형성과정에서구개돌기의융합실패로인한 cleft palate 가유발됨이보고된바있어서 12 구개상피에서의 TGF-β 신호전달이정상적인구개형성에서중요한역할을수행하는것으로여겨져왔으나본연구결과에서와같이상피보다는간엽에서 Smad4 를매개로하는신호전달이구개의형성과정에서핵심적인역할을수행함을확인하였다. 구개의형성과정에서상피와간엽의상호신호전달과정을이해하기위해, 구강상피와구개간엽에서특이적으로 유전자적중을시도하고생성된 mutant mouse 의표현형을분석한연구보고들은대부분이 TGF-βsuper family 의수용체를대상으로한보고들이대부분이었다. Ito 등 20 은 Wnt1- Cre mouse 를이용하여간엽에서특이적으로 TGFbr2 를적중하고표현형으로 cleft palate 와두개골의형성부전이나타남을보고한바있으나, Xu 등 21 은 K14-Cre mouse 를이용하여상피에서 TGFbr2 를적중시킨생쥐를생성하고분석한결과연구개에서의부분적인 cleft 가나타남을보고한바있다. 또한 Liu 등 14 은상피에서특이적으로유전자를적중한결과 BMPR1A 를경유하는신호전달이정상적인구순과구개의형성에서필수적인역할을수행함을보고하였다. 이와같은연구보고들을살펴보면 TGF-βsuperfamily 는구개간엽보다는구개상피에서차단되었을때정상적인구개의형성이차단되며, 구개간엽에서의신호전달차단은연구개나구개점막에서의부분적형성이상만을표현형으로나타내었다. 비록이들연구에서조직특이적유전자적중을시도하기위한 transactivator 가본연구에서사용한것과는차이가있지만이와같은현상은구개상피나구개간엽독자적인신호전달의이상에의한결과라기보다는구개형성과정에서상피와간엽간의상호작용이존재하며이와같은상호작용을매개하는신호전달이구개간엽에서주로일어남을시사한다. 향후다양한 marker 를이용한분자발현변동에관한실험을수행함으로써구개형성과정에서일어나는상피와간엽간의상호작용과이를조절하는신호전달과정을밝혀낼수있을것으로사료된다. Ⅴ. 결론 구개형성과정에서는많은신호전달물질들이관여하고있으며, 이들은구개돌기의수직성장, 수평거상, 구개상피의접촉및융합을달성하기위하여상피와간엽간의상호작용을매개함으로써핵심적인역할을수행한다. 본연구에서는구개형성과정에서 TGF-βsuperfamily 의핵심적인세포내신호전달매개체인 Smad4 가간엽에서의신호전달과정에서결적적인역할을수행함고있음을확인하였다. 결론적으로 Smad4 를매개로하는 TGF-βsuperfamily 의신호전달은정상적인구개의형성과정에있어서매우중요한역할을하고있으며상피에서보다는간엽에서더욱중요한역할을수행하는것으로생각되고이는구개형성과정에서상피 - 간엽상호작용을매개하는신호전달이구개간엽에서주로일어남을시사한다. References 1. Marazita ML, Field LL, Cooper ME, Tobias R, Maher BS, Peanchitlertkajorn S, et al. Genome scan for loci involved in cleft lip with or without cleft palate, in Chinese multiplex families. Am J Hum Genet 2002;71:349-64. 2. Gritli-Linde A. Molecular control of secondary palate develop- 464
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