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J Korean Surg Soc 2010;79:1-7 DOI: 10.4174/jkss.2010.79.1.1 원 저 피부화상치유에서줄기세포표지자의면역조직화학적발현에관한연구 한림대학교의과대학병리학교실, 1 생화학교실, 2 외과학교실 최영희ㆍ김민규ㆍ안동현ㆍ조성진ㆍ홍수희 1 ㆍ이재용 1 ㆍ이진원 2 ㆍ김해성 2 Immunohistochemical Expression of Stem Cell Markers during the Wound Healing Process of Cutaneous Burn Young Hee Choi, M.D., Min Gyu Kim, M.D., Dong-Hyun Ahn, M.D., Seong Jin Cho, M.D., Soo Hee Hong 1, Jae-Yong Lee, Ph.D. 1, Jin Won Lee, M.D. 2, Hae Sung Kim, M.D. 2 Departments of Pathology, 1 Biochemistry and 2 Surgery, College of Medicine, Hallym University, Chuncheon, Korea Purpose: A cutaneous wound healing requires a well-orchestrated integration of the complex biological and molecular events of cell migration and proliferation, extracellular matrix deposition, angiogenesis and remodeling. Finally, skin regeneration is the main goal. Stem cells are self-renewing multipotent progenitors with the broadest developmental potential in a given tissue at a given time. The aim of this study was to examine the role of stem cells during the wound healing process of cutaneous burn in hairless mice by using immunohistochemical stainings (nestin, cytokeratin 15 and CD31). Methods: Each mouse received 2 burns at the dorsal area by applying a metal stick heated in boiling water. Burn wound sites were dressed with duoderm. The mice were sacrificed at 0, 2, 7, 14 and 21 days after burn. Histological findings and immunohistochemical expression for stem cell markers were observed. Results: Nestin was expressed in the stromal cells beneath the epidermis, hair follices, dermal cysts and endothelial cells. Cytokeratin 15 was expressed in the epidermis except in basal cells. On 7 and 14 days after burn, the regenerated epidermis didn't express cytokeratin 15. CD31 was expressed in the endothelial cells on 7 and 14 days after burn. The amount of nestin expression was the highest. Conclusion: Our results showed that nestin may have various effects on burn wound healing. Cytokeratin 15 was expressed before burn and after burn. It is likely that other cytokeratin may stimulate epithelial regeneration. CD31 may act in vascular regeneration during burn healing. (J Korean Surg Soc 2010;79:1-7) Key Words: Hairless mouse, Burn, Wound healing, Stem cell 중심단어 : 무모쥐, 화상, 상처치유, 줄기세포 서 론 책임저자 : 김해성, 강원도춘천시교동 153 번지 200-704, 한림대학교춘천성심병원외과 Tel: 033-240-5179, Fax: 033-243-6413 E-mail: biogra@hallym.or.kr 접수일 :2010 년 1 월 5 일, 게재승인일 :2010 년 3 월 23 일 창상치유의궁극적인목표는반흔을최소화하면서조기에창상이닫히도록하는것이다. 임상적으로창상치유란창상이닫히는과정을의미하며이는상피화, 세포외기질의침착, 창상수축등으로설명된다. 조직학적으로는지혈단계, 염증단계, 증식단계, 성숙단계를거치면서다양한 1

2 J Korean Surg Soc. Vol. 79, No. 1 세포들과성장인자들이작용한다. 부가적으로줄기세포의발현으로피부재생과정이진행된다. 화상을입게되면화상으로조직에변성이오면서치유과정과같이병행된다. 줄기세포발현이피부재생에관여한다고생각하지만화상치유과정에서줄기세포의발현에관한보고가없다. 이에저자들은무모쥐에서심부 2도화상을유발한후화상치유과정을조직학적으로관찰하고, 줄기세포의표지자에대한면역조직화학염색 (immunohistochemical stain) 을시행하여줄기세포들이어디서발현하는지관찰하여화상의치유과정을이해하고자하였다. 방법 1) 동물 동물윤리위원회규정과동물실험관련법규 (Hallym 2008 2009) 에따라동물을보호하고실험하였다. 25 30 g 무게의수컷무모쥐를각군별로 5마리를사용하였고, 실험기간중사육실환경은 23±2 o C, 상대습도 55±10% 를유지하였다. 12시간인공조명하에서마우스용케이지에 4마리씩넣어사육하였으며, 실험동물용사료및식수는자유로이공급하였다. 2) 심부 2도화상유도및드레싱 70% 아산화질소와 30% 산소가섞여있는기체에 2% 이소플루란 (isoflurane) 을무모쥐에흡입시켜마취를유도한 후 1% 이소플루란농도로마취를유지시키면서화상을유도하였다. 지름 1 cm의둥글납작한쇠막대기를끓는물에넣어서가열한후무모쥐의등양쪽에 10초간두어서화상을입혔다. 조직학적으로심부 2도화상을확인하였다 (Fig. 1). 화상을입힌 2시간후, 2일, 7일, 14일, 21일후에각각 5 마리씩희생하였다. 동물들은모두경추탈골한후화상부위의피부조직을채취하였다. 채취한피부조직은가운데를잘라서 hematoxylin & eosin (H&E) 염색과면역조직화학염색을위하여 10% 중성포르말린용액에 10시간고정하였다. 3) 조직학적검사파라핀블록을만들어서 5μm 두께로연속절편을제작하였고일부는통상적인 H&E 염색을실시하여광학현미경으로관찰하였다. 그리고일부는면역조직화학염색을하였다. 광학현미경으로는아래의목록들을관찰하였다. (1) 염증세포침윤도 (cellularity): 화상부위에상피와나란하게침윤된염증세포를관찰하였는데, 화상장경을기준으로화상장경의 ⅓ 이하는 1, ⅓ ½ 이하는 2, ½ ⅔ 이하는 3, ⅔ 1이면 4로하였다. (2) 근육층의위치 (location of muscle layer): 화상부위의근육층이주위정상부위의근육층보다위에있으면 2, 그대로이면 0, 내려가있으면 2로하였다. (3) 이물질반응및염증세포군집의수 (number of inflammatory foci): 200배시야에서이물질반응숫자와염증세포 Fig. 1. Structures of normal and burned skin in hairless mice. (A) Normal skin showed the epidermis and dermis. (B) After burn, epidermis and most dermis were damaged. However, the lower part of dermal cyst was still intact as second-degree burn wound demonstrated (H&E, 40).

Young Hee Choi, et al:immunohistochemical Expression of Stem Cell Markers during the Wound Healing Process of Cutaneous Burn 3 군집의수를세었다. (4) 육아조직의양 (amount of granulation tissue): 100배로관찰하였을때, 모세혈관이흩어져있으면 1, 100배시야면적의 ⅓ 이하이면 2, ⅓ ½ 이하면 3, ½ ⅔ 이하면 4, 100배시야전체이면 5, 1 1⅓ 이하이면 6, 1⅓ 1½ 이하이면 7, 1½ 2배이면 8로하였다. 이와같은방법으로점수를준다. (5) 재생상피의길이측정 (length of regenerated epithelium): 재생상피는정상상피보다 4층이상으로두꺼워진상피로하였다.(1) 재생상피의길이가 100배시야의장경의 ⅓ 이하면 1, ⅓ ½이면 2, ½ ⅔이면 3, ⅔ 1이면 4, 1⅓ ½ 이면 5, 1½ ⅔이면 3, 1⅔ 2이면 8로측정하였다. 4) 면역조직화학염색 (immunohistochemical stain) 파라핀블록절편으로면역조직화학염색을실시하였다. 일차항체로 rabbit Nestin (1:4,000, ab 5968, abcam, Cambridge, UK), rabbit keratin 15 (1:200, NB 100-91841, Novus Biologicals, Litteleton, CO, USA), rabbit anti-cd31 (ab59251, abcam, Cambridge, UK) 을사용하였고, 면역조직화학염색은 Polink-2 plus Rabbit DAB kit를사용하였다. CD31은세포막, nestin은세포질, keratin 15는세포질에서발현한것을양성으로하였고, 화상부위와주위정상부위의진피낭 (dermal cyst) 에서의발현을관찰하였다. 5) 통계분석모든자료의분석은 SAS (version No. 9.1) 통계프로그램을이용하였고, 지표간의상관관계는 Pearson χ 2 test, Duncan's multiple range test로검정하였으며, 유의수준은 0.05 이하로하였다. 결과 1) 염증세포침윤도 염증세포들은주로화상부위에두꺼운띠모양으로침윤하였는데상피와평행하게침윤하였다. 염증세포의침윤은화상후 2일에가장많이침윤하였다 (2.25±1.36). 0일에는전혀없어서, 0일과비교하여, 2일, 7일, 14일의발현은통계학적으로유의하게증가하였고, 2일과 7일에비교하여, 14 일 (0.5±0.55) 에는유의하게감소하였다 (Table 1). 주위정상부위에서는관찰되지않았다. 2) 근육층의위치화상후 7일부터화상부위의근육층이주위의정상근육층보다올라가서 14일에도유지되었다. 21일에는육아조직및진피조직이생겼으나근육층은올라가있어서흉터수축이관찰되었다. 3) 염증세포군집의수화상부위에서염증세포의군집은 2일째생기기시작하여 7일 (15.56±1.97) 과 14일 (15.17±7.46) 에가장많이관찰되었고, 통계적으로유의하였다. 21일 (8.27±3.92) 에는유의하게감소하였다 (Table 1). 4) 육아조직의양화상후 7일부터화상부위에서육아조직을관찰할수있었다. 육아조직은 14일에가장많이생성되었으며, 7일 (4.33±0.49), 14일 (6.00±1.48), 21일 (2.93±1.49) 의육아조직의양은통계학적으로상호간에유의한차이를보였다 (Table 1). Table 1. Histologic changes in dressed wounds at 2, 7, 14 and 21 days after burn Dressing (day) Cellularity Location of muscle layer Histologic criteria No. of inflammatory foci Amount of granulation tissue Length of regenerated epithelium 0 0 f 0 a 5.75±2.53 c 0 d 0.50±1.73 c 2 2.25±1.36 a, b, c 0 a 8.83±6.31 b 0 d 1.25±0.45 b, c 7 1.67±1.75 b, c 2 b 15.56±1.97 a 4.33±0.49 b 4 a 14 0.5±0.55 d, e 2 b 15.17±7.46 a 6.00±1.48 a 5 a 21 8.27±3.92 b 2.93±1.49 c *Duncan's multiple range test: Means with the same letter are not significantly different. Means with the different letter are significantly different (P<0.05).

4 J Korean Surg Soc. Vol. 79, No. 1 5) 재생상피의길이측정재생상피는화상후 2일 (1.25±0.45) 부터관찰되었고, 14일 (5.00) 에는가장길었다 (Table 1). 그러나, 21일에는화상부위가완전히재생상피로덮여서길이를잴수가없었다. 6) Nestin 발현 (Fig. 2) 정상피부에서는모낭과진피낭주위상피세포의세포질에발현하였으며상피바로아래기질세포에서도발현하였다. 표피피지샘혹은모낭바닥, 표피낭, 진피내의털줄기 (hair shaft) 바닥등에서도발현하였다. 화상부위의모낭주위에서는화상당일과 2일후의 nestin 발현이비슷하였지만 7일에는현저하게감소하였다. 21일에 35% 로증가하였으나통계적인유의성은없었다. 화상부위의진피낭에서는화상당일보다 2일, 7일에 nestin의발현이감소하였으나, 21 일에는 95% 에서관찰되었다. 통계적으로유의하게증가하 였다. 화상주변조직의모낭주위에서 14일에 nestin의발현이약간증가하였으나, 전체적으로는감소하는추세였고, 진피낭주변에서발현하는 nestin은통계학적으로유의하게감소하였다. 화상부위의육아조직의내피세포에서도발현하였는데, 7일과 14일에가장많이발현하였다. 7) Cytokeratin 15 (CK15) 의발현 (Fig. 3) 세포질에발현하였다. 정상표피세포의기저세포에는염색되지않았고, 기저세포위의각질형성세포에서발현하였다. 정상부위의표피낭과털줄기, 모낭과진피낭에서발현하였는데, 기저세포에는발현하지않았다. 화상부위의모낭과진피낭에서는화상후 2일에발현이감소하였다가, 7 일에증가하였으며 14일에다시감소하였다. 재생표피세포는화상후 7일에선명하게보였는데 CK15의발현은감소되어있었고, 14일에도발현되지않았다. 21일에는재생표피가완전히서로붙었는데이때다시 CK15가발현하였다. Fig. 2. Immunohistochemistry for nestin. Expression of nestin protein is present in the cells below the epidermis (A), the outer cells of epidermal cyst (B) and endothelial cells of the granulation tissue (C).

Young Hee Choi, et al:immunohistochemical Expression of Stem Cell Markers during the Wound Healing Process of Cutaneous Burn 5 Fig. 3. Immunohistochemistry for cytokeratin 15. Expression of cytokeratin 15 is present in suptrabasal area of epidermis (A). At 7 days after burn, the expression of cytokeratin 15 was not present in regenerated epidermis (arrow). Fig. 4. Immunohistochemistry for CD31. Expression of CD31 is present in endothelial cells in 7 days after burn. 8) CD31 의발현 (Fig. 4) 세포막에발현하였고, 화상부위및화상주변정상부위의혈관내피세포에서발현하였는데, 화상 0일, 2일과 21일에는발현을관찰할수없었고, 화상 7일및 14일에발현이관찰되었다. 고 무모쥐는조직학적으로모낭이첫번째순환의퇴행기에서비정상으로발육하였는데, 퇴행하는과정이잘못되어서털이발육하지못하는것으로생각된다. 특징적인구조는 찰 두가지로타원낭 (utriculus) 와진피낭이다. 타원낭은과다각화가있는상피를가진팽대모양 (ampuliform) 의구조물로피부와연결이있으며, 털줄기의깔때기 (infundibulum) 에서기원한것으로보인다. 진피낭은깊은진피에있으며표피와연결이없다. 이낭은각화된상피로내층을형성하며피지세포가벽에있을수도있다. 이낭은털망울조상세포에서기원한것으로보고되었다.(2) 무모쥐는창상치유에대한연구에유용한동물이다. 털을깎을필요도없고, 털을깎으면서생기는염증도없으며, 털이없기때문에창상치유과정을관찰하는데용이하다. 털이있는쥐와같이창상치유과정중에생기는염증 ( 응혈및백혈구의침윤 ), 세포의생성과증식 ( 상피재생, 섬유증식, 신생혈관생성 ), 조직재형성 ( 흉터형성 ) 의전과정을무모쥐에서도관찰할수있다고한다.(2) Nestin은신경기원세포-모낭돌출부에있는세포-의표지자로알려져있는데 Li 등 (3) 은모낭돌출부세포, 부리집외층 (outer root sheath) 세포, 피지샘의기저세포에서 nestin과함께 CK5/8 및 CK15가동시에발현하였다고보고하였다. 이는모낭세포와신경줄기세포사이에어떤연관성이있을것으로보이며 nestin을발현하는세포가신경줄기세포로서뿐만아니라모낭줄기세포의역할도하는것으로제안하였다. 본실험에서 nestin은상피바로아래기질에서발현하였고, 모낭주위와진피낭주위에서발현하였다. 육아조직의내피세포뿐만아니라표피피지샘혹은모낭바닥에서도발현하였다. Nestin 발현하는모낭줄기세포는모줄기 (hair shaft) 주위에서발현하면서짧은수상돌기 (dendrite) 로서로

6 J Korean Surg Soc. Vol. 79, No. 1 연결되어있었다고하고, nestin을발현하는세포는부리집외층을형성하였다.(4) Nestin을발현하는모낭의줄기세포는신생혈관을성장혈관의숫자도증가시켰으며, 내피세포특이적인표지인 CD31과 von Willebrand factor도발현하였다.(5) 또한신경조직, 신경교세포, 평활근, 멜라닌세포로분화할수있었다고한다.(6) 본실험에서 CK15의발현은무모쥐의표피세포에서는기저세포에는염색되지않았고, 기저세포상부의각질형성세포에서발현하였다. 각질세포는 keratin intermediate filaments를발현하고있는데기저세포층은 CK5와 CK14가발현하고, CK1과 CK10은초기저세포층에서발현한다. 모낭줄기세포는이미언급한 CK5와 CK6, CK16, CK17이발현한다. 최근에는 CK15가모낭의팽대부위에서발현하여 CK15를줄기세포의표지자로인정하였다. CK15의촉진자 (promoter) 는쥐의모낭의팽대부에서활성화되었으며, CK15의면역염색은신생아의포피에서기저세포에서고르게염색되었다고한다.(7) 식도에서그리고신생쥐의식도에서 CK15가기저세포상부에서발현한다고하여서, 무모쥐의표피에서의 CK15의발현양상은식도나신생쥐의식도표피에서같았다.(8) 본실험에서는, CK15의단백질발현이화상주변정상부위의표피낭과털줄기, 모낭과진피낭의편평상피세포에서발현하였다. 그러나기저세포에는발현하지않았다. 화상부위의모낭과진피낭에서는화상후 2일에, CK15의단백질발현이감소하였다가, 7일에증가하였으며 14일에다시감소하였다. 재생표피세포는화상후 7일에선명하게보였는데 CK15의발현은감소되어있었고, 화상후 14일에도발현되지않았다. 21일에는재생표피가완전히서로붙었는데이때다시 CK15가발현하였다. Werner와 Munz(9) 에따르면, 일반 mice에서표피전층제거손상후치유과정중에서 CK15 mrna 발현이손상후첫 3일간의미있게감소하였고, 7일후에도계속감소된상태였다고하는데, 이는 CK15 단백질의합성이감소되었음을의미한다. 또한, 손상부위에표피가재생되어회복이되었을때 CK15 mrna가정상적으로발현하였다고하고, 육아조직바로위의두꺼워진활성화된표피세포에서 CK15의발현이상당히감소하였다. 그러나, 손상부위주위의정상표피에서는계속발현하였다.(8) 우리실험에서도, 재생표피세포에서는 CK15의발현이감소되었는데, 이는 Werner와 Munz(9) 에의하면 TNF-alpha, EGF, KGF가손상부위에많이증가하여 CK15의발현을억제시켰다고하였다. 또한 CK14의발현은손상이치유되는과정중에증가하였다고한다. 손상부위의치유중에손상주위의각질세포는모양도변하고이주하며, keratin의발현도변하였다고하며, 각질세포의세포배양에서도 CK14는계속발현하였지만, CK15은세포들이중층화가될때까지발현하지않았다고한다. CK14는모든각질세포들의기본적인물질인반면, CK15는성숙한기저세포와밀접한연관이있는것으로생각된다. 그러나성숙한쥐가되면기저세포에국한해서발현한다고하였다. Porter 등 (8) 에의하면빠르게분열하는편평상피세포나, 손상부위의편평상피세포혹은편평상피세포암에서 CK15은발현하지않았고, 기저세포에서도성숙하고안정되어있는세포에서만발현함으로보아, CK15은기저세포를안정화하고, 조직구조를유지하는기능을하는것으로생각된다. 즉 CK15은줄기세포표지자이지만, 성숙한표피세포에서는기저세포에만발현되는것으로보인다. 본실험에서는무모쥐의기저세포상부에서발현하였다. 피부손상이생기면 CK15가감소하지는않지만, 재생된표피세포에는발현하지않고있다가완전히표피가생기게되면발현하였다. CD31은혈소판내피세포접착분자-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule-1) 로서 130 kda의당단백질로로면역글로불린상과 (immunoglobulin superfamily) 의한종류이며많은혈액조성세포와내피세포에서발현한다 CD31은다양한혈액조성세포의표면에발현하며골수전구세포들을혈관에서골수로이주하도록도와준다고한다.(10) Nogami 등 (11) 은 Sprague-Dawley rat에절개손상을냈을때, CD31의발현이혈관이손상후 1일과 3일에는보이지않았고, 5과 7일에손상부위에서관찰되었다고하였다. 신생혈관은표피에수직으로놓여있었으며, 손상후 14일에는 CD31 양성인혈관들이수직방향을보이지않고흩어져있었고 28일후에는대조군과비슷한양상이되어있었다고한다. Shimamura 등 (12) 은 mice의피부를전층으로절제한후상처부위의치유과정을관찰하였을때, 육아조직은 5일부터관찰되었고, CD31 양성인신생혈관도관찰할수있었다고한다. 또한 9일째혈관숫자가가장높았고, 11일째재생된표피가완전히덮었으며 15일째는감소하였다고한다. 본실험에서는 CD31은화상후 7일, 14일에혈관의내피세포에서발현하였다.

Young Hee Choi, et al:immunohistochemical Expression of Stem Cell Markers during the Wound Healing Process of Cutaneous Burn 7 결 무모쥐의화상치유과정을, 화상을입힌후 2, 7, 14 및 21일에희생하여조직학적으로관찰하였고, 줄기세포의표지자인 nestin, CK15, CD31의단백질발현을면역조직염색을통하여관찰하였다. 염증세포침윤은화상후 2일에가장많이침윤하였으며, 육아조직은 14일에가장많이생성되었다. 재생상피는화상후 2일부터관찰되었고, 21일에는양측에서재생된상피가서로융합되어서화상부위가덮여있었다. Nestin은진피에서다양한구조물에서발현하여다양한방향으로분화하면서치유과정을돕는것으로생각되며, cytokeratin 15은표피의재생시기에는발현되지않고, 재생이된후안정화시기부터발현되는것으로보아, 표피의재생을돕는다른 cytokeratin을찾는연구가추가되어야하리라생각된다. 그리고 CD31은화상의치유과정중에육아조직이생기는 7일과 14일에혈관내피세포에서발현하므로혈관의재생을돕는것으로생각된다. 론 REFERENCES 1) Zhu H, Wei X, Bian K, Murad F. Effects of nitric oxide on skin burn wound healing. J Burn Care Res 2008;29:804-14. 2) Benavides F, Oberyszyn TM, VanBuskirk AM, Reeve VE, Kusewitt DF. The hairless mouse in skin research. J Dermatol Sci 2009;53:10-8. 3) Li L, Mignone J, Yang M, Matic M, Penman S, Enikolopov G, et al. Nestin expression in hair follicle sheath progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:9958-61. 4) Morris RJ, Liu Y, Marles L, Yang Z, Trempus C, Li S, et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat Biotechnol 2004;22:411-7. 5) Amoh Y, Li L, Yang M, Moossa AR, Katsuoka K, Penman S, et al. Nascent blood vessels in the skin arise from nestin-expressing hair-follicle cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101:13291-5. 6) Amoh Y, Li L, Katsuoka K, Penman S, Hoffman RM. Multipotent nestin-positive, keratin-negative hair-follicle bulge stem cells can form neurons. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102:5530-4. 7) Webb A, Li A, Kaur P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation 2004;72:387-95. 8) Porter RM, Lunny DP, Ogden PH, Morley SM, McLean WH, Evans A, et al. K15 expression implies lateral differentiation within stratified epithelial basal cells. Lab Invest 2000;80: 1701-10. 9) Werner S, Munz B. Suppression of keratin 15 expression by transforming growth factor beta in vitro and by cutaneous injury in vivo. Exp Cell Res 2000;254:80-90. 10) Ross EA, Freeman S, Zhao Y, Dhanjal TS, Ross EJ, Lax S, et al. A novel role for PECAM-1 (CD31) in regulating haematopoietic progenitor cell compartmentalization between the peripheral blood and bone marrow. PLoS One 2008;3:e2338. 11)Nogami M, Hoshi T, Arai T, Toukairin Y, Takama M, Takahashi I. Morphology of lymphatic regeneration in rat incision wound healing in comparison with vascular regeneration. Leg Med (Tokyo) 2009;11:213-8. 12) Shimamura K, Nakatani T, Ueda A, Sugama J, Okuwa M. Relationship between lymphangiogenesis and exudates during the wound-healing process of mouse skin full-thickness wound. Wound Repair Regen 2009;17:598-605.