51_김한수-신균주 Bacillus amyloliquefaciens.hwp

Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society Vol. 17, No. 7 pp. 442-450, 2016 http://dx.doi.org/10.5762/kais.2016.17.7.442 ISSN 1975-4701 / eissn 2288-4688 김한수조선대학교대학원보건학과 The Antimicrobial Activity of Cheonggukjang, Using the New Strain, Bacilllus amyloliquefaciens Extract and Their Heat and ph Stabilities Han Soo Kim Department of Health science Graduate School of Chosun University 요약본연구의목적은대나무줄기마디부분의표면에서처음발견되었으나, 아직까지는연구가미흡한신균주 Bacillus amyloliquefaciens 로발효한청국장추출물의항균활성을알아보려고한다. 청국장전통발효균주인 Bacillus subtilis 를대조군으로하고, 비교분석을실시하였다. 실험방법은항균활성, 최소억제농도 (MIC) 와열및 ph 안정성을측정하였다. 항균활성실험결과, 병원성 6종균주에서그람양성균주 C.perfringens, S.aureus와그람음성균주 A.faecalis, E.coli에서 B.amyloliquefaciens 이 B.subtilis 에비해강한항균활성을나타내었다. 최소억제농도실험결과, C.perfringens, S.aureus, A.faecalis, E.coli에서 B.amyloliquefaciens 이 B.subtilis 에비해 0.01 %, 0.21 %, 0.45 %, 0.29 % 의농도로억제효과를나타내었다. 열과 ph 안정성실험결과, B.subtilis 와더불어 B.amyloliquefaciens 청국장추출물은 121, 15분간열처리와 ph 2-10 처리에의한안정성에서활성이감소하지않았고, 열과 ph 실험에서비교적안정하였다. Abstract This study aims to determine the antimicrobial activity of fermented Cheonggukjang extract using the new Strain, Bacillus amyloliquefaciens, which was first found on the surface of the node part of bamboo stems, but has been studied very little so far. Bacillus subtilis, which is the traditional fermented strain of Cheonggukjang, was selected as the control group and a comparative analysis was performed. The experimental method included measurements of the antimicrobial activity, minimum inhibitory concentration (MIC) and heat and ph stability. B. amyloliquefaciens had stronger antimicrobial activity than B. subtilis against the gram-positive bacteria, C. perfringens and S. aureus and the gram-negative bacteria, A. faecalis and E. coli among the six species of pathogenic bacteria studied. When the minimum inhibitory concentration was measured, B. amyloliquefaciens in C. perfringens, S. aureus, A. faecalis, and E. coli had an inhibitory effect at concentrations of 0.01 %, 0.21 %, 0.45 % and 0.29 %, respectively, compared to B. subtilis. When the heat and ph stability was measured, B. subtilis and B. amyloliquefaciens Cheonggukjang extract did not show any decrease in activity when held at a temperature of 121 for 15 minutes and at ph values ranging from 2 to 10 and were therefore considered to be relatively stable against heat and ph changes Keywords : Antimicrobial activity; Bamboo; B.subtilis; B.amyloliquefaciens; Cheonggukjang. * Corresponding Author : Han Soo Kim(Chosun University) Tel: +82-10-7788-9474 email: kims2718@naver.com Received April 11, 2016 Revised (1st May 2, 2016, 2nd May 10, 2016) Accepted July 7, 2016 Published July 31, 2016 442

1. 서론최근, 의학과식품과학발전과더불어식생활개선및건강지향적인소비자욕구에따라기존의화학적혼합식품의사용을기피하고합성보존료의지속적인사용이인체에부작용을일으킬수있는안정성에대한문제를꾸준히제기함으로써 [1,2], 인체에무해하고변패를억제하며유통시한을늘릴수있는천연자원의식품이용개발이시도되고있으며, 특히식물성한약재를비롯한약용식물유래항균활성및생리활성물질에대한연구가활발히진행이되고있는실정이다 [3]. 세계보건기구 (WHO) 및국제식량기구 (FAO) 의합동전문가위원회에서 2001년에 Probiotics를 살아있는미생물로적당한양을섭취하면건강에유익한세균을포함한식이보충제 라정의하였으며 [4], Prebiotics는 Probiotics안에서발효미생물의생육을촉진하는물질 을의미한다 [5]. 대두 (Soybean, Glycine max) 는우리민족의전통적인식품원료이며, 각종영양성분이풍부한단백질급원식품으로서식이섬유, 인지질, Iso-flavonoids, saponins, trypsin, inhibitor, 배당체등의다양한생리활성성분이함유되어있다고알려져있으며 [6,7], 대두발효식품중에대표적인청국장은된장과간장, 고추장등과함께오래전부터행해져온가공공정의일환으로좋은발효식품으로상용되어왔다. 청국장발효식품은맛과향, 조직감등을부여하기위해서미생물작용을통해초산및젖산, 알코올발효과정을지나저장성향상과필수아미노산, 단백질, 비타민및무기질등이풍부한발효식품이된다. 또한, 독성물질파괴및생리활성물질생산및소화증진등의효과도있다 [8]. Bacillus spp. 가생산하는가장보편적인항생물질인 lipopeptide는 amphiphilic한특성으로계면에서의물리적, 화학적성질을변화시킬수있어서소수성기질의이용능력을향상시키며, 미생물이표면에부착및탈락하는데영향을주기도한다. 항생물질의일종인 Surfactin은 β-hydroxy fatty acid의 carboxyl group과 heptapeptide 의 hydroxyl group이결합한구조로, Surfactin을생산하는균종에는 B.subtilis과 B.pumilus, B.amyloliquefaciens 등이있다 [9]. 전통발효균주로인정받는고초균 (Bacillus subtilis) 은호기성으로다양한가수분해효소를생산하며, 이러한균주를이용해발효시켜제조한청국장은대표적인대두 발효식품으로발효과정을거치면서고초균에의해생산되는단백질및탄수화물기능성펩타이드, 가수분해효소, 고분자점질물등의생리활성물질을포함하고있다 [10]. 이러한생리물질은발효제품의품질특성에중요한영향을미치며, γ-pga(poly-γ-glutamic acid)[11] 는미생물고분자물질의일종으로항균효과 [12], 면역증진효과, 혈청콜레스테롤저하, 동맥경화예방, 항산화효과 [13], 항암효과뿐만아니라, 보습성이뛰어나화장품으로도각광받고있는기능성소재이다 [14]. 신균주 Bacillus amyloliquefaciens 은대나무줄기표면에서처음발견이되었으며, 16S rdna 염기서열구조분석에근거하여분자계통학적유연관계에의해분리된균주 [15] 로써 cellulolytic, proteolytic, amylolytic과 lipolytic 효과에관한 plate 분석결과에서식품의부패와인체에병원성을일으키는미생물인 Listeria monocytogenes와 Candida albicans, Yeast 등에대한항균효과가있다고현재까지는알려져있다 [16]. 아직까지 B.amyloliquefaciens 에대한연구는거의없지만, B.amyloliquefaciens 이발견된대나무에대한몇몇보고서에서는대나무가항균효과, 신경보호효과와면역기능강화, 항산화효과, 항암및가수분해효과등의여러생리활성기능이있다고보고하고있다 [15, 17-19]. 그러나, 대나무줄기표면에서발견된 B.amyloliquefaciens 은발견이된지얼마지나지않았기때문에신균주에대한여러연구는아직까지미비한실정이다. 또한, 혈중콜레스테롤저하및당뇨개선효과 [14] 가있는전통발효균주인 B.subtilis 와염기서열구조분석에근거하여유연관계에있는신균주 B.amyloliquefaciens 균주를이용하여발효한청국장이병원성균주들에서항균활성, 최소억제농도와열및 ph 안정성에어떠한특성을나타내는지에대한비교실험의결과는아직은알수가없다. 따라서본실험에서는대나무줄기의마디부분의표면에서발견된신균주 B.amyloliquefaciens 을이용한청국장추출물을실험군으로하고, 청국장발효의대표적인균주로알려진 B.subtilis 를이용한청국장추출물을대조군으로정하여항균활성, 최소억제농도를비교분석하고, 열및 ph 안정성도함께조사해봄으로써 B.amyloliquefaciens 을이용하여발효한청국장의기능성을확인할수있는기초자료로사용함을목적으로한다. 443

한국산학기술학회논문지제 17 권제 7 호, 2016 Fig. 1. Phylogenetic tree showing relationships between some members of the Bacillus species (Arguelles-Arias et al., 2009). 2. 재료및방법 2.1 실험재료본연구에서사용한대두 ( 국산 ) 는 2014년용두농업협동조합 ( 무안 ) 에서 1 kg을구매하여본항균활성과최소억제농도와열및 ph 안정성실험에사용하였다. 2.2 발효균주본실험에서청국장발효에이용되고있는대표적인균주 B.subtilis 와대나무줄기의마디부분의표면에서처음분리된신균주 B.amyloliquefaciens 을사용하였다. 목포대학교생물학과미생물학실험실에보관중인청국장발효균주 B.subtilis 와신균주 B.amyloliquefaciens 은일반적으로유전적분석에서유사한관계에있다고알려져있다 (Fig 1). 2.3 항균활성균주청국장추출물의병원성균주들에대한항균효과를측정하기위한 6종균주로 Gram Positive 균주는 Enterococcus faecalis, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus를사용하였고, Gram Negative 균주는 Alcaligenes faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa이다. 각균주는한국미생물보 존센터에서분양을받아항균활성실험에사용하였으며, 균주의배양조건은다음과같다 [Table 1]. Table 1. List of strains used for antimicrobial activity test Gram stain Positive (+) Negative (-) Strains Strain number E. faecalis ATCC 29212 C. perfringens KCTC 5014 S.aureus ATCC 13565 A. faecalis ATCC 49677 E. coli ATCC 25922 P. aeruginosa ATCC 21636 2.4 시약및기기 Media ( ) MHB & MHA (37 ) 실험기기로는 Shaking incubator, UV/Visible spectrophotometer, Freezing dryer와 Rotary vacuum evaporator외일반실험기구들을사용하였다. 추출용시약은 70 % ethanol을사용하였다. 고초균생육배지는 NB(Nutrient broth, Difco, Becton Dicnson Co., USA) 를사용하였고, 항균활성에사용한배지는 Mueller Hinton Broth & Mueller Hinton Agar(MHB & MHA, Difco, Becton Dicnson Co., USA) 를구입하여사용하였다. 그외 8 mm paper disc(advantec, LTD. Japan) 및나머지기타시약은필요에따라구매하여사용하였다. 444

2.5 B.subtilis 와 B.amyloliquefaciens 의 MHB 배양액 MHB를 10 kg씩두개를제조한다음 B.subtilis 와신균주 B.amyloliquefaciens 을이용하여배양되어있는 slant broth tube에서 Loop로채취하여각 broth flask에넣는다 [Table 2]. 진탕배양기를이용하여종균액을 37, 시간배양한다음 5 ml tube에각각 100 μl씩 시간배양하였다. Table 2. Components factor of MHB Components Concentration Beef Extract 2.0 g Acid Hydrolysed Casein 17.5 g Starch 1.5 g Calcium ions 50 mg/litre Magnesium ions 20 mg/litre ph : 7.4 ± 0.2 Appearance : Pale straw, dear 2.6 B.subtilis 와 B.amyloliquefaciens 에의한 FS의추출물조제 Fermented Soybean(FS) 의제조방법은대두 ( 콩 ) 를 500 g을세척하여 3배의증류수를넣고실온, 시간을침지하였다. 침지한대두를고압증기멸균기에서 115, 25분간증자하고, 50-60 로냉각하였다. 대두는 100 g 씩 10개의비커에나누어담고전날배양한두종균액을전체의 1 % (w/w) 가되도록 5개의비커에나누어서접종하였다. 균주를접종한대두를 37, 시간동안발효시켜 100g을뺀나머지를 -70, 시간냉동시킨후동결건조된시료중 400 g을 3배의 70 % ethanol로실온, 시간 3회반복하여진탕한후상층액시료를추출하였다. 추출액은여과지 (Whatman No. 2) 로여과하여불순물을제거하고진공농축기에서 40 로감압 농축한후사용하였다. 모든시료는 4 보관하였으며, 실험시적당한농도로희석하여사용하였다. 2.7 B.subtilis 와 B.amyloliquefaciens 에의한 FS 의항균활성 본실험은 B.subtilis 와신균주 B.amyloliquefaciens 에의한청국장추출물시료를가지고항균활성을비교분석하였고, Paper disc diffusion method[20] 을응용하여사용하였다. 각균주는액체배지에서 37, 시간배양하여세균배양액을 650 nm에서 Optical Density(O.D) 값 0.4[106 CFU(Colony Forming Unit)/mL] 가되게조절한후활성화시킨다음병원성균주 6종이배양된배지에 1회백금이로균을채취해 2.5 ml MHB의생육액체배지에현탁시켜배양한후높이가 4 5 mm인 MHA 배지를만들어하루정도건조시킨후시험균액 40 μl을무균상태에서 Plate에분주한후멸균된유리막대로잘도말한다. 각청국장추출물을에탄올을이용하여 4 mg/ml 농도로희석한다음시료를 30 μl씩지름이 8 mm인멸균된 paper disc에흡수시켜균주가도말된배지표면에고정시켰다. 이를실온, 1시간동안확산, 건조시킨후 시간동안배양하였으며, 각추출물로부터형성된 disc 주위에생성된환의모습을 clear zone의크기로판단하였다. 2.8 B.subtilis 와 B.amyloliquefaciens 에의한 FS의최소억제농도최소억제농도 (Minimal Inhibitory Concentration, MIC) 실험은한천배지확산법을응용하여비교분석을실시하였다 [21]. 본실험은멸균후완전히굳지않은 MHA 배지에 B.subtilis 와신균주 B.amyloliquefaciens 을이용하여발효시킨청국장의 70 % ethanol 추출물을 0.3-0.01 %(w/v) 범위의농도별로최종맞춰첨가하고여기에시험균주의농도가약 105 106 CFU 가량되도록접종한후혼합하였다. 이를평판에분주하여실온에서굳히고, 37 incubator에서 시간배양하였다. 여기서, 배양후실제현미경상에서균의성장이관찰되지않은평판의농도를최소억제농도로판단하였다. 2.9 B.subtilis 와 B.amyloliquefaciens 에의한 FS의열안정성열안정성 (Heat stability) 실험은 B.subtilis 와 B.amyloliquefaciens 을이용하여발효시킨청국장의 70 % ethanol 추출물을 4 mg/ml 농도로희석하였다. 희석한시료를 60 에서 10, 30 및 60분, 80 및 100 에서 10분과 20분, 121 에서 15분간열처리한후즉시냉각하였다. 이렇게처리된시료의항균활성변화를 paper disc법 [20] 으로측정하였다. 2.10 B.subtilis 와 B.amyloliquefaciens 에의한 FS의 ph 안정성 ph 안정성실험은 B.subtilis 와 B.amyloliquefaciens 445

한국산학기술학회논문지제 17 권제 7 호, 2016 을이용하여발효시킨청국장의 70 % ethanol 추출물을 4 mg/ml 농도로희석하였다. 희석한시료의 ph를 0.1 N NaOH와 0.1 N HCl을이용하여 2, 4, 6, 8 및 10으로조절한후실온에서 시간동안방치하였다. 이렇게방치한시료는 0.1 N NaOH와 0.1 N HCl을사용하여본래의 ph로중화시켜 4 mg/ml 농도로희석하여항균활성변화를 paper disc법 [20] 으로측정하였다. 3. 결과및고찰 3.1 B.subtilis 와 B.amyloliquefaciens 에의한 FS의항균활성 B.subtilis 와신균주 B.amyloliquefaciens 을이용하여발효시킨청국장의항균활성도를확인하기위하여 70 % ethanol로추출한후, paper disc 법을이용하여그람양성균주 3종, 그람음성균주 3종에대하여실험을실시하였다. 청국장에탄올추출물은 4 mg/ml 농도에서병원성균주 6종전체에서항균효과를보였고, 두균주간결과는다음과같다 (Table 3). 그람양성에서 E.faecalis는항균효과의차이가없었으나, C.perfringens와 S.aureus가 B.subtilis 에비해 B.amyloliquefaciens에서높은항균효과를보였다. 그람음성에서 P.aeruginosa는항균효과의차이가없었으나, A.faecalis와 E.coli에서는 B.subtilis 에비해 B.amyloliquefaciens에서높은항균효과를보였다. Yang 등 [22] 의연구에서는 B.subtilis에비해 B.amyloliquefaciens는세균및곰팡이에항균활성에대한넓은범위를가지며, 원인물질을규명한결과항세균및진균활성을함께가지는 fengycins와 surfactins을동시에생산하는특성과 lipopeptide 계열의물질로서단백분해효소의영향이없다고하였다. 또한, B.subtilis에비해 B.amyloliquefaciens 균주가발효과정중에세포벽분해효소인 chitinase를더많이생산하였다고하였으며 [23], 청국장발효시 peptidases 및 proteases와같은발효대사산물이 B.subtilis보다 B.amyloliquefaciens에서훨씬풍부하다고하였다 []. 이는 B.amyloliquefaciens가세균의원형질막을용해할수있는 surfactins과같은항균물질이더풍부하고, Iipopeptide 계열을비롯한단백질분해효소에영향을받지않는 B.amyloliquefaciens 균주가대두혼합에의한청국장발효과정에서생리활성의증가에시너지효과를 준것으로생각된다. 또한, Fiordiligie[16] 는 B.subtilis와유전적분석에의한유전정보가가장유사하며같은포자형성의형태를보이는상관관계 (25-27) 의균주인 B.pumilus를대조군으로하고 B.amyloliquefaciens를이용한항균활성을실험한결과 B.amyloliquefaciens에서같은조건및시간을배경으로할때배출하는효소나항생물질이배양시간의경과에따라 B.pumilus에비해강하게증가하였다고보고하였다. 또한, Kim 등 [28] 은 B.amyloliquefaciens KC41을이용한청국장이 B.subtilis 와유연관계가가장가까운 B.subtilis HH28보다는 γ-polyglutamate와 isoflavone-glycosides 및 β -glucosidase의활성이높다고하였고, amino nitrogen의함량은 B.amyloliquefaciens KC41이 450.0 mg%, B.subtilis HH28은 291.6 mg% 로 B.amyloliquefaciens KC41의함량이더많았다고하였는데, γ-polyglutamate 와 β-glucosidase 같은가수분해효소가풍부한 B.amyloliquefaciens 와대두안의성분이발효시에생성된다량의점질물 ( 점액성다당체 ) 이 B.subtilis 보다배지위에서항균력활성부분이더욱활발하게적응하는환경이되었기때문이라판단된다. Ahn 등 [29] 은발효과정중에단백질및가수분해중간생성물에작용하여생리활성을촉진하는 proteases가 B.subtilis에서는 179.6 Unit/mL/min로나타난반면, B.amyloliquefaciens에서는 201.9 Unit/mL/min로높았다고보고하였다. 이에본연구에서미생물의생리대사기작과균주의형태및구조적특성에따른항균물질이 B.subtilis와다른 B.amyloliquefaciens로발효된청국장이여러단백질및효소물질이항균기능성에더높은활성증가로작용하였기때문이라고사료된다. Table 3. Antimicrobial activity of 70% ethanol extracts from B.subtilis and B.amyloliquefaciens with soybean (concentration: 4 mg/ml) Strains E. faecalis + + C. perfringens + +++ S. aureus + ++ A. faecalis + +++ E. coli + ++++ P. aeruginosa + + *Growth inhibition size of clear zone: -, non detected; +, smaller than 1.5 mm; ++, 1.5 3. mm; +++, 3 5 mm; ++++, lager than 5 mm. 446

3.2 B.subtilis 와 B.amyloliquefaciens 에의한 FS 의최소억제농도 B.subtilis 와신균주 B.amyloliquefaciens 로 발효시킨청국장추출물에대한최소억제농도는다음과같다 (Table 4). 그람양성균주중 E.faecalis에서는 B.subtilis 와 B.amyloliquefaciens 을이용한 추출액의최소억제농도는각각 0.60 %, 0.55 % 로차이는없었다. C.perfringens에서는 0.15 %, 0.01 % 이었고, S.aureus에서는 0.40 %, 0.21 % 로 B.amyloliquefaciens 의최소억제농도가 B.subtilis 보다높았다. 그람음성균주중 A.faecalis에서는 B.subtilis 는 1.50 %, 0.45 % 이었고, E.coli에서는 >0.80 %, 0.29 % 로 B.amyloliquefaciens 의항균효과가 B.subtilis 보다높은것으로나타났지만, P.aeruginosa에서는두군간에효과가없었다. 그람음성균주에비해그람양성균주가항균물질에대한감수성이높게나온다는보고 (30) 와본연구와유사한결과를나타내었는데, 이는그람양성균주가감수성이높은것은양성균주에비해그람음성균주가세포막의구조가훨씬복잡하며, 세포막을둘러싸고있는외막이큰분자량의친수성물질의유입을차단하기때문이라생각된다. 또한, B.amyloliquefaciens 을이용한청국장추출물이 B.subtilis 에비해작은농도로도항균활성이우수하다고할수있으며, 대나무유래의신균주 B.amyloliquefaciens 의항균물질이미생물의생리대사기작과균주의구조적특성및형태가항균활성의정도에서로다르게작용하기때문이라사료된다. Table 4. Minimum Inhibitory Concentration(MIC) of 70% ethanol extracts from B.subtilis and B.amyloliquefaciens with soybean (unit: %) Strains MIC(mg/ml) E. faecalis 0.60 0.55 C. perfringens 0.15 0.01 S. aureus 0.40 0.21 A. faecalis 1.50 0.45 E. coli > 0.80 0.29 P. aeruginosa > 0.80 0.60 3.3 B.subtilis 와 B.amyloliquefaciens 에의한 FS 의열및 ph 안정성 현재대부분의가공식품들은제품고유의특성을살 리거나, 저장성과기호성을향상시키기위해열처리또는 ph의처리과정을거치게되므로이들식품에첨가되는보존료는열및 ph에안정성이있어야한다. 이에 B.subtilis 와신균주 B.amyloliquefaciens 에의한청국장추출물의열및 ph의안정성을측정하였다. 열안정성실험결과, B.subtilis 와 B.amyloliquefaciens 에의한청국장추출물을 121 에서 15분간열처리를하여도항균활성에변화가없었다. B.subtilis 와더불어 B.amyloliquefaciens 청국장추출물도열에안정성을확인할수있는물질임을알수있었다 (Table 5). 이러한결과로볼때, B.amyloliquefaciens 에의한청국장추출물은가공과정에서열처리를동반하는대부분의식품보존제로사용하기용이할것으로보여진다. 특히, B.amyloliquefaciens에의한발효추출물은 C.perfringens와같이 retort 및통조림제품에서변패나식중독을일으킬수있는균주에대해서도열처리시항균활성에변화가없는것으로나타나통조림이나 retort 제품의상업적멸균시이용할수있을것으로기대가된다. ph 안정성실험결과, B.subtilis 와 B.amyloliquefaciens 에의한청국장추출물은 ph 2-8의범위에서모두항균활성이잘유지되었다. 알칼리조건인 ph 10에서 B.subtilis 는감소한반면, B.amyloliquefaciens 은대부분의실험균주에서항균활성은나타내었다 (Table 6). 이와같이세포외막을둘러싸는특정단백질성분인 proteome 물질이온도변화에도 B.subtilis 및 B.amyloliquefaciens의구성되어있는단백질막의변성변화가나타나지않았다고하였다 (31). 이는청국장을포함한일반적인가공식품의 ph가약산성또는중성임을고려할때, ph 10의알칼리조건에서 B.subtilis 에비해 B.amyloliquefaciens 추출물이적정수준의항균활성을유지하는것은 B.amyloliquefaciens 을이용한천연식품보존제도 B.subtilis 와더불어안정된물질임을확인할수있었다. 또한, 산성및중성조건에서는항균활성이그대로유지됨으로유통중미생물생육억제효과를지속적으로얻을수있어 B.amyloliquefaciens 의추출물은열과 ph에비교적안정성을나타냄으로서식품의가공처리에도적합한천연가공식품으로활용가능성이높을것으로사료된다. 447

한국산학기술학회논문지제 17 권제 7 호, 2016 Table 5. Effect of heat treatments on antimicrobial activity of 70% ethanol extracts from B.subtilis and B.amyloliquefaciens with soybean (concentration: 4 mg/ml) E.faecalis C.perfringens S.aureus A.faecalis E.coli P.aeruginosa Temp( ) Untreated + + ++ ++++ + ++ + + + ++ + ++ 10 min + + ++ ++++ + ++ + + + ++ + ++ 60 30 min + + ++ ++++ + ++ + + + ++ + ++ 60 min + + ++ ++++ + ++ + + + ++ + ++ 80 10 min + + ++ ++++ + ++ + + + ++ + ++ 20 min + + ++ ++++ + ++ + + + ++ + ++ 100 10 min + + ++ ++++ + ++ + + + ++ + ++ 20 min + + ++ ++++ + ++ + + + ++ + ++ 121 15 min + + + +++ + ++ + + + ++ + + * Growth inhibition size of clear zone: +, smaller than 1.5 mm; ++, 1.5-3 mm; +++, 3-5 mm. Table 6. Effect of ph treatments on antimicrobial activity of 70% ethanol extracts from B.subtilis and B.amyloliquefaciens with soybean (concentration: 4 mg/ml) E.faecalis C.perfringens S.aureus A.faecalis E.coli P.aeruginosa ph Untreated + + ++ +++ + ++ + + + ++ + ++ 2 + + ++ +++ + ++ + + + ++ + ++ 4 + + ++ +++ + ++ + + + ++ + ++ 6 + + ++ +++ + ++ + + + ++ + ++ 8 + + ++ +++ + ++ + + + ++ + ++ 10 - + - ++ - + - - - + - + * Growth inhibition size of clear zone: +, smaller than 1.5 mm; ++, 1.5-3 mm; +++, 3-5 mm. 4. 결론연구의목적은대나무줄기의마디부분의표면에서발견하였으나, 아직까지는연구가미흡한신균주인 B.amyloliquefaciens 을이용하여발효한청국장의항균활성의효능을알아보려고한다. 혈중콜레스테롤저하및당뇨개선효과 [14] 를가지고있는청국장의대표적인발효균주인 B.subtilis 을이용하여발효한청국장을대조군으로하였다. 실험방법은병원성균주 6종을대상으로항균활성, 최소억제농도와열및 ph 안정성을비교분석하였다. 본항균실험의결과에서는 B.subtilis 를이용하여발효한청국장에비하여 B.amyloliquefaciens 로발효한청국장의항균효과가그람양성 E.faecalis는항균활성의차이가없었고, C.perfringens와 S.aureus가 B.subtilis 에비해 B.amyloliquefaciens 에서높은항균활성을보였다. 그람음성에서 P.aeruginosa 는항균활성이없었으며, A.faecalis와 E.coli 에서는 B.subtilis 에비해 B.amyloliquefaciens 에서높은항균활성을보였다. 최소억제농도실험에서는그람양성균주중 E.faecalis를제외한 C.perfringens 와 S. aureus는 B.subtilis 에비해 B.amyloliquefaciens 에서 0.01 % 및 0.21 % 농도로생육을억제하는효과가있었다. 그람음성균주중 P.aeruginosa을제외한 A.faecalis 와 E.coli는 B.subtilis 에비해 B.amyloliquefaciens 에서 0.45 % 및 0.29 % 농도에서생육을억제하는효과가있었다. 열안전성실험결과는 B.subtilis 와 B.amyloliquefaciens 에의한청국장추출물모두에서 100, 20분까지는열처리를하여도항균활성에변화가없었다. 따라서, B.amyloliquefaciens 추출물도 B.subtilis 와더불어열에안전한천연물질임을알수있었다. ph 안정성실험결과에서는 B.amyloliquefaciens 과 B.subtilis 를이용한추출물을 ph 2-8로처리해도변화가없었으 448

며, 알칼리인 ph 10 에서 B.subtilis 에비해 B.amyloliquefaciens 에항균활성의변화가없어이들추출물유래의항균물질은가공식품을만들기위한조건인열및 ph 변화에도안정한천연물질임을알수있었다. 이와같이, B.subtilis 와더불어신균주 B.amyloliquefaciens 을이용하여발효된청국장추출물의항균활성과열및 ph 안정성에서유사한시너지효과를보여준것은여러단백질, 가수분해효소물질및점질물이항균활성및생리활성측면에서높은기능성을가지고있기때문일것으로사료된다. 본연구에서는 B.amyloliquefaciens 로발효된청국장이 B.subtilis 를이용하여발효된청국장보다어떠한종류의항균물질이더많이존재하는지에대해서는명확히알수는없었다. 그러나, 천연항균력및항산화물질을가지고있다고알려져있는신균주 B.amyloliquefaciens 은대두가청국장으로발효되는과정에서 B.subtilis 보다청국장점질물의기능중항균활성과열및 ph의안전성면에서우월한효과를나타내었다. 따라서, 향후의연구에서는 B.subtilis 에비해신균주 B.amyloliquefaciens 을이용한발효가청국장점질물의기능중항균활성에영향을준물질들에대해세부적으로파악하고그구조적, 기능적특성들을비교분석을하여항균작용에있어두물질의상승효과등에대한연구가함께실행되어져야할것으로사료된다. References [1] Kwon, H. Y., Ryu, H. Y., Kwon, C. S., Lee, S. H. and Sohn, H. Y, Optimization of culture conditions of Bacillus pumilus JB-1 for Chungkook-jang fermentation in soybean boiling-waste liquor medium, Korean J. Microbiol Biotechnol, Vol.35, pp.304-309, 2007. [2] Jung, J. B., Choi, S. K., Jeong, D, Y., KIm, Y. S. and Kim, Y. S, Effects of germination time of soybeans on quality characteristics of Cheonggukjang fermented with an isolated bacterial strain, Korean J. Food sci, Technol, Vol.44, pp.69-75, 2012. [3] S. Y. Jang, H. J. Choi, N. Y. Ha, O. M. Kim, Y. J. Jeong, Study on the antimicrobial effects of citrus peel by different extract methods, Korean J. Food Preserv, Vol.11, pp.319-3, 2004. [4] FAO/WHO, Working Group Report on Drafting Guidelines for the evaluation of probiotics in food, London, Ontario, Canada, April 30 and May 1, 2001. [5] M. B. Roberfroid, Prebiotics and probiotics: are they functional foods?, The American J. of clinical nutrition, Vol.71, pp. 1682-1687, 2000. [6] Han ss, Hur SJ, Lee SK, 2015, A comparison of antioxidative and anti-inflammatory activities of sword beans and soybeans fermented with Bacillus subtilis, Food funct, Vol.6, pp.2736-2748, 2005. [7]. Park GS, Cookwise approach of slow food: Focused on traditional fermented sauces. Korean J. Soc Food Cookery Sci, Vol.20 pp.317-334, 2004. [8] M. Ongena and P. Jacques, Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol, Trends, Microbiol, Vol.16, pp.115-125, 2007. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.tim.2007.12.009 [9] S. J. Jung, J. H. Lee, H. N. Song, N. S. Seong, S. E. Lee, and N. I. Beak, Screening for antioxidant activity of plant medicinal extracts, Korean J. Soc. Appl Biol Chem, Vol.47, pp.135-140, 2004. [10] H. H. Lee and S. Y. Lee, Cytotoxic and antioxidant effects of taraxacum coreanum Nakai and T. officinale WEB extracts, Korean J. Medicinal Crop Sci, Vol.16, pp.79-85, 2008. [11] B. Y. Lee, D. H. Lim, and K. H. Kim, Physico-chemical properties of viscous substance extracted from Cheongguk-jang, Korean J. Food Sci, Vol.23, pp.599-604, 1991. [12] H. K. Youn, H. S. Choi, S. H. Hur, and J. H. Hong, Physico-chemical properties of viscous substance extracted from Cheonggukjang, Korean. J. food, Hyg Safety, Vol.16, pp.188-193, 2001. [13] N. K. Lee and Y. T. Hahm, Antioxidative characteristics of browning reaction products of glucoseγ-poly-glutamate(glu-γ-pga) obtained from amino-carbonyl reaction, Korean J. Food Sci. Technol, Vol.37, pp.812-815, 2005. [14] C. J. Shim, G. H. Lee, J. H. Jung, S. D. Yi, Y. H. Kim, and M. J. Oh, Isolation and identification of antimicrobial active substances from Rhodiola sachlinensis, Korean J. Food. Preserv, Vol.11, pp.63-70, 2004. [15] A. Arguelles-Arias, M. Ongena, B. Halimi, Y. Lara, A. Brans, B. Joris, and P. Fickers, Bacillus amyloliquefaciens GA1 as a source of potent antibiotics and secondary metabolites for biocontrol of plant pathogens, Microb. Cell. Fact, Vol.8, pp.63, 2009. DOI: http://dx.doi.org/10.1186/1475-2859-8-63 [16] P. Fiordiligie, Extracellular Enzyme and Antibiotic Substance Production of Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus pumilus 4 Isolated from the Surface of Bamboo Culms, Department of Biotechnology, Korean. National Uni, 2009. [17] Y. Ito, Y. Akao, M. Shimazawa, N. Seki, Y. Nozawa, and H. Hara, Lig-8, a highly bioactive lignophenol derivative from bamboo lignin, exhibits multifaceted neuro-protectve activity, CNS Drug Rev, Vol.13, pp.296-307, 2007. DOI: http://dx.doi.org/10.1111/j.1527-3458.2007.00017.x 449

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