Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society Vol. 15, No. 8 pp. 5088-5094, 2014 http://dx.doi.org/10.5762/kais.2014.15.8.5088 ISSN 1975-4701 / eissn 2288-4688 이준선 1, 이민경 2, 김윤경 2, 김기은 1, 현경예 1* 1 동의대학교임상병리학과, 2 동의대학교치위생학과 Attenuant Effects of Hovenia dulcis Extract on Inflammatory Orifacial Pain in Rats Jun-Seon Lee 1, Min-Kyung Lee 2, Yun-Kyung Kim 2, Ki-Eun Kim 1, Kyung-Yae Hyun 1* 1 Depart. of Clinical Laboratory Science, Dong-eui University 2 Depart. of Dental Hygiene, Dong-eui University 요약헛개나무추출물은알코올분해, 간손상회복과항산화기능을가지고있다. 본연구에서헛개나무추출물이 formalin 으로유도된염증통증동물모델에서염증성안면통증의개선하는능력여부에대하여조사하였다. 동물모델은각각 4개의그룹으로나누었다 ; 그룹1 ( 대조군 ), 그룹2 ( 우측안면부에 5% fomalin 을피하주입하여염증성안면통증유발군 ), 그룹3 (5% fomalin+d.w. 투여군 ), 그룹4 (5% fomalin+ 4.5 ml/kg 헛개나무추출물투여군 ). 긁거나문지르는행위에대한계수시험은 3그룹사이의다른점을평가하기위해적용되었다. 뇌와연수에서의 p38 MAPK, inos, Nrf2의발현은통증조절, 염증, 항산화와 NO생성과관련된다. 이것들을단백정량분석 (western blot) 으로분석하였다. 안면통증의정도는그룹4 가그룹 1,2,3에비하여유의하게낮았다. 뇌와연수에서의 p38 MAPK, inos, Nrf2의발현도또한그룹4 이다른그룹에비하여낮았다. 이러한결과는헛개나무추출물이 p38 MAPK, inos 와 Nrf2의발현을억제함으로서염증성안면통증을감소시킬수있다는것을시사한다. Abstract Hovenia dulcis extract (HDE) has positive effects on alcohol degradation, recovery of liver damage and antioxidant activities. This study examined whether HDE exerts an ameliorative effect on inflammatory orifacial pain in an animal algesic model with formalin. The animals (rats) were divided into four groups: group I (control), group II (right facial subcutaneous injection of 5% formalin, inflammatory orifacial pain group), group III (5% formalin + distilled water administration), and group IV injection (5% formalin + 4.5 ml/kg of HDE), respectively. The scores from the scratch and effleurage tests were applied to evaluate the differences between three groups. The expression of p38 MAPK, inos and Nrf2 in the brain and medulla oblongata, which are involved in pain regulation, inflammation, antioxidation and nitric oxide production, were analyzed by western blot. The degree of orifacial pain was significantly lower in group IV than in groups I, II and, III. The expression of p38mapk, inos and Nrf2 in the brain and medulla were also lower in group IV than in the other groups. These findings suggested that a Hovenia dulcis extract can attenuate inflammatory orifacial pain by suppressing the expression of p38 MAPK, inos and Nrf2. Key Words : Hovenia dulcis, inos, Nrf2, Orofacial pain, P38 MAPK 1. 서론 헛개나무 (Hovenia dulcis) 의열매는달아식용하거 나, 술을담그기도하고예로부터약용으로주독을제거하는데쓰이는동아시아가원산지인갈매나무과의낙엽교목이다. [ 한국본초도감 ] 에따르면열매, 뿌리, 수피, 액 * Corresponding Author : Kyung-Yae Hyun(Dong-eui Univ.) Tel: +82-10-5767-4458 email: kyhyun@deu.ac.kr Received June 3, 2014 Revised (1st July 17, 2014, 2nd July 23, 2014) Accepted August 7, 2014 5088
즙, 잎을약용으로하며, [ 본초강목 ] 에서는생즙은술독을풀며구역질을멎게한다라고하였다. 이러한헛개나무의효능은현대에서가장애용되는숙취음료와간기능개선제라는것으로도알수가있다. 기능성식품으로는사용되어지고있으나실질적의료에적용된보고는없다. 그외에헛개나무의효능으로는급성, 만성알코올로인한간손상회복 [1,2], 항당뇨 [3], 항기생충 [4], 항미생물 [5] 골다공증예방 [6], 피로회복및항산화 [7] 등이선행연구로보고된바있다. 중추신경계의주요흥분성신경전달물질인 Glutamate로유도된신경독성을가진 mouse 의 hippocampal HT22 cell의신경세포보호기능을본결과메탄올로추출한헛개나무의 8가지의 phenolic compounds (vanillic acid, ferulic acid, 3,5-dihydroxystilbene, (+)-aromadendrin, methyl vanillate, (-)-catechin, 2,3,4-trihydrobenzoic acid, and (+)-afzelechin) 가신경보호효능이있음이나타났다. 이러한물질들은항산화능측정의지표인 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), superoxide anion, ABTS (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) cation radical scavenging 효과를가지고있다고보고하였다 [8]. Uncaria sinensis( 조구등 ) 에서추출된 single compound 1-methoxyoctadecan-1-ol 가허혈성뇌졸중동물모델에서경색의크기와부종의감소와더불어염증과통증과관련된신호전달단백질인 p38 MAPK 의감소로인한신경보호효과를가지고있음을보고하였다 [9]. 이러한선행연구를바탕으로헛개나무가염증성안면통증의조절에도효능이있는지를확인하기위해염증동물모델은염증성통증유발물질인 [10] formalin을사용하였으며, p38 MAPK 과항산화신호전달인자인 inos 와 Nrf2의조절을중추신경계의가장중요한통증조절장기인연수와뇌의발현도로측정하였다. 2. 연구방법 2.1 실험대상실험동물은효창사이언스 ( 대구 ) 에서공급받은 Sprague-Dawley계수컷흰쥐 (240~280 g) 를사용하였다. 실험동물의외부환경에의한스트레스를최소화하기위해서 12시간주 / 야순환주기를조절하고적정온도인 23-24 의일정한환경을유지, 사료와물은동일한 량을자유로이공급하였고. 행동적인억압방지하기위해 1개의케이지당 2-3마리넣어사육하였다. 본연구는동의대학교실험동물윤리규정에따라수행하였다. 2.2 실험방법 2.2.1 헛개나무추출물헛개나무추출물은헛개나무잎 50 g과증류수 (distilled water, 이하 D.W.) 1.5 L를 2시간동안 100 C 추출하였다. 찌꺼기를제거하기위해서 filter paper로 2회여과하였고, 총 300 ml의추출물을수거후냉장보관하여사용하였다. 2.2.2 실험모델실험군은 Naive 군, formalin 주입군, D.W. 투여군 (vehicle), 헛개나무추출물투여군으로나눠구분하였다. 1.5 ml의 D.W. 와헛개나무추출물을 3일간경구투여하였고, 3일째 D.W. 와헛개나무추출물을마지막으로투여하고 15분뒤 formalin 을안면부에주입하여염증통증을유발시켰다. 2.2.3 조직적출헛개나무추출물투여 15분후 5% formalin (50 μl ) 을인슐린주사기를이용하여실험동물의안면부에주입하였고, 안면부의염증유발로인한통증행위반응이증가하는 15분에뇌와연수의조직적출을실시하였다. 적출전에 20% urethan (1.5 ml) 을주사기를이용하여복강에주입하여마취하였다. 그뒤랫의목부위를수술용칼로경동맥을절개하여충분히혈액을제거하고, 후두부부위를절개하여연수를먼저적출하고, 뇌를적출하였다. 적출한조직은균질화전까지 70 에보관하였다. 2.3 분석방법 2.3.1 안면부염증통증지표염증을유발시키기위해 5% formalin (50 μl ) 을인슐린주사기 (0.25 mm * 8 mm) 사용하여실험동물 (n=8) 의오른쪽수염부의피하에주입하였고, 주입직후부터 5분단위로안면부를긁거나문지르는행위를계수, 누적하여총 45분간행위반응을관찰했으며이를통증지표로간주하였다. 5089
한국산학기술학회논문지제 15 권제 8 호, 2014 2.3.2 단백정량분석적출한뇌, 연수조직을수술용칼로잘게다지고, lysis buffer (PRO-PREP TM, Protein Extraction Solution) 를조직량에맞게적당량첨가하여 4 에서 homogenizer (Intron Biotechnology, Gyeonggi-do, Korea) 를이용하여각각균질화하였다. 균질화한조직을 Centrifuge (Hanil science, korea) 로 4, 13,000 rpm, 10 분간원심분리하여상층액과불순물을분리하였다. 분리한상층액을 Bio-Rad Protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 을첨가하여 X-ma spectrophotometer (Human Cor. Korea) 로 595nm에서단백질흡광도를측정하였다. 측정한흡광도를이용하여 distilled water (D.W,), sample buffer (125 mm Tris(pH 6.8), 20% glycerol, 4% SDS, 2% β-mercaptoethanol, 0.04% bromophenol blue, D.W) 을각상층액과적정량섞어같은단백질농도로정량하여사용하였다. 샘플을 10분간 95 에서가열시키고 3분간 20 에서식히고, 원심후 voltex mixer 로다시혼합하였다. 준비된 sample 은 10% - 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylaminde gel에각 well마다 18.5 μl로 loading 후 gel의 % 에따라 70 V, 100 V, 110 V에서각각 30분, 1시간 30분, 1시간 40으로전압을조절하면서전기영동하였다. Gel에서 nitrocellulose membrane 으로단백질을이동시키기위해 transfer 는 100 V로 2시간동안 transfer 하였고, 단백질의패턴및이동여부를확인하기위해 Ponceau 용액으로염색하여확인후 D.W. 에 10분간세척하였다. 교반기 (WISD, SHO 2D, korea) 위에서 blocking buffer (1X PBST, 탈지분유, sodium azide) 로 1시간, 2번의새 blocking buffer로교체하여 blocking하고 p38 MAPK, Nrf2, inos, β-actin, Anti body(ab) 를 4 에서 over night 시켰다. 7분간 5회에걸쳐 1X PBST (10X PBST, D.W, 0.1% Tween 20) 로수세후 2차 Ab를교반기위에서 2시간실온반응시키고 ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK) 을이용하여발현, 분석하였다. Vision Works Image Software (UVP, Cambridge, UK) 를이용하여발현정도를측정하였다. 반응에대한헛개나무추출물의영향은 [Fig. 1] 과같이결과로타났다. 포르말린의주입은안면부위의염증통증행위반응을증가시켰고, D.W. (vehicle) 은이러한반응에영향을미치지않았다. 그러나헛개나무추출물은통증행위반응을 D.W.(vehicle) 에비해유의하게감소시켰다 [Fig. 1(a)]. 이러한헛개나무잎추출물의통증완화효과는통증반응이증가하기시작하는 15분부터나타나기시작하여 30분까지유의하게나타났다 [Fig. 1(b)]. Number of scratches 350 300 250 200 150 100 50 0 form alin D.W 헛개나무잎 * Number of scratches 120 100 80 60 40 20 0 form alin D.W 헛개나무잎 5 10 15 20 25 30 35 40 45 (a) (b) [Fig. 1] Effect of Hovenia dulcis (4.5 ml) Intraperitoneal on pain behavioral response formalin-induced. (a) Hovenia dulcis-adiministrated group was significantly reduced behavioral responses as compared with formalin-treated group *P<0.05 (b) Hovenia dulcis effect of reduced behaviroal responses is strated in 15min, continued until 30min. 3.2 헛개나무의항염증단백질의조절효과 3.2.1 헛개나무추출물의투여가 p38 MAPK 의발현조절 5% formalin 주입후헛개나무추출물의주기적투여로인한뇌와연수에서의통증및염증신호전달에주요한 p38 MAPK 발현의변화를 Fig. 2, 3로나타내었다. 뇌에서대조군에비해 formalin 주입군과 D.W. 주입군의발현도가상의하게증가하였고, 헛개나무추출물주입군은발현도가유의하게감소되었다. 연수에서는대조군에비해 formalin 주입군의발현도가약간증가하는경향을보였고, 헛개나무추출물주입군은감소하는경향을나타내었다. 3. 결과 3.1 안면염증의통증완화에대한행위반응 실험동물의안면부에포르말린으로유도된통증행위 5090
[Fig. 2] p38 MAPK protein Expression in Brain. rat 1 g/kg body weight-trated rat [Fig. 5] inos protein Expression in the medulla oblongata. 3.2.3 헛개나무추출물의투여가 Nrf2 의발현조절 Nrf2의발현이헛개나무추출물의투여로인한염증성통증의신호전달과정조절을 Fig. 6, 7에나타내었다. Formalin 주입군은 navie군에비해 Nrf2의발현이증가하는경향을보였고, 헛개나무의반복투여는증가된 Nrf2 의발현을뇌와연수에서유의하게감소시켰다. [Fig. 3] p38 MAPK protein Expression in the medulla oblongata. rat 1 g/kg body weight-trated rat 3.2.2 헛개나무추출물의투여가 inos 의발현조절헛개나무의투여가뇌와연수에서 inos 에의한염증성통증의신호전달과정조절을 Fig. 4, 5에나타내었다. 대조군과비교하여 Formalin 주입군은 inos 의발현을증가시켰고, 헛개나무의반복투여는증가된 inos 의발현을뇌와연수에서유의하게감소시켰다. [Fig. 6] Nrf2 Protein Expression in Brain. A. Naive; B, Formalin-treated rat; C. D.W-treated rat; D. Hovenia dulcis-treated [Fig. 4] inos protein Expression in Brain. [Fig. 7] Nrf2 Protein Expression in the medulla oblongata. A. Naive; B, Formalin-treated rat; C. D.W-treated rat; D. Hovenia dulcis-treated 5091
한국산학기술학회논문지제 15 권제 8 호, 2014 4. 고찰및결론우리나라는사회적으로인간관계가중요시되며이에술을권하는음주문화로주독및간기능의회복을위한다양한건강음료를소개하고있다. 헛개나무는알코올분해능과간기능회복에탁월한효과가있다고보고되어현대인들에게있어가장흔한숙취음료로알려져있다. 헛개나무의알코올대사효능은랫으로부터분리하고 2.5% 의에탄올을주입한간세포에헛개나무의열매, 종자, 잎, 줄기추출물을투여하여 LDH의활성도및시간의존시험을한결과모두 LDH의활성도가증가하였고특히열매의효과가높았으며, 대체로 8시간째에서유의성있게감소시키는결과로알수있다 [11]. 또한헛개나무의성분중하나인 methyl vanillate가난소절제수술을하여골다공증을유발시킨동물모델에서유전자발현을조절함으로써, 다양한생명현상을조절하는 wnt/β -catenin 신호전달경로를활성화하여세포분화및조골세포의형성및골다공증치료에효과가있음보여주었으며 [12], 그외에도당뇨, 항산화, 항미생물, 항기생충, 항진균등에효과가있다. 다양한헛개나무의항산화효과와신경세포보호기능으로헛개나무추출물이국소적통증완화에효과크기를알아보고자이실험을실시하였다. 안면부에포르말린을주입하여유발된통증행위반응 ( 긁거나문지르는등 ) 에대해대조군과 formlain 주입군, D.W. 투여군, 헛개나무추출물투여군에따라 5분간격으로 45분동안횟수를계수하여비교측정한결과, 대조군에비하여 formalin 주입군에서통증행위반응이증가하였고, 반대로헛개나무추출물투여군에서는감소하였으며, 통증완화효과는 15분부터시작되어 30분까지나타났다. 이러한결과는헛개나무추출물이급성염증으로인한국소적안면염증의통증조절에효과가있는것으로시사된다. 이는염증과통증조절인자인 p38 MAPK 와더불어항산화에관여하는신호전달단백질 inos 와 Nrf2 발현도감소의가능성을보여준다. p38 MAPK 은외부적인스트레스나 proinflammatory cytokines (IL-1, TNF- and IL-6) 에의해활성화되어염증조절, 세포자멸사및세포분화에관여하는신호전달단백질중의하나이다 [13]. 천식의치료제로사용되고있는 montelukast 를좌골신경에발생한 chronic constriction injury (CCI) 로인한신경변증으로통증을유발시킨랫에지속적으로복강내주입하여 cytokine (IL-1β, IL-6, TNF-α) 와 p38 MAPK, NF-κB 의척수 (spinal cord) 에서의발현도를비교한결과 p38 MAPK 의결과가유의하게감소하였고, 이를 montelukast 가신경변증으로인한통증조절에효과가있다고보고하였다 [14]. 이러한보고는 p38 MAPK 이염증조절뿐만아니라통증조절에도중요한역할을한다는것을보여준다. 본연구의실험결과는위의실험과유사하게헛개나무추출물을주입군이 5% formlian 주입군에비하여유의하게 p38 MAPK 의발현도가감소하였는데이는헛개나무추출물이 p38 MAPK 를조절함으로염증으로인한통증을완화시킨다는것을시사한다. inos 는항산화와더불어선천면역, 심혈관조절등에관여하는단백질로 LPS나 cytokine, interferon 에의해활성화된전사인자인 NF-κB와 AP-1 (activating protein 1), IRF-1 가핵내로유입되어 inos gene을발현시키게되고이로인해생성된 NO가염증및면역반응에기여하게된다. 특히 inos 의발현은항산화효소를억제하게된다 [15]. Nrf2 또한주요기능인항산화와염증조절과암, 약제내성등에관여하는인자로서외부적스트레스 (ROS (Response oxidative stress), hydroperoxides, carbonyls, and quinones) 에의해활성화된 Nrf2가핵내의 ARE (antioxidant response element) 와결합함으로서 GSTA-2, NQO-1, GST, HO-1 과같은항산화, 해독효소를발현하여세포보호및세포생존에기여하게된다 [16]. 이러한 p38 MAPK 와밀접한관계에있는 inos 와 Nrf2의발현도를뇌와연수에서측정한결과 5% formalin 주입군에비하여헛개나무추출물주입군이유의하게감소하는경향을보였다. 즉헛개나무의항산화작용이안면염증통증조절및완화에관여했을것이다. 본실험의결과를종합하여볼때 5% formalin 으로유도한안면염증통증모델의행위반응의감소는헛개나무추출물이국소적안면통증조절에가능성이있음을보여주며, 염증통증조절인자인 p38 MAPK 와항산화인자인 inos, Nrf2가감소한것으로보아헛개나무추출물이염증성통증환자의통증조절대안물질로의가능성이있을것이라생각된다. References [1] H. Y. Lee, H. S. Kim, Y. S. Park, Hovenodulinol, an active compound extracted from Hovenia dulcis Thunb., a 5092
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한국산학기술학회논문지제 15 권제 8 호, 2014 이민경 (Min-Kyung Lee) [ 정회원 ] 구강생물학 2007 년 2 월 : 경북대학교치의학전문대학원치의학과 ( 치의학석사 ) 2011 년 2 월 : 경북대학교치의학전문대학원치의학과 ( 치의학박사 ) 2012 년 3 월 ~ 현재 : 동의대학교치위생학과조교수 현경예 (Kyung-Yae Hyun) [ 정회원 ] 혈액생리학 2006 년 8 월 : 부산가톨릭대학교보건과학대학원임상병리학과 ( 임상병리학석사 ) 2011 년 2 월 : 인제대학교식의학대학원임상병리학과 ( 임상병리학박사 ) 2010 년 3 월 ~ 현재 : 동의대학교임상병리학과조교수 김윤경 (Yun-Kyung Kim) [ 정회원 ] 2013년 3월 ~ 현재 : 동의대학교 일반대학원 보건의과학과 ( 석사과 정 ) 구강생물학 김기은 (Ki-Eun Kim) [ 준회원 ] 2014년 3월 ~ 현재 : 동의대학교 보건과학대학 임상병리학과 석사 재학중 혈액생리학 5094