Korean Journal of Microbiology (2014) Vol. 50, No. 2, pp. 95-100 DOI http://dx.doi.org/10.7845/kjm.2014.4016 Copyright c 2014, The Microbiological Society of Korea 보문 효모에서 Hrq1 과 Rad14 의상호작용에대한연구 민문희 1 김민지 1 최유진 2 유민주 2 김유라 2 안효빈 2 김채현 2 권채연 2 배성호 1 * 1 인하대학교자연과학대학생명과학과, 2 학익여자고등학교 Characterization of Hrq1-Rad14 Interaction in Saccharomyces cerevisiae Moon-Hee Min 1, Min-Ji Kim 1, You-Jin Choi 2, Min-Ju You 2, Uy-Ra Kim 2, Hyo-Bin An 2, Chae-Hyun Kim 2, Chae-Yeon Kwon 2, and Sung-Ho Bae 1 * 1 Department of Biological Sciences, College of Natural Science, Inha University, Incheon 402-751, Republic of Korea 2 Hakik Girls High School, Incheon 402-040, Republic of Korea (Received March 24, 2014 / Accepted May 29, 2014) Hrq1 is a novel member of RecQ helicase family, found in fungal genomes by bioinformatics analyses. It is most homologous to human RECQL4 and recent genetic and biochemical studies suggested that it may play roles in the maintenance of genome stability. In this study, we investigated yeast two-hybrid interactions between Hrq1 and the yeast genes homologous to the human genes that are known to interact with RECQL4. Among the 11 genes tested, Rad14, a nucleotide excision repair (NER) factor, was found to interact with Hrq1. In addition, pull-down assay with the purified proteins revealed direct protein-protein interaction between Hrq1 and Rad14. The yeast two-hybrid interaction was enhanced by the DNA damage induced by 4-nitroquinoline-1-oxide, which was dependent on the presence of Rad4, a key NER factor. These results suggest that Hrq1 may function in NER through interaction with Rad14. Keywords: Hrq1, nucleotide excision repair, Rad4, Rad14, RecQ helicase, RECQL4 orthologoue DNA 수선과정의일종인 nucleotide excision repair (NER) 경로는모든생물체에잘보존되어있으며, 자외선과같이 DNA 이중나선구조의뒤틀림을유발하는다양한 DNA 손상을수선할수있는기작이다 (Prakash and Prakash, 2000). NER은 DNA 손상을인식하는방법에따라 global genome repair (GGR) 와 transcription-coupled repair (TCR) 의두가지경로로나누어진다. 이두경로는 DNA 손상을인식하는초기단계에서는일련의서로다른단백질들이관여하지만, 그이후에는 DNA 손상확인, 이중나선풀기, 손상된가닥자르기등의공통된단계들을거친다 (Prakash and Prakash, 2000; Compe and Egly, 2012). 효모에서 GGR 또는 TCR에의해 DNA 손상이인식되면 Rad4 ( 인간 XPC의 orthologue) 가손상된 DNA 부위에결합하여공통수선과정을촉진한다. 손상된 DNA에결합한 Rad4는다음으로전사개시인자인 TFIIH를끌어들인다 (Riedl et al., 2003; Lafrance-Vanasse et al., 2013). TFIIH 복합체에는 helicase인 Rad25와 Rad3 ( 각각인간 XPB와 XPD의 orthologue) 가포함되어있는데, 이들은 DNA 손상부위를확인하고여는역할을한다. 그다음으로또다른손상된 DNA 결합단백질인 Rad14 ( 인 *For correspondence. E-mail: sbae@inha.ac.kr; Tel.: +82-32-860-7712; Fax: +82-32-874-6737 간 XPA의 orthologue) 과 RPA 등이결합하여 pre-incision 복합체를형성한다 (Mardiros et al., 2011; Compe and Egly, 2012). Rad14과 RPA는 pre-incision 복합체를안정화시키고 NER 특이적 endonuclease인 Rad1-Rad10 복합체 ( 인간 XPF-ERCC1의 orthologue) 와 Rad2 ( 인간 XPG의 orthologue) 를끌어들이는등 NER에서매우중요한역할을한다. Rad1-Rad10 복합체와 Rad2는각각손상부위의 5 쪽과 3 쪽을자른다 (Guzder et al., 2006; Tsodikov et al., 2007; Mardiros et al., 2011). 대장균의 RecQ helicase에서그이름을따온 RecQ helicase family는모든생물체에잘보존되어있으며유전체의안정성을유지하기위하여다양한역할을한다. 이효소는상동재조합과 DNA 수선과정의여러단계에관여하는것으로알려져있다 (Chu and Hickson, 2009; Bernstein et al., 2010). 인간에는 5가지 RecQ helicase (RECQL1, BLM, WRN, RECQL4, 그리고 RECQL5) 가있으며, 이중에서 BLM, WRN, RECQL4는각각인간의희귀유전질환인 Bloom syndrome, Werner syndrome, Rothmund-Thomson syndrome의원인유전자로알려져있다. 이유전질환들은유전체불안정성의증가로인한암소인의증가와조기노화라는공통점을갖는다 (Bohr, 2008). 고등진핵생물과는달리박테리아와하등진핵생물은하나의 RecQ helicase만을가지고있는것으로알려져있다 (Ashton and Hickson, 2010;
96 Min et al. Table 1. Candidate genes interacting with HRQ1 Human gene Yeast orthologs Description Cloning sites APE1 APN2 AP endonuclease, DNA repair BamHI, PstI BLM SGS1 RecQ family DNA helicase BamHI, SalI FEN1 RAD27 5' flap endonuclease EcoRI, PstI MCM10 MCM10 Initiation of DNA replication EcoRI, PstI P300 GCN5 Subunit of ADA and SAGA histone acetyltransferase BamHI, PstI PARP1 RAD55 Recombinational repair BamHI, PstI POLb POL4 DNA polymerase IV, DNA repair EcoRI, PstI RAD51 RAD51 Strand exchange protein BamHI, PstI TFAM NHP10 Subunit of the chromatin-remodeling complex INO80 EcoRI, PstI TOM20 TOM20 Subunit of the translocase of outer membrane complex EcoRI, PstI XPA RAD14 Damaged DNA binding, Nucleotide excision repair EcoRI, PstI Bernstein et al., 2010). 예를들어, Saccharomyces cerevisiae와 Schizosaccharomyces pombe는유일한 RecQ helicase로서각각 Sgs1과 Rqh1을가지고있다고알려져있다. 그러나생물정보데이터베이스분석에의해서새로운 RecQ helicase인 Hrq1이곰팡이와식물의유전체에존재한다고예측되었는데, 이유전자는인간의 RECQL4와가장높은유사성을보였다 (Barea et al., 2008). 그리고 S. pombe와 S. cerevisiae에서유전학적연구를통해서이유전자가세포내에서발현이되며기능을하는유전자임이밝혀졌다 (Groocock et al., 2012; Choi et al., 2013). S. pombe hrq1δ 돌연변이는유전체불안정성, DNA 재조합빈도, 그리고돌연변이발생빈도가증가하는표현형을보였으며, 상위 (epistasis) 분석을바탕으로 Hrq1은 NER 경로에관여할것으로제안되었다. S. cerevisiae hrq1δ 돌연변이도 DNA 재조합빈도와돌연변이발생빈도가증가하였으며, 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO) 또는 cisplatin에의한 DNA 손상에민감한표현형을보였다 (Choi et al., 2013). 뿐만아니라수순분리된재조합 Hrq1 단백질은다른 RecQ helicase 들처럼 3-5 helicase 활성과 DNA strand-annealing 활성을나타내었다 (Kwon et al., 2012). 본연구에서는 S. cerevisiae Hrq1의기능에대한보다구체적인실마리를얻기위하여 Hrq1과상호작용하는유전자를찾고자하였다. 그결과, NER에관여하는 Rad14이 Hrq1과 yeast two-hybrid 상호작용을보이는것을발견하였다. 뿐만아니라정제된단백질을이용한 pull-down assay를통하여단백질사이의직접적인상호작용을관찰하였다. 재료및방법균주, 배지및돌연변이제조 Yeast two-hybrid 분석을위하여 S. cerevisiae PJ69-4A (MATa trp1-901 leu2-3,112 ura3-52 his3-200 gal4δ gal80δ LYS2::GAL1-HIS3 GAL2-ADE2 met2::gal7-lacz) (James et al., 1996) 를사용하였다. 효모배양에사용한완전배지 (YPD) 와최소배지 (synthetic complete, SC) 는 Chris 등 (1994) 의방법을따랐다. 유전자삭제돌연변이제조에는 one-step gene replacement 방법 (Baudin et al., 1993) 을사용하였다. rad4δ 돌연변이를얻기위해서 RAD4 open reading frame (ORF) 의 5 또는 3 flanking region과 50 base-pair에걸쳐상동성을갖는 primer를사용하여 PCR 방법으로선발표시자 (URA3) 를증폭하였다. PCR 산물을 agarose gel에서정제한후 PJ69-4A 균주에형질전환하여 Ura + colony를얻었다. 얻어진 colony들중에서 RAD4 유전자가삭제된것들을 colony PCR 방법으로확인하였다. Yeast two-hybrid 분석 HRQ1과조사하려는유전자의 ORF를 Table 1에표시된제한효소자리를이용하여 pgbd-c1과 pgad-c1 plasmid (James et al., 1996) 에클로닝하였다. 양성대조군으로는 pgad-rnr2 와 pgbd-rnr4를사용하였다 (Choi et al., 2014). RNA2와 RNR4는효모의 ribonucleotide reductase를암호화하는유전자로서복합체를형성하여효소활성에필수적인작은소단위를구성한다 (Huang and Elledge, 1997; Wang et al., 1997). Two-hybrid 분석을위해서재조합 plasmid를 PJ69-4A 균주에형질전환시켰다. PJ69-4A 균주는 GAL4 promoter에의해조절되는 HIS3 reporter 유전자를가지고있기때문에 bait와 prey 단백질이상호작용하면 His + 표현형이나타나 histidine이없는배지에서성장할수있게된다. 따라서 two-hybrid 상호작용을관찰하기위해서재조합 plasmid로형질전환된효모균주배양액을 histidine이없는 SC 최소배지에 spotting한다음 30 에서 3 5 일간배양하면서효모의성장을관찰하였다. DNA 손상이 two-hybrid 상호작용에미치는영향을조사하기위해서는 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO, 10 ng/ml), cisplatin (20 μg/ml), 또는 methyl methanesulfonate (MMS, 0.005%) 를포함하는 SC 배지에효모배양액을 spotting하였다. 자외선의영향을관찰하기위해서는효모배양액을 SC 배지에먼저 spotting한다음자외선 (30 J/m 2 ) 을쪼여주고어두운곳에서배양하였다. Hrq1 과 Rad14 단백질정제 FLAG-Hrq1 재조합단백질을생산하기위해서 HRQ1 ORF 를 PCR 증폭하여 N-말단 FLAG-tag을가진 pfastbachtb plasmid (Invitrogen) 의 SacI-NotI 자리에클로닝하였다. 이재조합
Hrq1 과 Rad14 의상호작용 97 plasmid를이용하여제조사에서제공한방법대로 baculovirus를만들고 Sf9 곤충세포에감염시켜단백질을발현시켰다. FLAG- Hrq1의정제는 anti-flag M2 affinity gel (Sigma-Aldrich) 를사용하여 Kwon 등 (2012) 에기술된대로정제하였다. Strep-Rad14 를얻기위해서는 N-말단 14 아미노산이결여된 RAD14 ORF (Rodriguez et al., 1998) 를 PCR 증폭하여 N-말단 Strep-tag (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) 을가진 pet28a plasmid (Novagen) 의 EcoRI-XhoI 자리에클로닝하였다. 이재조합 plasmid를 BL21DE3(pLysS) 에형질전환시켜단백질을발현시키고 Strep-tactin bead (Qiagen) 를사용하여 Rodriguez 등 (1998) 에기술된대로정제하였다. 결과 Hrq1 과 Rad14 사이의 yeast two-hybrid 상호작용효모의 Hrq1과아미노산서열이가장비슷한 RecQ helicase 는인간 RECQL4이다 (Barea et al., 2008). RECQL4는비교적오랫동안연구되어왔으며다양한연구를통하여 RECQL4와상호작용하는것으로예상되는여러단백질들이알려져있다 (Croteau et al., 2012). 이러한단백질들의 orthologue들이효모에도존재하는데이를 Table 1에정리하였다. 만약 Hrq1이아미노산서열뿐만아니라기능적으로도인간 RECQL4의 orthologue 라면 Table 1에열거된효모유전자들이 Hrq1과상호작용할가능성이있을것이다. 따라서본연구에서는이들과 Hrq1 사이의상호작용을 yeast two-hybrid 방법으로조사하고자하였다. 각유전자들이클로닝된 pgad plasmid와 pgbd-hrq1을이용하여 yeast two-hybrid 실험을수행하였으며그결과의일부를 Fig. 1에보였다. Table 1에열거된 11개의유전자는모두 SC (+His) 배지에서효모의성장에영향을주지않았다 ( 자료미제시, Fig. 1 참조 ). SC (-His) 배지에서는음성대조군 (vector) 으로사용한 pgad 벡터만으로도 SC (-His) 배지에서어느정도성장을보였는데, 이보다더나은성장을보이는것은 RAD14 뿐이었다 (Fig. 1A). 그러나이상호작용도양성대조군으로사용한 RNR2 와 RNR4 사이의상호작용보다는약하였다. pgbd 벡터와 pgad-rad14 사이에는 two-hybrid 상호작용이나타나지않는것으로보아 (Fig. 3), Fig. 1의 SC ( His) 배지에서관찰되는효모의성장은 Hrq1과 Rad14 사이의상호작용에의한것으로판단된다. pgad-hrq1을사용하였을때에는 pgbd 벡터를넣어준음성대조군 (vector) 에서 background 성장이보이지않았다 (Fig. 1B). 동시에 RAD14를제외한다른유전자들에서도 SC (-His) 배지에서효모의성장을전혀관찰할수없었다. 그러나 RAD14의경우에는매우약하지만상호작용을관찰할수있었다. 따라서조사한유전자들중에 Rad14만이 Hrq1과약한 yeast two-hybrid 상호작용을하는것으로생각된다. Hrq1 과 Rad14 단백질의직접적인상호작용 Yeast two-hybrid assay보다는좀더직접적인방법으로 Hrq1과 Rad14의상호작용을관찰하기위하여 pull-down assay 방법을사용하고자하였다. 이를위하여염색체상의 HRQ1과 RAD14 유전자의 3 -말단쪽에각각 tandem affinity purification (TAP) tag과 hemagglutin (HA) tag을융합시킨균주를제조하고 pull-down 실험을수행하였다. 그러나 IgG bead를사용하여 Hrq1-TAP 융합단백질을침전시켰을때 Rad14-HA가같이침전되지않았다 ( 자료미제시 ). 반대로 Rad14-HA를침전시켰을때도 Hrq1-TAP의공동침전을관찰할수없었다 ( 자료미제시 ). 다음으로정제된단백질을이용하여 pull-down assay를수행해보았다. 이를위하여재료및방법에서설명한대로 FLAG-Hrq1 과 Strep-Rad14를발현시키고각각 anti-flag bead와 Streptactin bead를사용하여부분정제하였다 (Fig. 2A). 정제한두단백질을혼합하여일정시간동안정치한후, Strep-tactin bead로침전시키고 Western blotting으로분석하였다. 그결과, Strep-Rad14 과같이혼합한 FLAG-Hrq1의상당한양이 Strep-tactin bead에의해침전되는반면, Strep-Rad14이없는시료에서는 background 수준의 FLAG-Hrq1만이침전되었다 (Fig. 2B). 이것은 Hrq1이 Rad14과물리적으로직접적인상호작용을한다는것을뒷받침하는결과이다. 그러나높은이온농도 (300 mm NaCl) 에서는 Fig. 1. Spotting test for yeast two-hybrid interactions between Hrq1 and the selected candidate genes. The candidate genes transformed into PJ69-4A strain are indicated at the left of the figure. PJ69-4A strain was transformed with pgbd-hrq1 and pgad-x (A) or pgad-hrq1 and pgbd-x (B), where X is one of the candidate genes. RNR2+RNR4 and vector denote the positive and negative controls, respectively. After transformants were grown to saturation, serial 10-fold dilutions were spotted onto SC media plus histidine (+His) or minus histidine (-His), followed by incubation for 3 5 days at 30.
98 Min et al. Fig. 2. Co-precipitation of Hrq1 and Rad14 proteins. (A) Coomassie staining of purified Hrq1 (3.5 μg) and Rad14 (3.5 μg) separated on SDS-PAGE (10%). M denotes molecular size markers. (B) Western blot showing precipitation of Strep-Rad14 and co-precipitation of FLAG-Hrq1. FLAG-Hrq1이침전되지않는것으로보아 ( 자료미제시 ), 정제된단백질사이의상호작용은일시적이고매우약할것으로생각된다. 따라서 Hrq1과 Rad14 단백질사이의상호작용이특이적이기보다는정제된단백질사이의비특이적인전기적또는소수성상호작용일가능성을배제할수는없다. 4-NQO 특이적 DNA 손상에의한 Hrq1-Rad14 상호작용의촉진 RAD14는 NER에관여하는유전자이기때문에 Hrq1과 Rad14 사이의상호작용은 Hrq1이 NER 과정에서어떤역할을할가능성을제기한다. 만약그렇다면 DNA 손상에의한 NER 활성화가 Hrq1과 Rad14 사이의상호작용에영향을줄수도있다고생각하였다. 이를확인하기위하여 재료및방법 에설명한대로 4-NQO, cisplatin, MMS, 또는자외선을처리하여효모의 DNA에손상을가하고 30 에배양하면서 two-hybrid 상호작용을관찰하였다 (Fig. 3). 4-NQO에의한 DNA 손상은아무것도처리하지않았을때와비교하여양성대조군 (RNR2와 RNR4) 의상호작용을약간약화시켰다. 그러나 Hrq1과 Rad14 사이의상호작용은오히려상대적으로증가하는것을발견하였다. 이러한현상은여러번의반복실험에서일관되게관찰되었으며, 그 중에한결과를 Fig. 3에보였다. 그러나 DNA 손상에의한 Hrq1-Rad14 상호작용의촉진은 4-NQO를처리했을때만특이적으로관찰되었다. 즉, cisplatin, MMS, 그리고자외선에의한 DNA 손상은 Hrq1-Rad14 상호작용을촉진시키지않았다 (Fig. 3). 이러한결과로미루어 Hrq1은 NER을활성화시키는모든종류의 DNA 손상을수선하는데관여한다기보다는어떤특정한손상의수선과정에만작용할것으로생각된다. Rad4 에의존적인 Hrq1-Rad14 상호작용의촉진 NER에서 Rad14의작용은 Rad4에의존적이다. Rad4는 NER 인자들중에가장상위단계에서작용하며 NER이활성화되는데필수적이다. GGR이나 TCR에의해 DNA 손상이인식되면 NER에공통적으로작용하는인자들이손상된 DNA 부위에차례로조립되는데, 이때 Rad4가가장먼저결합하여다른인자들을끌어들임으로써수선기구조립에핵심적인역할을한다 (Prakash and Prakash, 2000; Riedl et al., 2003; Lafrance-Vanasse et al., 2013). 따라서 4-NQO에의한 Hrq1-Rad14 상호작용촉진이 NER 활성화때문이라면, 이과정은 Rad4에의존적일가능성이있다. 이를조사하기위하여 rad4δ 돌연변이를제조하고이 Fig. 3. Yeast two-hybrid interactions between Hrq1 and Rad14. The plasmids transformed into PJ69-4A strain are indicated at the left of the figure. After transformants were grown to saturation, serial 10-fold dilutions were spotted onto SC media plus histidine (+His) or minus histidine (-His), followed by incubation for 3 5 days at 30. To induce DNA damage, 4-NQO (10 ng/ml), cisplatin (20 μg/ml), or MMS (0.005%) was added to the SC plates. To test the effect of UV irradiation, cells spotted on SC plates were irradiated with UV (30 J/m 2 ).
Hrq1 과 Rad14 의상호작용 99 균주에서 yeast two-hybrid 실험을수행하였다 (Fig. 4). 아무것도처리하지않았을때 (none) 야생형균주에서관찰되던수준의 Hrq1-Rad14 상호작용이 rad4δ 돌연변이에서도관찰되었다. 그러나 4-NQO를처리했을때야생형에서관찰되던상호작용의촉진은더이상관찰되지않았다 (Figs. 3 and 4). 따라서기본적인수준의 Hrq1-Rad14 상호작용에는 Rad4가필요하지않으나 DNA 손상에의해상호작용이촉진되기위해서는 Rad4가필수적이라고생각된다. 고찰본연구에서는 Hrq1과상호작용할가능성이있는유전자들을대상으로 yeast two-hybrid assay를수행하여 Rad14이 Hrq1 과상호작용이있는것을발견하였다. 또한정제한단백질을이용한 pull-down assay로 Hrq1과 Rad14 사이의직접적인상호작용이확인되었다. Hrq1과 Rad14 사이의 two-hybrid 상호작용은 4-NQO 처리에의해증가하였으며, 이러한상호작용의증가는 Rad4에의존적인것으로보아 NER의활성화와관련이있을것으로생각된다. 최근본연구진은상위분석을통해서 RAD4 유전자가 HRQ1의상위에서작용한다는것을보고하였다 (Choi et al., 2014). 이연구에서여러가지 DNA 수선돌연변이들과 hrq1δ 이중돌연변이는단일돌연변이들보다 4-NQO에대한민감성이증가한반면, rad4δ 돌연변이에대해서는 hrq1δ 돌연변이가아무런영향을주지않았다. 이러한결과는 Hrq1-Rad14 two-hybrid 상호작용의증가가 Rad4에의해영향을받는다는 Fig. 4의결과와일치하는것이다. 뿐만아니라 Hrq1과 Rad4 사이에도 two-hybrid 상호작용이관찰되었다 (Choi et al., 2014). 그러나 Hrq1과 Rad14 사이의 two-hybrid 상호작용은 rad4δ 돌연변이 background에서도관찰되기때문에 (Fig. 4), 두단백질사이의상호작용이 Rad4를매개로하는간접적인상호작용같지는않다. 더구나 pull-down assay는정제한 Hrq1과 Rad14 단백질을사이의직접적인상호작용을보여주고있다 (Fig. 2). 따라서 Hrq1은 Rad14 뿐만아니라 Rad4와도직접적인상호작용 을할것으로예상된다. Hrq1과 Rad14 사이의상호작용이 NER의활성화과정과관련이있다면분명히손상된 DNA 부위에서상호작용이일어나야한다. 그런데 yeast two-hybrid assay는 GAL promoter 상에서 BD-융합단백질과 AD-융합단백질사이에서일어나는상호작용을관찰하는것이다. 따라서 4-NQO 처리에의한 Hrq1-Rad14 two-hybrid 상호작용의증가는 Rad14가손상된 DNA에결합하는것과는무관할것이다. 아마도 DNA 손상에의해 NER 인자들이활성화되면 DNA에결합하지않고도어느정도상호작용이증가한다고추측된다. 또다른가능성으로는 Fig. 3의실험은효모가비교적높은농도의 4-NQO에지속적으로노출되어끊임없이 DNA 손상을받는조건이므로우연히 GAL promoter 부위에 DNA 손상이가해지면 NER 인자들이조립되면서 two-hybrid 상호작용이증가하는것일수도있다. 인간세포에서 RECQL4는 XPA (Rad14의인간 orthologue) 와의상호작용을통해서자외선에의해손상된 DNA 수선에관여하는것으로보고되었다 (Fan and Luo, 2008). S. pombe Hrq1 도 Rhp14 (Rad14의 S. pombe orthologue) 과물리적인상호작용을하는것이공동면역침전 (co-immunoprecipitation) 방법으로확인되었다 (Groocock et al., 2012). 따라서본연구에서관찰된 Hrq1과 Rad14 사이의 two-hybrid 상호작용은위의연구들과일치하는결과이다. 그러나위에서언급한바와같이본실험에서는 Hrq1-TAP과 Rad14-HA의공동침전을관찰할수없었다. 이것은 Hrq1과 Rad14의상호작용이매우약하거나일시적이기때문일가능성이있다. 또다른가능성으로는면역침전을쉽게하기위하여붙인 tag이단백질상호작용에입체장애를일으킬가능성이다. Yeast two-hybrid를위한 plasmid는단백질의 N-말단부위에 AD 또는 BD를융합시키도록디자인되어있지만, TAP 과 HA tag은염색체상의유전자의 3 -말단에삽입하여단백질의 C-말단과융합되도록디자인되어있다. 만약 Hrq1과 Rad14 의 C-말단이단백질상호작용에중요하다면본연구에서사용한융합단백질로는상호작용을관찰할수없을것이다. 따라서 N- 말단에 tag이융합된단백질을제조하여실험할필요성이있다. Fig. 4. Effect of rad4δ on yeast two-hybrid interactions between Hrq1 and Rad14. The plasmids transformed into the rad4δ strain are indicated at the left of the figure. After transformants were grown to saturation, serial 10-fold dilutions were spotted onto SC media plus histidine (+His) or minus histidine (-His), followed by incubation for 3 5 days at 30. To induce DNA damage, 4-NQO (10 ng/ml) or cisplatin (20 μg/ml) was added to the SC plates.
100 Min et al. NER 과정에는많은인자가관여하며 NER 인자사이의복잡한상호작용에의해서손상된 DNA에 NER 인자들이순차적으로조립하게된다 (Prakash and Prakash, 2000). 따라서 Hrq1의구체적인기능을연구하기위해서는보다많은 NER 인자들과의상호작용을조사해야할것이다. 뿐만아니라 Hrq1 helicase 활성의특성을보다면밀히연구하는것도이새로운 helicase의기능을밝히는데중요할것으로생각된다. 적요 Hrq1은곰팡이유전체에서생물정보분석에의해발견된새로운 RecQ helicase이다. 이단백질은인간의 RECQL4와가장상동성이높으며최근의유전학적생화학적연구를통해서유전체안정성을유지하는데어떤역할을할것으로예상되었다. 본연구에서는 RECQL4와상호작용하는것으로알려진인간유전자들과상동성이있는효모유전자들이 Hrq1과상호작용하는지를 yeast two-hybrid assay를이용하여조사하였다. 총 11개의유전자를조사한결과, nucleotide excision repair (NER) 인자중의하나인 Rad14이 Hrq1과상호작용하는것을발견하였다. 또한정제한단백질을이용한 pull-down assay로 Hrq1과 Rad14 사이의직접적인상호작용을확인하였다. Hrq1과 Rad14 사이의 yeast two-hybrid 상호작용은 4-nitroquinoline-1-oxide에의한 DNA 손상으로더욱증가하였으며, 이러한상호작용의증가는또다른 NER 인자인 Rad4에의존적이었다. 이러한결과들은 Hrq1이 Rad14과의상호작용을통하여 NER 과정에어떤역할을할가능성을제시하고있다. 감사의말 이논문은한국연구재단 (2012R1A1A2009053) 의연구비로수행되었습니다. References Ashton, T.M. and Hickson, I.D. 2010. Yeast as a model system to study RecQ helicase function. DNA Repair 9, 303 314. Barea, F., Tessaro, S., and Bonatto, D. 2008. 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