한국생물공학회지제 19 권제 1 호 Korean J. Biotechnol. Bioeng. Vol. 19, No. 1, 50-56(2004) 방향족화합물인 Aniline, Benzoate, p-hydroxybenzoate 를분해하는 Delftia sp. JK-2에서분리된 Dioxygenases 의특성연구 황선영 천재우 1 강형일 오계헌순천향대학교생명과학부, 1 순천대학교환경교육과 ( 접수 : 2003. 11. 15., 게재승인 : 2004. 2. 25.) Characterization of different Dioxygenases isolated from Delftia sp. JK-2 capable of degrading Aromatic Compounds, Aniline, Benzoate, and p-hydroxybenzoate Seon-Young Hwang, Jae-Woo Chun, Hyung-Yeel Kahng 1, and Kye-Heon Oh Department of Life Science, Soonchunhyang University, P.O. Box 97, Asan, Chungnam 336-600, Korea 1 Department of Environmental Education, Sunchon University, Jeonnam 540-742, Korea (Received : 2003. 11. 15., Accepted : 2004. 2. 25.) The aim of this work was to investigate the purification and characterization dioxygenases isolated from Delftia sp. JK-2, which could utilize aniline, benzoate, and p-hydroxybenoate as sole carbon and energy source. Catechol 1,2-dioxygenase (C1,2O), catechol 2,3-dioxygenase(C2,3O), and protocatechuate 4,5-dioxygenase(4,5-PCD) were isolated by benzoate, aniline, and p-hydroxybenzoate. In initial experiments, several characteristics of C1,2O, C2,3O, and 4,5-PCD separated with ammonium sulfate precipitation, DEAE-sepharose, and Q-sepharose were investigated. Specific activity of C1,2O, C2,3O, and 4,5-PCD were approximately 3.3 unit/mg, 4.7 unit/mg, and 2.0 unit/mg. C1,2O and C2,3O demonstrated their enzyme activities to other substrates, catechol and 4-methylcatechol. 4,5-PCD showed the specific activity to the only substrate, protocatechuate, but the substrates(e.g., catechol, 3-methylcatechol, 4-methylcatechol, 4-chlorocatechol, 4-nitrocatechol) did not show any specific activities in this work. The optimum temperature of C1,2O, C2,3O, and 4,5-PCD were 30, and the optimal phs were approximately 8, 8, and 7, respectively. Ag +, Hg +, Cu 2+ showed inhibitory effect on the activity of C1,2O and C2,3O, but Ag +, Hg +, Cu 2+, Fe 3+ showed inhibitory effect on the activity of 4,5-PCD. Molecular weight of the C1,2O, C2,3O, and 4,5-PCD were determined to approximately 60 kda, 35 kda, and 62 kda by SDS-PAGE. Key Words : Delftia sp. JK-2, aniline, benzoate, p-hydroxybenzoate, dioxygenases 1) 서론 다양한형태의방향족화합물이자연계에서식물을구성하는성분으로존재하고있으나, 현대사회에들어서면서많은산업공정을통하여대량으로생산되어소비되고있다. 이렇게생성되어진이들화합물이환경에유입되면토양및수생태계에잔류하여독성을나타내기때문에환경오염물질로 Corresponding Author : Department of Life Science, Soonchunhyang University, P.O. Box 97, Asan 336-600, Chungnam, Korea Tel : +82-41-530-1353, Fax : +82-41-530-1350 E-mail : kyeheon@sch.ac.kr 인식되고있다 (1, 2). 환경에노출된방향족화합물들은주로호기성세균의산화적분해경로를이용하여효과적으로분해되는데, 미생물의방향족화합물분해는초기단계에서산화반응 (oxidation), 하이드록시화반응 (hydroxylation), 탈수소화반응 (dehydrogenation) 을거치면서주요중간대사산물인 catechol 과 protocatechuate 등으로전환된다. 이들전환된 catechol 과 protocatechuate 은고리계열에서중요한역할을하는효소인 dioxygenases 에의해촉매반응이진행된다 (3, 4). Catechol 의경우 dioxygenases 에따라두가지분해경로를가질수있는데, catechol 1,2-dioxygenase(C1,2O) 에의한 ortho-cleavage 와 catechol 2,3-dioxygenase(C2,3O) 에의한 meta-cleavage 가있다 (2, 3, 5). C1,2O 는 catechol 작용하여 2 개의산소가붙게되면서 cis, cis-muconate 를생성한다. 이 50
Hwang, S. Y., Characterization of Dioxygenases isolated from Delftia sp. JK-2 51 작용에의해서방향족고리가열리게되고 β-ketoadipate 경로를통해최종적으로미생물이직접적으로이용할수있는 succinate 와 acetyl CoA 로분해된다. C2,3O 도마찬가지로 catechol 에두개의산소가붙게되면 2-hydroxymuconic semialdehyde 를형성한다. 이작용으로고리가열리고최종적으로 pyruvate 와 acetaldehyde 로분해되는것으로보고되고있다 (3). Protocatechuate 는일반적으로 3 가지의 dioxygeanases 가방향족고리를여는것으로보고되고있는데, 그 3 가지는 protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD), protocatechuate 4,5-dioxygenase (4,5-PCD), 그리고 protocatechuate 2,3- dioxygenase (2,3-PCD) 이다. 일반적으로대부분 ortho-cleavage 인 protocatechuate 3,4-cleavage 분해경로와 meta-cleavage 인 protocatechuate 4,5-cleavage 분해경로를이용한다 (4). 방향족화합물을분해하는세균에서 dioxygenases 에대한효소학적실험과분자유전학적실험들은지금까지많이이루어져있다 (6-14). 또한하나의균주로다양한기질을이용하여기질에따라다른 dioxygenases 를조사하는실험도이루어지고있다. Ground 등 (11) 은 quinate 와 p-hydroxybenzoate 를이용하는 actinomycetes 를이용하여 C1,2O, 3,4-PCD, 그리고 4,5-PCD 이외에 2 가지의효소의활성실험을하였고, Acinetobacter calcoaceticus DSM 586 에서 trans-ferulic acid 와 p-coumaric acid 의분해연구에서는 C1,2O, 3,4-PCD, 그리고 gentisate 1,2-dioxygenase 의활성이있는것을확인하였다 (15). 본연구에서는도시폐수처리장의활성슬러지에서분리한 Delftia sp. JK-2 에서기질을 benzoate, aniline, p-hydroxybenzoate 로배양함에따라분리정제된 C1,2O, C2,3O, 그리고 4,5-PCD 에대하여다양한환경조건에서활성도측정을실시하였고, 이효소의특성과저해요인에대한조사를실시하였다. 균주의확보및배양조건 재료및방법 천안소재폐수처리장으로부터수거된활성슬러지로부터 aniline 을분해하는 Delftia sp. JK-2 를분리ㆍ동정하였다. C1,2O 의분리에사용된배지는증류수 1 L 당 1 g K 2HPO 4, 1 g KH 2PO 4, 0.41 g MgSO 4 ㆍ 7H 2O, 0.05 g FeSO 4 ㆍ 7H 2O, 0.02 g CaCO 3 에단일탄소원으로 5 mm 의 benzoate 와질소원으로 10 g 의 NH 4Cl 이포함된액체무기배지를사용하였다. C2,3O 의분리에사용된배지는증류수 1 L 당 1 g K 2HPO 4, 1 g KH 2PO 4, 0.41 g MgSO 4 ㆍ 7H 2O, 0.05 g FeSO 4 ㆍ 7H 2O, 0.02 g CaCO 3 에단일탄소원및질소원으로 1 g 의 aniline 을포함하는액체무기배지를사용하였으며, 4,5-PCD 의분리에이용된배지는증류수 1 L 에 1 g K 2HPO 4, 1 g KH 2PO 4, 0.41 g MgSO 4 ㆍ 7H 2O, 0.05 g FeSO 4 ㆍ 7H 2O, 0.02 g CaCO 3 와단일탄소원으로 5 mm 의 p-hydroxybenzoate 와질소원으로 10 g 의 NH 4Cl 이포함된액체무기배지를이용하였다. 이배지에접종된 Delftia sp. JK-2 는 30 에서 150 rpm 으로진탕배양하였다. Delftia sp. JK-2 에대한생리ㆍ생화학적특성, 그리고 16s rdna 염기서열의계통수분석 (phylogenetic tree) 결과는이미보고된바있다 (16). Dioxygenases의분리배양한 Delftia sp. JK-2는효소분리를위해분광광도계 (V-550 UV/Vis Spectrophotometer, Jasco Co., Japan) 를이용하여 660 nm에서 O.D. 값이 0.8일때 250 ml의원심분리튜브에넣고 8,000 rpm에서 10분간원심분리를실시하였고, 50 mm Tris-HCl buffer (ph 8.0) 로 3회세척하였다. 준비된세포는초음파파쇄기 (Fisher M-300, Pittsburgh, PA, USA) 로 30초간 30회반복하여파쇄하였다. 파쇄한용액은원심분리 (13,000 rpm, 30 min, 4 ) 하여상등액을취하였다. 상등액을 30% 포화 ammonium sulfate를만들기위해천천히교반하면서, L 당 176 g의 ammonium sulfate (Sigma Co. St. Louis, MO, USA) 를첨가하여한시간동안반응하였다. 10,000 rpm에서 20분간원심분리하여침전물을제거하고상등액을취하였다. 다시상등액에 L 당 160 g의 ammonium sulfate를위와같은방법으로첨가하여 55% 포화 ammonium sulfate를만들어 10,000 rpm에서 20분간원심분리하여침전물을획득하였다. 침전물을 7 ml의 50 mm Tris-HCl buffer (ph 8.0) 에 30 분간완전히재현탁하였다. 50 mm Tris-HCl buffer (ph 8.0) 에녹인침전물을투석막 (Sigma Co. St. Louis, MO, USA) 에넣고 1 L의 50 mm Tris-HCl buffer (ph 8.0) 에서 10 시간이상투석후새로운 buffer에서다시투석을실시하였다. 투석을실시한용액을 DEAE-Sepharose 컬럼 (2.5 20 cm) 에주입하여 NaCl의농도를 0.1에서 0.5 M로증가시키면서 1.25 ml/min의유속으로용액을용출하였다. 위의과정까지는 C1,2O와 C2,3O, 그리고 4,5-PCD 모두같은과정으로이루어졌다. 용출액은 C1,2O의활성이있는부분을모아서단백질정량을실시하고, Q-Sepharose 컬럼에주입하여위의컬럼용출방법과동일하게실시하고유속은 1.0 ml/min으로용액을용출하였다. 4,5-PCD도동일한방법으로실시하였다. C2,3O의경우용출액에 C2,3O의활성이있는부분을모아서단백질정량을실시하고, 다시 DEAE-Sepharose 컬럼에주입하여같은방법에 1.0 ml/min의유속으로용액을용출하였다. 용출액은분취기로모아서효소활성측정을통해효소를분리하였고분리한용액은 Bradford 방법 (17) 을이용하여단백질정량을실시하였다. SDS-PAGE 컬럼을통해분리된 C1,2O, C2,3O, 그리고 4,5-PCD 는 Bollag 등의방법 (18) 을이용하여 SDS-PAGE 를실시하였다. Separating gel 은 12% 의 acrylamide gel 을사용하였고, stacking gel 은 5% 의 acrylamide gel 을사용하여전개하였다. 시료는 Bradford 방법으로단백질정량을실시하여동일량의단백질을주입하였고, 1 sample buffer 로양을맞추었다. 시료를 5 분간끓이고, 얼음에식힌후주입하였다. 표지단백질은 prestained SDS-PAGE Standard (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 를사용하였다. 전기영동은 100 V 에서 2 시간 30 분간실시하였다, 전기영동이끝난 gel 은 gel staining solution (0.1% Coomassie blue R-250, 45% methanol, 10% glacial acetic acid) 으로 2 시간염색하였고, gel destaining solution Ⅰ (10% methanol, 10% glacial acetic acid) 으로 1 시간동안처리한후, gel destaining solution Ⅱ (5% methanol, 7% glacial acetic acid) 으로 8 시간처리하였다.
52 Korean J. Biotechnol. Bioeng., Vol. 19, No. 1 Dioxygenases 의활성측정 C1,2O 의활성측정은 Aoki 방법 (6) 에의해서실시하였다. 50 mm Tris-HCl buffer (ph 8.0) 1.98 ml 에 100 mm catechol 이 10 μl 와효소용액을 10 μl 첨가하여, 260 nm 에서흡광도를측정하였다. 반응산물인 cis,cis-muconate 의몰흡광계수 (molar extinction coefficient) 는 19,000 M -1 cm -1 이며, 1 unit 를 24 에서분당 1 μmole 의 cis,cis-muconate 를생산하는효소량으로정하고특이활성도 (specific activity) 는 unit/mg 으로정하였다. C2,3O 의활성측정은 2-hydroxymuconic semialdehyde 의생성에의해측정되는 Aoki 방법 (7) 에의해서실시되었다. 1.98 ml 의 50 mm Tris-HCl buffer (ph 8.0) 에 10 μl 의 100 mm catechol, 그리고효소의정제과정을통하여분리된시료를첨가하여 375 nm 에서측정하였다. 반응산물인 2-hydroxymuconic semialdehyde 의몰흡광계수는 33,000 M -1 cm -1 이며, 1 unit 를 24 에서분당 1 μmole 의 2-hydroxymuconic semialdehyde 를생산하는효소량으로정하고특이활성도는 unit/mg 으로정하였다. 4,5-PCD 의활성측정은 4-carboxy-2-hydroxymuconate- 6-semialdehyde (CHMS) 의생성에의해측정되는방법 (11) 으로실시하였다. 1.98 ml 의 50 mm potassium phosphate buffer (ph 7.0) 에 10 μl 의 50 mm protocatechuate, 그리고효소의정제과정을통하여분리된시료를첨가하여 410 nm 에서측정하였다. 반응산물 4-carboxy-2-hydroxymuconate- 6-semialdehyde 의몰흡광계수는 29,000 M -1 cm -1 이었으며, 1 unit 를 24 에서분당 1 μmole 의 4-carboxy-2-hydroxymuconate-6- semialdehyde 를생산하는효소량으로정하고특이활성도는 unit/mg 으로정하였다. Table 1. Purification of dioxygenases, (A) C1,2O, (B) C2,3O, and (C) 4,5-PCD isolated from Delftia sp. JK-2 Dioxygenases 의특성조사 C1,2O 와 C2,3O, 그리고 4,5-PCD 의기질특이성을알아보기위해서 catechol 과유사한기질인 3-methylcatechol, 4-methylcatechol, 4-chlorocatechol, 그리고 4-nitrocatechol 을 0.33 mm 의동일한농도로첨가하였고, protocatechuate 는 0.165 mm 의농도로첨가하여실시하였다. 온도에따른효소활성변화의실험은 25-45 에서효소를 catechol 과 10 분간반응시키고 0.4 N HCl 로반응을멈추게한후 375 nm 에서흡광도를측정하였다. 효소활성의최적 ph 를조사하기위하여 50 mm potassium phosphate buffer 를 ph 5.0-7.0 으로변화시켜활성측정을하였고, 50 mm Tris base buffer 를이용하여 ph 8.0-12.0 에서의효소활성을측정하였다. 효소활성의억제제에대한실험에서는억제제의최종농도가 0.1 mm 이되게첨가한후에 2 분간효소반응을실시하였다. 결과및고찰 Dioxygenases 의분리및정제 (1) Catechol 1,2-dioxygenase Crude extract 상태인효소용액의단백질을 30-55% 의 ammonium sulfate 침전을통하여절반이상으로줄였으며, 음이온교환체인 DEAE-sepharose 컬럼과 Q-sepharose 컬럼을통과하여하여최종적으로얻어진효소는 crude extract 비하여 10 배이상농축된것으로나타났다. 최종적으로분리된효소는회수율이 9.1% 로조사되었고, 특이활성 (specific activity) 은 3.3 unit/mg 을나타냈다. Table 1(A) 은각정제단계에서분리해낸효소용액의단백질정량과효소활성을보여주고있다. 각단계에서얻은시료를 SDS-PAGE 상에전개하여 (A) C1,2O Purification step Vol. (ml) Total protein (mg) Total activity (U) Specific activity (unit/mg) Recovery of activity (%) Purification factor Crude extract 21.0 120.7 38.2 0.3 100.0 1.0 Ammonium sulfate 7.0 42.3 30.3 0.7 79.4 2.3 DEAE-sepharose FF 5.0 8.8 16.9 1.9 44.2 6.1 Q-sepharose 2.0 1.1 3.5 3.3 9.1 10.6 (B) C2,3O Purification step Vol (ml) Total protein (mg) Total activity (U) Specific activity (unit/mg) Recovery of activity (%) Purification factor Crude extract 21.0 100.8 44.0 0.4 100.0 1.0 Ammonium sulfate 7.0 35.0 40.1 1.2 91.2 2.6 DEAE-sepharose FF 5.0 10.0 29.9 3.0 68.0 6.8 DEAE-sepharose FF 2.0 0.8 3.8 4.7 8.6 10.8 (C) 4,5-PCD Purification step Vol (ml) Total protein (mg) Total activity (U) Specific activity (unit/mg) Recovery of activity (%) Purification factor Crude extract 21.0 132.7 24.0 0.2 100.0 1.0 Ammonium sulfate 7.0 38.2 15.5 0.4 64.5 2.3 DEAE-sepharose FF 5.0 7.5 9.5 1.3 39.3 7.1 Q-sepharose 2.0 0.8 1.7 2.0 7.1 11.4
Hwang, S. Y., Characterization of Dioxygenases isolated from Delftia sp. JK-2 53 C2,3O 의정제여부를확인하였고, 최종적으로정제된 C2,3O 의분자량이약 60 kda 임이관찰되었다 (Fig. 1). 본연구에서정제된 C1,2O 의분자량은 60 kda 인데반해 Frateuria sp. ANA-18 에서 38 kda 과 36 kda 인 CD Ⅰ 과 CD Ⅱ 를분리하였고 (6), Acinetobacter calcoacticus ADP-96 에서는분자량이 40 kda 인 C1,2O 가확인되었다 (19). (2) Catechol 2,3-dioxygenase Crude extract 상태인효소용액의단백질양을 30-55% 의 ammonium sulfate 침전을통하여절반이상으로줄였으며, 음이온교환체인 DEAE-Sepharose 컬럼에서두차례용출하여최종적으로얻어진효소는 crude extract 비하여 10 배이상농축된것으로나타났다. 최종적으로분리된효소는회수율이 8.6% 로조사되었고, 특이활성은 4.7 unit/mg 이었다. Table 1(B) 은각정제단계에서분리해낸효소용액의단백질정량과효소활성을보여주고있다. 각단계에서얻은시료를 SDS-PAGE 상에전개하여 C2,3O 의정제여부를확인하였고, 최종적으로정제된 C2,3O 의분자량이약 35 kda 임을관찰하였다 (Fig. 1B). Gibson 등 (20) 이보고한 Comamonas sp. JS765 에서분리된 C2,3O 는 35 kda 으로알려졌고, Alcaligenes sp. KF711 로부터분리된 C2,3O 의분자량이 35 kda 임을나타내는것으로보고된바있다 (21). (3) Protocatechuate 4,5-dioxygenase Crude extract 상태인효소용액의단백질양은 30-55% 의 ammonium sulfate 침전을통하여절반이상으로줄었으며, 음이온교환체인 DEAE-Sepharose 컬럼과 Q-Sepharose 컬럼을통과하여최종적으로얻어진효소는 crude extract 비하여 11배이상농축된것으로나타났다. 최종적으로분리된효소의회수율은 7.1% 로조사되었으며, 고유활성은 2.0 unit/mg을나타내었다. Table 1C는각정제단계에서분리해낸효소용액의단백질정량과효소활성을보여주고있다. 각단계에서얻은시료를 SDS-PAGE 상에전개하여 C2,3O의정제여부를확인하였고, 최종적으로정제된 4,5-PCD의분자량이약 62 kda임을관찰하였다 (Fig. 1C). Arciero등 (22) 이분리한 4,5-PCD는 2개의 α-subunit과 2개의 β-subunit이 α 2β 2 로서분 자량은약 103 kda 이며, α-subunit 과 β-subunit 의분자량은각각 17.7 kda 과 33.8 kda 으로보고되었다. p-hydroxybenzoate 에서배양된 Rhizobium leguminosarum 에서분리된 4,5-PCD 는 homodimer 로분자량이 120 kda 의크기로하나의 subunit 의분자량이 62 kda 인것이연구된바있다 (23). 본연구에서분리된 4,5-PCD 는 SDS-PAGE 상에서단일 band 로나타났으며분자량도 62 kda 으로상기연구에서보고된 subunit 의크기와동일하였으나, 실제로아미노산이나염기서열의비교를통하여상동성을확인하여야할것으로판단된다. 기질특이성 (1) Catechol 1,2-dioxygenase 분리된 C1,2O로 catechol과그의유사체인다양한기질에대한 C1,2O의기질특이성을조사하였다. JK-2에서분리된 C1,2O의경우는 catechol과 4-methylcatechol에대해서는각각 100% 와 31.4% 의활성이나타났고, 3-methylcatechol과 protocatechuate는 7.8% 와 2.3% 의미약한활성이관찰되었고, 4-chlorocatechol과 4-nitrocatechol은전혀활성을나타내지않았다 (Table 2). Acinetobacter calcoacticus ADP-96에서분리된 C1,2O는 catechol을비롯하여 4-methylcatechol, 3-methylcatechol, 그리고 2-isopropylcatechol에서활성을나타내었으며이를통하여볼때이균주는넓은범위의기질특이성을갖는것으로보고되었다 (19). Table 2. Substrate specificity of dioxygenases, C1,2O, C2,3O, and 4,5-PCD Substrates Concentration Relative activity (%) (mm) C1,2O C2,3O 4,5-PCD Catechol 0.33 100.0 100.0 0.0 3-Methylcatechol 0.33 7.8 0.0 0.0 4-Methylcatechol 0.33 31.4 13.8 0.0 4-Chlorocatechol 0.33 0.0 0.0 0.0 4-Nitrocatechol 0.33 0.0 0.0 0.0 Protocatechuate 0.17 2.3 3.5 100.0 kda 200 116 97.4 66 45 kda 209 124 49.1 kda 200 116 97.4 66 31 34.8 45 21.5 28.9 31 A B C D E (A) A B C D E (B) A B C D E (C) Figure 1. SDS-PAGE of purified dioxygenases, (A) C1,2O, (B) C2,3O, and (C) 4,5-PCD. A: marker (myosin-209 (200), β-galactosidase-124 (116), bovine serum albumin- (97.4), ovalbumin-49.1 (66), carbonic anhydrase-34.8 (45), soybean trypsin inhibitor-28.9(31)), B: crude cell extract, C: 30-55% saturated ammonium sulfate D: DEAE-Sepharose E: Q-Sepharose.
54 Korean J. Biotechnol. Bioeng., Vol. 19, No. 1 (2) Catechol 2,3-dioxygenase 분리된 C2,3O 의경우기질로 catechol (100%) 을이용하였으며, 4-methylcatechol 도일부 (13.8%) 이용하는것으로관찰되었다. 그러나 catechol 의유사기질인 3-methylcatechol, 4-chlorocatechol, 4-nirtocatechol 등은기질로이용하지못하는것으로조사되었다. Aniline 을포함하는액체배지에배양하여얻은 C2,3O 는특정기질에대해서만활성을갖는것으로나타났다 (Table 2). Cerdan 등 (9) 은 Pseudomonas putida 에존재하는 TOL plasmid 와 NAH plasmid 에서각각발현되는 C2,3O 사이에나타나는기질특이성에대해연구하였는데, TOL plasmid 에서발현되는 C2,3O 의경우 catechol, 3-methylcatechol 과 4-methylcatechol 를이용하였고, NAH plasmid 에서발현된 C2,3O 의경우는 3-methylcatechol 을이용하지못하는것으로보고되었다. 본연구에서분리된 C2,3O 는 Pseudomonas putida 의 NAH plasmid 에서발현된 C2,3O 와유사한기질능을나타내었다. (3) Protocatechuate 4,5-dioxygenase 분리된 4,5-PCD 의경우기질로 protocatechuate (100%) 를이용하였으나, catechol, 3-methylcatechol, 4-methylcatechol, 4-chlorocatechol, 4-nitrocatechol 등의다른기질들은모두이용하지못하는것으로조사되었다 (Table 2). p-hydroxy- Relative activity (%) 100 60 40 20 A 0 25 27.5 30 32.5 35 37.5 40 42.5 45 25 27.5 30 32.5 35 37.5 40 42.5 45 benzoate 상에서배양하여얻은 4,5-PCD 는특정기질에대해서만활성을갖는것으로나타났다. Dioxygenases 의온도에대한영향 Dioxygenases 활성에온도가미치는영향조사에서 C1,2O 와 C2,3O 의적정온도는 30-35 로 30 에서최고의활성을나타내었고, 온도가 25 이하로떨어지거나 40 이상으로오를때활성이급격히감소하는것을확인할수있었다 (Fig. 2 A&B). Acinetobacter radioresistens 에서분리한 IsoA 와 IsoB 는최적온도가 30-45, 40 로 JK-2 에비해높은온도에서도활성을지닌것으로보고되었다 (8). 또한, C2,3O 가암호화된 xyle 유전자를 Escherichia coli W3110 에클로닝하여대량발현한실험에서는 C2,3O 활성의적정온도가 25, Phenol 분해세균인 Bacillus thermoleovorans strain A2 에서분리된 C2,3O 의경우적정온도는 70 로 JK-2 에서분리된 C2,3O 와는최적온도에서많은차이를보였다 (12, 24). 4,5-PCD 의경우적정온도는 27.5-32.5 이며, 30 에서최고의활성을보였다 (Fig. 2C). Dioxygenases 의 ph 에대한영향 ph 가분리 정제된 dioxygenases 의활성에미치는영향에대한조사에서는 C1,2O 의경우 ph 5 와 ph 12 에서는효소 Temperature ( ) B C 25 27.5 30 32.5 35 37.5 40 42.5 45 Figure 2. Effects of temperature on the activity of dioxygenases, (A) C1,2O, (B) C2,3O, and (C) 4,5-PCD. The relative activity was calculated as the activity at 30 was 100%. Relative activity (%) 100 60 40 20 A B C 0 5 6 7 8 9 10 11 12 5 6 7 8 9 10 11 12 5 6 7 8 9 10 11 12 ph Figure 3. Effects of ph on the activity of dioxygenases, (A) C1,2O, (B) C2,3O, and (C) 4,5-PCD at ph 5-7 in 50 mm potassium phosphate buffer and at ph 8-12 in 50 mm Tris base buffer.
Hwang, S. Y., Characterization of Dioxygenases isolated from Delftia sp. JK-2 55 활성이전혀나타나지않았으며, ph 6.0 이상에서효소활성이나타나기시작하여 ph 8.0 에서최고의활성을나타내었다 (Fig. 3A). A. radioresistens 에서분리한 IsoA 와 IsoB 는최적 ph 가 6.6-8.5 로나타났는데, 본연구에서분리한 C1,2O 와비슷한것으로조사되었다 (8). C2,3O 는 ph 5 와 ph 10-12 사이에서는활성이전혀나타나지않았으며, ph 6.0 이상에서효소의활성이나타나기시작하여 ph 8.0 에서최고의활성을나타내는것으로조사되었다 (Fig. 3B). Escherichia coli W3110 에분리된 C2,3O 는최적 ph 가 7.5 로보고되었고, Bacillus thermoleovorans strain A2 에서분리된 C2,3O 의경우는적정 ph 는 7.2 가 7.0 으로알려져있다. 이것으로보아 JK-2 에서분리된 C2,3O 는적정 ph 가보고된연구들과유사한것으로사료된다 (12, 24). 4,5-PCD 는 ph 5 와 ph 10-12 사이에서는활성이전혀나타나지않았으며, ph 6.0 이상에서효소의활성이나타나기시작하여 ph 7.0 에서최고의활성을나타내었다 (Fig. 3C). Chen 등 (23) 이연구한 4,5-PCD 의경우최적의활성을나타내는 ph 가 9.5 로나타나본연구와는다르게약염기에안정한것이보고된바있다. Dioxygenases에미치는중금속에의한영향 (1) Catechol 1,2-dioxygenase 중금속에의한 C1,2O의효소활성억제에대한조사에서 Hg +, Cu 2+ 는 C1,2O에대하여각각 13.4%, 38.7% 로효소활성이저해되는것으로나타났으며, Ag + 같은경우는효소활성을완전히저해하는것으로조사되었다 (Fig. 4A). 그러나 Fe 3+ 의존재하에서는 C1,2O의효소활성이약간증가하는것이조사된것으로보아이러한현상은 C1,2O의구조내에철을포함하고있기때문에 Fe 3+ 이온이효소의활성에영향을주지않거나효소의활성을증가되는것으로사료된다 (25). Relative activity (%) 100 60 40 20 0 None CuSO 4 AgNO 3 HgCl 3 FeCl 3 Metal ions Figure 4. Effects of various metal ions on the activity of dioxygenases, C1,2O ( ), C2,3O ( ), and 4,5-PCD ( ). The final concentration of inhibitor was 0.1 mm. Each bar represents the average of three independent experiments. 러한현상은 C2,3O의구조내에철을포함하고있기때문에 Fe 2+ 이온이효소의활성에영향을주지않거나효소의활성을증가시키는것으로보고되고있는데, 여기서실험에사용한 Fe 3+ 또한같은철이온이기때문에영향을미치지않은것으로생각되어진다 (25). (3) Protocatechuate 4,5-dioxygenase 중금속에의한 4,5-PCD의효소활성억제에대한조사에서 Hg +, Ag +, Cu 2+, Fe 3+ 는 4,5-PCD에대하여각각 11.6%, 0%, 2.3%, 60.5% 정도로효소활성을저해하는것으로나타났다 (Fig. 4C). Sugimoto등 (26) 이연구한벤젠고리를여는 dioxygenase와 Arciero등 (22) 이분리한 4,5-PCD는효소에조효소로철이온을포함하고있어철이온에안정한것을보고한바있다. 그러나본연구에서정제된 4,5-PCD는이전연구와는다르게철이온에도불안정한것으로나타났다. 본실험에서는폐수처리장에서분리 동정한 Delftia sp. JK-2에서생산된 C1,2O와 C2,3O, 그리고 4,5-PCD를분리정제하였다. 분리정제된 C1,2O와 C2,3O, 그리고 4,5-PCD는기질특이성및 ph, 온도, 중금속에대한영향도의실험으로물리화학적특성을규명하였고, SDS-PAGE를통한정제여부조사에서는분리된 C1,2O의크기가 60 kda, C2,3O는 35 kda, 4,5-PCD는 62 kda이확인되었다. 본연구에서분리한 C1,2O 분자량의경우분자량이 60 kda으로이전에분리된것이 33-40 kda인것에비해상당한차이가있는것으로나타났으며 (6, 19), 분자량이 35 kda인 C2,3O는이전에연구된것과유사한것으로조사되었다 (20, 21). Dioxygenases의특성실험에서는 C1,2O와 C2,3O가 catechol 이외에도 4-methylcatechol에기질특이성이있는것으로조사되었고, C1,2O의최적활성이나타나는 ph와온도는 ph 8과 30 로 A. radioresistens의 Iso A와유사한것으로나타났다 (7). 그리고 C2,3O는이전연구들에나타난 C2,3O와효소활성 ph는유사하나최고활성을나타내는온도에서는차이가있는것으로조사되었다 (12, 24). 4,5-PCD의경우이전연구에서는구조상여러개의 subunit으로구성되어있는 4,5-PCD가연구가이루어졌는데, 본연구에서분리된 4,5-PCD가하나의 subunit 크기와비슷한것으로보아분리된효소의구조실험이필요한것으로사료된다 (23). 향후본연구는얻어진결과를바탕으로정제된 C1,2O와 C2,3O, 그리고 4,5-PCD의 N-terminal sequencing을통해 primer를제작하여 PCR 기법을통한 DNA sequencing을실시하여위의세효소들의유전자서열을조사하고, 이들을 probe로이용한 southern blotting을하여 C1,2O와 C2,3O, 그리고 4,5-PCD의유전자를 cloning 실험하는데이용할것이다. 요약 (2) Catechol 2,3-dioxygenase 중금속에의한 C2,3O 의효소활성억제에대한조사에서 Hg +, Cu 2+ 는 C2,3O 에대하여각각 10.5%, 40.63% 로효소활성이저해되는것으로나타났으며, Ag + 같은경우는효소활성을완전히저해하는것으로조사되었다 (Fig. 4B). 그러나 Fe 3+ 의존재하에서는 C2,3O 의효소활성이증가되었다. 이 본연구의목적은방향족화합물인 aniline, benzoate, p-hydroxybenzoate 를분해할수있는 Delftia sp. JK-2 에서이들각기질에서배양시다른종류의 dioxygenases 를분리정제하고, 정제된 dioxygenases 의특성을조사하기위하여실시하기위한것이다. 기질로서 benzoate, aniline, 또는 p-hydroxybenzoate 에따라분리된 dioxygenases 는각각
56 Korean J. Biotechnol. Bioeng., Vol. 19, No. 1 catechol 1,2-dioxygenase (C1,2O), catechol 2,3-dioxygenase (C2,3O), 그리고 protocatechuate 4,5-dioxygenase (4,5-PCD) 였다. 각 dioxygenases 의특성을조사하기위하여먼저 benzoate, aniline 또는 p-hydroxybenzoate 에서배양한 Delftia sp. JK-2 세포를초음파분쇄기로파쇄하여, ammonium sulfate precipitation, DEAE-sepharose, 그리고 Q-sepharose 의순서로정제하여농축하였다. 정제ㆍ농축된 dioxygenases 의특이활성도를보면 C1,2O 는 3.3 unit/mg, C2,3O 는 4.7 unit/mg 이고, 4,5-PCD 는 2.0 unit/mg 이다. C1,2O 와 C2,3O 의기질특이성조사에서는 catechol 과 4-methylcatechol 에서두효소모두효소활성이나타났으며, C1,2O 에서는 3-methylcatechol 에서약간의활성이확인되었고, 4,5-PCD 는 protocatechuate 에서만효소활성을보여주었다. C1,2O 와 C2,3O 는 3 0 와 ph 8.0 에서최적의활성을나타내는것으로조사되었으며, 4,5-PCD 는 30 와 ph 7.0 에서최적의활성이조사되었다. Delftia sp. JK-2 에서정제된 C1,2O 와 C2,3O 의효소활성은 Ag +, Hg +, 그리고 Cu 2+ 에의해억제되는것으로나타났으며, 4,5-PCD 의경우에는 Ag +, Hg +, 그리고 Cu 2+ 뿐만아니라 Fe 3+ 에의해서도효소활성이억제되는것이확인되었다. C1,2O, C2,3O, 4,5-PCD 의분자량은 SDS-PAGE 에의해각각 60 kda, 35 kda, 62 kda 로측정되었다. REFERENCES 1. Lyons, C. D., S. Katz, and R. 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