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천희 봉
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1 The Korean Journal of Microbiology, Vol. 41, No. 1, March 2005, p Copyrightc2005, The Microbiological Society of Korea Aniline 분해세균 Delftia sp. JK-2 에서분리된 Catechol 2,3-dioxygenase 의 N- 말단아미노산서열분석 황선영ㆍ강형일 1 ㆍ오계헌 * 순천향대학교자연과학대학생명과학부, 1 순천대학교환경교육과 본연구에서는이전연구에서단일탄소원과질소원및에너지원으로 aniline 을이용하는 Delftia sp. JK-2 에서분리, 정제된바있는 C2,3O 의 N- 말단아미노산과 DNA 서열을분석하였다. Aniline 에서배양한 Delftia sp. JK-2 에서분리된약 35 kda 의 C2,3O 의 N- 말단아미노산서열을분석한결과 1 MGVMRIGHASLKVMDMDAAVRHYENV 26 로 Pseudomonas sp. AW-2 와 Comamonas sp. JS765 의 C2,3O 와일치하는것으로나타났다. 위에서확인된아미노산서열을바탕으로제작된 primer 와 JK-2 의 total genomic DNA 를기질로사용하여 PCR 을수행한결과약 950 bp 의유전자증폭산물을획득하였다. 이증폭산물중정확히확인된 890 bp 의염기서열을분석한결과 Delftia JK-2 의 C2,3O 유전자염기서열은 Pseudomonas sp. AW-2 의 C2,3O 와일치하였으며 Comamonas sp. JS765 의 C2,3O 와 97% 의높은상동성을나타내었다. Key words aniline. catechol 2,3-dioxygenase (C2,3O), Delftia sp. JK-2 Aniline은제약, 플라스틱, 염색, 살충제등의제조에원료로서널리사용되어왔다 (5,8). 또한폭발물, 아질산아닐린계제초제, 니트로피렌 (nitropyrene) 과같은니트로방향족화합물의미생물에의한전환으로생성되며자연계에광범위하게분포하는합성화합물이다 (8). 환경에노출된방향족화합물들은주로호기성세균의산화적분해경로를이용하여효과적으로분해될수있다. 미생물의방향족화합물분해는초기단계에산소화반응 (oxygenation), 하이드록시화반응 (hydroxylation), 탈수소화반응 (dehydrogenation) 을거치며, 방향족화합물의주요중간대사산물인 catechol과 protocatechuate 등으로전환된다. 이들전환된 catechol과 protocatechuate는고리계열에서중요한역할을하는효소인 dioxygenase에의해촉매반응이진행된다 (1, 4, 7, 15). Catechol의경우 dioxygenase에따라두가지분해경로를가질수있는데, catechol 1,2-dioxygenase (C1,2O) 에의한 ortho cleavage와 catechol 2,3-dioxygenase (C2,3O) 에의한 metacleavage가있다. 방향족고리의수산기 (-OH) 사이를절단하는 C1,2O는 catechol에작용하여 2개의산소를붙게하여 cis,cismuconate를생성한다. 이작용에의해서방향족고리가열리게되고 β-ketoadipate 경로를통해최종적으로미생물이직접적으로이용할수있는 succinate와 acetyl-coa로분해된다. 고리의수산기외부를절단하는 C2,3O도마찬가지로 catechol에두개의산소가붙게하여 2-hydroxymuconic semialdehyde를형성하고, 이작용으로고리가열리고최종적으로 pyruvate와 acetaldehyde로분해되는것이보고되고있다 (9, 13, 16-17). C2,3O에대한연구 는몇몇연구자에의해 Pseudomonas sp. AW-2, Comamonas sp. JS765, Rhodococcus rhodochrous CTM 등을포함하는여러종의미생물에서수행되어져왔다 (12, 14,). Yoko 등 (19) 은 aniline 에서배양한 Pseudomonas sp. FK-8-2에서분리한 C2,3O의특성조사를보고한바있다. 또한 aniline을분해하는 Pseudomonas sp. AW-2로부터 C2,3O를분리하여특성조사와유전자분석을연구한바있다 (12). Milo 등 (10) 은 Bacillus thermoleovorans strain A2에존재하는 C2,3O가높은온도에서도생산된다는것을보고한바있다. 높은온도에서 phenol을분해하는 Bacillus thermoglucosidasius A7에서는 phenol 분해시 meta 경로를이용하는것이확인되었고, meta 경로에관련된 5가지효소에대한클로닝과서열분석을하였다 (6). C2,3O의연구는효소학적연구외에도분자유전학적인연구가많은진척을보여왔다. Schreiner 등 (18) 은 2-methylaniline을분해하는 Rhodococcus rhodochrous CTM에서 C2,3O 유전자를클로닝하여발현시켰고, nitrobenzene 을분해하는 Comamonas sp. JS765을이용하여 C2,3O 유전자서열분석하고클로닝하여유전자를발현시킨연구가보고된바있다 (13). C2,3O에대한연구는 C1,2O의연구에비해서서히진행되었으나, 최근에들어많은연구가보고되고있다. 본연구에서는이전연구 (7) 를통해 Delftia sp. JK-2에서분리 정제되어부분적으로효소학적특성이밝혀진바있는 C2,3O의특성을보다자세하게밝히기위하여분자생물학적수준에서연구를수행하여 C2,3O의 N-말단아미노산서열을결정하였다. *To whom correspondence should be addressed. Tel: , Fax: kyeheon@sch.ac.kr 13

2 14 Seon-Young Hwang et al. Kor. J. Microbiol 균주의배양조건 재료및방법 균주의배양에사용된배지는증류수 1 L 당 1 g K 2 HPO 4, 1 g KH 2 PO 4, 0.41 g MgSO 4 ㆍ 7H 2 O, 0.05 g FeSO 4 ㆍ 7H 2 O, 0.02 g CaCO 3 에단일탄소원및질소원으로 1 g 의 aniline 을포함하는 액체무기배지를사용하였으며, 30 o C에서 150 rpm으로진탕배양하였다. Delftia sp. JK-2에대한생리생화학적특성, 분해에미치는부가탄소원과부가질소원의영향, 그리고 16S rdna 염기서열의계통수분석결과는이미보고된바있다 (4). SDS-PAGE 컬럼을통해분리된 C2,3O는 Bollag 등 (2) 의방법을이용하여 SDS-PAGE 를실시하였다. Separating gel은 12% 의 acrylamide gel을사용하였고, stacking gel은 5% 의 acrylamide gel을사용하여전개하였다. 시료는 Bradford 방법으로단백질정량을실시하여동일량의단백질을주입하였고, 1 sample buffer로양을맞추었다. 시료를 5분간끓이고, 얼음에식힌후주입하였다. 표지단백질은 prestained SDS-PAGE Standard (Bio-Rad, Hercules, USA) 를사용하였다. 전기영동은 100 V에서 2시간 30분간실시하였다, 전기영동이끝난 gel은 gel staining solution (0.1% Coomassie blue R-250, 45% methanol, 10% glacial acetic acid) 으로 2시간염색하였고, gel destaining solution I (10% methanol, 10% glacial acetic acid) 으로 1시간동안처리한후, gel destaining solution II (5% methanol, 7% glacial acetic acid) 으로 8시간처리하였다. N- 말단아미노산서열분석 분리한 C2,3O를 SDS-PAGE 상에서전개한 gel을 semidry electroblotter (Bio-Rad, Hercules, USA) 를이용하여 18V, 20분간 polyvinyldifluoride (PVDF) 막 (Applied Biosystem, Foster City, USA) 에옮긴후 PVDF 막을 Coomassie blue R-250 용액으로염색하였으며, 탈염색을실시하여염색된단백질부분을잘라내었다. 잘라낸 PVDF 막을단백질자동서열분석기 Model 491A (Perkin Elmer, Foster City, USA) 를이용하여아미노산서열을분석하였다. 여기서얻어진 N-말단서열은 NCBI의 BLAST Search 프로그램에서상동성을분석하였다. Chromosomal DNA 분리 LB 배지에서 12 시간동안배양 (30 o C, 160 rpm) 한 Delftia JK-2 30 ml을원심분리 (6,300 g, 10 min, 4 o C) 하여세포를얻 었다. 침전된세포를 5 ml TEN buffer [0.1 M Tris-HCl (ph 7.0), 0.01 M EDTA, 1M NaCl] 로재현탁하고, lysozyme (20 mg/ml) 을 200 µl 첨가하여 37 o C에서 15 분간반응시킨다. 10% SDS를 100 µl 첨가하고, 천천히섞어주었다. 점도가높아지면 50 µl proteinase K (20 mg/ml) 와 5 µl RNase를첨가하여 37 o C 에서 30분간반응시켰다. 5 ml TEN buffer를더첨가하고 10 ml의 phenol을첨가하여가볍게섞어준다. 원심분리를통하여상등액을취하여 phenol/chloroform/isoamyl alcohol 추출은 2회, chloroform 추출은 1회실시하였다. 상등액을 5 ml 취하여 500 µl 3M sodium acetate와 15 ml ethanol을첨가하여원심분리를실시하였다. 침전된염색체는 70% ethanol로염류를제거하고다시원심분리하여공기중에서 ethanol을제거하였다. 얻어진침전물을 300 µl의물에녹인후분리여부를확인하기위해서 0.8% agarose gel에전기영동을실시하였고, UV-spectrophotometer 를이용하여정량하였다. Polymerase chain reaction과염기서열결정 N-말단서열분석결과를이용하여상동성이높게나온 Pseudomonas sp. AW-2 와 Comamonas sp. JS765의 C2,3O DNA 서열을이용하여 primer를합성하여 PCR (MJ Research, Watertown, USA) 을실시하였다. Primer No. 1과 No. 2는 coding strand로, 그리고 No. 3와 No. 4는 complementary strand primer로제작하여, PCR premix kit (Bioneer, Daejeon, Korea) 를사용하여증폭하였다 (Table 1). PCR의반응조건은시작 denaturation 단계를 94 o C에서 5 분간실시하였고, 94 o C에서 30초, 50 o C에서 30초, 72 o C에서 30 초씩 30 cycles 반응하였으며, 마지막 extension 단계는 72 o C에서 5분간실시하였다. PCR 산물을 0.8% agarose gel에서전기영동하였다. 전기영동을통해서분리된 PCR 산물은 gel extract kit (Qiagen, Hilden, Germany) 를이용하여설명서의절차에따라 gel로부터추출하였다. 추출한 PCR 산물을표지하기위하여 ABI의 BigDye terminator cycle sequencing ready reaction kit (ABI, Piscataway, NJ, USA) 를사용하였다. 2 µl의 BigDye, 50 ng의 DNA, 2.5 pmole의 primer를첨가하여 25 cycle (96 o C 10초, 50 5초, 60 o C 4분 ) 동안증폭하여표지하였다. DyeEx (Qiagen, Hilden, Germany) 를이용하여결합하지않는 BigDye를증폭된 DNA로부터제거하였고, 3700 DNA analyzer (ABI, Piscataway, USA) 를이용하여 DNA 염기서열을분석하였다. 분석된서열은 NCBI의 BLAST Search 프로그램을이용하여상동성조사를실시하였다. Table 1. PCR primers for amplification of C2,3O Designation Nucleotide sequence Amino acid sequence Position No.1 5'-ATGGGTGTGATGCGCATCGG-3' (20 mer) MGVMRIG N-terminal No.2 5'-ATGTGCGAGATGAATCCCCA-3' (20 mer) CMLLCHD Internal No.3 5'-TGGTGACGGACGACTACACG-3' (20 mer) EPNMECM Internal No.4 5'-AGTGGCTCCACATGTGCACT-3' (20 mer) SFTEVYT C-terminal

Delftia sp. JK-2 유래 C2,3O의 N-말단 아미노산서열 15 Vol. 41, No. 1 N-말단 아미노산 서열분석 아미노산 염기서열 분석기를 통하여 분석한 결과 Delftia sp.

AW-2의 C2,3O와 Comamonas sp. Fig. 1. SDS-PAGE of purified catechol 2,3-dioxygenase. A: marker (myosin-209, β-galactosidase-124, bovine serum albumin-80, ovalbumin49.1, carbonic anhydrase-34.

결과 및 고찰 C2,3O의 분자량 결정 균주 JK-2에서 분리, 정제된 C2,3O의 효소학적 특성은 이미 부분적으로 보고된 바 있다(7). SDS-PAGE 상에 전개하여 JK-2 에서 분리, 정제된 C2,3O의 분자량을 측정한 결과 약 35 kda임 이 확인되었다(Fig. 1). 이러한 결과는 Gibson (14)이 보고한 Comamonas sp.

3 Delftia sp. JK-2 유래 C2,3O의 N-말단 아미노산서열 15 Vol. 41, No. 1 N-말단 아미노산 서열분석 아미노산 염기서열 분석기를 통하여 분석한 결과 Delftia sp. JK-2에서 분리한 C2,3O의 아미노산 서열은 N-말단으로부터 MGVMRIGHASLKVMDMDAAVRHYENV26로 총 26개의 아미 1 노산 서열이 결정되었다(Fig. 3). 분석된 26개 아미노산 서열을 BLAST Search 프로그램으로 분석한 결과 Delftia sp. JK-2의 C2,3O는 Pseudomonas sp. AW-2의 C2,3O와 Comamonas sp. Fig. 1. SDS-PAGE of purified catechol 2,3-dioxygenase. A: marker (myosin-209, β-galactosidase-124, bovine serum albumin-80, ovalbumin49.1, carbonic anhydrase-34.8, soybean trypsin inhibitor-28.9), B: crude cell extract, C: 30-50% saturated ammonium sulfate D: DEAEsepharose E: DEAE-sepharose. 결과 및 고찰 C2,3O의 분자량 결정 균주 JK-2에서 분리, 정제된 C2,3O의 효소학적 특성은 이미 부분적으로 보고된 바 있다(7). SDS-PAGE 상에 전개하여 JK-2 에서 분리, 정제된 C2,3O의 분자량을 측정한 결과 약 35 kda임 이 확인되었다(Fig. 1). 이러한 결과는 Gibson (14)이 보고한 Comamonas sp. JS765와 Alcaligenes sp. KF711로부터 분리된 C2,3O의 분자량(11)과 그 크기가 일치하는 것으로 나타났다. Fig. 2. PCR products of catechol 2,3-dioxygenase gene from Delftia sp. JK-2. Lane M, 1 kb DNA ladder; lane 1, PCR product of No. 1 and No. 3 primers (470 bp); lane 2, PCR product of No. 1 and No. 4 primers (950 bp); lane 3, PCR product of No. 2 and No. 4 primers (490 bp). Fig. 3. Multialigment of deduced amino acid sequence of catechol 2,3-dioxygenase : sequence of C2,3O from Delftia sp. JK-2, PAW-2 C2,3O: sequence of C2,3O from Pseudomonas sp. AW-2, CJS765 C2,3O: sequence of C2,3O from Comamonas sp. JS765, PP C2,3O: sequence of C2,3O from Pseudomonas putida, CT C2,3O: sequence of C2,3O from Comamonas testosteroni, PC C2,3O: sequence of C2,3O from Pseudomonas cepacia, BRP007 C2,3O: sequence of C2,3O from Burkholderia sp. RP007. The N-terminal 296 amino acid sequences deduced from DNA sequences of PCR product were used to draw the phylogenetic tree. The bottom line indicates the part of the 26 N-terminal amino acid sequences determined by N-terminal amino acid sequence analysis of the C2,3O purified from strain JK-2.

4 16 Seon-Young Hwang et al. Kor. J. Microbiol JS765의 C2,3O의 N-말단의 26개아미노산서열과 100% 일치하는것으로나타났으며 (12, 14). Comamonas testosteroni와 Burkholderia sp. RP007의 C2,3O의아미노산서열과는 84% 의상동성을보여주었다 (Fig. 3). 결정된아미노산서열은 JK-2로부터유래된 C2,3O 유전자를증폭하기위한 primer를합성하는데사용하였다. C2,3O 유전자의 PCR 과염기서열분석 Table 1에서보여준 primer를이용하여 Delftia sp. JK-2의염색체 DNA를 PCR한결과 No. 1과 No. 3 primer로증폭된 470 bp, No. 1과 No. 4 primer로증폭된 950 bp, 그리고 No. 2와 No. 4 primer를이용해서는 490 bp 절편이증폭되었다 (Fig. 2). 증폭된결과는 Comamonas sp. JS765에서분리된 C2,3O의 DNA 서열로부터예상되는절편의크기가일치하는것으로나타났다 (13). No. 1과 No. 4 primers를사용하여증폭된 PCR 반응산물은자동염기서열분석기로분석한결과 950 bp 중에 890 bp의정확한염기서열을얻었다. NCBI의 BLAST Search 프로그램을이용하여분석된염기서열의번역된서열을분석한결과 N-말단으로부터모두 296개의아미노산서열이결정되었으며결정된 JK-2의 C2,3O의아미노산서열은 Pseudomonas sp. AW-2와 100% 일치하였으며, Comamonas sp. JS765 (97%), Pseudomonas putida (84%), Comamonas testosteroni (82%), Pseudomonas cepacia (77%) 와높은상동성을나타내었다 (Fig. 3). 참고문헌 1. Aoki, K., Y. Nakanishi, S. Murakami, and R. Shinke Microbial metabolism of aniline through a meta-cleavage pathway: isolation of strains and production of catechol 2,3-dioxygenase. Agric. Biol. Chem 54, Bollag, D.M., M. D. Rozycki, and S. J. Edelstein Gel electrophoresis under denaturing condition. New York, NY, USA. 2nd ed, Bugg, T.D.H Oxygenases: mechanisms and structural motifs for O 2 activation. Curr. Opin. Chem. Biol. 5, Cho, Y.S., H.Y. Kahng, H.W. Chang, and K.H. Oh Characterization of aniline-degrading bacterium, Delftia sp. JK-2 isolated from activated sludge of municipal sewage treatment plant. Kor. J. Microbiol. 36, Duffner, F.M., U. Kirchner, M.P. Bauer, and R. Muller Phenol/cresol degradation by the thermophilic Bacillus thermoglucosidasius A7: cloning and sequence analysis of five genes involved in the pathway. Gene 256, Hwang, S.Y., J.W. Chun, and K.H. Oh Characterization of different dioxygenases isolated from Delftia sp. JK-2 capable of degrading aromatic compounds, aniline, benzoate, and p-hydroxybenzoate. Kor. J. Biotechnol. Bioeng. 19, Konopka, A., D. Knight, and R.F. Turco Characterization of a Pseudomonas sp. capable of aniline degradation in the presence of secondary carbon sources. Appl. Environ. Microbiol. 55, Liu, Z., H. Yang, Z. Huang, P. Zhou, and S.J. Liu Degradation of aniline by newly isolated, extremely aniline-tolerant Delftia sp. AN3. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58, Milo, R.E., F.M. Duffner, and R. Muller Catechol 2,3-dioxygenase from the thermophilic, phenol-degrading Bacillus thermoleovorans strain A2 has unexpected low thermal stability. Extremophiles 3, Murakami, S., Y. Nakanishi, N. Kodama, S. Takenaka, R. Shinke, and K. Aoki Purification, characterization, and gene analysis of catechol 2,3-dioxygenase from the aniline-assimilating bacterium Pseudomonas species AW-2. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, Ornston, L.N The conversion of catechol and protocatechuate to β-ketoadipate by Pseudomonas putida. J. Biol. Chem. 241, Parales, R.E., T.A. Ontl, and D.T. Gibson Cloning and sequence analysis of a catechol 2,3-dioxygenase gene from the nitrobenzene-degrading strain Comamonas sp. JS765. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 19, Provident, M.A., J. Mampel, S. Macsween, A.M. Cook, and R.C. Wyndham Comamonas testosteroni BR 6020 possesses a single genetic locus for extradiol cleavage of protocatechuate. Microbiology 147, Reineke, W., and H.J. Knacmuss Microbial degradation of haloaromatic. Annu. Rev. Microbiol. 42, Schlomann, M Evolution of chlorocatechol catabolic pathway. Biodegradation 255, Schreiner, A., K. Fuchs, F. Lottspeich, H. Poth, and F. Lingens Degradation of 2-methylaniline in Rhodococcus rhodochrous: cloning and expression of two clustered catechol 2,3-dioxygenase genes from strain CTM. J. Gen. Microbiol. 137, Yoko, N., S. Murakami, R. Shinke, and K. Aoki Induction, purification, and characterization of catechol 2,3-dioxygenase from aniline-assimilating Pseudomonas sp. FK-8-2. Agric. Biol. Chem. 55, (Received January 17, 2005/Accepted March 9, 2005)

5 Vol. 41, No. 1 Delftia sp. JK-2 유래 C2,3O 의 N- 말단아미노산서열 17 ABSTRACT : Analysis of N-Terminal Amino Acid Sequence of Catechol 2,3-dioxygenase from Aniline Degrading Delftia sp. JK-2 Seon-Young Hwang, Hyung-Yeel Kahng 1, and Kye-Heon Oh* (Department of Life Science, Soonchunghyang University, P.O. Box 97, Asan, , Korea; 1 Department of Environmental Education, Sunchon National University, Sunchon, , Korea) The aim of this work was to investigate the N-terminal amino acid sequence of catechol 2,3-dioxygenase isolated from Delftia sp. JK-2, which could utilize aniline as sole carbon, nitrogen and energy source. Molecular weight of the enzyme was determined to approximately 35 kda by SDS-PAGE. N-terminal amino acid sequence of C2,3O from strain JK-2 was 1 MGVMRIGHASLKVMDMDAAVRHYENV 26, and exhibited high sequence similarity with that of C2,3O from Pseudomonas sp., Comamonas sp. JS765, Comamonas testosteroni, or Burkholderia sp. RP007. Approximately 950-bp C2,3O was obtained through PCR using the primers derived from N-terminal amino acid sequence. Analysis of the DNA sequence revealed that the deduced 296 amino acid sequences were determined, and it showed 100% identity with C2,3O from Pseudomonas sp. AW-2 and 97% similarity with Comamonas sp. JS765.

19-08-오계헌(50-56).hwp

19-08-오계헌(50-56).hwp 한국생물공학회지제 19 권제 1 호 Korean J. Biotechnol. Bioeng. Vol. 19, No. 1, 50-56(2004) 방향족화합물인 Aniline, Benzoate, p-hydroxybenzoate 를분해하는 Delftia sp. JK-2에서분리된 Dioxygenases 의특성연구 황선영 천재우 1 강형일 오계헌순천향대학교생명과학부, 1