원유의노출이담치와조피볼락의 phase II 약물대사효소 UDP-glucoronosyl transferase 및 glutathione S-transferase 의활성에미치는영향 박관하, 김주완, 박음미, 임철원, 최민순, 최선남, 황인영, 1 김정상 2 J. ENVIRON. TOXICOL. Vol. 21, No. 2, 103~113 (2006) 군산대학교해양과학대학수산생명의학과및식품공학과, 1 인제대학교자연과학대학환경공학부, 2 경북대학교농업생명과학대학동물공학과 Activity Changes in Phase II Drug-metabolizing Enzymes UDP-Glucoronosyl Transferase and Glutathione S-Transferase to Crude Oil Exposure in Mussel and Rockfish Kwan Ha Park, Ju-Wan Kim, Eum-Mi Park, Chul-Won Lim, Min-Soon Choi, Sun-Nam Choe, In-Young Hwang 1 and Jung-Sang Kim 2 Departments of Aquatic Life Medicine and Food Science & Engineering, Kunsan National University, 1 School of Environmental Science & Engineering, Inje University, 2 Department of Animal Science & Biotechnology, Kyungpook National University ABSTRACT This study examined effects of crude oil on the phase II drug-metabolizing enzymes UDP-glucuronosyl transferase (UDPGT) and glutathione S-transferase (GST) in mussel Mytilus edulis and rockfish Sebastes schlegeli, a representative bivalve and a culture fish, respectively. This work also intended indirectly to evaluate the post impact recovery from the massive oil tanker spillage accidents occurred during the summer of 1995 in the sea area off Yosu City, Chonnam. For these, enzyme activities of UDPGT and GST were examined in the fish and mussel following laboratory exposure to fresh crude oil, weathered oil, field-obtained oil residues, or in the field biota samples. Decreased GST activity was observed in rock fish following exposure to oil-soluble fraction (OSF) of fresh oil. A similar diminished GST activity was also observed after OSF of artificially weathered oil. OSF of field oil residues retrieved from the spillage area approximately 1 year later also exerted a slight inhibition of GST to rockfish. There was neither a change in UDPGT in rockfish, nor were there changes in mussel in both enzymes to any oil fractions. We could not observe any difference in the two enzymes either in rockfish or mussel sampled from the field during 1.5~2.0 years post spillage, indicating that their enzyme systems might had been recovered by the sampling time. In conclusion, it seems that the inhibition of GST activity in rockfish is a biomarker response to crude oil exposure. The results, however, must be interpreted with care, as the inhibition may reflect various factors such as oil concentration, duration and water temperature. Key words : crude oil, phase II drug-metabolizing enzymes, UDPGT, GST, rockfish, mussel To whom correspondence should be addressed. Tel: +82-63-469-1885, E-mail: khpark@kunsan.ac.kr 103
104 J. ENVIRON. TOXICOL. Vol. 21, No. 2 서 론 전세계적으로매년약 5 백만톤의유류관련물질이해양내로유입 (Neff, 1990) 되며유류물질내에함유되어있는 4 환이상의 polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) 는돌연변이원성및발암성을보유 (Krahn et al., 1986; Van Veld et al., 1992) 하고있기때문에중요한환경독성학적연구대상이되어왔다. 그러나한편유류물질들은복잡한화학성분구성만큼이나독성현상도복잡하여환경독성평가결과를해석하는것이단순하지가않다. 유류물질이해양으로유출되면 2~5% 의유기성분은해수로용해 (Payne et al., 1987) 되며, 이들중강력한독성성분들이생물체내로용이하게흡수 (Thomas and Rice, 1981) 되어해양생물에심각한영향을미친다 (Neff and Anderson, 1981). 유류물질에의오염정도를파악하기위해조직내 PAHs 물질을분석하는방법이자주사용되고는있으나, 해양생물의종류에따라 PAHs 를분해하는능력이상이하기때문에독성의생화학적지표가경우에따라서는더예민한지표가되기도한다 (Collier et al., 1996). 어류및패류에서약물대사효계 phase I 의하나인 mixed-function oxygenase (MFO) cytochrome P 450 은 PAHs 의대사에관여하며유류오염시활성유도가관찰된다 (Collodi et al., 1984; Gagnon and Holdway 1998; Peters et al., 1999). Phase II 대사효소계인 UDP-glucuronosyl transferase (UDPGT) 및 glutathione S-transferase (GST) 는 endogenous compounds, xenobiotics 및 phase I enzyme 에의해생성된 1 차대사물질의무독화와배설에중요한역할을한다 (Clark, 1989). 이 phase II 효소들도화학물질에의한오염시활성이변화되기때문에유류오염지표로서의역할에대한연구가수행되어왔다 (Moreira et al., 2004). 이와같이약물대사효소의변화는유류물질에의한오염의중요한생화학적지표의위치에있다 (Collier et al., 1996). 산업의급격한발달에따라유류물질의국내로의수입이현저히증가하였고이에따른직접적해양유류유출사고나유류부산물의해양으로의유출이증가하였다. 국내에서의유류유출사고중 1995 년여름여수지역해역에서발생한씨프린스호원유수송선전복사고는세계적기준으로도대 형의유출사고로서인근해역해역에미친직 간접적영향이막대하였던것으로평가된다. 특히, 과거외국의유류유출사고에서발견된결과 (Lee and Anderson, 2005) 를고려하면이지역의해양생물에적지않은영향을미쳤을것으로추정된다. 유류물질에오염되었을경우유류물질의대사와배설을촉진하기위하여어류간장이나, 패류에서이물질 (xenobiotics) 의대사에관여하는소화선의약물대사 phase II 효소의변화도예상된다. 따라서본연구에서는유류에노출된어패류에서나타나는생화학반응의일환으로서어류의간장또는패류의소화선에의 UDPGT 및 GST 의활성을측정하였다. 즉, 유류에오염된경력이없는것으로인정되는어패류를사용하여실험실에서다양한유류성분에노출시킨후의변화를측정함으로써이변화의정도를실험실적으로측정하여 biomarker 로사용할수있는가를확인하였다. 그결과를바탕으로현장에서채취한생물시료에서도과연이효소들의변화가일어났는가를측정함으로써유류피해의정도를평가하고자하였다. 재료및방법 1. 실험실적노출용생물시료 유류시료가해양생물에서유발하는생화학적반응을검토하기위해 2 종의생물을사용하여시험을수행하였다. 대표적인어류로는여수지역에서많이양식하고있는조피볼락 (Sebastes schlegeli), 패류로는여수인근조간대에서빈번히발견되는담치 (Mytilus edulis) 를조사대상으로하였다. 시험동물인조피볼락은체중 24~73 g 및체장 11.3~ 15.1 cm, 패류인담치는체중 9~15 g, 각장 4.0~ 6.0 cm 의크기를사용하여시험하였다. 실험실적노출시험에사용된생물은전북및충남지역의양식장에서구입하거나조간대에서채취하였다. 시험시료노출전까지약 1 주일간실험실에서순치하였다. 시험중조피볼락에는치어용사료를급이하였으며담치에는사료를공급하지아니하였다. 2. 현장생물시료 현장시료의효소측정을위해서사용된조피볼락
June 2006 Park et al. : 원유노출과어패류 phase II 효소 105 N 고돌산반도 Fig. 1. Map of collection site for oil residue samples and biota samples ( OR: oil residue samples, BS: biota samples, SS: spill site). (360~700 g, 17~22 cm) 은송도인근에설치된 5 개소의양식장에서, 담치 ( 각장 10~13 g, 4~5 cm) 는방죽포등 8 개소의조간대에서각각 1997 년 2 월및 5 월에구입하거나채취하여사용하였다 (Fig. 1). 이시험에서분석한조피볼락은 1 년정도사육한시료들로서치어기에, 잔존하는유류로인해부분적인유류피해를입었을가능성이있는크기였으며담치는유류노출가능성을높이기위해비교적크기가큰것들을사고인근지역조간대에서채취하였다. 시료는분석시까지 -70 C 에서보관하였으며채취후 6 개월이내에분석에사용하였다. 3. 유류시료 광양만 여수시 개도 127 40 E 송도 BS4 BS5 묘도 돌산도 BS3 여수해만 남해도 34 50 N 39 30 N 유류시료는총 3 종, Saudi Arabia 의카푸치원유, SS2 BS1 BS8 BS2 BS7 BS6 BS9 금오도 BS10 BS11 BS12 BS13 BS14 OR BS15 SS1 연도 덕포 OR 해양사고시원유유출후발생하는풍화과정을실험실적으로모사한원유풍화시료를, 현장유류시료는해안지역의조간대에서전복사고시유출된것으로추정되는유류성분을사고지역인소리도연목지역 (Fig. 1) 에서채취하여사용하였다. 이현장시료채취지역에인근의유류오염사고는 1995 년 7 월 23 일씨프린스호 ( 소리도남단 15 마일, Fig. 1 의 SS1) 가있었으며, 다소떨어진지점으로는 1995 년 11 월 17 일의호남싸파이어호 ( 여수시낙포부두, Fig. 1 의 SS2) 의 2 건 ( 해양경찰청자료 ) 이있었으며현장유류시료는대략 1 년후인 1996 년 8 월 19~23 일 ( 여름시료 ) 및 1996 년 9 월 18~20 일 ( 가을시료 ) 의 2 차에걸쳐수거한것을사용하였다. 원유의실험실적풍화는하계실험실조건 ( 실온 22~30 C, 상대습도 42~92%, 해수온도 17.0~ 29.5 C) 에서 14 일간지속하였다. 즉내경 39.8 cm, 높이 44.0 cm 의원통형 stainless 용기에해수를 12.0 L 채우고원유 1.0 L 를혼합하였다. 이용기안에바닥에서 15 cm 에높이에위치한날개길이약 6.0 cm 의프로펠라를 360~420 rpm 의속도로연속적으로회전시켰다. 풍화과정동안용기의상단에위치한프로펠라구동용 motor 의높이에는가정용선풍기를강하게틀어지속적으로공기를강제순환시켰다. 4. 유류시료의분획처리 원유에는동량용적의해수 (volume : volume) 를가하고 2 시간동안교반하여해수에용출된성분을수용성성분 (water-soluble fraction, WSF) 으로사용하였으며나머지성분에 Tween 80 을 5:1 의비율로혼합하고교반후추출된물질을지용성시험시료 (oil-soluble fraction, OSF) 로하였다. 농도의표현에서는최초의원유량에서유래한성분량을시험시의노출량으로정의하였다. 즉, 예를들어 지용성성분 1,000 mg/l 라함은총유류량으로 1,000 mg/l 이되도록노출하였을경우를가정하면그 1,000 mg/l 에서유래한성분중 Tween 80 가용성분만 ( 수용성성분을뺀량 ) 을 100% 의지용성성분으로정의하였다. 실험실적풍화원유시료도원유와동일한방법으로처리하였다. 그러나풍화유는반고형상태로유동성이없었기때문에중량비 (weight : weight) 로동량의해수를가하여수용성
106 J. ENVIRON. TOXICOL. Vol. 21, No. 2 성분을추출한후에 Tween 80 을가해 (5 : 1) 시험시료로사용하였다. 현장채취유류시료는시료 : 해수를 3:1 의비율로섞고격렬하게 2 시간교반하여유출된시료를수용성성분, 20 : 1 의비율로시료 : Tween 80 으로 2 시간추출한것을지용성성분으로각각정의하였다. 농도의계산은유류유래성분의제거후잔존하는고형물질을칭량하여 [ 총중량 - 고형성분 ] 을유류량으로하였다. 유류를분획하였을때해수로추출한 WSF 에는저분자방향족물질이분리를목적으로, Tween 80 을이용한 OSF 의추출은중요한독성성분인저분자 PAHs 를제외한대부분의 PAHs 를추출함을각각목적으로하였다 (Bobra et al., 1989; Heras et al., 1992; Saeed and Al-Mutairi, 2000). 이런방법으로추출한두중의분획은육안적으로관찰하였을때노출농도에서사육해수와균질하게섞이는것을확인하였다. 5. 시험동물의시료에대한노출 원유에대한노출을위해동물을직사각형수조 (45 25 20 cm) 에수용하고시험물질을 15 L 의해수에서가해, 15 C 또는 25 C 의온도에서 1 주일간노출을지속하였다. 그후 24 시간에동물을희생시켜서조피볼락의경우에는간췌장을, 담치는전육질부를적출하여효소의분석에사용하였다. 사육수는매일전량을교체하였다. 사망동물이발생하는경우잔존동물만을효소의측정에사용하였다. 실험실적풍화원유에대한노출은 25 C 에서만수행하였으며노출기간은 1 주일로하였다. 현장채취유류시료의경우에는하계시료는 25 C, 추계시료는 15 C 각각 1 주일간노출을지속하였다. 그러나현장채취하계유류시료에노출한조피볼락의경우에는, 지용성 1,000 mg/l 으로 48 시간노출에서대량폐사가발견되었으므로노출을중단하고 1 일후효소분석을행하였다. 노출중에는 heater 를사용하여사육수온도를 15±2 C 또는 25±2 C 로유지하였으며이를각각온도표시시 15 C 또는 25 C 로정의하였다. 수조에는지속적으로폭기장치를사용하여산소를공급하였다. 노출후생존하는모든개체를분석에사용하였다. 시료는분석시까지 -70 C 에서보관하였으며저장 6 개월이내에 분석을수행하였다. 6. UDP-glucuronosyl transferase (UDPGT) 효소활성의분석 어류의경우에는간췌장, 담치의경우에는육질전체를각각적출하여 100 mm K-phosphate buffer (ph 7.4) 를시료량의 3 배량가하고 homogenize 한후 9,000 g 에서 20 분간냉장 centrifuge 하여단백질농도 4~8 mg/ml 로조정하여사용하였다. 시료 homogenate 100 µl 에 Tris-HCl buffer (286 mm, ph 7.4, 28.6 mm MgCl 2 함유 ) 70 µl 와 4-nitrophenol (20 mm) 20 µl 를가하고 1 분간 preincubation 하였다. UDPGA (100 mm) 10 µl 을가한후 25 C 에서 30 분간 incubation 한다음 0.5 M TCA 1.0 ml 를가하여반응을정지시켰다. 30 분간저온에서방치후 2,500 g 에서 10 분간원심분리하여상청액 0.5 ml 를 0.315 M KOH 2.5 ml 와혼합후 400 nm 에서흡광도를측정 (Isselbacher et al., 1962) 하였다. UDPGA 첨가직후의반응액을 reference 로흡광도변화를비교하였다. Incubation 을시작한시점에서의존재하는 4-nitrophenol 의양이 400 nmol 이므로그의흡광도의소실량을흡광도변화로부터산출하여활성은 nmoles/mg protein/min 으로표현하였다. 7. Glutathione S-transferase (GST) 효소활성의측정 UDPGT 측정에사용하기위해조제한 homogenate 시료 5~10 µl 와 0.25 M K-phosphate buffer (ph 7.45) 0.48 ml 및증류수 0.54 ml 씩넣고 25 C 로 incubation 하였다. 10 분후 20 mm GSH 용액 0.06 ml 와 20 mm 의 1-dichloro-2, 4-dinitro benzene (CDNB) 용액 0.06 ml 를넣은즉시 vortexing 하여 spectrophotometer 용의 semimicro cell 에옮겨서 340 nm 에서 1 분간의흡광도변화를측정하였으며활성은 1 분간의반응곡선의기울기로부터구하였다. CDNB 의 glutathione 포합체의분자흡광계수는 ε=9.6 mm -1 cm -1 을이용하여 GST 의활성을산출하여 µmol/mg protein/min 으로표현하였다 (Habig et al., 1974).
June 2006 Park et al. : 원유노출과어패류 phase II 효소 107 8. 통계학적처리 대조군과처리군, 또처리군상호간의차이나현장에서채취한시료상호간에대해서는 Duncan s multiple range test 를사용하여검정하고 p-value 가 0.05 이하일때두군간에는차이가있다고판정하였다. Data 는 mean±sem 으로표현하였다. 결 과 1. 원유시료의실험실적노출후의효소활성 조피볼락과담치를원유시료에 1 주간노출한후의효소활성을 Table 1 에서보여주고있다. UDPGT 활성에시험군간의차이가없었다. 그러나 GST 활성은지용성 300 및 1,000 mg/l 에의하여조피볼락에서현저히감소되었다. 담치에서는조피볼락과는달리 GST 의활성변화가없었다. 2. 실험실적풍화원유시료로실험실적노출후의효소활성 담치와조피볼락의 UDPGT 활성은원유시료의경우와마찬가지로풍화시료에서도변화하지아니하였다 (Table 2). 그러나조피볼락의 GST 의활성이 지용성 300 및 1,000 mg/l 의노출에의하여현저하게감소하였다. 한편담치에서는 GST 의활성에변화가관찰되지아니하였다. 3. 현장채취유류시료의실험실적노출후의효소활성 현장에서채취한유류잔류시료를사용하여서효소의변화를측정하였다. 이유류시료는하계와추계에걸쳐채취하였으며채취계절에따라다른노출온도에서시험을수행하였다. 즉하계시료로는 25 C 에서추계시료는 15 C 에서각각수행하였으며결과는 Table 3 에보여주고있다. 이들시료에노출된조피볼락과담치에서모두대조군과비교하여 UDPGT 활성의유의성있는변화는관찰되지아니하였다. 그러나조피볼락의 GST 활성에서는지용성성분을 300 mg/l 로 1 주일간노출하였을때대조군과비교하여유의성있는효소량의감소가관찰되었다. 조피볼락 1,000 mg/l 의경우에는노출첫날부터치사동물이많이발생 (10 마리중 7 마리 ) 하여 48 시간후노출을중단하고다시 24 시간후효소를분석하였으나유의성있는변화를관찰할수없었다. 담치에대해서는추계시료만을시험한바, 유의성있는 GST 활성이관찰되지않았다. UDPGT 활성에있어서는조피볼락과담치어떤 Table 1. Enzyme activities in rockfish and mussel following exposure to crude oil Enzyme activity Group Con. (mg/l) Temp. ( C) # of animals survived UDPGT GST (nmol/mg protein/min) (µmol/mg protein/min) Control 0 15 C 10/10 0.550±0.040 0.620±0.050 WSF 1,000 15 C 10/10 0.480±0.030 0.680±0.050 Rochfish 1,000 25 C 9/10 0.510±0.040 0.660±0.050 OSF 300 25 C 9/13 0.620±1.000 0.380±0.040* 1,000 15 C 10/12 0.490±0.030 0.400±0.040* Tween 80 1.0 ml/l 15 C 11/11 0.580±0.090 0.601±0.040 Control 0 15 C 10/10 0.104±0.012 0.980±0.080 WSF 1,000 15 C 10/10 0.125±0.013 0.905±0.060 Mussel 1,000 25 C 10/10 0.101±0.009 1.002±0.060 OSF 300 25 C 10/10 0.138±0.010 0.970±0.070 1,000 15 C 10/10 0.116±0.030 1.210±0.050 Tween 80 1.0 ml/l 15 C 10/10 0.094±0.028 1.280±0.110 Animals were exposed to crude oil-derived fractions for 1 week and enzyme activities were assessed 24 hr thereafter. Tween 80 was used as the solvent to accomodate oil-soluble fraction at 1 ml/l concentration. WSF: water soluble fraction; OSF: oil-soluble fraction. *Significant decrease compared to control by Duncan s multiple range test at P 0.05.
108 J. ENVIRON. TOXICOL. Vol. 21, No. 2 Table 2. Enzyme activities in rockfish and mussel following exposure to laboratory-weathered crude oil Enzyme activity Group Con. (mg/l) Temp. ( C) # of animals survived UDPGT GST (nmol/mg protein/min) (µmol/mg protein/min) Control 0 25 C 10/10 0.430±0.100 0.520±0.070 Rochfish WSF 1,000 25 C 9/10 0.510±0.080 0.590±0.120 OSF 300 25 C 8/10 0.380±0.110 0.280±0.070* 1,000 25 C 6/10 0.550±0.160 0.206±0.140* Control 0 25 C 10/10 0.077±0.014 0.764±0.102 Mussel WSF 1,000 25 C 10/10 0.093±0.009 0.815±0.083 OSF 300 25 C 10/10 0.071±0.015 0.916±0.122 1,000 25 C 10/10 0.086±0.024 0.841±0.142 For experimental details, refer to the legend to Table 1. *Significant decrease compared to control by Duncan s multiple range test at P 0.05. Table 3. Enzyme activities in rockfish and mussel following exposure to oil residue sampled in the oil spill area Enzyme activity Temp. Group Con. (mg/l) # of animals UDPGT GST ( C) survived (nmol/mg (µmol/mg protein/min) protein/min Control 0 25 C 11/11 0.580±0.090 0.690±0.050 Summer oil WSF 1,000 25 C 10/10 0.370±0.070 0.600±0.030 sample OSF 300 25 C 8/10 0.390±0.060 0.480±0.040* Rochfish 1,000 25 C 3/10 0.420±0.180 0.506±0.090 Control 0 15 C 9/9 0.730±0.070 0.570±0.060 Autumn oil WSF 1,000 15 C 9/9 0.720±0.090 0.690±0.090 sample OSF 1,000 15 C 9/9 0.620±0.080 0.710±0.070 Tween 80 1 ml/l 15 C 10/10 0.660±0.080 0.660±0.070 Summer oil sample N.T Mussel Control 0 15 C 10/10 0.092±0.007 0.890±0.080 Autumn oil WSF 1,000 15 C 10/10 0.092±0.009 0.980±0.100 sample OSF 1,000 15 C 9/9 0.102±0.009 0.910±0.120 Tween 80 1 ml/l 15 C 10/10 0.088±0.010 0.990±0.110 Summer and autumn samples were respectively collectively during Aug. 19~23, 1996, and Sep. 18~20, 1996. For 1,000 mg/l Summer oil sample in rockfish, the exposure was terminated after 2 days due to marked mortality, and enzyme analysis was performed 24 hr later. For other experimental details, refer to the legend to Table 1. N.T: not tested. *Significant decrease compared to control by Duncan s multiple range test at P 0.05. 것도대조군과비교하여효소활성에유의성있는변화가관찰되지아니하였다. 4. 현장채취생물시료에서의효소활성 유류오염사고발생현장에서가장가까운장소에 설치된양식장에서조피볼락을구입하거나, 사고지역근처의조간대에서채취한담치에서의활성을측정하였으며그결과를 Table 4 에서정리하였다. 구입하거나채취한조피볼락과담치에서 UDPGT 의활성에채취장소간유의할만한차이가발견되지아니하였다. 또한이들의활성은실험실에서사
June 2006 Park et al. : 원유노출과어패류 phase II 효소 109 Table 4. Enzyme activities in rockfish and mussel sampled in the oil spill vicinity Enzyme activity Organism Sampling site Sampling date # of animals examined UDPGT GST (nmol/mg protein/min) (µmol/mg protein/min) BS4 Feb. 12, 1977 6 0.710±0.077 0.788±0.111 May 8, 1977 5 0.527±0.043 0.824±0.083 Rockfish BS12 Feb. 12, 1977 5 0.728±0.112 0.754±0.115 BS3 Feb. 12, 1977 5 0.790±0.154 0.776±0.105 BS6 Feb. 11, 1977 5 0.674±0.167 0.608±0.208 BS7 May 8, 1977 5 0.584±0.104 0.711±0.116 BS2 Feb. 11, 1977 6 0.087±0.008 0.900±0.111 BS11 Feb. 11, 1977 5 0.089±0.081 0.834±0.118 BS1 Feb. 11, 1977 7 0.097±0.015 0.879±0.181 BS15 Feb. 24, 1977 10 0.084±0.010 0.684±0.072 Mussel BS8 Feb. 24, 1977 10 0.075±0.005 0.672±0.094 May 9, 1977 10 0.082±0.008 0.708±0.099 BS8 Feb. 24, 1977 10 0.088±0.008 0.662±0.088 BS10 Feb. 24, 1977 10 0.068±0.009 0.804±0.125 May 9, 1977 8 0.068±0.009 0.725±0.092 BS5 May 9, 1977 3 0.072±0.006 0.728±0.212 For collection sites, refer to Fig. 1. Two BS8 sample sites in mussel were very close as to be expressed as a single circle. 용한동일어류의대조군과비교하여도유의할만한차이가발견되지아니하였다. 현장에서입수한조피볼락과담치의 GST 활성에있어서도채취장소간, 또는이미설명한동일종의대조군에서의효소활성과비교하여서도유의할만한차이가발견되지아니하였다. 고 찰 최근해양생물에서의다양한생화학적반응을유류오염의평가의지표로활용하는연구가많이수행되었다. 특히담치와같은고착생믈들은오염현장에서도피하는능력이결여되어있기때문에오염물질에고농도로노출되는결과가초래되어심각한손상을입게된다. 본연구에서는원유, 실험실적으로유도한풍화유류시료, 1996 년하계및 1996 년추계에오염현장에서채취한유류를, 비노출지역에서입수한어류및패류에 1 주일동안노출시키면서생화학적인측면에서의독성인 Phase II 약물대사효소활성의변화를조사하였다. 또한동일한생물종을오염지 역에서채취하여이들효소의변화를측정함으로써현장의어패류가어느정도독성학적영향을받고있는가를검토하고자하였다. 독성물질에노출된생물에서의생화학적반응은대부분가역적이므로어떤시점에서분석하였느냐에따라결과와해석이달라지게될것이다. 이연구의경우불행하게도현장오염전및직후에확보한현장시료가없어서오염직후에현장의생물에서일어났을것으로생각되는상황은추정에의존할수밖에없을것이다. 그러나유류사고발생후상당한기간이경과한생물시료수집시점에서도, 현장에서는유류잔류물이발견되었을뿐아니라유류오염에기인하는것으로추정되는현상으로서빈약한조간대생물상이관찰되었다 ( 개인관찰자료 ). 또한이연구에서분석한생물시료에는유류잔류물에지속적으로노출되고있던것으로추정되는것들도포함시켰다. 따라서본연구의결과는, 유류사고후상당시간경과후에는잔류하고있는유류물질의노출이생물에어느정도영향을미칠수있는가를평가할수있는중요한자료로사용될수있을것이다. 아울러현재또는향후에동일지역생물에대한분석을수행하는데에
110 J. ENVIRON. TOXICOL. Vol. 21, No. 2 참고자료로활용될수있을것이다. 본연구는이러한변화하는상황을고려, 현장생물시료의분석, 현장유류시료에대한실험실적노출및인공풍화시료에대한실험실적노출시험등다양한변수를검토하였다. 이논문의결과부분에서 data 를제시한순서와는달리, 실제시험순서는오염현장에서채취한하계유류시료를가장먼저시험하였으며그시료를사용한시험결과를참고로하여이후의시험농도나노출기간을정하였다. 우선하계유류시료중지용성성분은최고노출농도인 1,000 mg/l 에서상당수의조피볼락이치사하였다. 따라서효소활성을측정할정도로충분한수의잔존동물이노출후남지않을가능성이우려되어 300 mg/l 으로농도를감소하여재시험을시도하였다. 또한이하계시료를이용한시험에서는비교적고온인 25 C 로노출하는예비시험과정에서노출농도가높을수록독성이증가하는경향이있음이파악되었다. 이하계유류시료에서발견된현상은지용성성분의 300 mg/l 의노출에의해조피볼락 GST 활성의현저한감소였다. 더높은농도인 1,000 mg/l 에서는 48 시간만노출하였을뿐만아니라분석할수있는잔존동물수가너무적었기때문에통계학적으로유의할만한변화가관찰되지않았을것으로생각된다. 지용성 300 mg/l 에서의 GST 활성의감소가추출용매로사용된 Tween 80 에의한효과일가능성이의심되었으나이후의연구에서 Tween 80 은관계가없음이규명되었다. 한편이이연구에서사용한 300 mg/l 이상은, 다른연구자 (Georgiades et al., in press; Siron et al., 1991; Strömgren, 1987) 들이사용한원유의농도 ( 30 mg/l) 보다훨씬높아원유유출사고직후에국지적으로나타날수있는생물계의반응과깊은연관성이있는것으로사료된다. 추계채취유류시료에의한노출에서는노출온도를 15 C 로유지하였으며 1,000 mg/l 까지의노출에서도하계시료에서발견되었던심각한치사효과나조피볼락의 GST 활성감소현상은관찰되지아니하였다. 추계시료와하계시료모두유출사고약 1 년후채취하였으며실제로추계 - 하계의기간차이는겨우 1 개월에불과하여추계시료에서하계시료보다현저한물리화학적변화가발생하였다고추정하기는어렵고, 단지두시료는이미채취이전부터독성의강도측면에서상이한단계에도달해있 었기때문으로보인다. 그러나추계유류시료가하계채취시에는어떠한단계에있었던가를알지못하기때문에확정적인결론을내리기가다소어렵기는하다. 제 2 단계의시험에서는원유시료및실험실적풍화유류시료를사용하여실험실적노출시험을수행하였다. 특히이전의조사에서하계현장시료중지용성성분으로노출 (300 mg/l, 25 C) 시킨경우 GST 활성의부분적감소가관찰된반면추계시료로노출 (1,000 mg/l, 15 C) 시에는그변화가관찰되지아니하였기때문에원유를사용한시험에서는 15 C 와 25 C 로노출온도를구분하여시험하였다. 또한이단계에서는지용성성분에의노출시관찰된변화가지용성성분용해목적으로사용된 Tween 80 의노출에의한효과는아님을확인할수있었다. 전반적으로높은온도의노출이독성작용을증가시키는경향이있었기때문에풍화유류시료의경우는 25 C 에서만시험하였다. 실제로원유와풍화시료로치사경향과효소의활성변화를검토한결과대체적으로하계유류시료에서나타난독성, 즉지용성성분에의한상당수조피볼락의치사와 GST 활성의감소가관찰되었다. 그러나원유시료와풍화시료를비교하였을경우에는현저한차이가없음이관찰되었다. 이는풍화과정에의해치사를유발하거나생화학적인독성을유발하는물질이그다지현저하게는소실되지않음을시사한다. 또한조피볼락이나담치에서모두수용성분획인경우는비교적높은농도에노출되는경우에는효소활성의변화나사망동물이잘발생하지않았다. 이는독성이강한 PAHs 는주로지용성분획에존재함을의미한다. 유류오염시생물에서나타나는생화학적변화는독성을평가하는지표로활용되어왔으며, phase I 및 II 의약물대사효소계들은모두예민한반응중의하나로간주되고있다. Phase I 효소계는유류오염에의해예민하게증가하는것이일반적 (Lee and Anderson, 2005) 이나, phase II 의변화는다소둔감하면서도생물종이나노출조건에따라다르게관찰되고있다. 예를들어담치의일종인 Mytilus galloprovincialis, 굴의일종인 Crassostrea rhizohorae, 환형동물 Euthoe complanata 에서는 GST 의활성이증가함을보고 (Moreira et al., 2004; Da Silva et al., 2005; Nusetti et al., 2005) 하고있는반면, 성게류
June 2006 Park et al. : 원유노출과어패류 phase II 효소 111 Paracentrotus lividus 와 mouse 에서는감소가보고되고있다 (Raza et al., 1995; Cunha et al., 2005). 그러나 rat 에서는처음에는증가하였다가감소하는경향으로변동 (Arif et al., 1994) 되는등분석시점에따라서도다른결과를얻을수있음을시사한다. 어류인 Atlantic salmon 에도유류의오염이 phase II enzyme 을억제할수있는가능성이제시된바있다 (Gagnon and Holdway, 2000). 그러나이연구에서직접적으로다른독성학적지표인체중의변화나간장유래혈장효소 ( 예, GOT, GPT) 를분석하지않았기때문에확인할수는없지만, 발견된 Phase II 활성의감소가이들효소계에미친선택적인영향이아니라일반적인간장독성으로인한대사장해일가능성 (Khan et al., 1986) 도배제할수는없을것이다. 한편본연구와연계하여수행한분석에서는동일한방법으로실험실적으로원유에노출한조피볼락과담치에서 phase I 효소들인 EROD 및 AHH 가 1.7~22.0 배까지증가하는양상을발견 ( 김정상, 미발표자료 ) 하였다. 즉 Phase II 효소는감소한반면, phase I 효소는증가한현상이관찰되므로두효소계의변화방향이반드시일치하지는않음을의미한다. 이와유사하게동일한오염물질노출로인해 phase I 효소계와 II 효소계가서로다른방향으로변화할수있음이보고되어있다 (Croce and Stagg, 1997). 본연구에서유류오염현장으로부터, 실험실적노출생물종과동일종인조피볼락및담치를유출사고 1 년 6 개월 ~2 년후에해당하는 1997 년 2 월과 1997 년 5 월에채취하여효소활성을조사하였다. 그결과분석한 2 종의효소활성에서채취장소간차이가발견되지않았다. 특히이때생물채취장소를유류지점으로부터거리가다른, 즉상이한수준의유류오염을겪었을곳으로추정되는현장을대상으로분석한바, 실험실적으로노출하였던경우의조피볼락과는달리채취장소간차이가발견되지아니하였다. 이는생물채취시점에현장에존재하는어류에서유류오염에의한생화학적독성이잔존하고있지않다는의미이다. 또한이들에서의효소활성이실험실에서사용한동일종의대조군과차이가없음은효소계에영향이없음을확인하였다고할수있다. 본연구에서원유또는그실험실적풍화물질을 노출하였을때나타난감소반응이유류사고가난지약 1 년이상경과한후에채취한시료에서는관찰되지않아서, 시료를채취한시점에서는이미노출반응이소실된것으로보인다. 이는다른연구자들이유류사고후약 2~3 개월간은유류오염지역에서포획한어류간장 phase I 효소계의활성이지속적으로증가하지만 1 년이내 ( 보통 4 개월 ) 에는이전의수준으로복귀하는현상 (Lindström-Seppä, 1988) 과유사하다고할수있을것이다. 생물시료를채취한 1997 년에도현장에서유류잔류물이조간대에서발견되고는있었지만, 이연구에서사용한현장생물시료들은노출사고 1.5~2 년후에채취되었기때문에현장생물시료에서의분석결과는독성현상의하나인효소계가복구되었음을확인하는의미를가진다. 결론적으로, 실험실적으로유류시료를어패류에높은농도로노출시키면현저한생화학적인독성이나타나지만현장에서채취한어패류에서는 Phase II 효소계에의독성이나타나고있지않는것으로미루어, 효소변화가이미회복되었거나또는생물시료수집시점에의오염유류의농도는생화학적독성을유발할정도로높지않았던것으로판단된다. 감사의글 이논문은 2006 년도군산대학교수산과학연구소의연구비지원에의해서수행되었습니다. 참고문헌 Arif JM, Khan SG, Mahmood N, Aslam M and Rahman Q. Effect of coexposure to asbestos and kerosene soot on pulmonary drug-metabolizing enzyme system. Environ Health Perspect 1994; 102: 181-183. Bobra AM, Shiu WY, MacKay D and Goodman RH. Acute toxicity of dispersed fresh and weathered crude oil and dispersants to Dapnhia magna. Chemosphere 1989; 19: 1199-1222. Clark AG. The comparative enzymology of the glutathione S-transferases from non-vertebrate organisms. Comp. Biochem. Physiol. 1989; B92: 419-446 Collier TK, Krone CA, Krahn MM, Stein JE, Chan S-L and
112 J. ENVIRON. TOXICOL. Vol. 21, No. 2 Varanasi U. Petroleum exposure and associated biochemical effects in subtidal fish after the Exxon Valdez oil spill. Am Fish Soc Symp 1996; 18: 671-683. Collodi P, Stekoll MS and Rice SD. Hepatic aryl hydrocarbon hydroxylase activities in coho salmon (Oncorhynchus kisutch) exposed to petroleum hydrocarbons. Comp Biochem Physiol 1984; 97C: 447-341. Croce B and Stagg RM. Exposure of Atlantic salmon parr (Salmo salar) to a combination of resin acids and a water soluble fraction of diesel fuel oil: a model to investigate the chemical causes of pigmented salmon syndrome. Environ Toxicol 1997; 9: 1921-1929. Cunha I, Garcia LM and Guilhermino L. Sea-urchin (Paracentrotus lividus) glutathione S-transferase and cholineraterase activities as biomarkers of environmental contamination. J Environ Monit 2005; 7: 288-294. Da Silva AZ, Zanette J, Fernando-Ferreira J, Guzenski J, Marques MR and Bainy AC. Effects of salinity on biomarker responses in Crassostrea rhizophorae (Mollusca, Bivalvia) exposed to diesel oil. Ecotoxicol Environ Saf 2005; 62: 376-382. Gagnon MM and Holdway DA. MFO induction in Atlantic salmon (Salmo salar) during and after exposure to Bass Strait crude oil. Aus J Ecotox 1998; 4: 29-35. Gagnon MM and Holdway DA. EROD induction and biliary metabolite excretion following exposure to the water accommodated fraction of crude oil and to chemically dispersed crude oil. Arch Environ Contam Toxicol 2000; 38: 70-77. Georgiades ET, Danis B, Gillan DC, Dubois Ph., Temara A and Holdway DA. Effect of crude oil contaminated sediment exposure on cytochrome P450 enzymes in the Auatralian asteroid Coscinasterias muricata. Chemesphere, in press. Habig WH, Pabst MJ and Jacoby WB. Glutathione transferases: The first enzymatic step in mercapturic acid formation. J Biol Chem 1974; 249: 7130-7139. Heras H, Ackman RG and MacPherson EJ. Tainting of Atlantic salmon (Salmo salar) by petroleum hydrocarbons during a short-term exposure. Mar Poll Bull 1992; 24: 310-315. Khan S, Rahman AM, Payne JF and Rahimtula AD. Mechanisms of petroleum hydrocarbon toxicity: studies on the response of rat liver mitochondria to Prudhoe Bay crude oil and its aliphatic, aromatic and hetrocyclic fractions. Toxicology 1986; 42: 131-142. Krahn MM, Rhodes LD, Myers MS, Moore LK, MacLeod WD Jr and Malins DC. Association between metaboliters of aromatic compounds in bile and the occurrence of hepatic lesions in English sole (Paophyrus vetulus) from Puget Sound, Washington. Arch Environ Contam Toxicol 1986; 15: 61-76. Lee RF and Anderson JW. Significance of cytochrome P 450 system responses and level of bile fluorescent aromatic compounds in marine wildlife following oil spills. Mar Poll Bull 2005; 50: 705-723. Lindström-Seppä P. Biomonitoring of oil spill in a boreal archipelago by xenobiotic biotransfomation in perch (Perca fluviatilis). Ecotoxicol Environ Saf 1988; 15: 161-170. Moreira SM, Moreira-Santos M, Ribeira R and Giulhermino L. The Coral Bulker fuel oil spill on the north coast of Portugal: spatial and temporal biomarker responses in Mytilus galloprovincialis. Ecotoxicology 2004; 13: 619-630. Neff JM. Composition and fate of petroleum and sill-treating agents in the marine environment. In: Geraci JR and St. Aubin DJ (eds) Sea mammals and oil: confronting the risks. Academic Press, London, 1990; pp. 1-12. Neff JM and Anderson JW. Responses of marine animals to petroleum and specific petroleum hydrocarbons. Applied Science Publishers, Essex, 1981; 177pp. Nusetti O, Zapata-Vivenes E, Esclapes MM and Rojas A. Antioxidant enzymes and tissue regeneration in Eurythoe complanata (Polychaeta: Amphinomidae) exposed to used vehicle crankcase oil. Arch Envion Contam Toxicol 2005; 48: 509-514. Payne JR, Phillips CR and Hom W. Transport and transformations: Water column processes. In: Boesch DF and Rabalais NN (eds). Long-term environmental effects of offshore oil and gas development. Elsevier Applied Publishers, London, 1987; pp. 175-231. Peters LD, Shaw JP, Nott M, O Hara SCM and Livingstone DR. Development of cytochrome P 450 as a biomarker of organic pollution in Mytilus sp.: Field studies in United Kingdom (Sea Empress s oil spill) and the Mediterranean Sea. Biomarkers 1999; 4: 425-441. Raja H, Qureshi MM and Montague W. Alteration, glutathione S-transferase and lipid peroxidation in mouse skin and extracutaneous tissues after topical application of gasoline. Int J Biochem Cell Biol 1995; 27: 271-277. Saeed T and Al-Mutairi M. Comparative composition of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in the sea water-soluble fractions of different Kuwaiti crude oil. Adv Environ Res 2000; 4: 141-145. Siron R, Giusti G, Berland B, Morales-Loo R and Pelletier E. Water-soluble petroleum compounds: chemical aspects and effects on the growth of microalgae. Sci Total
June 2006 Park et al. : 원유노출과어패류 phase II 효소 113 Environ 1991; 104: 211-227. Stromgren T. Effect of oil and dispersants on the growth of mussels. Mar Environ Res 1987; 21: 239-246. Thomas RE and Rice SD. Excretion of aromatic hydocarbons and their metabolites by freshwater and seawater Dolly Varden char. In: Verbnberg FJ, Calabrese A, Thurberg F and Venberg W (eds) Biological monitoring of marine pollutants. Academic Press, New York, NY, 1981; pp. 425-448.