<C6EDC1FD2D32362D34C8A32DBEC8C0CCBAF1C0CEC8C4B0FAC7D0C8B8C1F62E687770>

The Journal of Korean Medical Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology 2013;26(4):1-14 pissn 1738-6640 eissn 2234-4020 http://www.ood.or.kr http://dx.doi.org/10.6114/jkood.2013.26.4.001 Original Article / 원저정향추출물도포가 DNCB로유발된알레르기성접촉피부염에미치는영향 이경엽 강다혜 김희택세명대학교한의과대학안이비인후피부과교실 The Effects of Syzygium aromaticum extract Spread on the Allergic Contact Dermatitis induced by DNCB Kyung-Yeob Lee Da-Hae Kang Hee-Taek Kim Dept. of Korean Oriental Medical Opthalmology & Dermatology, College of Korean Medicine, Semyung University Abstract Objectives : The purpose of this study is to investigate effects of Syzygium aromaticum (SAE) spread on the allergic contact dermatitis caused by 2,4-dinitro-chlorobezene (DNCB). Methods : Forty-two mice were divided into six groups ; normal, negative control (DNCB-treated), positive control (DNCB + 1% pimecrolimus), experimental group Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ. control and experimental groups were induced allergic contact dermatitis by DNCB. Experimental group Ⅰ(DNCB + 0.2% SAE), Ⅱ(DNCB + 1% SAE) and Ⅲ(DNCB + 5% SAE) were spread SAE and positive control was spread the 1% pimecrolimus. In this study, effect of SAE on clinical aspects on the skin, histopathological change, the blood level of IgE, cytokines, histamine were investigated. In addition, effect of SAE on spleen CD4 + /CD8 + T cell subset was investigated. Results : 1. In experimental group Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ, erythemas and edema were more reduced than negative control. 2. In experimental group Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ inflammatory edema and the numbers of infiltrated inflammatory cells were more reduced than negative control. 3. In experimental group Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ, clinical skin score was more reduced than negative control. 4. In experimental group Ⅱ and Ⅲ, the thickness of skin was statistically significant reduced than negative control. c 2013 the Society of Korean Medical Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology This is an Open Access journal distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/license/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 1

5. In experimental group Ⅱ and Ⅲ, histamine release was statistically significant reduced than negative control in dose-dependantly. 6. In experimental group Ⅱ and Ⅲ, cytokines (IL-1β, TNF-α, IL-4, IL-6, IL-10) were statistically significant reduced than negative control in dose-dependantly. 7. In experimental group Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ, the level of total IgE was statistically significant reduced than negative control in dose-dependantly. 8. In experimental group Ⅲ, CD4 + and CD8 + T cells were statistically significant decreased similar to the positive control. Conclusions : According to above experiments, Syzygium aromaticum(sae) was effective on allergic contact dermatitis. Key words ; Syzygium aromaticum(sae); Allergic Contact Dermatitis; DNCB; Th1; Th2; histamine; Spread 서론 알레르기성접촉피부염은개체가이미항원에감 작된후다시항원에재차노출되면서 T 림프구와 대식세포등에의해서발생되는세포성면역과민반 응으로, 항원과접촉시수시간에서 72 시간사이에 염증반응이시작되는지연형과민반응이다 1). 알레르기성접촉피부염의치료로는항히스타민제및부신피질호르몬제가사용되고있으나일시적인진정효과및염증완화작용은뛰어나지만오남용의우려와장기간사용에따른각종부작용발생등의문제가있어근본적인치료제는부적합한실정이고, 과민성면역질환이라는점에서 cyclosporin 등면역억제제를사용한연구가이루어지고있으나여러부작용이보고되고있다 2,3). 이에따라치료효과가높고부작용이적은치료제를개별한약재나처방에서찾고자하는다양한연구들이진행되고있다 4-10). DNCB(2,4-dinitrochlorobenzen) 는동물실험에서알레르기성접촉피부염을유발시키는데사용되는대표적인유발물질로최근 DNCB로유발한알레르기성접촉피부염에관한한의학연구에서는개별한약재 4,5) 나처방 6,7) 을이용한항알레르기및소염효과에 교신저자 : 김희택, 충북제천시신월동산 21-11 세명대학교부속제천한방병원한방안이비인후피부과학교실 (Tel : 043-649-1817, E-mail : kht8725c@naver.com) 접수 2013/10/2 수정 2013/11/1 채택 2013/11/8 대한연구들이이루어지고있다. 특히이들을알레르기성접촉피부염병변부위에직접도포하여외용제로활용하는연구또한소수이루어지고있다 8-10). 본연구에사용한정향 (syzygium aromaticum) 은본래비위 ( 脾胃 ) 를따뜻하게하고, 곽란 ( 霍亂 ), 분돈기 ( 奔豚氣 ) 와냉기로배가아프고음낭이아픈것을치료하는효능이있는약물이다 11). 최근피부진균및장티프스, 디프테리아같은균에대한항균작용과항산화활성에대한보고 12-14) 가있으며, 즉각형과민반응억제효과 15) 와항알레르기작용 16) 등이보고되고있다. 정향의외용에대한연구로는에센셜오일형태로피부에도포하여여드름 17) 과칸디다질염 18) 에항균효과가있음이보고된바가있지만알레르기성접촉피부염에대한연구는접하지못하였다. 이에저자는정향추출물을직접피부에도포했을때피부항균효과뿐만아니라항알레르기효과를검증하기위해본실험을설계하였다. DNCB 을이용하여알레르기성접촉성피부염을유발한 mouse 에정향에탄올추출물과 pimecrolimus을각각도포하는실험을진행하여혈청히스타민, IgE 면역관련인자인사이토카인, T림프구의발현과육안적피부병변과조직병리학적관찰을통해알레르기성접촉성피부염을억제하는효과를관찰하였기에보고하는바이다. 2

이경엽외 2 인 : 정향추출물도포가 DNCB 로유발된알레르기성접촉피부염에미치는영향 실험방법 1. 실험동물및실험재료 1) 실험동물실험동물인수컷마우스 (NC/Nga, 6주령 ) 는 SLC (Japan) 로부터구입하였다. 모든마우스는 25, 60% 습도조건에서멸균시킨사료로사육하였다. 세명대학교한의과대학동물실험실의환경에약일주일간적응후실험에포함시켰다. 본실험은세명대학교동물실험윤리위원회의규정을준수하여설계, 수행되었다. 2) 시약구입 DNCB는씨그마알드리치코리아 ( 주 ) 에서구입하였다. Pimecrolimus 는 NOVARTIS에서판매하는엘리델 (1% pimecrolimus 크림 ) 을사용하였다. RPMI 1640 배지는 lonza( 주 ) 에서구입하였다. 3) 실험재료본실험에사용할정향은 ( 주 ) 한의유통을통해서 500g 구입하여 3차증류수 1l와혼합하여 2시간동안 80 로열탕한후상층액을여과지로여과하고이여과액을 rotary evaporator (EYELA, NE-1001, Japan) 를이용하여 200ml로농축시킨후, -80 에서동결시켰다. 이농축액을다시 freezer dryer system (Labconco, USA) 를이용하여 7일간동결건조시킨후최종적으로 97.5g( 수율 19.5%) 의분말을얻었으며, 이분말을 3차증류수 50ml에 0.2%, 1%, 5% 로용해시켜실험동물의피부에도포하였다. 2. 실험방법 1) 실험군의구성생후 6주령된수컷마우스 (NC/Nga, 6주령 ) 를실 험실시전두피를제외하고복부와등부의털을모두제거하였고, 무작위로각각 7마리씩다음의여섯군으로분류하였다. 1 Normal Control (NC) 2 Negative Control (DNCB 도포군, DNCB) 3 Positive Control (DNCB + 1% pimecrolimus 도포군, PC) 4 Experimental Group Ⅰ (DNCB + 0.2% 정향도포군, EG Ⅰ) 5 Experimental Group Ⅱ (DNCB + 1% 정향도포군, EG Ⅱ) 6 Experimental Group Ⅲ (DNCB + 5% 정향도포군, EG Ⅲ) 2) 알레르기성접촉피부염유발 Day 0에 100μl의 0.8% DNCB in acetone/ ethanol (1:4) 을등부에 1주일간도포하여감작시켰다. 그리고 100μl의 5% 의 DNCB in Olive oil 을등에주 3회씩총 5주동안도포 (day 7 to 42) 하여알레르기성접촉피부염을유발시켰다. 동시에 200μl씩각각의실험물질 (dissolved distilled water) 을등에주 5회의간격으로도포하였으며, 정상대조군에는 distilled water만도포하였다. 피부의증상에대한평가는실험물질도포후 0, 1, 2, 3, 4, 5 그리고 6주차에각각이루어졌다. 3) 혈청 histamine, IgE, cytokine 측정실험시작후 42일째, 마우스의심장으로부터혈액을채취하였다. 혈청은원심분리 (1,700 x g, 10 min) 하여채취하였고실험전까지 -80 에서보관하였다. 혈청에포함되어있는 IgE (R&D system), histamine (SPI Bio), TNF-α, IL-1β, IL-6 (R&D system) 그리고 Th1/Th2 cytokine (ebioscience) 의양을 ELISA kit을사용하여측정하였다. 구체적인실험방법은각각의제조사의방법에따라이루어졌으며, 측정은 SPECTRAMAX190(Molecular Devices) 3

를사용하여이루어졌다. 4) 피부병변에대한평가마우스의피부병변의정도 (Clinical Skin Severity Score) 측정은아토피피부염에서일반적으로사용되는 Yamamoto M의방법을약간변형하여임상적육안평가법을이용하였다 19). 육안평가항목은 erythema/hemorrhage, dryness/scarring, edema, excoriation/erosion, lichenification 5가지항목으로하고, 육안평가결과는각각평가한점수의총합으로나타낸다. 각각의항목은없음 (0), 약함 (1), 중증도 (2), 심함 (3) 으로채점하였으며최소 0 점에서, 최고 15 점사이의점수를측정하였다. 5) CD4 + /CD8 + T세포분석각실험군의마우스에서무균적으로비장을채취하였다. 채취된비장을 glass slider로분쇄하고 Red Blood Lysis Buffer (0.83% ammonium chloride 용액 ; NH 4 Cl:Tris=9:1) 로적혈구를용해시킨뒤, 비장림프구를분리하였다. 5 10 6 cell/ ml의세포를 4% paraformaldehyde로고정시킨후 Alexa Fluor 488 conjugated CD4+ 항체와 PE conjugated CD8+ 항체를이용하여비장에서분리한림프구에붙였다. Flow cytometric analysis 는 FACScalibur flow cytometer (BD Biosciences) 를사용하여이루어졌다. Kruskal Wallis 검정 (ANOVA 에대한비모수적검정법 ) 과 Student t-test 를사용하였다. 모든결과는각실험군의평균값 ± 표준편차 (Mean ± SD) 로나타내었고, 유의확률 (p-value) 은 p<0.05로하였다. 실험결과 1. 육안적관찰 DNCB의도포가반복될수록정상군에비해 DNCB 도포군의홍반과부종은증가하였다. 양성대조군인 DNCB + 1% pimecrolimus 도포군은발생된홍반과부종을감소시켰으며, 실험군 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 은농도의존적으로홍반과부종을감소시켰다. 특히실험군 Ⅲ인 DNCB + 5% 정향도포군은양성대조군과유사할정도로홍반과부종을감소시켰다 (Fig. 1). A B C 6) 피부의조직병리학적관찰 마우스의등부위피부를적출하여 10% 의중성포르말린용액에서고정하였다. 고정시킨피부조직을파라핀포매하고, 8μm로박절한후 Hematoxylin & Eosin 염색을하였다. 이렇게제작된각실험군의검체를가지고광학현미경으로조직병리학적인병변을관찰하였다. 7) 통계분석각실험군간통계적유의성을분석하기위하여 D E F Fig. 1. Therapeutic effect of SAE in NC/Nga mice with allergic contact dermatitis induced by DNCB A : Normal Control B : Negative Control (DNCB-treated) C : Positive Control (DNCB + 1% pimecrolimus treated) D : Experimental Group Ⅰ (DNCB + 0.2% SAE treated) E : Experimental Group Ⅱ (DNCB + 1% SAE treated) F : Experimental Group Ⅲ (DNCB + 5% SAE treated) 4

이경엽외 2 인 : 정향추출물도포가 DNCB 로유발된알레르기성접촉피부염에미치는영향 2. 조직병리학적변화마우스의등부위피부조직을광학현미경을이용하여 100배와 200배배율로관찰하였다 (Fig. 2, 3). 정상군의피부조직은특별한이상소견이발견되지않은반면 (Fig. 3A), DNCB 도포군은피부조직의비후화와염증성부종이관찰되었다. 표피세포의유극세포층증식소견이여러부위에서관찰되었으며, 진피표피경계부 (dermoepidermal junction) 는틈새가형성되어있었으며, 모세혈관의확장이두드러지게관찰되었다. 침윤된염증세포는대부분호중구및림프구가혼재되어있었으며, 또한많은수의호염구도침윤되어있었다 (Fig. 3B). 실험군 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ에서는염증성부종과염증세포침윤이줄어드는경향을보였는데, 특히실험군 Ⅲ 은 DNCB+1% pimecrolimus 도포한양성대조군과유사한감소를보였다 (Fig. 3D-F). 3. 피부병변의정도에미치는영향 Erythema/hemorrhage, dryness/scarring, edema, excoriation/erosion, lichenification 의총 5가지항목에대하여 3점척도를사용하여 6주간육안적관찰을실시하였다. 6주후 clinical skin score 는실험군 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 모두 DNCB 도포군에비해감소하였는데, 특히 5% 정향도포군인실험군 Ⅲ는양성대조군인 DNCB+1% pimecrolimus 도포군보다피부병변의정도가감소되어있는것이관찰되었다 (Fig. 4). 16 Fig. 2. Histologic analysis of allergic contact dermatitis in NC/Nga mice treated with SAE( 100) A : Normal Control B : Negative Control (DNCB-treated) C : Positive Control (DNCB + 1% pimecrolimus treated) D : Experimental Group Ⅰ (DNCB + 0.2% SAE treated) E : Experimental Group Ⅱ (DNCB + 1% SAE treated) F : Experimental Group Ⅲ (DNCB + 5% SAE treated) Clinical skin score 14 12 10 8 6 4 2 0 Normal Control DNCB DNCB+1% pimecrolimus DNCB+0.2% SAE DNCB+1% SAE DNCB+5% SAE 0 1 2 3 4 5 6 Weeks after sensitization Fig. 4. Effects of SAE on development of allergic contact dermatitis-like skin lesions in NC/Nga mice in response to repeated DNCB challenge 4. 표피의두께에미치는영향 Fig. 3. Histologic analysis of allergic contact dermatitis in NC/Nga mice treated with SAE( 200) 실험마지막날마우스의등부위피부조직을채취하여표피의두께를측정한결과, DNCB 도포군에비해실험군 Ⅱ와실험군 Ⅲ에서는농도의존적으로유의하게 (p<0.05) 표피두께를감소시켰다 (Fig. 5). 5

DNCB 도포군은비만세포주의활성화에의하여정상군에비하여 2배이상증가된 histamine 유리를보였다. 실험군 Ⅱ, Ⅲ는농도의존적으로유의하게 (p<0.05) histamine 유리를감소시켰는데, 특히 5% 정향도포군인실험군 Ⅲ는양성대조군인 DNCB+1% pimecrolimus 도포군과유사하게 histamine 유리를감소시켰다 (Fig. 6). 6. Cytokine 에미치는영향 1) Pro-inflammatory cytokine Fig. 5. Effects of epidermis thickness in NC/Nga mice NC : Normal Control DNCB : Negative Control (DNCB-treated) PC : Positive Control (DNCB + 1% pimecrolimus treated) EG Ⅰ : Experimental Group Ⅰ (DNCB + 0.2% SAE treated) EG Ⅱ : Experimental Group Ⅱ (DNCB + 1% SAE treated) EG Ⅲ : Experimental Group Ⅲ (DNCB + 5% SAE treated) 5. 혈중 histamine 유리억제에미치는영향 실험마지막날, 심장채혈을통하여얻은혈청에서 pro-inflammatory cytokine 인 IL-1β와 TNF-α 의농도를분석하였다. 그결과 IL-1β와 TNF-α는실험군 Ⅱ, Ⅲ에서농도의존적으로유의하게 (p<0.05) 감소되었는데, 특히 5% 정향도포군인실험군 Ⅲ는양성대조군인 DNCB+1% pimecrolimus 도포군과유사하게 IL-1β와 TNF-α의농도를감소시켰다 (Fig. 7, 8). Fig. 6. Effects of SAE on the serum histamine levels in DNCB treated Nc/Nga mice 실험 6 주후마우스의심장으로부터혈액을채취 하여 histamine 유리에미치는영향을관찰한결과, Fig. 7. Effects of SAE on serum level of IL-1β in DNCB treated Nc/Nga mice 6

이경엽외 2 인 : 정향추출물도포가 DNCB 로유발된알레르기성접촉피부염에미치는영향 서 Th2 cytokine인 IL-4, IL-6, IL-10의농도를분석하였다. 그결과 IL-4, IL-6, IL-10은실험군 Ⅱ, Ⅲ에서농도의존적으로유의하게 (p<0.05) 감소되었는데, 특히 5% 정향도포군인실험군 Ⅲ는 IL-4 농도를양성대조군인 DNCB+1% pimecrolimus 도포군과유사하게감소시켰으며, IL-10의경우에는양성대조군인 DNCB+1% pimecrolimus 도포군보다더유의성있게감소시켰다 (Fig. 10, 11, 12). Fig. 8. Effects of SAE on serum level of TNF-α in DNCB treated Nc/Nga mice 2) Th1 실험마지막날, 심장채혈을통하여얻은혈청에서 Th1 cytokine인 INF-γ 를분석하였다. 그결과 INF-γ 의농도는모든실험군에서유의성이관찰되지않았다 (Fig. 9). Fig. 10. Effects of SAE on serum level of IL-4 in DNCB treated Nc/Nga mice Fig. 9. Effects of SAE on serum level of INF-γ in DNCB treated Nc/Nga mice 3) Th2 실험마지막날, 심장채혈을통하여얻은혈청에 Fig. 11. Effects of SAE on serum level of IL-6 in DNCB treated Nc/Nga mice 7

7. Total IgE 에미치는영향 실험 6주후마우스의심장으로부터혈액을채취하여 total IgE에미치는영향을관찰한결과, DNCB 도포군은정상군에비하여 total IgE 수치가 3배이상증가되었다. 실험군 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ은농도의존적으로유의하게 (p<0.05) total IgE 수치를감소시켰는데, 특히 5% 정향도포군인실험군 Ⅲ는양성대조군인 DNCB+1% pimecrolimus 도포군보다더유의성있게 total IgE 수치를감소시켰다 (Fig. 13). 8. 비장의 CD4 +, CD8 + T 세포변화에미치는영향 Fig. 12. Effects of SAE on serum level of IL-10 in DNCB treated Nc/Nga mice 정향이 T 세포의유입을억제하는가를비장에서적출한 T 세포를유세포분석기를이용하여조사하였다 (Table 1). 비장에서각군의 CD4 + 와 CD8 + T 세포를조사한결과실험군 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ에서농도의존적으로 CD4 + 와 CD8 + T 세포가감소하였는데, 특히실험군 Ⅲ에서는양성대조군인 DNCB+1% pimecrolimus 도포군과유사한유의성 (p<0.05) 있는 CD4 + 와 CD8 + T 세포감소를보였다. 고찰 Fig. 13. Effects of SAE on the serum IgE levels in DNCB treated Nc/Nga mice 알레르기성접촉성피부염은급속한산업화의진행과생활양식의변화로다양한항원에신체가노출되면서야기되는피부염으로, 발병이점차증가하는추세이다. 알레르기성접촉피부염은항원에이미감작된개 Table 1. Effect of SAE on Spleen T Lymphocyte Subset Group CD4 +, % CD8 +, % CD4 + /CD8 +, % Normal Control 2.82±0.523 1.72±0.302 2.03±0.362 DNCB 6.43±0.702 2.52±0.452 5.63±0.623 DNCB+1% pimecrolimus 3.15±0.356 * 1.82±0.369 * 2.13±0.396 * DNCD+0.2% SAE 5.94±0.564 2.41±0.362 2.63±0.412 DNCD+1% SAE 5.02±0.632 2.32±0.251 2.03±0.213 DNCD+5% SAE 3.82±0.236 * 2.08±0.302 * 1.92±0.152 * 8

이경엽외 2 인 : 정향추출물도포가 DNCB 로유발된알레르기성접촉피부염에미치는영향 체가재차항원에접촉될때접촉된국소부위에발 적, 구진, 소수포, 소양등의염증반응을일으키는 제 Ⅳ 형지연형과민반응 (Delayed type hypersensitivity) 에속하는면역질환으로, World Allergy Organization 에따르면항원과결합한단백질복합체에감작된 사람들에게일어나는 Th1 우세면역반응으로정의 하고있다 1,20,21). 발병기전은알레르겐이피부를침투하여표피에서매개단백과결합하여완전한항원이된뒤, 항원제시세포인랑게르한스세포와접촉하여 T 림프구에항원을전달하게된다. 이러한 T림프구중일부가기억세포로체내에남아있게되면서재차항원이피부를침투하게되면기억세포가이를감지하여 IL-1, IL-3, IL-6, INF-γ, TNF-α, GM-CFS 등과같은각종화학물질이분비되며, 이를매개로염증이발생된다 21,22). 모든물질들이항원이될수있으며, 특히니켈, 크롬을포함하여옻나무의 pentadecylcatechol, 은행나무열매의 gingkolic acid 등이항원성이높다. 이외에도화장품의방향성화합물, 염색약에포함된 paraphenylenediamine, 매니큐어성분, 합성수지를고분자화하기전의중간물질이나촉매제제, 농약등이항원으로종종작용한다 21,22). 알레르기성접촉피부염은한의학적인범주로서발생부위와원인물질에따라漆瘡 23), 狐尿刺 24), 粉花 25) 瘡등에해당한다. 漆瘡은漆의辛熱之毒이원인이되어얼굴에발생하며, 狐尿刺는螳螂의분비물, 狐狸의배설물로인하여수족지절에생긴다. 粉花瘡은鉛粉을이용한화장으로인해얼굴에발생하는것으로접촉하는항원의종류만달라현대의학의알레르기성접촉피부염과유사하다 26). 한의학적치료는內治와外治로구분할수있으며內治法의경우급성기에는淸熱解毒, 祛風, 利濕, 凉血이위주가되며, 만성기에는祛風, 養血을위주로하였다. 外治法의경우급성기에는淸熱燥濕하는약물들이, 만성기에는活血養血하는약물들이사용되 었다. 劑型에서도급성기에는丘疹위주이거나水疱가터지지않았을경우에는洗劑, 散劑를, 水疱가터져삼출물이있는경우는煎湯液, 洗劑, 散劑를, 滲出液이없는경우와糜爛하거나結痂를이룬경우또는만성기에는膏劑를사용하였다 27). 최근 DNCB로유발한알레르기성접촉피부염에관련한연구들은개별한약재 4,5) 나처방 6,7) 을을이용한연구들이이루어지고있다. 정향 (syzygium aromaticum) 은도금낭과 (Myrtaceac) 에속하는정향나무의피지않은꽃봉우리이다. 성분은 eugenol, oleanolic acid, kaempferol 7-Ometylether, 3,3''4-trio-O-methylellagic acid, maslinic acid, β-sitosterol-3-o-glucoside, isorhamnetin 3-O-glucoside 7가지로분리된다 12). 性味는辛溫無毒하며暖胃健脾, 理氣消食, 止嘔등의효능이있는약물이다. 최근피부진균및장티프스, 디프테리아같은병원성미생물에대한항균작용과항산화활성, 항응고작용에대한보고 13,14) 가있으며, 즉각형과민반응억제효과와항알레르기작용 15,16) 등이보고되고있으나알레르기성접촉성피부염에치료효과를실험한연구는없었다. 이를위해 NC/Nga mouse 42마리를각각 7마리씩정상군, 음성대조군 (DNCB 도포군 ), 양성대조군 (DNCB+1% pimecrolimus 도포군 ), 실험군 Ⅰ (DNCB+0.2% 정향도포군 ), 실험군 Ⅱ (DNCB+1% 정향도포군 ), 실험군 Ⅲ (DNCB+5% 정향도포군 ) 6 개군으로나누어육안적피부병변과, 병리조직학적변화관찰, 혈청히스타민, IgE, 면역관련인자인사이토카인의양을측정하였다. 본연구에서알레르기성접촉피부염유발을위하여사용한 2,4-dinitrochlorobenzen (DNCB) 는과민한세포성면역반응을일으켜피부손상즉홍반, 해면화, 상피세포과형성, 비만세포와 T림프구, 혈청 IgE의증가등을일으킨다 28,29). 대부분의사람이 DNCB에노출되게되면 T 림프구의 type IV hypersensitivity reaction 을일으키게된다 30). Matsukura 9

등은실험쥐에장기적으로도포하면 Th1형이우세한접촉과민반응이유도되어접촉성피부염과유사한피부병변의자연적발생을촉진한다고하였다 31). 본연구에서도 DNCB 를사용하여만든알레르기성접촉피부염모델은피부홍반 (erythema), 낙설 (desquamation), 각화 (keratosis) 등이발생하고, 조직병리학적소견에서비후된스폰지조직 (spongiosis) 등을보여인간에서보이는중등도이상의피부염소견을발현시킨것으로평가되었다. 양성대조군에사용된 pimecrolimus는스테로이드의부작용이없는칼시뉴런억제제로서알레르기성접촉피부염, 아토피피부염등에사용되고있는연고제이며최근스테로이드제제의부작용을줄이기위해병용되어지고있다 32). DNCB를사용하여 NC/Nga mice에알레르기성접촉피부염을유발시키고실험군 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ를도포하고육안적관찰을한결과실험군 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 모두농도의존적으로부종을감소시켰는데, 특히실험군 Ⅲ인 DNCB + 5% 정향도포군의부종감소는양성대조군과유사할정도로부종을감소시켰다. 알레르기성접촉피부염조직의가장특징적인변화는스폰지조직의비후와부종, 단핵구및각종염증관련면역세포의침윤등이라고할수있는데, 본연구에서도음성대조군의피부조직에서스폰지조직의비후소견과기저조직에서단핵구들이증가하는소견이관찰되었다. 실험군 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ에서는염증성부종과염증세포침윤이줄어드는경향을보였는데, 특히실험군 Ⅲ은 1% pimecrolimus 도포한양성대조군과유사한감소를보였다. 정향도포가피부병변의정도에미치는영향을알아보고자 erythema/hemorrhage, dryness/scarring, edema, excoriation/erosion, lichenification 의총 5가지항목에대하여 3점척도를사용하여 6주간육안적관찰을실시하였다. 6주후 clinical skin score는실험군 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 모두 DNCB 도포군에비해감소하였는데, 특히 5% 정향도포군인실험군 Ⅲ는양성대조군인 DNCB+1% pimecrolimus 도포군보다피부병변의정도가감소되어있는것이관찰되었다. 또한표피의두께를측정한결과실험군 Ⅱ와실험군 Ⅲ에서는농도의존적으로유의하게 (p<0.05) 표피두께를감소시켰다. Histamine은항원-항체반응에의해비만세포가자극될때, 비만세포의과립에서세로토닌, 뉴코트리엔, 헤파린등의많은화학물질들과함께유리되는데, 혈관확장과단백의유출을유도하여가려움증, 발적, 홍반, 팽진등을야기하고제Ⅰ형아나필락시스과민반응을일으킨다 1). 본연구에서는실험 6주후마우스의심장으로부터혈액을채취하여 histamine 유리에미치는영향을관찰한결과, DNCB 도포군은비만세포주의활성화에의하여정상군에비하여 2배이상증가된 histamine 유리를보였다. 실험군 Ⅱ, Ⅲ는농도의존적으로유의하게 (p<0.05) histamine 유리를감소시켰는데, 특히 5% 정향도포군인실험군 Ⅲ는양성대조군인 DNCB+1% pimecrolimus 도포군과유사하게 histamine 유리를감소시켰다. 과민성면역질환에서매개역할을하는것으로알려진 IgE는정상군보다 DNCB 도포군에서 3배이상증가하였으나실험군 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ는농도의존적으로유의하게 (p<0.05) total IgE 수치를감소시켰다. 특히 5% 정향도포군인실험군 Ⅲ는양성대조군인 DNCB+1% pimecrolimus 도포군보다더유의성있게 IgE 수치를감소시켰다. B림프구에서의 IgE 생성은 Th2 사이토카인인 IL-4 및 IL-13에의해증가되며 Th1 사이토카인인 IFN-γ등에의해서강력히억제된다 33). 본연구에서는 IL-4에의존하여 IgE 가증가하는것을볼수있었다. 생체내에서발생하는면역반응에서 T림프구가관여하는면역반응을중심으로분류해보면 Th1 반응과 Th2 반응으로나누어볼수있다 34). 즉, CD4 + T림프구가활성되었을때분비하는 cytokine 에따라서 Th1세포와 Th2세포로분류된다. Th1 세 10

이경엽외 2 인 : 정향추출물도포가 DNCB 로유발된알레르기성접촉피부염에미치는영향 포는 IL-2, IFN-ɤ 를분비하며, 지연형과민반응을매개하지만 Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10을분비하여즉시형과민반응, 체액성면역반응에관여한다. 이러한 Th1 세포와 Th2 세포의상호길항작용을통해서인체는면역균형을유지하게된다. Th1과 Th2 반응에서가장대표적인 cytokine 으로 IL-4와 IFN-ɤ 를들수있다 34,35). 천식 (asthma) 과같은질환은 Th2 반응이위주가되므로 IL-4를비롯하여 IL-5, IL-6, IL-10과같은 Th2 계열 cytokine이증가되며 34,35), 알레르기접촉피부염은 Th1 반응이위주가되어 IFN-ɤ, IL-2 등의 cytokine이증가하게된다 36). IFN-γ 는주로 DC4 + 보조 T림프구의 Th1세포에의해생산되는 cytokine으로대식세포를활성화하고지연형면역반응을매개한다 35). IL-4는주로 CD4 + 보조 T림프구의 Th2세포에의해생산되는 cytokine 으로미감작 CD4 + 전구세포로부터 Th2림프구의분화를유도하며, B림프구에의한 IgE생산을자극한다 34). IL-6는활성화된대식세포, 내피세포, 섬유아세포와같은여러유형의세포로부터생산되는사이토카인으로 B림프구의성장에관여하며과민성면역반응을매개한다 37). TNF-α 는대식세포에서생성되며감염부위고호중구및단핵구의보충을자극시키는 cytokine으로혈관내피세포를자극하여새로운부착분자를발현하게한다 38). IL-1β는랑게르한스세포나단핵세포, 대식세포의주된 cytokine으로서표피로부터랑게르한스세포가이주하는데관여한다. TNF-α 와 IL-1β는모든염증반응의시작을유발할수있어서전염증성 (pro-inflammatory) cytokine으로불린다 1). 본연구에서정향도포가 cytokinedp 미치는영향을살펴본결과 pro-inflammatory cytokine인 IL-1β와 TNF-α는실험군 Ⅱ, Ⅲ에서농도의존적으로유의하게 (p<0.05) 감소되었는데, 특히 5% 정향도포군인실험군 Ⅲ는양성대조군인 DNCB+1% pimecrolimus 도포군과유사하게 IL-1β와 TNF-α 의농도를감소시켰다. Th1 cytokine인 INF-γ 의농도를분석한결과 INF-γ의농도는모든실험군에서유의성이관찰되지않았다. Th2 cytokine인 IL-4, IL-6, IL-10의농도를분석한결과 IL-4, IL-6, IL-10은실험군 Ⅱ, Ⅲ에서농도의존적으로유의하게 (p<0.05) 감소되었는데, 특히 5% 정향도포군인실험군 Ⅲ는 IL-4 농도를양성대조군인 DNCB+1% pimecrolimus 도포군과유사하게감소시켰으며, IL-10의경우에는양성대조군인 DNCB+1% pimecrolimus 도포군보다더유의성있게감소시켰다 CD4 + 는도움 T림프구의표지인자이고, CD8 + 는세포독성 T림프구의표지인자 39) 로서비장에서각군의 CD4 + 와 CD8 + T 세포를조사한결과실험군 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ에서농도의존적으로 CD4 + 와 CD8 + T 세포가감소하였는데, 특히실험군 Ⅲ에서는양성대조군인 DNCB+1% pimecrolimus 도포군과유사한유의성 (p<0.05) 있는 CD4 + 와 CD8 + T 세포감소를보였다. 그러나본연구에서는에탄올추출물을피부를통하여직접처리하였기때문에피부조직내에서의정향농도는구강투여보다는높을것으로유추하지만어느정도수준일지에대하여아직까지어떤연구결과도없는실정이다. 추후정향의특정성분을측정하는등의방법을통하여피부조직내의농도를가늠할수있는후속연구가이루어져야할것으로생각된다. 결론정향이 DNCB로유발된알레르기성접촉성피부염에미치는영향을관찰한결과다음과같은결론을얻었다. 1. 육안적관찰에서실험군 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ은 DNCB 도 11

포군에비해농도의존적으로홍반과부종을감소시켰다. 2. 실험군 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ에서 DNCB 도포군에비해염증성부종과염증세포침윤이감소되었다. 3. 실험군 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ은 DNCB 도포군에비해 clinical skin score를감소시켰다. 4. 실험군 Ⅱ, Ⅲ은 DNCB 도포군에비해농도의존적으로유의하게감작된표피의두께를감소시켰다. 5. 실험군 Ⅱ, Ⅲ은 DNCB 도포군에비해농도의존적으로유의하게 histamine 유리를감소시켰다. 6. 실험군 Ⅱ, Ⅲ은 DNCB 도포군에비해농도의존적으로유의하게 IL-1β, TNF-α, IL-4, IL-6, IL-10의농도를감소시켰다. 7. 실험군 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ은 DNCB 도포군에비해농도의존적으로유의하게 total IgE 수치를감소시켰다. 8. 실험군 Ⅲ에서양성대조군과유사한유의성있는 CD4 + 와 CD8 + T 세포감소를보였다. 참고문헌 1. Korean Dermatological Association. Dermatology. Seoul:Yeomoonkak Co. 2008:64-8, 72-4, 78-80, 125-33, 179-85, 234-5. 2. Kim SW. Cyclosporin Treatment Atopic Dermatitis. Is it really associated with infection disease. Ann Dermatol. 2010;20: 170-1. 3. ML Pacor, G Di Lorenzo, N Martinelli, P Mansueto, GB Rini, R Corrocher. Comparing tacrolimus ointment and oral cyclosporine in adults patients affected by atopic dermatitis. A randomized study. Clin Exp Allergy. 2004;34:639-45. 4. Shin GS. The Effects of Rhemanniae Radix Extract on Allergic Contact Dermatitis induced by DNCB in Mice. Graduate School Dongguk University. 2000. 5. Baik YH. Salviae Miltiorrhizae Root inhibits Atopic Dermatitis in the DNCB(dinitrochlorobenzene)-induced Atopic Dermatitis NC/Nga Mice. Graduate School Kyung Won University Seoul, Korea. 2006. 6. Byun SH, Lee BW, Kim SC. Effect of Samyoyongantang on Contact Hypersensitivity induced by Repeat Elicitation of DNCB. The Korean Journal of Oriental Medical Prescription. 2005;13(2):59-69. 7. Kim CH, Kim KJ. The Effects of Yanghyulsamultanggamibang to Allergic Contact Dermatitis. The Journal of Korean Oriental Medical Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology. 2005;18(1):13-26. 8.Kim SC, Lee JR, Choi KI, Park SJ, Kwon YK, Byun SH. Effect of Lonicerae Flos-Skin on Contact Hypersensitivity induced by Repeat Elicitation of DNCB. Kore. J. Herbology. 2006;21(1):9-15. 9. Lim JH, Park YM, Kim JS, Jeong HY, Seo EW. Effect of Cnidium officinale Extract on Recovery Capability of Allergic Contact- Dermatitis in Rat. Korean J. Plant Res. 2011;24(4):430-7. 10.Kim CJ, Kim YB, Ku YH, Nam HJ. The Effects of Sophorae Radix and Coptidis Rhizoma - Iotophoresis in Allergic contact Dermatitis. The Journal of Korean Oriental Medical Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology. 2005;18(1):1999-220. 12

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