초임계유체추출법을이용한龍膽瀉肝湯藥鍼液의精油성분에대한硏究 177 DOI:10.3831 KPI.8.11.1.177 원저 초임계유체추출법을이용한龍膽瀉肝湯藥鍼液의精油성분에대한硏究 신민섭ㆍ육태한우석대학교한의과대학침구과 The Study on the Composition of Yongdamsagan-tang( 龍膽瀉肝湯 ) s Essential Oil Obtained by Supercritical Carbon Dioxide Extraction Shin Min-Seop, Yook Tae-Han ABSTRACT Objectives Methods Results This study was performed to analyze the effective components of essential oil obtained from Yongdamsagan-tang, which has been efficacious against leukorrhea in gynecologic diseases. I obtained the essential oils of Yongdamsagan-tang by hydrodistillation extraction method and supercritical fluid extraction(sfe) method, and then I analyzed those by GC/MS(Gas Chromatography/Mass Spectrum). 1. The optimum SFE(Supercritical Fluid Extraction) condition was obtained in the following experiment conditions: pressure atm, temperature, duration of extraction minutes. 2. With GC(Gas Chromatography) and GC/MS(Gas Chromato- graphy/mass Spectrum) analysis, I identified 37 compounds in the Yongdamsagan-tang's essential oil obtained through the SFE method. The main compounds were as follows : 3-Methyl-but-2-enoic acid,2,2-dimethyl-8-oxo-3,4-dihydro-2h,8h -pyrano[3,2-g]chromen-3-yl ester(49.81 %), (Z)-6-Pentadecen-1 -ol(3.19%), (-)-Spathulenol(2.40%). 3. I identified 4 compounds in the Yongdamsagan-tang's essential oil obtained through the hydrodistillation method. The main compounds were as follows : 3-Methyl-but-2-enoic acid, 2,2-dimethyl-8-oxo-3,4-dihydro-2H,8H-pyrano[3,2- g]chromen-3-yl ester(2.61%). 4. 3 - Methy l - but - 2 - enoic acid, 2, 2 - dimethyl - 8 - oxo - 3, 4 - dihydro - 2H, 8H - pyrano[3, 2 - g] chromen - 3 - yl ester, all were identified in both the SFE method and the hydrodistillation method, but the others were not identified in common. 5. I also conducted an additional test in order to examine the essential oil's antimicrobial action against bacteria. Both MIC(Minimum Inhibitory Concentrations) and MBC(Minimum Bactericidal Concentrations) were 0.1mg / ml against N. meningitidis, however MIC and MBC were 1.0mg / ml in antimicrobial action against 12 different genera of bacteria. key words Supercritical fluid extraction, Yongdamsagan-tang( 龍膽瀉肝湯 ), Herbal acupuncture, Hydrodistillation, Antimicrobial action 교신저자 : 육태한, 전주시완산구중화산동 2 가 5 번지우석대학교한방병원 Tel : 063-220-8622 E-mail : nasiss@naver.com
178 대한약침학회지제 11 권제 1 호 (8 년 3 월 ) Ⅰ. 서론 藥鍼療法은經絡學과本草學이접목된한방치료기술로서임상에서그활용도가점차로증가하고있는치료법으로서, 이에사용되는약침액중八綱藥鍼液은수증기증류법을이용하여추출하며, 약침액에함유된精油성분의藥理作用보다는구성된處方의효능에근거하여치료에적용하고있지만그구성성분의藥理作用역시배제할수는없다 1). 藥物의精油성분을추출하는방법으로는초임계유체추출법 (Supercritical Fluid Extraction; SFE) 과수증기증류법 (Hydrodistillation Extraction) 이있는데, 초임계유체추출법은유체의점도가기체와비슷하게낮아추출대상물질의내부로쉽게침투해유효성분을빠르게추출할수있고, 밀도는액체와비슷하여용해력 (solubility) 이크다는장점이있으며, 유체로임계온도와임계압력이비교적낮은이산화탄소 (Carbon Dioxide) 를이용함으로써많은양의용매를필요로하는煎湯이나여과방법을통해서는추출하기어려운精油성분 (Essential Oil) 을효과적으로추출할수있는방법이다 2,3). 수증기증류법은높은온도로인한성분의변성과긴추출시간, 수득률감소등의단점이있는데비하여, 초임계유체추출법은낮은온도와높은압력하에서짧은추출시간과높은수득률을갖는특징이있으므로, 전통적인추출방법인수증기증류법과최신방법인초임계유체추출법을이용하여추출성분을비교하는것은煎湯전후의성분변화와회수율을알아보는데있어서중요한의의를지닌다 4). 龍膽瀉肝湯은肝膽의實火또는肝經에濕熱邪가침범함으로써발생하는증상을치료하는데, 肝膽의火가上炎하면頭痛 口苦 目赤腫痛 耳聾이발생하고, 肝經은 脇을 注하므로肝膽의實火또는濕熱이盛하면脇痛이발생하며, 肝經은陰器에連絡하므로肝經에침입한濕熱이經脈을따라下注하면 濁, 陰腫이발생한다 5). 즉급성방광염으로인한염증과小 不利, 분비물이排尿中에있으며痛症을수반할때이를응용하는데, 임상적으로急性요도염 바르톨린선염 陰部痒痛 子宮內膜炎 陰部濕疹에사용되고있다 5). 6) 龍膽瀉肝湯에대한기존의연구에서徐와 등 7) 8), 宋은龍膽瀉肝湯의항알레르기, 抗炎症 解熱 鎭痛 利尿및항균효과를, 등 9,10) 은龍膽瀉肝湯이白鼠의肝損傷에 미치는영향을, 11) 은龍膽瀉肝湯加味方추출물이 Trichophyton mentagrophytes에우수한항균력이있음을연구보고하고있으나이들에대한성분분석및藥鍼液의효능에대한연구는보고된바가없다. 이에저자는임상에서婦人帶下症의치료에적용되는龍膽草山梔子柴胡黃芩車前子木通澤瀉生地黃當歸 12) 甘草로구성된龍膽瀉肝湯을선정하여, 이를수증기증류법과초임계유체추출법으로각각추출하고 Gas Chromatography(GC)-Mass spectroscopy(ms) 를이용하여유효성분을분석하기위해본硏究를진행하였으며, 초임계유체추출법으로추출한精油성분을 8종의표준균주와 5종의임상분리균주에투여해서이들성분의항균활성효과를확인하여유의성있는결과를얻었기에보고하는바이다. Ⅱ. 실험 1. 龍膽瀉肝湯의준비 1) 처방구성실험에는龍膽瀉肝湯 (Table 1) 을사용하였다. 약재들은 ( 주 )HMAX( 서울, Korea) 에서자체적으로시행한성분검사, 중금속검사 (Heavy Metal Test Report), 화학물질오염도 (Chemical Pollution) 검사, 미생물검사 (Biological Test), SO₂검사등의기준에적합판정을받은약재를구입하여사용하였다. 2) 약재의처리각각의약재는동결건조처리후사용하였다. 동결건조는 -30~-40 에서각각의약재를동결한후진공속에서얼음을승화 (sublimation) 시켜수분을제거하게되므로, 색 맛 조직 형태등의변화가적으며보존이용이하기때문에이방법을시행하였다.
초임계유체추출법을이용한龍膽瀉肝湯藥鍼液의精油성분에대한硏究 179 (Table 1) Components of Yongdamsagan-tang ( 龍膽瀉肝湯 ) Herb Scientific Name Weight(78g) 라반응조내부에서만순환하던수증기가냉각수에의해액체화되어분액여두로한방울씩받아지게된다. 龍膽草山梔子柴胡黃芩 Genlianac scabrac Radix Gardeniae Fructus Bulpleuri Radix Scutellariae Radix 6g 9g 6g 9g 5) 무기염류의침강추출이끝나고 1l PYREX병에받아진藥鍼液은무기염류를침강시키기위해서하루동안냉장보관하였다. 車前子 Plantaginis Semen 9g 木通澤瀉生地黃當歸甘草 Akebiae Caulis Alismatis Rhizoma Rehmanniae Radix Crudus Angelicae Gigantis Radix Glycyrrhiza uralensis 9g 12g 9g 3g 6g 6) 등장액및 ph 조절무기염류를침강시킨약침의상층액을분리한후, Na 3 PO 4 를첨가하여 ph가 7.~7.가되도록조절하고, 약전소금 (NaCl) 을첨가하여 0.9 % 등장액이되도록하였 다 ( 염도계 : DEMTRA, Japan). 2. 수증기증류추출 (Hydrodistillation Extraction) 1) 세척작은크기로절단된약재를채반에담아 Ultra pure water(3차증류수기 : Ultra Pure 900, USA) 로세척하였다. 2) 약재의침출반응조하부에약재를넣고약재의부피를고려하여 3 차증류수를부어 Impeller, 반응조하부, 반응조상부냉각관 ( 환류 증류 ), 분액여두를설치하고, controller를 setting한뒤약 80-90분동안약재를불렸다. Controller는온도를 105 로설정해 10분이상예열하도록 setting하였다. Impellar speed는 4.5~5정도로작동하며, 환류냉각관에호수를꽂아 5 의냉각수가흐르도록하였다. 3) 전탕약재의불림이끝나고 105 로 120분동안전탕을시작하였다. 이때 Impeller 작동을하고전압스위치는 10으로고정하고, 냉각수가환류냉각관에서흐르도록하였다. 4) 추출전탕이끝나면호스의위치를증류냉각관쪽으로바꿔주어서흐르게하고온도는 107 로올려주었다 ( 추출시간 3시간 ). 추출원리는시간의경과함에따라설정온도범위 ( 전탕온도 105 ) 에서전탕되고, 충분히끓었던약재의온도가높아지고 ( 추출온도 107 ) 냉각수순환위치가바뀜에따 7) 여과 Filter장치를준비하고여과지를깔아음압을이용하여여과한다. 여과지는 Whatman(cellulose) 을사용하고, 0.μm 0.2μm 0.1μm의순서로사용하였다. 8) 소분및멸균멸균된 vial에여과된藥鍼液 20cc를자동분주기 (EMakku-drivedispenser, Germany) 를사용하여넣은후 cap을씌웠다. 고압증기멸균기 (high pressure sterilizer: 신진, Korea) 에넣어 30 분간 121, 1.5기압으로고압멸균하였다. 9) 냉장보관변질을방지하기위해시료는냉장보관하였다. 3. 초임계유체추출 (Superciritical Fluid Extraction) 1) 시약초임계유체추출용매는 99.9 % 의순도를가진이산화탄소 (Carbon dioxide) 를사용하였고, 조건은 Taguchi method를따랐다 13). 2) 방법초임계유체추출장치는 Suprex MPS/ system (Pittsburgh, PA, Figure 1) 을이용하여분말시료 g 을추출용기에넣고추출압력, 온도및시간의 parameter 를각각 3단계로변화시키면서추출하였다. 이때추출압력은, 및 atm에서, 추출온도
180 대한약침학회지제 11 권제 1 호 (8 년 3 월 ) 는, 및 에서, 추출시간은, 및 분에서각각시행하였다. 또한각각의추출단계에서추출의최적조건을위해추출수율및굴절률을 1.476에서 1.480의범위에서병행하여실시하였다. 4. 굴절율의측정 (Measurement of Refractive Index) 초임계의여러조건에서추출한精油의물리화학적인성질을측정하기위해서 Abbe 굴절기 (Atago-3T, Japan) 를이용하여 20 의나트륨램프 (D-line) 에서굴절률을측정하였다 14,) (Table 2). 5. GC-MS 분석 1) GC-MS 분석조건시료의성분을분석하기위하여 Shimadzu GC-MS (QP2010) 을사용하였으며분석조건은아래의표와같다. 2) 시료조건각각의시료에서초임계유체추출법으로추출한龍膽瀉肝湯精油는 CHCl3 로 10배희석하여주입하였으며, 수증기증류방법으로조제한藥鍼液은원액을그대로주입하였다. 1.CO2 cylinder 2.Check valve 3.Filter 4.Cooling bath 5.High pressure pump 6.Safety valve 7.Cosolvent pump 8.Preheater 9.Extractor 10.Metering valve 11.Back pressure regulator 12.separator 13.Gas meter P. Pressure gauge T. Temperature indicator Figure. 1. Schematic Diagram of Supercritical Fluid Extractor Apparatus (Table 3) The GC-MS Operating Conditions (Table 2) SFE Experimental Conditions and Extraction Yields for Yongdamsagan-tang ( 龍膽瀉肝湯 ) Run No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Pressure (atm) Temperature ( ) Dynamic time (min) μmμm RItems Conditions GC-2010 Column HP-5 (30m 0.mm 0. ) Carrier gas He Injector temp. 0 Oven temp. 50 (5min) - 2 /min - 0 (20min) Column flow 0.8mL/min Injection volume 1.0 Split ratio 20 : 1 MS(QP2010) Ion Source EI, 70eV Ion Source temp. Interface temp. 0 Scan range 30-0m/z
초임계유체추출법을이용한龍膽瀉肝湯藥鍼液의精油성분에대한硏究 181 6. 성분분석 精油성분의분석은정성된 peak를확인후그 RT(Retention Time) 와기존에보고된 Mass spectra를비교 16) 하였으며또한, NIST 27, 147과 Wiley 7 library를기준으로프로그램검색을시행하였고, 가능한경우는검증된 compound를시료와 co-injection하는방법도병행하였다. 7. 항균활성효과 1) 항균력실험에사용된균주항균효과를확인하기위해사용된미생물은 % glycerol이들어있는 BHI(Brain Heart Infusion) 에넣어 -70 초저온냉동기에보관사용하였으며, 균주현황은 Table 4와같다. 2) 배지및기타 (1) Mueller-Hinton agar (MHA, Difco laboratories, Sparks, MD) MHA 38g을증류수 0ml에녹여가압멸균후평판배지를만들어항균력실험에사용하였다. (2) Mueller-Hinton broth (MHB, Difco laboratories, Sparks, MD) MHA 218g을증류수 0ml에녹여 4ml씩실험관에넣어가압멸균후항균력실험에사용하였다. (3) 0.5 McFarland turbidity standard (Table 4) Strains used this Study Strains ATCC b 1 Bacillus cereus 11778 2 Candida albicansa 3 Escherichia coli 922 4 Enterobacter cloacea 235 5 Neisseria meningitidisa 6 Staphylococcus aureus 923 7 Staphylococcus aureus 391 8 Staphylococcus epidermidis 12228 9 Streptococcus agalactiae a 10 Salmonella Typhi 14028 11 Shigella sonneia 12 Vibrio parahemolyticus a 13 Vibrio vulnificus 29307 a Strain isolated from clinical sample b American type culture collection 미생물농도 (1.5 x 108/ ml ) 를맞추는데사용하였다. (4) 精油성분초임계유체추출법으로추출한龍膽瀉肝湯精油를사용하였다. 3) 방법실험균주중 N. meingitidis는초콜릿한천배지에접종하여 5 % CO2 배양기에, Streptococcus agalactiae는혈액한천에, 그외는모두 MHA배지에접종하여 37 공기중배양기에서 24시간배양하였으나 C. albicans는 48 시간배양하여순수배양된집락으로 MHB 4ml에 McFarland 0.5관 (1.5x10 8 / ml ) 이되도록균액을만들었다. 精油성분은 0μg / ml에서부터 1.95μg / ml가되도록증류수로단계희석하였다. N. meningitidis는초콜릿한천배지에서, 다른균주들은 MHA에골고루바른다음지름 6mm빈디스크를놓고그위에각각의균주를 10μl씩넣고 37 에서 24 시간배양하여억제대의지름을측정하였다. 조금이라도억제대의징후가보이면감수성으로판정하였고, 항균력을확인하기위해서억제된디스크주위를 loop로채취하여증식여부를관찰하였다. Ⅲ. 결과 1) 초임계유체추출법 (SFE) 에의한龍膽瀉肝湯精油의추출최적조건탄소수 10, 및 20 과생리활성을나타내는작용기 ketone과 hydroxy group을갖는精油를얻기위해추출압력, 추출온도및추출시간을각각 3단계로변화를시키면서총 9단계에서추출하여굴절률및추출수율을측정하면서최적조건을찾아내었다 (Table 5). 이때 atm,, 분, 2.12g/g, 굴절률 1.4873에서최적조건을얻었고, 이최적조건에서얻은精油로성분분석을시도하였다. 2) GC-MS 분석에의한龍膽瀉肝湯精油의성분 Figure 2, 3과같이각각의 peak를정성하였으며, 초임계유체추출법에의해추출된龍膽瀉肝湯精油에서많은성분을확인할수있었다. 초임계유체추출법에의해서 37 종의성분을확인하였고, 수증기증류법에의해서는 4종의성분을확인하였다.
182 대한약침학회지제 11 권제 1 호 (8 년 3 월 ) (Table 5) SFE Experimental Conditions and Extraction Yields for Yongdamsagan - tang ( 龍膽瀉肝湯 ) Run No. Pressure (atm) Temperature ( ) Dynamic time (min) Extraction yield (w/w) Refractive Index(nD20) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.78 0.84 1.02 1.11 2.12 1.01 1.13 1.49 1. 1.3323 1.3612 1.43 1.4671 1.4873 1.5021 1.5056 1.5122 1.5189 Fig. 2. GC/MS Chromatogram of Essential Oil from Yongdamsagan-tang with SFE Fig. 3. GC/MS Chromatogram of Essential oil from Yongdamsagan-tang with the Hydrodistillation 초임계법으로추출한龍膽瀉肝湯精油의주성분은 3- Methyl-but-2-enoic acid,2,2-dimethyl-8-oxo- 3,4-dihydro-2H,8H-pyrano[3,2-g] chromen-3-yl ester(49.81 %), (Z)-6-Pentadecen-1-ol(3.19 %), (-)- Spathulenol(2.40 %) 등으로나타났다. 수증기증류법의藥鍼液주성분은 3-Methyl-but-2- enoic acid,2,2- dimethyl-8-oxo-3,4-dihydro- 2H,8H-pyrano[3,2-g]chromen-3-yl ester(2.61 %) 이었다. 3) 추출된精油의물리화학적특성 (Analyses of Physico chemical Parameter) 보통精油의성분으로는탄소수가 monoditerpen, sesquiterpene 및 diterpen으로구성되어있는것으로알려져있다. 또한이들精油성분이생리활성을나타내는작용기 (functional group) 는 ketone 및 hydroxy group 인것으로많이보고되고있다 17). 본연구에서이러한精油의주요성분과생리활성을나타내는작용기들의존재여부를물리화학적인특징인굴절을측정함으로써알수있었다. 그결과를 Table 5에나타내었다. 이때 Abbe 굴절기로나트륨램프 (D-line) 에서 20 에서굴절률을측정한결과 1.3323에서 1.5189까지측정되었다. 탄소수가 10, 및 20 개의탄소수와, ketone 및 hydroxy기가함유된것으로알려진精油성분의굴절률의범위가 1.476에서 1.480을만족하는 3, 4 및 5단계중에서추출수율이높은 5단계의 atm,, 분및굴절률이 1.4873에서최적조건을얻을수있었다. 4) 억제농도 (Minimum Inhibitory Concentrations) 와살균농도 (Minimum Bactericidal Concentrations) 의측정 Neisseria meningitidis의균주에서최소억제농도 (MIC) 와최소살균농도 (MBC) 는각각 0.1와 0.0mg /L
초임계유체추출법을이용한龍膽瀉肝湯藥鍼液의精油성분에대한硏究 183 (Table 6) Yongdamsagan - tang ( 龍膽瀉肝湯 ) Obtained by SFE RT 10.8 11.8 16.392 21.758 37.308 37.492 40.967 42.5 44.633 50.5 50.808 52.308 54.567.8 56.167 56.333 57.900 60.342 62.875 64.608 68.467 70.817 71.900 74.142 75.317 75.892 76.9 78.6 78.9 81.4 81.700 81.967 95.500 95.650 97.267 102.892 105.483 107.600 107.9 118.392 122.683 Name.α.-Pinene Camphene D-Limonene Nonanal Ocimene Bicyclo[4.1.0]hept-2-ene, 3,7,7-trimethyl- Cyclohexane,1-ethenyl-1-methyl-2,4-bis(1-methylethenyl)-,[1S-(1.α.,2.β.,4.β.)]- Caryophyllene α.-caryophyllene Cyclohexanemethanol,4-ethenyl-.α.,.α.,4-trimethyl-3-(1-methylethenyl)-,[1R-(1.α.,3.α.,4.β.)]-.γ.-Elemene Caryophyllene oxide 1-Hydroxy-1,7-dimethyl-4-isopropyl-2,7-cyclodecadiene (-)-Spathulenol 2-Naphthalenemethanol,decahydro-.α.,.α.,4a-trimethyl-8-methylene-,[2R-(2.α.,4a.α.,8a.β.)]- 2-Naphthalenemethanol,1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydro-.α.,.α.,4a,8-tetramethyl-,[2R-(2.α.,4a.α.,8a.β.)]- 1-Hexadecanol Oxacyclotridecan-2-one (-)-Spathulenol (-)-Spathulenol 1-Nonadecanol Hexadecanoic acid Falcarinol Pentadecanoic acid Methoxsalen Falcarinol (E)-9-Octadecen-1-ol 9,12-Octadecadienoic acid (Z)-9-Octadecenoic acid (Z)-6-Pentadecen-1-ol 9,12-Octadecadienoic acid E)-9-Octadecenoic acid Tetracosane Palmitin, 2-mono- Diisooctyl phthalate 3-Methyl-but-2-enoic acid,2,2-dimethyl-8-oxo-3,4-dihydro-2h,8h-pyrano[3,2-g]chromen-3- yl ester 3-Methyl-but-2-enoic acid,2,2-dimethyl-8-oxo-3,4-dihydro-2h,8h-pyrano[3,2-g]chromen-3- yl ester trans-squalene Pentadecanal Oxirane, heptadecyl- Hexatriacontane (Table 7) Yongdamsagan - tang ( 龍膽瀉肝湯 ) Obtained by Hydrodistillation RT 6.033 92.8 94.267 101.992 104.283 Name Furfural Linolein, 2-mono- (Z,Z)-2-(9,12-octadecadienyloxy)-ethanol 3-Methyl-but-2-enoic acid,2,2-dimethyl-8-oxo-3,4-dihydro-2h,8h-pyrano[3,2-g]chromen-3- yl ester 3-Methyl-but-2-enoic acid,2,2-dimethyl-8-oxo-3,4-dihydro-2h,8h-pyrano[3,2-g]chromen-3- yl ester
184 대한약침학회지제 11 권제 1 호 (8 년 3 월 ) 이었으나, 나머지 12균주는모두 MIC와 MBC가모두 1.0 mg /L이상이었다(Table 8). (Table 8) Antibacterial Properties of Essential Oil against 5 Clinical and 8 Standard Strains Ⅳ. 고찰 Strains Bacillus cereus ATCC b 11778 Candida albicans a Escherichia coli ATCC 922 Enterobacter cloacea ATCC 235 Neisseria meningtitidis a Staphylococcus aureus ATCC 923 Staphylococcus aureus ATCC 391 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 Streptococcus agalactiae a Salmonella Typhi ATCC 14028 Shigella sonnei a Vibrio parahemolyticus a Vibrio vulnificus ATCC 29307 a Strain isolated from clinical sample b American type culture collection MIC ( mg /L) MBC ( mg /L) 0.1 1 0.1 1 전통적인韓藥療法과鍼灸療法외에韓藥材에서추출한약침액을鍼灸治療法에응용하는新鍼療法으로서藥鍼療法이있는데, 이療法은經絡學의원리와本草學의氣味論이접목된한방치료기술로서최근그활용도가증가하고있다 1). 八綱藥鍼液은수증기증류법을이용하여추출하며, 藥鍼液에함유된精油성분의藥理作用보다는구성된處方의氣味論에근거하여치료에적용하고있지만그구성성분의藥理作用에대해서는아직까지연구된바가없다. 천연물이나약재에서유효성분을추출해내는방법으로는煎湯이나유기용매를통한방법이있으나발생가능한유해물질의잔류나환경독성등이문제가될수있다. 이러한문제점을극복하기위한방법의하나로초임계유체기술을통해서천연물의추출 정제에활용되고있는데, 주로精油 (Essential oil) 성분을추출하는데응용되고있다 18,19,20,21,22). 초임계유체는임계온도와임계압력이상에존재하는유체로써기체와액체의중간적인성격에서기인한낮은 점도, 높은용해력을이용하여식품산업, 향장품산업에이용되고있으며, 최근에는고분자합성및분획, 난분해성폐기물의처리, 특수염색등에도이용되고있으며그응용범위가확장되는추세이다 2,3). 임상적으로龍膽瀉肝湯은婦人帶下症을치료하는데龍膽草山梔子柴胡黃芩車前子木通澤瀉生地黃當歸甘草등으로구성된처방으로瀉肝淸膽, 淸熱 濕하는효능이있어肝火實火로인한胸痛 口苦 目赤 耳聾 耳鳴등과肝經濕熱로인한小 濁 陰腫 陰痒 囊癰 纏腰火丹의치료에이용되고있다 5). 구성약재중개별적으로는龍膽草가백선균, 피부진균의억제작용이있고, 梔子의眞菌類에대한억제작용, 黃芩의포도상구균 연쇄상구균 수막구균등에대해서억제효과, 柴胡의육아종생장억제효과, 木通의병원성진 23,24) 균에대한억제효과, 當歸의항균효과등의藥理作用이있다. 혼합구성된龍膽瀉肝湯에대한연구로는煎湯을통해龍膽瀉肝湯液을추출하여白鼠의肝損傷에미치는영향 9,10) 과항알레르기에관한효과 11), 抗炎症 解熱 鎭痛 利尿 8,18) 및抗菌效果등의실험이보고된바있으나藥鍼液이나초임계유체추출법에대한연구는아직까지진행되지않았다. 이러한龍膽瀉肝湯의精油성분을추출 분석하기위해수증기증류법과초임계유체추출법을활용하여본硏究를진행하였다. 龍膽瀉肝湯의초임계추출시사용된유체는임계점이상온에가깝고, 무독성 불연성이면서가격이매우저렴한이산화탄소 (Tc=31, Pc=73atm) 를사용하였는데, 환경친화성또는에너지절약형공정개발이가능하고, 특히잔존용매가전혀남지않기때문에천연물에서유효성분을추출하는데유리하며,26), 온도 압력의변화로용질성분을선택적으로추출할수있으므로 27,28,29) 본연구에서도이를사용하였다. 추출시초임계장치를이용하여추출압력, 온도및시간의 parameter를각각 3단계로변화시키면서추출하였고, 탄소수 10, 및 20 과생리활성을나타내는작용기 ketone과 hydroxy기를갖는精油를얻기위해추출압력, 추출온도및추출시간을각각 3단계로변화를시키면서총 9단계에서추출하여굴절률및추출수율을측정하면서최적조건을찾아내었다 30). 이때 atm,, 분, 2.12g/g, 굴절률 1.4873에서최적조건을얻었고, 이최적조건에서얻은精
초임계유체추출법을이용한龍膽瀉肝湯藥鍼液의精油성분에대한硏究 185 油를가지고성분분석을하였다. 수증기증류법으로추출한龍膽瀉肝湯의藥鍼液은 KGMP 무균실에서藥材를煎湯하고증류와여과과정을통해서얻은후성분분석을하였다. 초임계유체추출법 (SFE) 으로추출한龍膽瀉肝湯의精油성분을 GC(Gas Chromatography) 및 GC/MS(Gas Chromatography/Mass Spectrum) 분석법을통해확인한바 37종이검출되었고, 주요성분은 3-Methyl-but- 2-enoic acid, 2, 2-dimethyl-8-oxo-3, 4-dihydro- 2H, 8H-pyrano[3,2-g] chromen-3-yl ester(49.81 %), (Z)-6-Pentadecen-1-ol(3.19%), (-)- Spathulenol (2.40 %) 등이었다. 나머지성분들은 2% 미만의미량이었다. 수증기증류법으로추출한龍膽瀉肝湯藥鍼液도 GC- MS를통해서 4종을분석하였으며, 주성분은 3-Methylbut-2-enoic acid, 2, 2-dimethyl-8-oxo-3,4- dihydro-2h, 8H-pyrano[3,2-g] chromen-3-yl ester (2.61%) 이었고, 나머지성분들은 1% 미만의극미량이었다. 이들초임계추출법과수증기증류법에서 3-Methyl but -2-enoic acid, 2, 2-dimethyl-8-oxo-3,4-dihydro- 2H, 8H-pyrano[3,2-g] chromen-3-yl ester가주성분으로검출되었지만, 이외각각시료에서공통된성분이검출되지는않는것으로나타나서추출방법에따라유효성분이다르게나타남을알수있었다. 또한龍膽瀉肝湯이下焦濕熱症에적용되고, 婦人帶下症에응용되는바이에해당되는 8종의표준균주와 5종의임상균주를선정하였고, 이精油성분의항균효과를검증하고자항균력실험을하였다. 이때精油성분에대한각각의항균력실험을시행하였는데 N. meningitidis의균주에서최소억제농도 (MIC) 와최소살균농도 (MBC) 는각각 0.1와 0.0mg /L이었으나, 나머지 12균주는모두 MIC 와 MBC가모두 1.0mg /L이상이었다. 이러한결과를놓고볼때煎湯液을통한여러실험에서의보고된抗菌效果보다미약한抗菌효과가나온것은, 추출한물질들이氣味論的으로각각약재들의輕淸한부분에해당되는精油성분들이기때문에重濁한濕熱症의균주에는큰작용을나타내지못한것으로판단할수있다. Ⅴ. 결론 초임계유체추출법을통해추출된龍膽瀉肝湯의精油성분과藥鍼液의성분에대한비교및그유효성을실험한결과다음과같은결론을얻었다. 1. 최적의초임계추출 (SFE, Supercritical Fluid Extraction) 조건으로기압은 atm, 온도는, 추출시간은 분임을알았다. 2. 초임계유체추출법으로추출한龍膽瀉肝湯의精油를 GC-MS 분석을통해확인한바 37 종이검출되었는데, 주성분은 3-Methy l-but-2-enoicacid, 2,2 -dimethyl-8-oxo-3,4-dihydro-2h,8hpyrano[3,2-g]chromen-3-yl ester(49.81%), (Z) -6-Pentadecen-1-ol(3.19%), (-)-Spathulenol (2.40%) 등이었다. 3. 수증기증류법으로추출한龍膽瀉肝湯藥鍼液성분은 4종이검출되었는데, 주성분은 3-Methyl-but -2-enoic acid, 2, 2-dimethyl-8-oxo-3, 4-dihydro-2H, 8H-pyrano[3,2-g]chromen-3- yl ester(2.61%) 이었다. 4. 초임계유체추출법과수증기증류법에서 3-Methyl -but-2-enoic acid, 2, 2-dimethyl-8- oxo-3, 4-dihydro-2H, 8H-pyrano[3,2-g) chromen-3-yl ester가공통적으로검출되었지만, 다른성분들은각각다르게검출되었다. 5. 초임계유체추출법으로추출한精油성분에대한 5 종표준균주와 8종임상분리균주의항균력실험에서 N. meningitidis의균주에서최소억제농도 (MIC) 와최소살균농도 (MBC) 는각각 0.1와 0.0mg /L이었으나, 나머지 12균주는모두 MIC와 MBC가모두 1.0mg /L이상이었다. Ⅵ. 參考文獻 1. 대한약침학회. 약침요법시술지침서. 서울 : 한성인쇄. 0:128-33. 2. 이윤우. 초임계유체이용기술 (I). 화학공학. 1:19(3);3-33. 3. 이윤우. 초임계유체이용기술 (II). 화학공학. 1:19(4);7-67. 4. 박창호. 한약재가공실험및이론. 서울 : 청문각. 4:83,90-5.
186 대한약침학회지제 11 권제 1 호 (8 년 3 월 ) 5. 배병철. 표준임상방제학. 서울 : 성보사. 1995:130-1. 6. 서만선, 진영상, 정규만. 膽瀉肝湯및 膽瀉肝湯加味方의항알레르기에관한실험적효과. 대한한방소아과학회지. 1991;5(1):-27. 7. 김남권, 김종한, 임규상, 황충연. 龍膽瀉肝湯의항바이러스활성및면역반응에대한실험적고찰. 대한외관과학회지. 1998;11(1):1-22. 8. 宋炳基. 龍膽瀉肝湯과銀花瀉肝湯의抗炎症, 解熱, 鎭痛, 利尿및抗菌효과. 趙永植博士華甲記念論文集編纂委員會. 1981:10-39. 9. 廣水. 龍膽瀉肝湯및龍膽瀉肝湯加金銀花煎湯液이사염화탄소에의한白鼠肝損傷에미치는영향. 원광대학교대학원. 1982. 10. 文大煥. 龍膽瀉肝湯및茵蔯五散이膽道結紮로유발된白鼠의肝損傷에미치는영향. 원광대학교대학원. 1993. 11. 김정근. 龍膽瀉肝湯加味方의항알레르기및항염증효과에대한실험적연구. 원광대학교대학원박사학위논문. 4. 12. 吳謙. 醫宗金鑒 ( 下 ). 서울 : 一中社. 1991:11,1718. 13. Ranjit Roy. A Primer on the Taguchi Method. New York:Van Nostrand Reinhold. 1990:pp24 7. 14. Davis N.W., J. Chromatogr. 1990:503;1-24.. O. David Sparkman. Identification of Essential oil Components by Gas Chromatography/Mass Spectroscopy. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5:16(11);1902-3. 16. Jennings W., Shibamoto T., Qualitative Analysis of Flavour and Fragrance Volatiles by Glass Capillary Gas Chromato graphy. New York: Academic Press. 1980:pp472. 17. E.H. Lee et al., Activation of inducible nitric oxide synthase by Yongdam-Sagan-Tang in mouse peritoneal macrophages. Journal of Ethnopharmacology. 1998:60;61-9. 18. Hyoung Chul Mun et. al., Comparison of Immune Activities of Essential Oils from Juniperus rigida S. et Z. and Boswellia carteii Birew by Supercritical Fluid Extraction System. Korean J. Medical Crop Sci. 4:12(3);243-48. 19. Seung Jin Lee et. al., Extraction of Volatile Essential Oil from Citrus junos Peel by Supercritical Carbon Dioxide. Korean J. Biotechnol. Bioeng. 2:17(2);148-52. 20. G. Della Porta et. al., Isolation of eucalyptus oil by supercritical fluid extraction. Flavour and Fragrance J. 1999:14;214-8. 21. Seied Mahdi Pourmortazavi et. al., Supercritical Carbon Dioxide Extraction of Essential Oils from Perovskia atriplicifolia Benth. J. Agric. Food Chem. 3:51;5414-9. 22. 江蘇新醫學院編 昌玟外譯. 完譯中藥大辭典. 서울 : 정담출판사. 1998:68, 889, 890, 1380, 23, 2624,3178,4041,4361,4403,5003. 23. 王治生. 中藥藥理與應用. 北京 : 人民衛生出版社. 1983:709-18. 24. 성기천. 초임계이산화탄소를이용한쑥추출물의항균효과에관한연구. 한국유화학회지. 3:20(4);309-.. Hyun Soo Lee et. al., Comparison of biological activities of essential oils from Feniculum vulgare Mill, Boswellia carteii Birew and Juniperus rigida Sieb. by a supercritical fluid extraction system. Korean J. Medicinal Crop Sci. 3:11 (2);1-21. 26. 정승현, 장규섭, 고경희. 강황으로부터초임계유체추출한 curcumin의생리활성. 한국식품과학회지. 4:36(2);317-20. 27. 최영해외. 초임계이산화탄소를이용한약용식물성분의선택적추출. 생약학회지. 1999:30(1);59-64. 28. Min Jeong Noh et. al., Selective Extraction of Bioactive Substances from Natural Medicinal Resources Utilizing Supercritical Fluid Technology. Chemical Industry and Technology. 1997:(1);14-21. 29. Rui Ruivo et. al., Hydrodynamics and mass transfer of a static mixer at high pressure conditions. Chemical Engineering and Processing. 6:;224-31. 30. Eui-Ju Hong, Ki-Jeung Na, In-Gyu Choi,
초임계유체추출법을이용한龍膽瀉肝湯藥鍼液의精油성분에대한硏究 187 Kyung-Chul, Eui-Bae Jeong. Antibacterial and Antifungal effects of Essential Oils from Coniferous Trees. Biol. Pharm. Bull. 4:27(6);863-6.