(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2013-0029595 (43) 공개일자 2013년03월25일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 36/02 (2006.01) A61P 39/06 (2006.01) (21) 출원번호 10-2011-0092949 (22) 출원일자 2011 년 09 월 15 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 4 항 2011 년 09 월 15 일 (71) 출원인 조선대학교산학협력단 광주광역시동구서석동 375 조선대학교내 (72) 발명자 정원교 광주광역시서구풍암동현대삼환아파트 104 동 302 호 천충길 전라남도완도군신지면명사십리 61 번길 220, 조선대학교해양생물연구교육센터 정상화 광주광역시남구봉선동더실아파트 102 동 604 호 (74) 대리인 이덕록 (54) 발명의명칭항산화효과를가지는미세조류발효물및이를함유하는기능성조성물 (57) 요약 본발명은미세조류를효모에의해발효시켜그의물질조성및아미노산조성을변화시킴으로써항산화특성을증가시킨것을특징으로하는미세조류발효물및그의항산화용도에관한것이다. 대표도 - 도 2-1 -
이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 20103020090020 부처명 농림수산식품부 연구사업명 농림수산식품연구개발사업 연구과제명 바이오리파이너리기반고효율평판형 (FPA) 광생물반응기개발 주관기관 농림수산식품기술기획평가원 연구기간 2009.06.01 ~ 2012.05.31-2 -
특허청구의범위청구항 1 한세눌라폴리모르파 (Hansenula polymorpha) 로하프토조류 (Haptophyceae) 를발효시켜수득되는것을특징으로하는미세조류발효물. 청구항 2 제1항에있어서, 체내항산화활성을가짐을특징으로하는미세조류발효물. 청구항 3 제1항의미세조류발효물을유효성분으로함유하는것을특징으로하는항산화활성을갖는약학조성물. 청구항 4 제1항의미세조류발효물을유효성분으로함유하는것을특징으로하는항산화활성을갖는기능성건강식품용조성물. 명세서 [0001] 기술분야본발명은미세조류발효물및그의용도에관한것으로, 보다구체적으로는미세조류인하프토조류 (Haptophyceae) 를한세눌라폴리모르파 (Hansenula polymorpha) 효모에의해발효시켜물질조성및아미노산조성을변화시킴으로써항산화특성을증가시킨것을특징으로하는미세조류발효물, 그의항산화용도및상기미세조류발효물을유효성분으로함유하는항산화활성의약학조성물및기능성건강식품조성물에관한것이다. [0002] [0003] [0004] 배경기술유리라디칼및반응성산소종 (ROS) 은활성화된산소의다양한형태를가지며, 주로생물학적반응또는외인성요인의산화에의해종종생성된다. ROS는살아있는생물에서일부분자와쉽게반응할수있는일종의반응성분자로, 신경퇴행성질환, 암, 죽상경화증, 백내장및심혈관질환과같은여러종류의질환을발생시킬수있는중요한원인인자이다. 최근, ROS에의해야기되는여러질환을치료또는예방하기위해서효과적인항산화제를포함하는기능성식품및의약품개발에관심이증가하고있다. 항산화제는생물학적시스템에서산화손상방어및세포의주요신호화경로참여를비롯한여러기능을갖는다. 세포에서항산화제의주요작용중하나는반응성산소종이작용하여야기되는손상을방지하는것이다. 최근, 항산화제는식품, 의약품및화장품과같은산화성 (oxidizable) 제품의열화를방지하기위한중요한첨가제로이용된다. 천연물유래의항산화제에대한연구는대부분육상식물에서추출하여정화된화합물에집중되어있다. 해양미세조류는단백질, 지질, 비타민및기타영양보충물을다량함유하고있어주로건강식품으로가공, 판매된다. 또한, 바이오디젤및바이오-수소생산및연료가스로부터 CO 2 를제거하는것과관련된용도에서도주 목받고있다. 특히, 약물학적활성물질의유용한신규공급원으로서미세조류가보고되고있는데, 예를들어, 보트리오코쿠스브라우니이 (Botryococcus braunii), 클로렐라종, 두나리엘라프리모렉탈 (Dunaliella primolectal), 난노클로리스종 (Nannochloris sp.), 네오클로리스올레오어번단스 (Neochloris oleoabundans) 및파리에토클로리스종 (Parietochloris sp) 과같은미세조류가적절한조건하에서세포내에고함량의단백질을갖는것으로보고된바있다. 해양미세조류공급원은일반적으로다양한미세조류원료로부터저렴하게제조될수있는이점을갖는다. - 3 -
[0005] [0006] 발효는음식생산및보존을위한가장오래되고경제적인방법중하나이다. 식품가공에서효모, 세균또는이들의혼합물은일반적으로탄수화물, 단백질및이산화탄소를무산소조건하에변환시킨다. 또한, 발효는수송할재료의부피를줄이고바람직하지않은구성성분을파괴시키며음식의영양학적가치와외관을향상시키고요리에필요한에너지를줄이며안전한제품을만드는자연적방법이다. 단백질분해 (proteolysis) 는발효중에폴리펩타이드, 보다작은펩타이드, 아미노산및아민으로주로구성된작은분자를형성하는데수반되는주된생화학현상이다. 발효반응은내인성효소의결과이며, 미생물유형에영향을받는다. 선행기술중에는대한민국등록특허제1008899730000호 ( 등록일 : 20090316)' 미세녹조류를이용한항산화, 주름개선, 항여드름ㆍ항염증및미백효능을가지는기능성추출물및그의제조방법 ' 에서미세녹조류인테트라셀미스수에시카 (Tetraselmis suecica) 의항산화효능에대하여기재하고있고, 대한민국등록특허제1010574270000호 ( 등록이 : 2011.08.10) ' 신규한패유래이시고사이드화합물 ' 에서항산화활성을갖는갈조류패유래의화합물인 1,2-디-O-팔미토일-3-O-(6-데옥시-6-아미노 )-α-d-글루코피라노실-글리세롤에대하여기재하고있으나, 미세조류를발효시켜항산화기능을극대화시키는연구결과는아직까지전혀보고된바가없다. 선행기술문헌 [0007] 특허문헌 ( 특허문헌 0001) 1. 대한민국등록특허제 1008899730000 호 ( 등록일 : 2009.03.16, 공개번호제 20090025431 호, 공개일 : 2009.03.11) ( 특허문헌 0002) 2. 대한민국등록특허제 1010574270000 호 ( 등록일 : 2011.08.10, 공개번호제 20100039105 호, 공개일 : 2010.04.15) 발명의내용 [0008] [0009] [0010] 해결하려는과제본발명에서는해양미세조류인하프토조류를한세눌라폴리모르파효모에의해발효시킨미세조류발효물을제공하고자한다. 또한, 본발명에서는상기미세조류발효물의항산화용도를제공하고자한다. 또한, 본발명에서는상기미세조류발효물을함유한항산화활성의약학조성물및기능성건강식품조성물을제공하고자한다. [0011] [0012] [0013] 과제의해결수단본발명에서는해양미세조류인하프토조류를한세눌라폴리모르파효모에의해발효시켜서항산화활성이증가된미세조류를제공한다. 본발명에서상기해양미세조류는바람직하게는파블로바 (Pavlova) 이고, 더욱바람직하게는파블로바루테나 (Pavlova luthena) 이다. 해양미세조류파블로바는먹이그물에서가장많은개체수를차지하는구성요소중하나이고, 해양과학업계에서는파블로바의계절적풍도 (abundance), 변동및증식률에대하여중점적인연구가이루어지고있다. 파블로바종은성장단계중대부분을차지하는세포유형에따라 2개군으로분리된다. 즉, 대부분의단계에서운동성세포로존재하는제1 군은파블로바헬리카타 (P. helicata), 파블로바루테리 (P. lutheri) 및파블로바살리나 (P. salina) 등으로구성되는데, 마지막종의경우에는 2개월이상된배양물및아가상에서증식한배양물에서는비-운동성세포가발견된다. 대부분의단계에서비-운동성세포로존재하는또다른제2 군은팔멜로이드 (palmelloid) 콜로니를형성하고, 파블로바엔노레아 (P. ennorea), 파블로바그라니페라 (P. granifera) 및파블로바비레센스 (P. virescens) 등으로구성된다. 파블로바루테리 (P. lutheri) 는일반적으로양식장에서해양생물사료로이용된다. 본발명에서사용되는한세눌라폴리모르파 (Hasenula polymorpha: Pichia angusta) 는메탄올자화 - 4 -
(methylotrophic) 효모종에속한다. 메탄올자화효모에는칸디다보이디니이 (Candida boidinii), 피치아메탈로리카 (Pichia methanolica), 피치아파스토리스 (Pichia pastoris) 및한세눌라폴리모르파가포함된다. 한세눌라폴리모르파는분류학상으로사카로미세스목 (Saccharomycetaceae) 계열의종이며, 그의특이한특성으로인해단백질, 특히당뇨병치료용인슐린, B형간염백신또는 C형간염치료용 IFNα-2a와같은의약품의생산에사용되고있다. [0014] [0015] [0016] 본발명에따르면, 미세조류하프토조류분말에한세눌라폴리모르파효모를첨가하여미세조류용액을수득하고, 여기에배양액을첨가하여배양한후에발효된미세조류를동결건조시킴으로써미세조류발효물 (Fermented Microalgae Preparation: FMP) 이수득된다. 본발명에따른미세조류발효물은한세눌라폴리모르파효모에의해적은분자량의단백질및펩타이드를생성시켜, 소정의변화및아미노산함량변화를초래한다. 미세조류발효물은아미노산조성측면에서아스파르트산, 알라닌, 발린, 류신, 티로신, 페닐알라닌, 히스티딘및아르기닌이증가하지만, 글리신, 프롤린, 세린및라이신은감소한다 ( 하기표 2 참조 ). 미세조류발효물의아미노산조성에존재하는 Leu, Val 및 Ala와같은소수성아미노산이라디칼소거특성에유리하고, 리놀레산모델시스템에서테스트된지방산산화억제에도효과적이다. 또한, 상기단백질의아미노산조성에서 Glu, Leu 및 His의적절한위치가라디칼소거활성을증가시키는것으로보인다. 이러한 FMP의라디칼소거활성은발효동안에유래된펩타이드의생물물리학적특성에기인한것으로보인다. 본발명에따른 FMP의지질과산화억제활성을측정하기위해서, 널리알려진다중불포화지방산 (PUFA) 인리놀레산을배양하여암실에서물 / 에탄올유화액에서자가산화시킨다. 상기모델시스템에서, 기존의지질퍼옥사이드로부터유래된퍼옥실 (ROO ) 및알콕실 (RO ) 라디칼은유화된리놀레산시스템에서지질과산화를개시시키기위해직접이용된다. DPPH는안정한유리라디칼로, 전자또는수소라디칼을받아들여서안정한반자성분자가된다. 따라서, DPPH는중성기질의항산화활성을평가하기위해기질로종종사용된다. 하이드록실라디칼은다양한생물학적손상및지질과산화개시를일으키는주요한반응성산소종이다. Fenton 시스템 (Fe 2+ /H 2 O 2 ) 에서생성된하이드록실라디칼은 DMPO에트래핑 (trapping) 되어, ESR 분광계에의해검출될수있는스핀부가물을형성하고, ESR 신호는 DMPO-OH와경쟁하는 OH 소거제의존재하에억제된다. 수퍼옥사이드음이온라디칼은체내에서발생하는산화반응동안에생성된다. 이는약한산화제이지만, 철및구리와같은금속존재하에강력하고위험한하이드록실라디칼로변형될수있어서세포손상및 ROS-관련질환을초래할수있다. 알킬라디칼은수용성퍼옥실라디칼개시제인 AAPH에의해분해되어생성되고, 이어서 4-POBN에의해 ESR 신호수치가감소한다. 본발명에서는 FMP의유리라디칼활성소거능평가를위해 DPPH, 수산기, 수퍼옥사이드음이온및알킬라디칼을비롯한 4종의전형적인유리라디칼이사용되고, 그결과, FMP는하이드록실및수퍼옥사이드라디칼에대해강한소거활성을갖는것으로나타났다. [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] 또한, 본발명에서는 FMP의항산화효과를 in vitro 실험을통해제공한다. 마우스마크로파지 (RAW264.7) 를과산화수소로처리한후에, 세포내산화스트레스를관측하기위해널리이용되는 DCFH-DA를이용하여세포내 ROS 를측정한다. 또한, 본발명에따르면전체조성물의중량을기준으로 FMP를 0.01 내지 99중량 % 로포함하는항산화활성을갖는약학조성물이제공된다. 본발명의약학조성물은본발명이속하는기술분야에서통상적으로사용하는부형제를포함할수있다. 또한, 약학조성물의제조에통상적으로사용하는적절한담체, 부형제및희석제를추가로포함할수있다. 본발명에따른 FMP를포함하는약학조성물은각각통상의방법에따라산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸등의경구형제형, 외용제, 좌제및멸균주사용액의형태로제형화하여사용될수있다. 본발명에따른약학조성물에포함될수있는담체, 부형제및희석제로는락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트및광물유를들수있다. 제제화할경우에는보통사용하는충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제등의희석제또는부형제를사용하여조제된다. 경구투여를위한고형제제에는정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이포함되며, 이러한고형제제는적어도하나이상의부형제예를들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는락토오스 - 5 -
(lactose), 젤라틴등을섞어조제된다. 또한단순한부형제이외에마그네슘스테아레이트, 탈크같은윤활제들도사용된다. 경구를위한액상제제로는현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이해당되는데흔히사용되는단순희석제인물, 리퀴드파라핀이외에여러가지부형제, 예를들면습윤제, 감미제, 방향제, 보존제등이포함될수있다. 비경구투여를위한제제에는멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가포함된다. 비수성용제, 현탁제로는프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과같은식물성기름, 에틸올레이트와같은주사가능한에스테르등이사용될수있다. 좌제의기제로는위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴등이사용될수있다. [0022] [0023] 본발명의 FMP 또는이를함유하는약학조성물의바람직한투여량은환자의상태및체중, 질병의정도, 약물형태, 투여경로및기간에따라다르지만, 담당의사등에의해적절하게선택될수있다. 또한, 본발명에따르면 FMP를주성분으로포함하는항산화활성을갖는건강식품용조성물이제공된다. 또한, 상기조성물은정제, 캡슐등의형태로제공될수있을뿐만아니라, 과일, 야채, 과일이나야채의건조제품이나절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의혼합쥬스이거나칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효유식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류중어느하나이상의제형일수있으며, 당업계에서통상적으로사용하는향미제, 착색제, 첨가제등을포함할수있다. [0024] 발명의효과본발명에따르면, 전세계적으로풍부한미세조류인하프토조류를한세눌라폴리모르파효모로발효처리함으로써우수한항산화효과를갖는미세조류발효물및이를함유하는항산화용기능성건강식품조성물을제공하는유익한효과를갖는다. [0025] 도면의간단한설명 도 1 은 ferric thiocyanate 방법에의해측정된리놀레산유화시스템중 FMP 의항산화활성을나타낸그래프이 다. 도 2는 ESR 분광계에의해측정된, 다양한농도의 FMP 존재하에유리라디칼소거활성을나타낸그래프이다. 도 3은 RAW264.7, HL60 및 MRC-5 세포에대한 FMP의세포적합성효과를나타낸그래프이다. 도 4는 0.1, 0.5 및 1 mg/ml 농도의 FMP의세포라디칼소거활성을나타낸그래프이다. 도 5는 HL60 세포에서 FMP에의한미엘로퍼옥시다아제 (MPO) 억제를나타낸그래프이다. 도 6은 0.1, 0.5 및 1 mg/ml 농도의 FMP가 RAW264.7 세포에서과산화수소-유도된항산화효소에갖는영향을 H 2 O 2 단독처리된군과비교하여나타낸이미지이다. [0026] 발명을실시하기위한구체적인내용 본발명은하기실시예에의해보다구체적으로설명되며, 하기실시예는본발명을보다구체적으로예시하기 위한것으로, 본발명의권리범위가이에한정되는것이아님이당업자들에게명백히이해될것이다. [0027] [0028] [0029] 재료및방법본발명에서사용된파블로바루테리 (KMCC H-006) 는한국해양미세조류은행 (Korea Marine Microalgae Culture Center) 에서공급받았다. 생명자원관리본부 (Korea Biological Resource Center) 에서입수한한세눌라폴리모르파 (KCTC 7538) 는표준 F/2(Guillard) 배지에보관하였다. 37 에서 8시간동안기질 / 효소의비를 100:1 (w/w) 로조정하며셀룰로오즈에의해세포벽을분해시켰다 (ph 6.0). 마우스마크로파지 (RAW264.7), 인간태아의폐섬유아세포 (MRC-5) 및인간골수세포 (HL60) 세포주는아메리칸타입오브컬쳐컬렉션 (American Type of Culture Collection)( 미국버지니아주매너새스소재 ) 에서입수하였다. 둘베코변형이글배지 (DMEM), RPMI 1640 배지, 트립신 -EDTA, 페니실린 / 스트렙토마이신 / 앰포테리신 ( 각각 10,000 U ml -1, 10,000 μg ml -1 및 2500-6 -
μg ml -1 ) 및소태아혈청 (FBS) 은깁코비알엘, 라이프테크놀러지스 (Gibco BRL, Life Technologies)( 미국 ) 에서입수하였다. MTT (3-(4,5-다이메틸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸륨브로마이드 ) 시약, 5,5-다이메틸-1-피롤리딘 -N-옥사이드(DMPO), α-(4 -피리딜-1-옥사이드)-N-3급-부틸니트론 (4-POBN), 2,2`-아조비스 (2-아미디노프로판) 다이하이드로클로라이드 (AAPH) 및미엘로퍼옥시다아제 (MPO) 를시그마케미칼캄파니 (Sigma Chemical Co., 미국미주리주세인트루이스소재 ) 에서구입하였다. 2',7'-다이클로로플루오레신다이아세테이트 (DCFH-DA) 및모노브로모바만을몰레큘러프로브스 (Molecular probes, 미국오레곤주유진소재 ) 에서구입하였다. 웨스턴블롯분석에사용된일차및이차항체는산타크루즈바이오테크놀러지잉크 (Santa Cruz Biotechnology Inc., 미국캘리포니아주산타크루즈소재 ) 및아머샴파마시아바이오사이언스이즈 (Amersham Pharmacia Biosciences, 미국뉴저지주피스카타웨이소재 ) 에서각각구입하였다. 다른화학약품및시약은시판되는분석용등급이었다. [0030] [0031] 제조예 1: 미세조류발효물의제조및분석미세조류발효물을제조하기위해, 미세조류분말을 1:15 (w/v) 의비로 Sodium phosphate 완충액 (ph 7) 에첨가하고, 미세조류양에근거한한세눌라폴리모르파용액 (500:1) 을상기혼합물에첨가하여발효를도왔다. 121 에서 30분동안가압멸균처리 (autoclaving) 한후에, 미세조류용액을수득하고, 이용액에락토바실러스브레비스 (Lactobacillus brevis) BJ20 ( 수탁번호 KCTC 11377BP) 배양액을 1 % (v/v) 농도로첨가하여충분히혼합하고, 37 에서 3일, 6일및 12일동안배양하였다. 모든회수된미세조류발효물 (FMP) 을동결건조하여사용시까지 -80 로보관하였다. [0032] [0033] FMP의수분, 회분, 단백질및지질함량은 AOAC 방법을약간변형하여결정하고, 탄수화물함량은페놀-황산방법을이용하여결정하였다. 그결과, 미세조류및미세조류발효물 (FMP) 의수분, 조단백질, 조지질, 회분, 탄수화물함량은하기표 1과같았다. [0034] 조성 함량 (%) 발효전 발효 (12일) 후 수분 17.53 ±0.07 13.03 ±0.05 회분 36.58 ±0.04 18.61 ±0.01 조지질 14.86 ±0.03 11.27 ±0.04 조단백질 23.27 ±0.07 35.20 ±0.01 조탄수화물 8.71 ±0.05 20.8 ±0.04 전체 100 100 표 1 [0035] [0036] 상기로부터알수있듯이, 발효동안에수분함량은 17.53 % 에서 13.03 % 로변하였고, 조단백질과탄수화물의함량은 12일동안 35.20 % 및 20.8 % 까지증가하였다. 이러한결과는효모작용에의한것이며, 작은단백질과펩타이드가생성되었다. 그러나, 조지질및회분함량은각각 36.58% 에서 18.61% 로, 또한 14.86% 에서 11.27% 로감소하였다. 동결건조된 FMP (20 mg, 12일 ) 을 110 진공에서 0.1% 티오글리콜산을함유하는 6 N HCl에서 24시간동안가수분해하였다. 페닐이소티오시아네이트에의해유도된아미노산을동정하고, 자동아미노산분석기 (Biochrom 20, 파마시아바이오텍 (Pharmacia Biotech), 영국소재 ) 를사용하여계량하고, 미세조류및 FMP의아미노산조성비율은하기표 2에요약하였다. [0037] 아미노산 파블로바루테리 ( 시료중 %) 발효전 발효후 Asp. 5.88 7.95 Thr. 4.52 4.63 표 2-7 -
Ser. 4.48 2.8 Glu. 10.3 10.13 Pro. 6.33 3.67 Gly. 9.4 4.41 Ala 9.39 9.82 Val. 7.25 9.25 Ile. 5.98 5.85 Leu. 10.24 12.93 Tyr. 2.85 3.07 Phe. 6.12 7.17 His. 3.91 4.44 Lys. 7.54 6.38 Arg. 5.63 7.5 전체 100% 100% [0038] 상기로부터알수있듯이, 발효전에비해아스파르트산, 알라닌, 발린, 류신, 티로신, 페닐알라닌, 히스티딘 및아르기닌이증가하고, 글리신, 프롤린, 세린과라이신은감소한것으로나타났다. [0039] [0040] 실험예 1: 전체항산화활성의결정전체항산화활성은오사와 (Osawa) 및나미키 (Namiki) 의방법에따라리놀레산모델시스템에서측정하였다. 즉, FMP (1.3 mg, 3, 6, 12일 ) 를물에용해시키고, 리놀레산 0.13 ml 및 99.5% 에탄올 10 ml의용액에첨가하였다. 이어서, 증류수를이용하여전체부피를 25 ml로조정하였다. 상기혼합물을스크류캡 (screw cap) 이있는삼각플라스크에넣고암실 40±1 에서배양하고, ferric thiocyanate 값을측정하여서산화정도를평가하였다. 리놀레산모델시스템에서배양된반응용액 (100 μl ) 을 75 % 에탄올 4.7 ml, 30 % 암모늄티오시아네이트 0.1 ml, 3.5% HCl 중 2 x 10-2 M 염화철용액 0.1mL와혼합하였다. 3분후에, 500nm 흡광도를읽어서티오시아네이트값을측정하고, 40±1 에서배양기간동안상이한간격으로 FeCl 2 및티오시아네이트에의한발색 을측정하고, 그결과를도 1 에나타내었고, 여기서낮은흡광도는보다높은수준의항산화활성을나타낸다. [0041] 도 1 에서알수있듯이, 배양 7 일후에는리놀레산의이용불가능성때문에과산화물형성이중단되었다. 또한, 중간생성물은안정한말단생성물로전환되어 Fe 2+ 산화를중단시켰다. FMP (12 일 ) (78.5 %) 및 α- 토코페 롤 (78.6 %) 은 7 일후에대조군에비해 FMP (6 일 ) (73.5 %) 및 FMP (3 일 ) (69.4 %) 에서보다높은활성을나 타내었다. 후속실험에서는강한항산화제로증명된 FMP (12 일 ) 를사용하였다. [0042] [0043] [0044] 실험예 2: 전자스핀공명 (ESR) 분광계에의한유리라디칼소거활성의측정최근에, 전자스핀공명 (ESR) 분광계는반응에남아있는라디칼농도를정확히측정하기위한가장유용한분광계이다. 따라서, JES-FA 전자스핀공명 (ESR) 분광계 (JEOL Lts., 일본동경소재 ) 를사용하여 DPPH, 하이드록실, 수퍼옥사이드및알킬라디칼에대한소거효과에의해 FMP의항산화활성을측정하였다. 라디칼소거활성은하기수식으로계산한다 : [0045] [0046] 상기식에서, H 및 H 0 는시료를갖는라디칼신호및시료를갖지않는라디칼신호각각의상대피크 높이이다. - 8 -
[0047] [0048] DPPH 라디칼소거활성 Nanjo 등 (1996) 에기재된방법을이용하여 DPPH 라디칼소거활성을측정하였다. 30 μl FMP 용액 ( 또는대조군으로서물자체 ) 을에탄올용액중 DPPH 30 μl (60 μm) 에첨가하였다. 10초동안격렬하게혼합한후에, 상기용액을 100μl석영모세관으로옮기고, JES-FA ESR 분광계 (JEOL Lts., 일본동경소재 ) 를이용하여 DPPH 라디칼에대한 FMP의소거활성을측정하였다. 정확히 2분후에, ESR 분광계상에서스핀부가물을측정하였다. 실험조건은다음과같았다 : 자기장 336.5±5 mt; 전력 5 mw; 변조주파수 9.41 GHz; 진폭 1 x 1000; 스위프 (sweep) 시간 30초. 상기수식을이용하여 DPPH 라디칼소거능을계산하였다. [0049] [0050] 하이드록실라디칼소거활성 하이드록실라디칼은철 - 촉매화된 Fenton Haber-Weiss 반응에의해생성시키고, 생성된하이드록실라디칼은니 트론스핀트랩 (nitrone spin trap) DMPO 와신속하게반응하였다. 생성된 DMPO-OH 부가물을 ESR 분광계로검 출하였다. FMP 용액 (20μl) 을인산염완충액 (ph 7.4) 중 DMPO (0.3 M, 20 μl ), FeSO 4 (10 mm, 20 μl ) 및 H 2 O 2 (10 mm, 20 μl ) 와혼합하고, 이어서 100 μl들이석영모세관으로옮겼다. 2.5분후, ESR 분광계를사용하여 ESR 스펙트럼을기록하였다. 실험조건은다음과같았다 : 자기장 336.5 ± 5 mt; 전원 1 mw; 변조주파수 9.41 GHz; 진폭 1 200; 스위프시간 4 분. 상기수식을이용하여하이드록실라디칼소거능을계산하였다. [0051] [0052] 수퍼옥사이드라디칼소거활성 UV 조사된리보플라빈 /EDTA 시스템에의해수퍼옥사이드음이온라디칼을생성시켰다. 0.3 mm 리보플라빈 (20 μl ), 1.6 mm EDTA (20 μl ), 800 mm DMPO (20 μl ) 및지시농도의 FMP 용액 (20 μl ) 을함유한반응혼합물에 UV 램프하에 365 nm을 1분동안조사하였다. 이어서, 반응혼합물을측정을위해 ESP 분광계의 100 μl들이석영모세관으로옮겼다. 이용된실험조건은하기와같았다 : 자기장 336.5 ± 5 mt; 전원 10 mw; 변조주파수 9.41 GHz; 진폭 1 1,000; 스위프시간 1 분. 상기수식을이용하여수퍼옥사이드라디칼소거능을계산하였다. [0053] [0054] [0055] 퍼옥실라디칼소거분석히라모토 (Hiramoto) 등 (1993) 의방법에따라퍼옥실라디칼을생성시켰다. 40 mm의 2,2'-아조비스 (2-아미디노프로판 ) 다이하이드로클로라이드 (AAPH) 20 μl를 PBS 완충액 20μl, 40 mm 4-POBN 20 μl및 FSM 용액 20 μl와혼합하였다. 상기혼합물을볼텍스 (vortex) 처리하고, 30분동안 37 에서배양하였다. 이어서, 반응혼합물을밀폐모세관으로이동시키고, 스핀부가물을제어된분광조건하에기록하였다 : 변조주파수 100 khz; 마이크로파전력 10 mw; 마이크로파주파수 9,441 MHz; 자기장 336.5±5 mt 및스위프시간 30초. 상기수식을이용하여퍼옥실라디칼소거능을계산하였다. 그결과, FMP는다양한농도 (1, 0.5 및 0.1mg/mL) 에서 DPPH, 하이드록실, 수퍼옥사이드및알킬라디칼의소거에있어서각각 72.4% (DPPH, 1 mg/ml), 93.5 % ( 하이드록실, 1 mg/ml), 94 % ( 수퍼옥사이드, 1 mg/ml) 및 84 % ( 알킬, 1 mg/ml) 소거율을가져서유의한효능 (p < 0.05) 을갖는것으로증명되었다. 또한, FMP은 DPPH 소거활성에대해서 0.257 mg/ml, 하이드록실소거활성에대해서 0.024 mg/ml, 수퍼옥사이드소거활성에대해서 0.064 mg/ml 및알킬라디칼소거활성에대해서 0.187 mg/ml의 IC 50 값을갖는것으로나타났다. [0056] [0057] [0058] 실험예 3: 세포배양및생존도결정백혈구세포주 (HL60), RAW264.7 및 MRC-5를 10% 소태아혈청, 2 mm 글루타민및 100 μg/ml 페니실린-스트렙토마이신을함유한 DMEM 배지에서 5 % CO 2 및 37 가습분위기에서증식시켰다. 세포독성은 Hansen 등 (1989) 에기재된 MTT (3-(4,5-다이메틸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸륨브로마이드 ) 방법을사용하여측정하였다. 세포를 5 x 10 3 세포 / 웰의밀도로 96-웰플레이트에증식시켰다. 24 시간후에, 세포를새로운배지로세척하고, 상이한농도의 FMP로처리하였다. 48 시간배양후에, 세포를재세척하고, MTT - 9 -
100μl (1mg/mL) 를첨가하고, 4시간동안배양하였다. 최종적으로, DMSO (150μl) 를첨가하여형성된포르마잔염을용해시키고, GENios( 등록상표 ) 마이크로플레이트리더 (microplate reader)( 테칸오스트리아게엠베하 (Tecan Austria GmbH), 오스트리아소재 ) 를이용하여 540 nm에서 OD를측정하여포르마잔염의양을결정하였다. 상대세포생존도는포르마잔염으로전환된 MTT 양에의해결정하였다. 세포생존도는대조군대비백분율 ( 처리세포의 OD - 블랭크 OD/ 대조군 OD - 블랭크 OD x 100%) 로정량화하였고, 투여량반응곡선을작성하였다. 상기데이터는적어도 3회의별개실험의평균값으로표기되고, P < 0.05가유의한것으로간주되었다. [0059] 그결과, 도 3 에도시한바와같이, FMP 는 0.1 내지 2 mg/ml 의다양한농도에서상기 3 가지테스트된배양세포 주에대하여세포독성효과를나타내지않았다. [0060] [0061] [0062] 실험예 4: DCFH - DA 라벨을이용한세포내반응성산소종 (ROS) 형성의결정세포내반응성산소종 (ROS) 의형성은산화민감성염료인 2',7'-다이클로로플루오레신다이아세테이트 (DCFH- DA) 를기질로사용하여전술한바와같이측정하였다 (Okimotoa, Watanabea, Nikia, Yamashitab & Noguchia, 2000). 형광미세적정 96-웰플레이트에서증식하고있는 RAW264.7 세포에 HBSS 중 20μM DCFH-DA를로딩 (loading) 하고, 상기세포를암실에서 20분동안배양하였다. 비형광성 DCFH-DA 염료는세포내로자유롭게침투하여, 세포내에스테라아제에의해 2',7'-다이클로로플루오레신 (DCFH) 으로가수분해되고세포내에트래핑 (trapping) 된다. 이어서, 세포를상이한농도 (1, 0.5 또는 0.1 mg/ml) 의테스트화합물로처리하고, 1시간동안배양하였다. 세포를 PBS로 3회세척한후에, HBSS에용해된 300μM H 2 O 2 를세포에첨가하였다. 다양한 ROS 존재하에 DCFH 산 화로인한 2',7'-다이클로로플루오레신 (DCF) 의형성을 485 nm 여기파장 (Ex: excitation wavelength) 및 535 nm 방출파장 (Em: emission wavelength) 에서 GENions( 등록상표 ) 형광마이크로플레이트리더 ( 테칸오스트리아게엠베하, 오스트리아 ) 를이용하여 30분마다읽었다. 처리군의투여량의존적및시간의존적효과를도 4 그래프에표시하고, 대조군및블랭크군의형광강도와비교하였다. [0063] 그결과, 도 4에서알수있는바와같이, FMP를이용한전배양은 DCF 형광을투여량- 및시간-의존적으로감소시켰다. 60분배양한후에 FMP는 0.1 mg/ml의최저농도에서도상당한소거활성을나타내었다. 반면, 1 mg/ml의최고농도에서 FMP는배양시간동안 ROS를유의하게소거시켰다. 200분배양후에, FMP는 1 mg/ml 농도에서 ROS 생성을 86.8% 감소시켰다. 상기결과는 FMP의항산화활성이세포 ROS의직접적인소거에의해야기됨을나타낸다. 따라서, FMP는세포 ROS 형성을억제하기위한효과적인항산화제가될수있다. [0064] [0065] 실험예 5: 미엘로퍼옥시다아제 (Myeloperoxidase) 활성분석미엘로퍼옥시다아제는비특이적면역방어시스템중심에연결된미생물효소로오랫동안간주되어온백혈구유래의헴퍼옥시다아제 (heme peroxidase) 이다. 조직의 MPO 함량을결정하기위해널리이용되는방법은호중구침윤정도를정량하는방법이다. 상기방법에서는가장강력한산화제인하이포아염소산 (HOCl) 의생성을촉진하기위해염화물및 H 2 O 2 를사용하며, 상기하이포아염소산은미생물살처리및이후숙주조직의산화적손상 둘다에일조하여중증염증질환을유발한다. [0066] HL60 인간프로 (PRO) 미엘로퍼옥시다아제세포에의해배출되는미엘로퍼옥시다아제 (MPO) 의양을 O-다이아니시딘방법 (Worthing 1972) 을약간변형시켜결정하였다. HL60 세포를페놀레드및 FBS없이 RPMI-1640에현탁시키고, 96-웰플레이트에씨딩 (seeding) 하였다. 다양한농도 (1, 0.5, 0.1 mg/ml) 의 FMP와함께세포를 30분동안전배양하고, TNF-α (0.05 μg/ml) 로 37 에서 30분동안자극시켰다. 이어서, 0.1M 포스페이트완충액 (ph 6.0) 중 1 mm H 2 O 2 0.05 ml 및탈이온수중 ( 새로제조된 ) 0.02 M O-다이아니시딘 0.05 ml를함유하는분 석혼합물과함께세포를첨가하였다. 배출되는 MPO 양을분광계에서 460 nm 로측정하고, 미처리된블랭크군 과비교한흡수도값으로 MPO 활성을그래프에표시하였다 ( 도 5 참조 ). [0067] 도 5에서알수있듯이, FMP는 TNF-α-자극된대조군에비해 MPO 활성을감소시켰다. MPO 활성은서로다른농도의전처리에의해투여량의존적으로억제되었다. FMP의억제활성은 50.4 % (1 mg/ml), 33.0 % (0.5 mg/ml) 및 15.3 % (0.1 mg/ml) 이었다. 따라서, 이러한결과는 FMP가살아있는세포시스템에서간접방법을통해세포의항산화제로이용될수있음을시사한다. - 10 -
[0068] [0069] [0070] [0071] 실험예 6: 웨스턴블롯분석퇴행성관절염의산화적스트레스의병인중요도에대하여많은연구가이루어졌는데, 산화적스트레스는많은질환에서산화스트레스징후증가및신체의자연항산화제, 예컨대 SOD 및 GSH의낮은농도와관련된다. SOD-1은수퍼옥사이드의유해한반응을감소시키기때문에주요한항산화효소중하나이며, 세포를수퍼옥사이드독성으로부터보호한다. GSH는세포내산화환원상태를조절하는데있어중요한역할을한다. GSH 농도가증가하면유리라디칼이제거되거나독성물과결합하게되어세포가사멸하지않는다. FMP의세포내유리라디칼소거효과는항산화효소의특성을통해측정되므로, 항산화효소 (SOD-1 및 GSH) 의단백질발현정도를 RAW264.7 세포에서웨스턴블롯분석으로결정하였다. RAW264.7 세포를 1 x 10-6 세포 / 웰의밀도로 6-웰배양접시에씨딩하고, 24시간동안증식배지 2 ml에증식시켜서 60 내지 70% confluence에도달하도록하였다. 세포를 1시간동안 FMP로통상적으로전처리하고, 이어서 24시간동안배양하였다. 처리된세포를완충액 (1% Triton X-100, 100 mm 피로인산나트륨, 50 mm HEPRS, 2 mm PMSF, ph 7.4) 에서균질화하였다. 상기균질화물을 4 에서 20분동안 12000 rpm으로원심분리하고, 상청액을제거하였다. 10% SDS-PAGE을이용하여단백질추출물을분리하였다. 단백질을전기영동에의해니트로셀룰로즈막으로옮겼다. 5% 탈지유및 0.1% Tween-20을함유한포스페이트완충액에서니트로셀룰로즈막을 4 에서하룻밤배양하여서, 비특이적인결합을감소시키고, 제조업체지시에따라 SOD-1 및 GSH 항체 (1:1000, 산타크루즈바이오테크놀러지, 미국캘리포니아주소재 ) 로블롯팅 (blotting) 하였다. 퍼옥시다아제-결합된 2차항체 (1:2000, 산타크루즈바이오테크놀러지 ) 와배양한후에, 강화된화학발광을이용하여단백질을시각화하였다. 밴드강도를농도계측기에의해정량하고, 하우스키핑유전자 (housekeeping gene), 베타-액틴및항체를착색하여하였다. 도 6에나타난바와같이, 항산화효소의모든단백질발현정도는 FMP 처리에의해투여량의존적으로상향조절되었다. 이러한결과는 FMP가 RAW264.7 세포에서항산화효소의발현정도를증가시켜라디칼을효과적으로소거함을나타낸다. [0072] [0073] [0074] [0075] 통계분석통계분석은스튜던트 (Student) t-테스트에의해실시하였다. 적어도 3회이상의별개실험을바탕으로한 p < 0.05 값이통계적으로유의하다고간주된다. 배합예 1: 약학제제 FMP 25 mg을락토오스 26 mg, 아비셀 ( 미결정셀룰로오스 ) 3.5 mg, 나트륨전분글리코네이트 1.5 mg및 L- HPC(low-hydrosyprophylcellulose) 8 mg과함께 U형혼합기에넣고 20분간혼합하였다. 혼합이완료된후마그네슘스테아레이트 1 mg을추가로첨가하고 3분간혼합하였다. 정량시험과항습도시험을거쳐타정하고필름코팅하여정제를제조하였다. [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] [0081] [0082] 배합예 2: 건강식품제제하기배합에따라당업계에서통상적인방법으로정제형태의기능성건강식품을제조하였다 : D-만니톨 44.0 중량 % 유당 40.0 중량 % 결정셀룰로오스 10.0 중량 % 히드록시프로필셀룰로오스 5.0 중량 % FMP 1.0 중량 % - 11 -
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