Journal of Life Science 2014 Vol. 24. No. 10. 1039~1045 ISSN (Print) 1225-9918 ISSN (Online) 2287-3406 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2014.24.10.1039 hcg-induced Endoplasmic Reticulum Stress Leads to Activation of the IRE1/XBP1 Pathway in Mouse Leydig Tumor Cells (mltc-1) Sun-Ji Park 1, Tae-Shin Kim 2 and Dong-Seok Lee 1 * 1 School of Life Science and Biotechnology (BK 21 plus program), Kyungpook National University, Daegu 702-701, Korea 2 Department of Reproductive Medicine, University of California, San Diego, 9500 Gilman Drives, La Jolla, California 92093, USA Received July 17, 2014 /Revised August 11, 2014 /Accepted August 11, 2014 This study analyzed whether human chorionic gonadotropin (hcg) induces ER stress via the IRE/XBP1 pathway in mouse Leydig tumor (mltc-1) cells. In a previous study, we demonstrated that the unfolding protein response (UPR) plays an important role in the expression of steroidogenic enzymes by modulating the ATF6 pathway, as well as ER stress-mediated apoptosis in hcg-stimulated Leydig cells. Although UPR signaling has been reported to regulate the IRE1/XBP1 pathway, it is not known whether hcg-induced ER stress in Leydig cells can activate the pathway. To investigate the activation of the IRE1/XBP1 pathway in mltc-1 cells after hcg treatment, we performed a Western blot analysis to detect the phospho-ire1 protein and an RT-PCR analysis to validate splicing of XBP1 mrna. We used ER stress-activated indicator (ERAI) constructs for monitoring the activity of IRE1 and then analyzed by fluorescence microscopy and flow cytometry. The expression levels of the phospho-ire1 protein markedly increased in response to the hcg treatment. In the mltc-1 cells transfected with an F-XBP1-venus/F-XBP1 DBD-venus construct, the hcg treatment led to the appearance of green fluorescent cells and detectable fluorescence in the nucleus and cytosol, respectively. In addition, splicing of XBP1 mrna significantly increased after the hcg treatment. Taken together, these results indicate that hcg-induced ER stress leads to activation of the IRE1/XBP pathway in Leydig cells. Key words : ER stress, hcg (human chorionic gonadotropin), IRE1, leydig cells, XBP1 서 소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 는단백질의합성과폴 딩 (folding), 조립 (assembly) 등의과정이일어나는중요한장 소이다. 하지만소포체내에과도한단백질합성과미성숙된 단백질의축적, 칼슘이온의항상성이상등으로인해소포체 기능에장애가발생하는데이를소포체스트레스 (ER stress) 라고한다 [3]. 세포는이스트레스에대항하여생존하기위한 방어기전으로 UPR (unfolding protein response) 경로를활성 화시킨다. UPR 경로는소포체막에존재하는세가지신호전달체계인 protein kinase RNA (PKR)-like ER kinase (PERK), inositol- requiring protein 1 (IRE1) 그리고 activating transcription factor 6 (ATF6) 에의해매개되어소포체의항상성을회복시킨다 [6]. PERK, IRE1, ATF6는스트레스가없는상태에 *Corresponding author *Tel : +82-53-950-7366, Fax : +82-53-943-6925 *E-mail : lee1@knu.ac.kr This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 론 서는소포체샤페론인 Grp78/Bip과결합하여비활성상태로존재하지만소포체스트레스가발생하게되면 Grp78/Bip과의결합으로부터분리되어져활성화된다 [14]. 먼저 PERK는이량체 (dimer) 형성후자가인산화 (autophosphorylation) 에의해활성화되고, 활성형의 PERK는 eukaryotic translation initiation factor 2α (eif2α) 를인산화시켜 mrna에서단백질로번역 (translation) 되는과정을감소시킨다 [16]. 두번째로 IRE1은 PERK와마찬가지로이량체형성후자가인산화되면 endonuclease로써작용하여 X-box binding protein 1 (XBP1) mrna를 splicing시켜활성형의 XBP1 단백질로의발현을유도하고, 이는전사인자로작용하여소포체스트레스관련유전자의 ER stress response element (ERSE) 부위에결합하여전사를증가시킨다 [6, 11]. 마지막으로 glucose-regulated protein (Grp78/ Bip) 에서분리된비활성형 ATF6 (p90) 는소포체에서골지체 (Golgi apparatus) 로운반된후절단되어활성형 ATF6 (p50) 로바뀌고핵속으로이동하여전사인자로작용하여샤페론의발현을유도한다 [11]. 이런 UPR signaling에대한연구는인슐린 (insulin) 을분비하는췌장의베타세포 [8], 콜라겐 (collagen) 을분비하는조골세포 [4] 와 gonadotropin을분비하는 gonadotrope 세포 [2] 등과같은특정단백질을생산하는분비세포에서많이이루어졌다. 정소의레이디히세포 (leydig cell) 는세정관간극에위치
1040 생명과학회지 2014, Vol. 24. No. 10 하며황체형성호르몬 (luteinizing hormone; LH) 의자극을받아남성호르몬인테스토스테론 (testosterone) 을생산하는또다른유형의분비세포이다. 레이디히세포는 LH의자극을받아테스토스테론합성을위해성호르몬합성효소들 (steroidogenic enzymes) 을지속적으로발현시켜야하므로 UPR signaling이레이디히세포에서중요한조절작용을할것으로생각된다. 이전연구를통하여마우스레이디히세포인 mltc-1 세포와 10주령수컷마우스에 LH 유사호르몬인사람융모성성선자극호르몬 (human chorionic gonadotropin; hcg) 을처리하였을때소포체스트레스가야기되어 UPR signaling이활성화되고특히활성형 ATF6 (p50) 에의해성호르몬합성효소의발현이직접적으로조절되는것을처음으로증명하였다 [9]. 또한이 hcg를고농도혹은장시간처리할경우소포체스트레스매개의세포자멸사가유도되는것을 in vivo와 in vitro level의레이디히세포에서모두확인하였다. 이연구를통하여레이디히세포역시다른분비세포와같이소포체스트레스가발생하여 UPR signaling의조절을받는다는것을확인할수있었다. 하지만아직레이디히세포에서 hcg처리에의해증가된세가지 UPR경로가각각어떤역할을하는지다밝혀지지않았으며각 UPR 관련유전자의세포내역할에대한연구가좀더필요한단계이다. 따라서본연구에서는 mltc-1세포에 hcg를다양한농도와시간으로처리하여 IRE1 유전자의활성여부및활성 IRE1 의 endonuclease 기능에의한 XBP1 mrna의 splicing 유도를확인하기위하여다양한실험방법을이용하여분석하였다. 이결과를통하여향후정소의레이디히세포에서 IRE1/XBP1유전자의역할을연구에적용및응용가능성을조사하고자하였다. 재료및방법시약본연구에서사용된 Human chorionic gonadotropin (hcg) 는 Intervet 社 (Chorulon, Milton Keynes, Buckinghamshire, UK) 으로부터, 8-Bromo-cAMP (8-Br-cAMP) 는 Sigma (St. Louis, MO, USA) 에서그리고 Tunicamycin (Tm) 은 Calbiochem (La. Jolla, Cal., USA) 에서각각구입하였다. 세포배양실험에사용한생쥐라이디히세포주인 mltc-1 세포는 ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) 에서구입하였다. mltc-1 세포는 RPMI 1640배지에 10% FBS (fetal bovine serum, Hyclone, Thermo Scientific, Inc.) 와 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 그리고 10mM Hepes를첨가한배지를사용하였으며 37, 5% CO 2 세포배양기에서배양하였다. Western blot hcg를농도별, 시간별로처리한후 PRO-PREP buffer (intron Biotechnology Inc.) 를넣어파쇄한후 13,000rpm으로 10분간원심분리하여단백질상층액을얻어사용하였다. 단백질을분리하기위하여 10% SDS- polyacrylamide gel을이용하여전기영동하였다. 그런다음분리된단백질은 nitrocellulose membrane (Pall Life sciences, NY, USA) 으로이동시키고 5% skim milk에 1시간동안 blocking 하였다. 이후 membrane을 anti-grp78/bip, anti-ire1 (Cell Signaling, MA, USA), anti-phospho-ire1 (Abcam, MA, USA), anti- β-actin (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 각 1차 antibody로 4 에서 12시간배양한다. 1XTBST buffer로 washing 한후 antimouse/ rabbit IgG (Thermo, Scientific, MA, USA) 로각 2차 antibody로실온에서 1시간배양한다. 다시 1XTBST buffer로 washing 한후 ECL 용액 (abfrontier, Seoul, Korea) 으로감광시킨후암실에서 X-선필름에노출시킨후인화하였다. In vitro transient transfection mltc-1 세포에소포체스트레스-활성표지자 (ER stressactivated indicator, ERAI) 인 pcax-f-xbp1-venus 혹은 pcax- F-XBP1 DBD-venus 플라스미드 [10] 를 Effectene transfection reagent (Qiagen, Valenica, CA, USA) 를이용하여세포에도입하였다. 이후 48시간뒤에 FBS가들어있지않은 RPMI1640 배지에 12시간배양한다. 그런다음 5 IU hcg, 500 um camp 그리고 2 μg/ml Tm을 12시간처리한다. Flow cytometry 분석 pcax-f-xbp1-venus 혹은 pcax-f-xbp1 DBD-venus vector를도입한 mltc-1세포에 hcg, camp를처리하고난후 0.05% trypsine-edta (Invitrogen) 을이용하여세포를수확한다. 이후세포를 phosphate-buffered saline (PBS, ph7.4) 로두번 washing 하고 DMEM (-Phenol red) 에현탁시켰다. 세포현탁액을 green fluorescence 신호로 FACSCalibur (BD Biosciences, NJ, USA) 를이용하여분석하였다. 형광현미경을이용한세포관찰 pcax-f-xbp1-venus 혹은 pcax-f-xbp1 DBD-venus 플라스미드를도입한세포에소포체스트레스가유도되면녹색형광이핵혹은세포질에서발현된다. mltc-1세포에이플라스미드를각각도입한뒤 hcg, camp, Tm을처리하고형광현미경으로관찰하였다. 배지를제거하고 PBS로두번 washing 하고 methanol로고정한뒤 1 μg/ml Hoechst 33258로핵을염색시켰다. 염색 10분후에형광현미경 (Leica DMIL microscope, DFC420C digital camera) 을이용하여소포체스트레스가핵혹은세포질에서의발현여부를관찰하였다.
Journal of Life Science 2014, Vol. 24. No. 10 1041 Total RNA 추출및 cdna 합성 5 IU hcg, 500 um camp 그리고 2 μg/ml Tm을시간별로처리한 mltc-1 cell에 PBS washing 2번후 1 ml의 Trizol solution(bio science Technology, korea) 을넣고 cell scrapper를이용하여 cell을수확하였다. 1.5 ml tube에옮겨서 ice에서 5분간반응시킨후수층과유기용매층으로분리시키기위해 200 μl chloroform을첨가하여 5분간반응시킨다. 12,000rpm에 15 분간원심분리한뒤, total RNA가들어있는상층액을 500 μl의 Isopropanol이들어있는새 tube에옮기고가볍게 inverting 하였다. 원심분리하여 total RNA pellet을 down 시킨후, 1 ml의 75% EtOH를이용하여 2차례 washing 한다음상온에서건조시켰다. 추출된 RNA는 50 μl의 RNase-free water인 DEPC에희석하였다. 추출한 1 μg의 total RNA와 Oligo-dT 그리고 AccuPower RT-PCR premix (Bioneer, korea) 을이용하여 cdna를합성한뒤 -20 에냉동보관하였다. RT-PCR 및 XBP1 mrna의 splicing 분석합성된 cdna를주형으로특정 primer (Table 1) 를첨가하여 AccuPower PCR premix (Bioneer) 를이용하여 PCR을수행하였다. PCR 조건은 95 에서 5분, 95 에서 30초, 55 에서 30초, 72 에서 30초, 72 에서 5분총 30 cycle 수행하였다. 대조군으로 GAPDH 유전자를사용하였다. XBP1 mrna의 splicing 분석하기위해서먼저 2X PCR Premix (Enzynomics, Seoul, Korea) 와 XBP-1 primer (Table 1) 를이용하여위의조건과동일하게 PCR을수행하였다. 이 PCR 산물에 Pst1 제한효소를첨가하여 37 에서 90분간반응시킨다. 그런다음 EtBr 이포함된 2% agarose gel에전기영동하여 UV상에서 band를확인하였다. 결과 hcg처리후 p-ire1 단백질발현량분석마우스레이디히세포에서 hcg처리에의해 p-ire1의발현패턴을확인하기위하여 mltc-l 세포에 hcg를농도별, 시간별로처리하여실험을진행하였다. 먼저주요한소포체스트레스표지자인 Grp78/Bip의단백질의발현패턴을확인한결과 hcg처리에의해 Grp78/Bip단백질의발현량이급격히증가하는것을통하여이전연구결과 [9] 와같이 mltc-l 세포에 hcg처리시소포체스트레스가증가하는것을확인하였다 (Fig. 1). hcg에의해유도된소포체스트레스가 IRE1경로를 활성화시키는지확인하기위하여 p-ire1와 Total IRE1의단백질발현량을 western blot을통하여확인하였다. Fig. 1A에서보듯이 hcg의농도가증가함에따라 p-ire1의발현이점점증가하였다 (p<0.001). 또한 5IU/ml의 hcg을시간별시처리하였을때, 3시간후부터 p-ire1이급격히증가하여 24시간까지꾸준히유지되었다 (Fig. 1B). 이결과를통하여마우스레이디히세포인 mltc-1세포에 hcg처리에의해유도되는소포체스트레스는 IRE1을인산화시키는것을단백질수준에서확인할수있었다. hcg와 camp 처리에의한 IRE의활성분석소포체스트레스에의해인산화된 IRE1읠활성화되어 endonuclease 활성을가지게된다. hcg처리에의해증가된 p- IRE1이활성화되어 endonuclease의기능을수행하는지확인하기위하여 IRE1의활성을분석할수있는소포체스트레스- 활성표지자 (ER stress-activated indicator, ERAI) 인 pcax-f- XBP1-venus 혹은 pcax-f-xbp1 DBD-venus vector 를 mltc- 1 세포에도입하여실험을진행하였다 [10]. 소포체스트레스환경에서이 vector에삽입되어있는 XBP1 유전자가 splicing 되면, splicing된 XBP1 mrna는 XBP1-venus fusion protein 으로번역되어녹색형광이발현되어세포내활성 IRE1을표지할수있다. pcax-f-xbp1-venus는활성 IRE1에의해 splicing 되어만들어진 XBP1-venus fusion protein이핵에위치하게되며, pcax-f-xbp1 DBD-venus 로부터만들어진 XBP1 DBD-venus fusion protein은세포질에위치하게된다 [5]. Figure 2에서 mltc-1 세포에각각 pcax-f-xbp1-venus, pcax-f-xbp1 DBD-venus을 transfection 한뒤 hcg와 hcg 자극에의한이차전달자인 camp를 12시간처리하여형광현미경으로관찰하였다. pcax-f-xbp1-venus vector가도입된세포에 hcg와 camp 처리시녹색형광을띄는세포들이 control에서보다많이증가되었으며 (Fig. 2A), 세포를확대해서관찰하니녹색형광이핵에서발현되는것을확인할수있었다 (Fig. 2B). pcax-f-xbp1 DBD-venus를도입한세포에서도역시 hcg와 camp 처리시녹색형광의세포들이많이발견되며, 녹색형광단백질 XBP1 DBD-venus fusion protein이세포질에서발현하는것을관찰할수있었다 (Fig. 2C and 2D). hcg와 camp 처리에의해증가되는녹색형광을띄는세포수는 positive control로써사용한소포체스트레스유도제인 Tunicamycin (Tm) 처리한경우와비슷한수준으로발견되는것을확인하였다. Table 1. Primer sequence for reverse-transcription PCR Gene Accession number Forword (5'-3') Reverse (5'-3') Grp78/Bip XBP1 GAPDH NM_022310.2 NM_013842.2 NM_008084.2 TGCAGCAGGACATCAAGTTC AAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGC ACCACAGTCCATGCCATCAC CAGCTGCTGAGGCTCATTG TCCTTCTGGGTAGACCTCTGGGAG TCCACCACCCTGTTGCTGTA
1042 생명과학회지 2014, Vol. 24. No. 10 A B Fig. 1. hcg treatment cause ER stress and leads to IRE1 activation in mltc-1 cells. Western blot analysis of Grp78/Bip, phospho-ire1, total IRE1, β-actin protein in treated MLTC-1 cells with variant hcg concentrations. mltc-1 cells were incubated with dose dependent manner of hcg for 12 hr (A). mltc-1 cells were incubated with 5 IU/ml hcg for different incubation times (B). phospho-ire1 protein were quantified and normalized by total IRE1 for Western blot analysis. Data in bar graph are the means ± SEM of three independent measurements. A Cont 500μM camp 2μg/ml Tm B C Cont 500μM camp 2μg/ml Tm D Fig. 2. hcg and camp induce the activation of IRE1. Fluorescence (green) image in mltc-1 cells were transfected with indicator plasmids and treated with camp, hcg and Tm. mltc-1cells were transfected with pcax-f-xbp1-venus (A, B) and pcax-xbp1 DBD-venus (C,D) for 48 hr. After transfection, mltc-1 cells were pre-incuated with serum free medium for 12 hr, and then cells treated with camp (500 μm), hcg (5 IU/ml), and Tm (2 μg/ml) as positive control for 12 hr. Cells were fixed with methanol and stained with 1 μg/ml Hoechst 33258 for 10 min (B,D) And then, cells were visualized and analyzed under a fluorescence microscope. Scale bar, 200 μm.
Journal of Life Science 2014, Vol. 24. No. 10 1043 또한 pcax-f-xbp1-venus, pcax-f-xbp1 DBD-venus 를각각도입한세포에 hcg와 camp 처리하여증가하는녹색형광의강도를조사하고정량화하기위하여 Flow cytometry를이용하여분석하였다. Fig. 3에서확인할수있듯이 control에비하여 hcg와 camp 처리한세포에서형광강도가많이증가하였다. 세번의반복실험을통하여얻은평균값을통계처리하여그래프화한결과 control에비하여 hcg와 camp 처리하였을때유의적으로형광강도가증가하는것을확인할수있었다 (p<0.05). 이실험들을통하여 hcg와 2차전달자인 camp 모두 IRE1을활성화시키고, 활성화된 IRE1은 endonuclease 기능을수행하여도입된 pcax-f-xbp1-venus 와 pcax- F-XBP1 DBD-venus의 XBP1 mrna 영역을 splicing 시키는것을확인할수있었다. hcg 와 camp 처리에의한 XBP1 mrna의 splicing 분석 hcg와 camp 처리에의해활성화된 IRE1이세포내에서발현되는 XBP1 mrna의 splicing을유도하는지확인하기위하여 RT-PCR을수행하여분석하였다. XBP1 mrna는소포체스트레스에의해활성화된 IRE1에의해 26개의 nucleotide 가 splicing 된다. RT-PCR을통하여증폭한 unspliced XBP1 (uxbp1) 과 spliced XBP1 (sxbp1) 는 26개의 nucleotide 밖에차이가나지않아바로전기영동으로분리하여확인하기가어렵다. 따라서 splicing 되는 26개의 nucleotide 영역안에존재하는 Pst1 제한효소절단부위를이용하여 uxbp1와 sxbp1 를구별하였다 [1]. mltc-1 세포에 camp와 hcg를시간별로처리한뒤 sxbp1의발현량을확인하였다. camp 처리후 4시간부터 sxbp1의발현이증가하기시작하며 (p<0.01), 처리시간이길어질수록발현량이점점더증가하여 8시간에가장많이증가하였다 (p<0.001). hcg 역시처리후 3시간부터 sxbp1 발현이증가하며 (p<0.01), 6시간후부터급격히증가하는것을확인할수있다 (p<0.001). camp와 hcg 모두처리시간의존적으로 sxbp1의발현이점점증가하는경향을보이다가 12시간부터는조금씩감소하기시작한다. 하지만소포체스트레스유도물질인 Tm 처리한경우, 처리초반인 4시간때부터 sxbp1의발현이급격히증가하였다 (p<0.001). 이결과들을통하여 camp와 hcg 처리는 mltc-1 세포에소포체스트레스를유발하며 IRE1/XBP1 경로를활성화시키는것을확인할수있었다. 고찰마우스정소의레이디히세포인 mltc-1 세포에 hcg와 camp를처리하여 Grp78/Bip의발현증가를통하여소포체스트레스가유도되었음을확인하였고이에대한방어기작으로 UPR signaling 중활성 IRE1이증가하며 XBP1 mrna의 splicing이유도되는것을통하여 IRE1/XBP1 경로가활성화됨을확인할수있었다. 본연구에서는이 IRE1/XBP1 경로를분석하기위하여여러가지실험방법을사용하였다. 먼저소 A 500μM camp B 500μM camp Fig. 3. hcg and camp induce the ER stress- dependent splicing of XBP1. Quantification of green fluorescent cells by flow cytometry. After transfected mltc-1 cells with pcax-f-xbp1-venus (A) and pcax-xbp1 DBD-venus (B) were treated with camp (500 μm), hcg (5 IU/ml) for 12 hr, and then cells were analyzed with flow cytometry. The black and red lines indicate non-treated mock transfectants (pcax, control) and treatments in pcax-f-xbp1-venus and pcax-xbp1 DBD-venus, respectively. The mean fluorescence from three experiments is expressed per group of cells; intensities are expressed relative to the level in the each treatment cells. Asterisks indicate a statistically significant difference (p<0.05) between control (Cont) and treated cells using Student s t-test.
1044 생명과학회지 2014, Vol. 24. No. 10 A B C 2 μg/ml Tm Fig. 4. hcg and its Second messenger camp induces ER stress via IRE1/XBP1 pathway in mltc-1 cells. RT-PCR analysis of spliced XBP1 (sxbp1) and unspliced XBP1 (uxbp1) in 500 μm camp (A), 5 IU/ml hcg (B) and 2 ug/ml Tm (C) for indicated times. The sxbp-1 mrna were quantified and normalized by GAPDH for RT-PCR. Data in the bar graph represent mean ± S.E.M. of three independent measurements. **, p<0.01; ***, p<0.001, compared with control (0 hr). 포체스트레스에의해 Grp78/Bip과의결합에서해리된 IRE1 단백질이인산화되는데이를분석하기위하여 Western blot을수행하여 p-ire1/ IRE1의발현을확인하였다. 다음으로인산화된 IRE1은활성화되어 endonuclease 기능을하므로이를확인하기위하여 ERAI인 pcax-f-xbp1-venus, pcax-f-xbp1 DBD-venus vector를세포에도입하여형광현미경과 Flow cytometry를통하여분석하였다. 그리고소포체스트레스에의한세포내 XBP1 mrna의 splicing이유도되는지확인하기위하여 total RNA를추출하여 RT-PCR을수행한뒤 Pst1 제한효소를처리하여 unspliced XBP1과 spliced XBP1 분리하여발현량을조사하였다. 다음과같은실험방법들을이용하여 IRE1/XBP1 경로가활성화됨을판단할수있었으며, 본연구를통하여정립된실험방법을응용하여 mltc-1 세포내에서활성화된 IRE1과 XBP1의기능을규명하는데기여할것으로사료된다. 이전연구에서활성형 ATF6 (p50) 를세포에과발현시켰을때테스토스테론합성에필수적인성호르몬합성효소인 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD) 의발현을감소시켰으나, 다른 UPR signaling의하위신호전달유전자인 sxbp1과 ATF4를과발현시켰을경우 3β-HSD의발현에영향을주지못하였다 [9]. 따라서 hcg 처리에의해활성화되는 sxbp1은성호르몬합성효소의발현에직접적으로관여하지않지만 ERSE 부위에결합하여소포체스트레스관련유전자의전사를증가시키고단백질의폴딩을도와주는샤페론기능을할것으로사료되며추가적인실험을통하여이가설을증명할예정이다 [7, 15]. 또한 IRE1이활성화되면 endonuclease domain과 serine-threonine kinase domain을가져 2가지기능을하게되는데, 본연구에서는활성 IRE1의 endonuclease기능에대하여만증명하였다. 활성 IRE1은 serine-threonine kinase로써역할을하여 pro-apoptotic 인자인 Jun N-terminal kinase (JNK) 를인산화시켜서소포체스트레스매개의세포자멸사를유도한다고알려져있다 [12, 13]. 우리도이전연구를통하여 5IU/ml의 hcg를처리뒤 12시간부터 p-jnk의단백질발현량이증가하며이것이소포체매개의세포자멸사를유도할것이라고보고하였다. hcg 처리에의해증가하는활성 IRE1의 endonuclease domain과 serine-threonine kinase domain이각각세포에작용하는시기에대하여아직연구가되지않았다. 따라서 hcg의처리시간및농도에따라활성 IRE의어떤 domain이활성화되는지본연구에서이용한실험방법들을이용하여이를분석할수있을것으로예상된다. 본논문을통하여향후정소의레이디히세포내에서 hcg 처리에의한 IRE과 XBP1 유전자의역할연구에적용및응용할수있는가능성을제시하였으며이결과는기초연구자료로써활용할수있을것으로사료된다. 감사의글 본연구는한국연구재단이공분야기초연구사업 (NRF- 2012R1A1A2008880) 및농림축산식품부생명산업기술개발사업 (112020-03-2-SB020) 그리고미래창조과학부한국생명공학연구원바이오인프라위탁과제 (KGM4611411) 의지원에의하여연구되었음. References 1. Calfon, M., Zeng, H., Urano, F., Till, J. H., Hubbard, S. R., Harding, H. P., Clark, S. G. and Ron, D. 2002. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mrna. Nature 415, 92-96. 2. Do, M. H., Santos, S. J. and Lawson, M. A. 2009. GNRH
Journal of Life Science 2014, Vol. 24. No. 10 1045 induces the unfolded protein response in the LbetaT2 pituitary gonadotrope cell line. Mol Endocrinol 23, 100-112. 3. Fonseca, S. G., Gromada, J. and Urano, F. 2011. Endoplasmic reticulum stress and pancreatic beta-cell death. Trends Endocrinol Metab 22, 266-274. 4. Hamamura, K. and Yokota, H. 2007. Stress to endoplasmic reticulum of mouse osteoblasts induces apoptosis and transcriptional activation for bone remodeling. FEBS Lett 581, 1769-1774. 5. Iwawaki, T., Akai, R., Kohno, K. and Miura, M. 2004. A transgenic mouse model for monitoring endoplasmic reticulum stress. Nat Med 10, 98-102. 6. Lai, E., Teodoro, T. and Volchuk, A. 2007. Endoplasmic reticulum stress: signaling the unfolded protein response. Physiology (Bethesda) 22, 193-201. 7. Lee, A. H., Iwakoshi, N. N. and Glimcher, L. H. 2003. XBP-1 regulates a subset of endoplasmic reticulum resident chaperone genes in the unfolded protein response. Mol Cell Biol 23, 7448-7459. 8. Ozcan, U., Cao, Q., Yilmaz, E., Lee, A. H., Iwakoshi, N. N., Ozdelen, E., Tuncman, G., Gorgun, C., Glimcher, L. H. and Hotamisligil, G. S. 2004. Endoplasmic reticulum stress links obesity, insulin action, and type 2 diabetes. Science 306, 457-461. 9. Park, S. J., Kim, T. S., Park, C. K., Lee, S. H., Kim, J. M., Lee, K. S., Lee, I. K., Park, J. W., Lawson, M. A. and Lee, D. S. 2013. hcg-in-duced endoplasmic reticulum stress triggers apoptosis and reduces steroidogenic enzyme expression through activating transcription factor 6 in Leydig cells of the testis. J Mol Endocrinol 50, 151-166. 10. Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. and Gupta, S. 2010. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol 2010, 830307. 11. Schroder, M. and Kaufman, R. J. 2005. The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Biochem 74, 739-789. 12. Szegezdi, E., Logue, S. E., Gorman, A. M. and Samali, A. 2006. Mediators of endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis. EMBO Rep 7, 880-885. 13. Urano, F., Wang, X., Bertolotti, A., Zhang, Y., Chung, P., Harding, H. P. and Ron, D. 2000. Coupling of stress in the ER to activation of JNK protein kinases by transmembrane protein kinase IRE1. Science 287, 664-666. 14. Wu, J. and Kaufman, R. J. 2006. From acute ER stress to physiological roles of the Unfolded Protein Response. Cell Death Differ 13, 374-384. 15. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T. and Mori, K. 2001. XBP1 mrna is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell 107, 881-891. 16. Zhao, L. and Ackerman, S. L. 2006. Endoplasmic reticulum stress in health and disease. Curr Opin Cell Biol 18, 444-452. 초록 :mltc-1 세포에 hcg 처리에의해유도된소포체스트레스가 IRE1/XBP1 경로의활성화유발박선지 1 김태신 2 이동석 1 * ( 1 경북대학교자연과학대학생명과학부 (BK 21 plus 사업 ), 2 캘리포니아대학교생식의학부 ) 본연구의목적은마우스레이디히세포인 mltc-1 세포에사람융모성성선자극호르몬인 hcg를처리하여유도되는소포체스트레스가 IRE1/XBP1 경로를통하는지분석하는것이다. 이전연구에서 hcg처리에의해레이디히세포는소포체스트레스매개의세포자멸사가유도될뿐만아니라 ATF6경로를조절함으로써 UPR이성호르몬합성효소의발현에중요한역할을하는것을증명하였다. UPR 경로는또한 IRE1/XBP1 경로를통하여조절되는것이알려져있지만레이디히세포에서 hcg에의한소포체스트레스에의해 IRE1/XBP1 경로의활성화가유도되는지에대해서는거의알려져있지않다. mltc-1세포에서 hcg 처리후 IRE1/XBP1경로의활성을조사하기위하여, 인산화된 IRE1 단백질확인하기위한 western blot, XBP1 mrna splicing 확인하기위한 RT-PCR을수행하였다. 또한우리는 IRE의활성을관찰하기위하여소포체스트레스-활성표지자 (ERAI) construct를이용하고이를형광현미경과 flow cytometry를이용하여분석하였다. 결과적으로, hcg 처리에의해인산화된 IRE1 단백질의발현수준이두드러지게증가하였다. F-XBP1-venus/ F-XBP1 DBD-venus가도입된 mltc-1 세포에서, hcg 처리에의해녹색형광을띄는세포들이유도되었고각각핵 / 세포질에서발현하는것을확인할수있었다. 게다가 hcg 처리후에 XBP1 mrna의 splicing 또한상당히증가되는것을확인할수있었다. 이결과들을통하여종합해볼때레이디히세포에서 hcg 처리에의해유도되는소포체스트레스가 IRE1/XBP1 경로의활성을유발하는것을확인할수있었다.