Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(2): 134-143 (2016) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2016.31.2.134 ISSN 1225-7117 / eissn 2288-8268 연구논문 발효전후구기자열매추출물의 ADH 및 ALDH 활성인자분리및특성 최지현, 강동희, 김현수 * Separation and Characteristics of ADH and ALDH Activators in Fermented Lycii fructus Extract Ji-Hyun Choi, Dong-Hee Kang, and Hyun-Soo Kim* Received: 9 May 2016 / Revised: 20 June 2016 / Accepted: 27 June 2016 2016 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: Lycii fructus has been traditionally used as a preventive and therapeutic medicine to treat enervation and diverse chronic diseases. In this study, we investigated whether fermentation of Lycii fructus extract (LE) increases the enzymatic activity of the alcohol dehydrogenase (ADH) and aldehyde dehydrogenase (ALDH). The fermentation of LE by Bacillus subtilis subsp. subtilis and Saccharomyces cerevisiae IFO 2376 was shown to increase the enzymatic activity of ADH and ALDH. TLC analysis of LE and fermented LE (FLE) showed that ADH and ALDH activities increased in different spots. Fraction No. 66 of LE and fraction No. 68 of FLE by Silica gel chromatography showed increased ADH activity of 129.1% and 148.9%, respectively. Fractions No. 128 of LE and FLE by Silica gel chromatography showed increased ALDH activity of 134.1% and 148.1%, respectively. The fraction No. 68 of FLE obtained by HPLC showed new peaks at R t 11.938min, R t 22.072min and R t 28.842min, indicating that ADH activity was increased. The LE and FLE fractions with the greatest increases in ADH activity peaked at the same time (R t 13min),whereas the LE and FLE fractions with the greatest increases in ALDH activity peaked at different times (R t 16.307min and R t 36.640min, respectively). 계명대학교자연과학대학기초과학부생명과학전공 Major in Biological Sciences, Faculty of Basic Sciences, College of Natural Science, Keimyung University, Daegu 42601, Korea Tel: +82-53-580-5284, Fax: +82-53-580-5284 e-mail: hskim@kmu.ac.kr Key words: Lycii fructus extract, Fermented Lycii fructus extract, Alcohol dehydrogenase, Aldehyde dehydrogenase, Activators 1. INTRODUCTION 국민건강영양조사에서는 1 회평균음주량이남성 7 잔, 여성 5 잔이상이며주 2 회이상음주를할때고위험음주군이라한다. 한국인의음주습관은 2013 년국민건강영양조사에서고위험음주군으로서주 2 회이상음주를하는경우를조사한결과남성 19.7%, 여성 5.4% 로확인되어우려할수준으로나타났다 [1]. 알코올은스트레스해소나사교등을목적으로애용되는기호품으로소량섭취시기분전환을위해서도좋고혈액순환에도움이되어건강에유익할수있지만, 많은양을장기간섭취시췌장염, 심근경색, 신경장애, 결핵, 간질환등이유발된다 [2]. 체내에들어온알코올은간이나몸의다른기관과부위로운반되어 ADH (Alcohol dehydrogenase) 에의해 acetaldehyde 로전환되며, 그다음 ALDH (Aldehyde dehydrogenase) 에의해 acetic acid 로전환되어소변이나 CO 2 로배설된다 [3]. 우리몸에치명적인손상을주는것은알코올그자체보다도산화과정에서생성된 acetaldehyde 가심혈관계에작용하여급성증상을나타나게하며, 체내의거의모든기관을손상시키고특히간조직의구조와기능에치명적인손상을유발한다 [4,5]. ADH 와 ALDH 활성은미네랄성분이나아미노산성분에의해촉진되거나재활성화되는것으로알려져있다 [6,7]. 아미노산중 aspartic acid, asparagine, glycine, glutamic acid, methionine 이간보호효과및알코올대사에관련이있는것으
발효전후구기자열매추출물의 ADH 및 ALDH 활성인자분리및특성 135 로보고되었다 [8,9]. 숙취해소를위한제품의주요소재로사용되고있는헛개나무열매추출물, 숙취해소식품으로알려진콩나물, 복어추출물의주요아미노산인 arginine, aspartic acid 및 glutamic acid 가알코올에의한간손상으로부터보호효과가있다고보고되었다 [10]. 구기자열매 (Lycii fructus) 는가지과에속한구기자나무의성숙한과실로서항암효과, 면역증진, 간기능개선효과, 콜레스테롤저하작용, 혈당및혈압강하작용, 피부미백작용등에대한효능이보고되었으며 [11-16], Yoon 등은구기자추출물함유알코올을실험동물에음용시켰을때알코올에의하여생성된유해산소와 acetaldehyde 의해독효소활성이증가됨을관찰하였다 [17]. 미생물을이용하여천연물을발효할때천연물의영양성분은미생물의에너지원을제외하고그대로보존되며, 미생물이분비하는각종가수분해효소와세포내조직에결합되어있던생리활성물질들이유리되기때문에발효전보다발효후천연물의생체이용률 (bioavailability) 이훨씬높아지는것으로알려져있다 [18-20]. 천연물발효에사용되는미생물은곰팡이, 고초균, Lactobacillus 속균주를포함한유산균과효모인 Saccharomyces 속균주등을이용하고있다 [21]. 유산균, 효모, 고초균등유익한미생물을이용한발효기술의진보로천연물의생리활성효능이증가된발효산물을얻거나상호간의상승효과에의해생리활성효능이상승되는제품들이개발되고있다 [22]. 본연구에서는해독작용이있다고알려져있는구기자열매를추출하여 Bacillus 속균주, Saccharomyces 속균주와 Schizosaccharomyces 속균주를이용하여발효시킨후 ADH 및 ALDH 의활성을증대시키고, 각효소의활성을증대시키는기능을가진활성인자 (activator) 로추정되는물질을확인하고자한다. 2. MATERIALS AND METHOD 2.1. 구기자열매의추출발효에사용한한약재는간해독작용이알려진구기자열매 (Lycii fructus) 를선정하였으며, 약재는대구광역시약전골목내한약방에서구입하여사용하였다. 구기자열매의추출은 methanol, ethanol 과 ethyl acetate 를이용한유기용매추출과열수추출을통해수행하였다. 구기자열매의유기용매추출은구기자열매 40 g 에 methanol, ethanol 과 ethyl acetate 을각각 500 ml 첨가하여 28 o C 에서 24 시간동안진탕하여수행하 였으며, 구기자열매의열수추출은구기자열매 40 g 에물 1 L 를첨가하여 100 o C 에서 1 시간동안가열하여수행하였다. 각추출물은 filter paper 를이용하여여과한후 vacuum rotary evaporator (EYELA, Japan) 를이용하여농축하였으며, 농축액은사용할때까지 4 o C 이하에서냉장보관하였다. 2.2. 구기자열매추출물의발효 2.2.1. 유용미생물의선정및배양발효를위해사용한미생물은 Table 1 에서보는바와같이고초균인 Bacillus 속균주, 효모인 Schizosaccharomyces 속균주와 Saccharomyces 속 3 균주를사용하였다. Bacillus subtilis subsp. subtilis 는청국장에서분리하여한국미생물보존센터에서 16S rdna 분석의뢰를통해동정된균주이며, Schizosaccharomyces pombe var. pombe KCTC 7522 와 Saccharomyces ellipsoideus KCTC 7243 는생물자원센터에서분양을받았으며, Saccharomyces cerevisiae IFO 2346 와 Saccharomyces cerevisiae IFO 2376 은오사카발효연구소에서분양을받아사용하였다. B. subtilis subsp. subtilis 는 nutrient 배지 (beef extract 3 g, peptone 3 g/l, ph 6.8, Difco, USA) 에, 효모는 YM 배지 (yeast extract 3 g, malt extract 3 g, dextrose 10 g, peptone 5 g/l, ph 7.6, Difco, USA) 에각각계대배양한후균체를 20% glycerol 이포함된저장액에넣어 -70 o C 에보관하였으며, 실험에사용하기전계대배양을실시하였다. 2.2.2. 구기자열매추출물의발효구기자열매추출물의발효는단일배양을통하여유용균주를선정후복합배양을수행하였다. 구기자열매추출물은 nutrient 배지와 YM 배지에 5 mg/ml 농도로첨가하였으며, 단일배양및복합배양은구기자열매추출물을첨가한각배지를멸균하여수행하였다. 발효시사용한 Bacillus 속균주, Schizosaccharomyces 속균주와 Saccharomyces 속균주는 1 10 cells/ml 로 stock 액을제조한후멸균된생육배지에각각 0.4% (v/v) 를접종하였다. 단일배양시온도는각균주의최적생육온도를기준으로설정하여 Bacillus 속균주는 37 o C 에서, 효모는 28 o C 에서 7 일간배양한후배양일수별로 sampling 을하였다. 배양액은 4 o C, 3,000 rpm 에서 10 분간원심분리후상등액을분리하여실험에사용하였다. 복합배양은구기자열매추출물을 5 mg/ml 농도로첨가한 nutrient 배지와 YM 배지를각각사용하였으며, B. subtilis subsp. subtilis 와 S. cerevisiae IFO 2376 을 0.4% (v/v) 의농도로접종하여수행하였다. 복합배양시조건은 28 o C 에서 7 일간배양하였으며배양일수별로 sampling 을하였다. 배양액은 4 o C, 3,000 rpm 에서 10 분 Table 1. Strains used for fermentation Strains Sources Bacillus subtilis subsp. subtilis Cheonggukjang Saccharomyces cerevisiae IFO 2346 Sake yeast Kyokai No. 6 Saccharomyces cerevisiae IFO 2376 Sake yeast Kyokai No. 8 Schizosaccharomyces pombe var. pombe KCTC 7522 Listan grapes, Spain Saccharomyces ellipsoideus KCTC 7243 Wine
136 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(2): 134-143 (2016) 간원심분리후상등액을분리하여실험에사용하였다. 2.2.3. 생육도확인발효구기자열매추출물에서공시균주의생육은 1 일, 3 일, 5 일과 7 일에 sampling 을한배양액의생균수측정을통해확인하였다. 생균수측정을위해발효구기자열매추출물은 3,000 rpm 에서 10 분간원심분리를하였다. 침전물은멸균수에현탁하여희석을한후 nutrient 평판배지와 YM 평판배지에도말하였으며, 28 o C 에서 3 일간정치배양한후생균수를확인하였다. 2.3. 효소활성촉진효과측정 2.3.1. ADH 활성촉진효과측정 ADH 활성측정은 Bergmeyer [23] 의방법을약간변형하여흡광도 340 nm에서 NADH의생성양을측정하여대조군에대한상대적활성으로비교하였다. 시료의 ADH 활성촉진효과는시료 50 µl에증류수 700 µl, 1 M Tris-HCl buffer (ph 8.8) 375 µl, 20 mm NAD (Sigma-Aldrich) 150 µl, ethanol 150 µl와 standard enzyme인 ADH (Sigma-Aldrich) 75 µl (1 unit/ml) 를넣어혼합후 30 o C에서 5분간방치한후 340 nm에서측정하여확인하였다. 결과는대조구로서시료를첨가하지않은 ADH 자체활성을 100% 로하여실험구의상대활성 (%) 을나타내었다. ADH activity (%) = (B / A) 100 A : 대조구의흡광도, B : 실험구의흡광도 2.3.2. ALDH 활성촉진효과측정 ALDH 활성측정은 Koivula 및 Koivusalo [24] 의방법을약간변형하여 acetaldehyde에서 acetate를생성하는효소로 NAD 로부터 NADH를생성하는원리를이용하였다. 시료의 ALDH 활성촉진효과는시료 50 µl에증류수 1,050 µl, 1 M Tris- HCl buffer (ph 8.0) 150 µl, 20 mm NAD (Sigma-Aldrich) 50 µl, 0.1 M acetaldehyde 50 µl, 3 M KCl 50 µl, 0.33 M 2- mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) 50 µl와 standard enzyme인 ALDH (Sigma-Aldrich) 50 µl (1 unit/ml) 를넣어혼합하여 30 o C에서 5분간방치한후 340 nm에서측정하여확인하였다. 결과는대조구로서시료를첨가하지않은 ALDH 자체활성을 100% 로하여실험구의상대활성 (%) 을나타내었다. ALDH activity (%)= (B / A) 100 A : 대조구의흡광도, B : 실험구의흡광도 2.4. 발효전후구기자열매추출물의비교 2.4.1. TLC TLC 분석은발효전후구기자열매추출물의물질을비교하기위해수행하였다. 발효전후구기자열매추출물은 30 o C 의 건조기 (Sanyo Electric Co.) 에두어수분을증발시킨후 methanol 을이용하여 5 mg/ml 의농도로조정하여 TLC 분석에사용하였다. 5 mg/ml 의발효전후구기자열매추출물은 TLC plate (Silica gel 60 F254, Merck, Germany) 에 5 µl 를 spotting 하고 methylene chloride, ethanol 과증류수를 3:5:2 로혼합한전개용매를포화시킨 TLC chamber 에넣어전개하였다. 검출은 UV lamp 를사용하여 254 nm 와 365 nm 에서조사한후확인하였다. Silica gel plate 상에서 UV 로확인된 spot 은 R f 를산출하고, 회수하여 methanol 로추출한후농축하여 ADH 및 ALDH 활성측정시첨가하여활성변화를비교하였다. 2.4.2. Silica gel column chromatography 발효전후의구기자열매추출물은 methylene chloride 로평형화시킨 silica gel column (=3.7 30 cm, 70~230 mesh, Merck, Germany) 에 100 mg/ml 로첨가한후용출용매로서 methylene chloride, ethanol 과증류수를 3:5:2, 2:5:2, 2:6:2, 2:6:3 으로혼합한후순차적으로용출하여 5 ml 씩분획하였다. 각분획은 vaccum rotary evaporator (EYELA, Japan) 로 10 mg/ml 로농축하여 ADH 및 ALDH 활성측정시첨가하여활성변화를비교하였다. 2.4.3. HPLC Silica gel column chromatography를수행한후각효소활성의증가가가장높은발효전후구기자열매추출물의분획은 C 18 column (HAIsil C 18 5micron, Higgins Analytical, Inc., USA) 을이용한 HPLC (Shimadzu LC 10-A, Japan) 에 10 µl를주입하여분석하였다. 유속은 0.8 ml/min, 검출은 UV-visible detector (SPD-10A) 를사용하여 245 nm에서측정하였으며, 이동상은 60% methanol을사용하였다. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 구기자열매추출물이효소활성에미치는영향구기자열매는동물실험을통하여간손상보호작용이있으며 [25], 구기자열매함유알코올을동물에음용시켰을때알코올에의하여생성된유해산소와 acetaldehyde 의해독효소활성이증가함을확인한선행연구가보고되었다 [17]. 또한 Lee 등은본연구와다르게 25 종한약재에서 ADH 활성을 Choi 등 [26] 과 Racker [27] 의방법을변형하여저해정도를측정하고, ALDH 활성을 Hwang 등 [28] 과 Tottmar 등 [29] 의방법을변형하여증가정도를확인한결과구기자열매가뛰어난 ADH 활성저해와 ALDH 활성증가를보였다고보고하였다 [30]. 본연구에서 ADH 및 ALDH 의활성을높이는물질의분리를위해구기자열매의추출은유기용매인 methanol, ethanol, ethyl acetate 와열수를이용하여수행하였다. 구기자열매의유기용매추출물과열수추출물은 5 mg/ml 농도로조정하여 ADH 및 ALDH 활성을측정하였다. 각추출물을첨가하여
발효전후구기자열매추출물의 ADH 및 ALDH 활성인자분리및특성 137 Fig. 1. Effect of solvent for extraction of LE on ADH (a) and ALDH (b) activities. Each extract (5 mg/ml) from LE was used for ADH and ALDH activities. The percentage of ADH and ALDH activities was defined relative to the activity of standard enzyme (control). LE: Lycii fructus extract. 효소활성을측정을한결과, Fig. 1(a) 에서보는바와같이 ADH 활성은구기자열매추출물을첨가하지않은대조구인 control 을 100% 로하였을때 methanol 추출물은 153.6%, ethanol 추출물은 152%, ethyl acetate 추출물은 142.3%, 열수추출물이 180.7% 로활성증가가확인되었다. 각추출물의 ALDH 활성은 Fig. 1(b) 에서보는바와같이구기자열매추출물을첨가하지않은대조구인 control 을 100% 로하였을때 methanol 추출물은 96.1%, ethanol 추출물은 127.3%, ethyl acetate 추출물은 98.3%, 열수추출물은 134.3% 로활성증가가확인되었다. 구기자열매는열수추출을하였을때 ADH 및 ALDH 활성증가가가장높게확인되어발효전후구기자열매추출물의비교와 ADH 및 ALDH 의활성을증대시키는활성인자분리를위해열수추출방법을이용하여수행하였다. 3.2. 발효구기자열매추출물이효소활성에미치는영향 3.2.1. 단일배양을통한효소활성측정약용식물의발효를통한숙취해소효과는보고된바가많지않으나, Monascus 속을백미에발효시켜서얻어진홍국이알코올대사를촉진시켜알코올의체외배설을촉진시킨다는보고가있다 [31]. ADH 및 ALDH 활성을증대시키기위한일환으로구기자열매추출물은 Bacillus 속균주, Saccharomyces 속균주및 Schizosaccharomyces 속균주를이용하여발효를수행하였다. 단일배양은각균주를이용하여구기자열매추출물을발효시킨후효소반응액에첨가하여 ADH 및 ALDH 의활성변화를확인하고, 복합배양을위한균주를선정하기위해수행하였다. Fig. 2(a) 와 (b) 에서보는바와같이균주배양에사용한배지와구기자추출물이첨가되지않은발효균주의배양액은배양일수에따라서모두 ADH 및 ALDH 활성의증가에영향을주지않았다. 구기자열매추출물은 Fig. 1 에서보는바와같이열수추출을통해농축후 ADH 활성을측정하였을때약 180% 로확인되었으나, 발효를위해배지와혼합된구기자열매추출물은 Fig. 3 에서보는바와같이 ADH 활성을측정하였을때약 150% 로감소하는것으로확인되었 Fig. 2. Effect of medium and culture broth on ADH (a) and ALDH (b) activities. The percentage of ADH and ALDH activities was defined relative to the activity of standard enzyme (control). 다. 이러한결과는구기자열매추출물과배지를혼합후다른균주의오염을방지하기위한멸균과정에서 ADH 활성을증가시키는물질의일부변화에의해감소한것으로사료된다.
138 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(2): 134-143 (2016) B. subtilis subsp. subtilis 로발효한구기자열매추출물에대한 ADH 활성은 Fig. 3(a) 에서보는바와같이구기자추출물과발효균주가포함되지않은 control 을 100% 로하였을때활성증가가배양일수에따라증가하여발효 5 일째 176.1%, 7 일째 188.6% 로확인되었으며, 발효전구기자열매추출물의 ADH 활성증가는 150% 로확인되어 B. subtilis subsp. subtilis 로구기자열매추출물을발효하였을때 ADH 활성이증가하는것으로나타났다. Saccharomyces 속균주및 Schizosaccharomyces 속균주로 7 일간발효시구기자열매추출물에대한 ADH 활성은발효전구기자열매추출물과비교하여활성이증가하지않았다. Fig. 3(b) 에서보는바와같이 ALDH 활성은 B. subtilis subsp. subtilis 로발효한구기자열매추출물의경우발효전구기자열매추출물의 ALDH 활성과비교하여활성이크게증가하지않았으며, Saccharomyces 속균주및 Schizosaccharomyces 속균주로 7 일간발효한구기자열매추출물의경우시료미첨가대조군으로서 control 을 100% 로하였을때 S. cerevisiae IFO 2376 으로 7 일간발효한구기자열매추출물의 ALDH 활성증가가약 158.8% 로확인되었다. 발효전구기자열매추출물의 ALDH 활성증가는 132.1% 로확인되어 S. cerevisiae IFO 2376 로구기자열매추출물을발효하였을때 ALDH 활성이증가하는것으로나타났다. 3.2.2. 복합배양을통한효소활성측정복합배양은단일배양시높은 ADH 활성증가를보였던 B. subtilis subsp. subtilis 와높은 ALDH 활성증가를보였던 S. cerevisiae IFO 2376 을복합배양하여 ADH 와 ALDH 활성의증가를증대시키기위해수행하였다. Fig. 4(a) 에서보는바와같이 B. subtilis subsp. subtilis 와 S. cerevisiae IFO 2376 로 7 일간발효한구기자열매추출물에대한 ADH 활성은 nutrient 배지를이용하였을때 160%, YM 배지를이용하였을때 178.2% 로확인되어, 복합배양을통한구기자열매추출물의발효는시료미첨가대조군으로서 control 을 100% 로하였을때 ADH 활성증가가확인되었다. 발효전구기자열매추출물에대한 ADH 활성증가는 150% 로확인되어 B. subtilis subsp. subtilis 와 S. cerevisiae IFO 2376 로발효하였을때 ADH 활성이증가하였으며, YM 배지에서 7 일간발효하였을때 ADH 활성이가장높게증가하였다. Fig. 4(b) 에서보는바와같이 B. subtilis subsp. subtilis 와 S. cerevisiae IFO 2376 로 7 일간발효한구기자열매추출물에대한 ALDH 활성은 nutrient 배지를이용하였을때감소하였으며, YM 배지를이용하였을때 155.8% 로확인되어, 시료미첨가대조군으로서 control 을 100% 와비교하였을때활성증가가확인되었다. 발효전구기자열매추출물에대한 ALDH 활성증가는 132.1% 로확인되어 YM 배지를이용하여 B. subtilis subsp. subtilis 와 S. cerevisiae IFO 2376 로구기자열매추출물을 7 일간발효하였을때 ALDH 활성이증가하는것으로나타났다. 3.2.3. 생육도확인발효후구기자열매추출물에서공시균주의생육은 YM 배 Fig. 3. ADH (a) and ALDH (b) activities of LE and FLE. B. subtilis subsp. subtilis was incubated in nutrient medium containing 5 mg/ ml LE for 7 days. Saccharomyces sp. and S. pombe var. pombe were incubated in YM medium containing 5 mg/ml LE for 7 days. The percentage of ADH and ALDH activities was defined relative to the activity of standard enzyme (control). FLE: fermented Lycii fructus extract. 지에 B. subtilis subsp. subtilis 와 S. cerevisiae IFO 2376 을복합배양한후배양일수별로 sampling 을하여생균수측정을통해확인하였다. 그결과, Fig. 5 에서보는바와같이접종한두균주가생육하여발효 7 일째에도지속적으로증식이유지되었다. 3.3. 발효전후구기자열매추출물의비교 3.3.1. TLC TLC 분석은구기자열매추출물의발효에의한물질의변화를검토하기위해발효전후구기자열매추출물을대상으로수행하였다. Fig. 6(a) 는발효전후구기자열매추출물을 5 mg/ml 의농도로조정하여 5 µl 를점적후 TLC 분석을한결과이며, 각 spot 은 R f 를산출하여회수후 ADH 및 ALDH 활성증가를확인하였다. Fig. 6(b) 에서보는바와같이발효전구기자열매추출물의 ADH 활성은시료미첨가대조구인 control 을 100% 로하였을때 R f 값이 0.68 인 spot No. 4 에서 118.6% 로가장높게확인되었으며, 발효후구기자열매추출
발효전후구기자열매추출물의 ADH 및 ALDH 활성인자분리및특성 139 Fig. 4. ADH (a) and ALDH (b) activities of FLE by co-culture of B. subtilis subsp. subtilis and S. cerevisiae IFO 2376 in nutrient and YM medium containing 5 mg/ml LE for 7 days. The percentage of ADH and ALDH activities was defined relative to the activity of standard enzyme (control). Fig. 5. Viable cell count of strains from FLE by co-culture of B. subtilis subsp. subtilis and S. cerevisiae IFO 2376 in YM medium for 7 days. 물의 ADH 활성은 R f 값이 0.74 인 spot No. F4 에서 120.9% 로가장높게확인되었다. ALDH 활성은 Fig. 6(c) 에서보는바와같이발효전구기자열매추출물의경우 R f 값이 0.55 인 spot No. 2 에서 114.2% 로가장높게확인되었으며, 발효후구기자열매추출물의경우 R f 값이 0.36 인 spot No. F1 에서 120.6% 로가장높게확인되었다. 이러한결과를토대로발효후구기자열매추출물에서 ADH 및 ALDH 활성을증가시키는물질은발효전보다증가하였으며각각새롭게검출된 R f 값이 0.74 인 spot No. F4 와 R f 값이 0.36 인 spot No. F1 으로확인되어발효에따른물질의전환가능성을나타내었다. 3.3.2 Silica gel column chromatography Silica gel column chromatography 는발효전후구기자열매추출물로부터 ADH 및 ALDH 활성인자로추정되는물질을분리하기위해수행하였으며, 발효전후구기자열매추출물로부터각각 135 분획을분취하였다. 각분획의 ADH 활성증가 를확인한결과, Fig. 7(a) 에서보는바와같이발효전구기자열매추출물은 50 번 ~100 번분획까지 ADH 활성증가가확인되었으며, 그중 66 번분획의 ADH 활성증가가 129.6% 로확인되어가장높았다. 발효후구기자열매추출물은 50 번 ~110 번분획까지 ADH 활성증가가확인되었으며, 그중 68 번분획의 ADH 활성증가가 148.9% 로확인되어가장높았다. ALDH 활성증가는 Fig. 7(b) 에서보는바와같이발효전구기자열매추출물로부터용출된 100 번 ~133 번분획과발효후구기자열매추출물로부터용출된 100 번 ~134 번분획에서확인되었다. 발효전구기자열매추출물로부터용출된 128 번분획이 134.1% 로확인되어가장높은 ALDH 활성증가를나타내었으며, 발효후구기자열매추출물로부터용출된 128 번분획이 148.1% 로확인되어가장높은 ALDH 활성증가를나타내었다. 3.3.3. HPLC HPLC의분석은발효전후구기자열매추출물의 silica gel column chromatography를통해분리한 ADH 및 ALDH 활성의증가가가장높은분획으로수행하였다. HPLC의분석파장을결정하기위해각분획의흡수파장은 UV-vis spectrophotometer를이용하여 200~500 nm에서확인하였다. 그결과, Fig. 8에서보는바와같이발효전후구기자열매추출물의 ADH 및 ALDH 활성의증가가가장높은분획은모두 245 nm에서최대흡수를보였다. 따라서발효전후구기자열매의 ADH 및 ALDH 활성증가가높은분획은각각 10 mg/ml의농도로조정하여 HPLC에 10 µl를주입후최대흡수파장인 245 nm에서분석하였다. 발효전후구기자열매추출물의 ADH 활성증가가가장높은분획은발효전이 66번분획, 발효후가 68번분획으로확인되어 HPLC를통해분석하였다. 분석한결과, Fig. 9(a) 에서보는바와같이발효전구기자열매추출물의 66번분획은 R t 13.452분에하나의 peak가확인되었으며, Fig. 9(b) 에서보는바와같이발효후구기자열매추출물의 68번분획은 R t 11.938분, R t 13.014분, R t 22.072분과
140 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(2): 134-143 (2016) Fig. 6. ADH and ALDH activities of spots by TLC analysis of LE and FLE. TLC analysis (a) was performed on aluminium plates precoated with silica gel 60F 254 as the stationary phase using CH 2 Cl 2 - C 2 H 5 OH - H 2 O (3:5:2) as mobile phase. 5 µl of LE (5 mg/ml) and FLE (5 mg/ml) were spotted at the base line of TLC plate. The spots were visualized with ultraviolet lamp at 365 nm. Each spot was collected to measure ADH (b) and ALDH (c) activities. The percentage of ADH and ALDH activities was defined relative to the activity of standard enzyme (control). Fig. 7. ADH (a) and ALDH (b) activities of fractions by silica gel column chromatography of LE and FLE. Each fraction was concentrated to 10 mg/ml. ADH activity was high on fraction number 60~80. ALDH activity was high on fraction number 110~132. R t 28.842 분에 peak 가확인되었다. Fig. 9(c) 에서보는바와같이대조구인 control 을 100% 로하였을때발효전 R t 13.452 분 peak 의 ADH 활성은 127% 로확인되었으며, 발효후구기자열매추출물로부터확인된각 peak 의 ADH 활성은 R t 11.938 분의 peak 가 110.6%, R t 13.014 분의 peak 가 134.1%, R t 22.072 분의 peak 가 108.1%, R t 28.842 분의 peak 가 101.3% 로확인되 었다. 발효후구기자열매추출물의 68 번분획으로부터확인된 R t 13.014 분 peak 의물질은발효전구기자열매추출물에서분리한 ADH 활성인자추정물질과동일한물질로사료되며, 새롭게검출된 R t 11.938 분, R t 22.072 분과 R t 28.842 분 peak 는발효에따른생물전환으로생성된새로운물질로사료된다.
발효전후구기자열매추출물의 ADH 및 ALDH 활성인자분리및특성 141 Fig. 8. UV-visible spectral analysis of ADH and ALDH activator fractions by silica gel column chromatography of LE and FLE. 발효전후구기자열매추출물의 ALDH 활성증가가가장높은분획은발효전후모두 128 번분획으로확인되어 HPLC 를통해분석하였다. 분석한결과는 Fig. 10(a) 와 (b) 에서보는바와같이발효전구기자열매추출물의 128 번분획으로부터 R t 15.037 분, 16.046 분, 17.072 분, 23.056 분과 30.447 분의 peak 가확인되었으며, 발효후구기자열매추출물의 128 번분획으로부터 R t 14.859 분, 33.465 분과 35.640 분의 peak 가확인되었다. 각 peak 의 ALDH 활성은 Fig. 10(c) 에서보는바와같이대조구인 control 을 100% 로하였을때발효전 R t 16.046 분의 peak 가 122.3%, 발효후 R t 35.640 분의 peak 가 130% 로 ALDH 활성의증가가확인되어발효전후구기자열매추출물에서분리한 ALDH 활성인자추정물질은다른물질로사료된다. 발효구기자열매추출물에서분리한 ADH 및 ALDH 활성인자추정물질은 NMR, MS 등의분광학적분석기법을이용하여추후규명하여새로운물질생성여부에대한연구를수행하고자한다. 4. CONCLUSION 본연구에서는구기자열매추출물의발효를통해 ADH 및 ALDH 의활성을증대시키고, 각효소의활성을증대시키는기능을가진활성인자 (activator) 로추정되는물질을확인하고자하였다. 구기자열매는열수추출을하였을때 ADH 및 ALDH 활성증가가가장높게확인되었다. 복합배양은단일배양시높은 ADH 활성증가를보였던 B. subtilis subsp. subtilis 와높은 ALDH 활성증가를보였던 S. cerevisiae IFO 2376 을이용하여복합배양한후 ADH 와 ALDH 활성의증가를증대시키기위해수행하였다. 그결과, 시료미첨가대조군으로서 control 을 100% 와비교하였을때 YM 배지에서 B. subtilis subsp. subtilis 와 S. cerevisiae IFO 2376 을 7 일간발효한구기자열매추출물은발효전에비해 ADH 활성이약 28%, ALDH 활성이약 23% 증가하였다. TLC 분석을한결과, ADH 활성은발효전후구기자열매추출물모두 R f 값이 0.68 인 spot 에서 Fig. 9. ADH activity of isolated fraction according to retention time (R t ) by HPLC from fractions. HPLC analysis of fraction number 66 from LE (a) and fraction number 68 (b) form FLE was performed using a HAlsil C 18 5 micron (150 4.6 mm) column. The mobile phase was consisted of methanol - water (6 : 4, v/v). The flow rate was set to 0.8 ml/min. The injection volume was 10 µl (10 mg/ ml) and detection wavelength was set at 245 nm. Each fraction was used for ADH activity (c). The percentage of ADH activity was defined relative to the activity of standard enzyme (control). 각각약 128%, 132.4% 로확인되었으며, ALDH 활성은발효전구기자열매추출물의경우 R f 값이 0.55 인 spot 에서 120.2%, 발효후 R f 값이 0.36 인 spot 에서 126.6% 로확인되었다. 발효전후구기자열매추출물로부터 ADH 및 ALDH 활성인자로추정되는물질을분리하기위해 silica gel column chromatography 를수행한결과, 발효전구기자열매추출물로부터용출된분획의 ADH 활성은 66 번이약 133% 로가장높았으며, ALDH 활성은 128 번분획이약 130% 로가장높게확인되었다. 발효후구기자열매추출물의 ADH 활성은 68 번이약 150% 로가장높았으며, ALDH 활성은 128 번분획이약 148% 로가장높게확인되었다. Silica gel column chromatography 를통해분리한분획중 ADH 및 ALDH 활성의증가가가장
142 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(2): 134-143 (2016) 구기자열매추출물의발효하였을때 ADH 및 ALDH 활성을증대시키는기능을가진활성인자 (activator) 로추정되는물질의생산이추정되었다. REFERENCES Fig. 10. ALDH activity of isolated fraction according to retention time (R t ) by HPLC from fractions. HPLC analysis of fraction number 128 from LE (a) and fraction number 128 form FLE (b) was performed using a HAlsil C 18 5 micron (150 4.6 mm) column. The mobile phase was consisted of methanol - water (6 : 4, v/v). The flow rate was set to 0.8 ml/min. The injection volume was 10 µl (10 mg/ml) and detection wavelength was set at 245 nm. Each fraction was used for ALDH activity (c). The percentage of ALDH activity was defined relative to the activity of standard enzyme (control). 높은분획을 HPLC 를통해분석한결과, 발효전분획은 R t 13.452 분 peak 만검출되었으며, R t 13.452 분 peak 의 ADH 활성은 127% 로확인되었다. 발효후분획은발효전분획과동일한 R t 13.014 분 peak 가검출되었으며, R t 11.938 분, R t 22.072 분과 R t 28.842 분 peak 가새롭게검출되었다. 각 peak 의 ADH 활성은 R t 11.938 분 peak 가 110.6%, R t 13.014 분 peak 가 134.1%, R t 22.072 분 peak 가 108.1%, R t 28.842 분 peak 가 101.3% 로확인되었다. 발효전후구기자열매추출물의 ALDH 활성증가가가장높은분획을분석한결과, 발효전분획은 R t 16.307 분의 peak 에서 ALDH 활성증가가확인되었으며, 발효후분획은 R t 36.640 분의 peak 에서 ALDH 활성의증가가확인되었다. B. subtilis subsp. subtilis 와 S. cerevisiae IFO 2376 을이용하여 1. Ministry of health and welfare, and centers for disease control and prevention (2014) Korea health statistics 2013: Korea national health and nutrition examination survey (KNHANES VI-1). Ministry of health and welfare. pp. 24-25. 2. Tsukamoto, S., T. Muto, T. Nagoya, M. Shimamura, M. Satio, and H. Tainaka (1989) Determination of ethanol, acetaldehyde and acetate in blood and urine during alcohol oxidation in man. Alcohol Alcoholism 24: 101-108. 3. Lieber, C. S. (1994) Alcohol and the liver: update. Gastroenterology 106: 1085-1090. 4. Bode, C., V. Kugler, and J. C. Bode (1987) Endotoxemia in patients with alcoholic and non-alcoholic cirrhosis and in subjects with no evidence of chronic liver disease following acute alcohol excess. J. Hepatol. 4: 8-14. 5. Setshedi, M., J. R. Wands, and S. M. Monte (2010) Acetaldehyde adducts in alcoholic liver disease. Oxid. Med. Cell. Longev. 3: 178-185. 6. Moore, P. A. and W. H. Patrick (1987) Effect of zinc deficiency on alcohol dehydrogenase activity and nutrient uptake in rice. Agron. J. 80: 882-885. 7. Cha, J. Y., H. J. Jung, J. J. Jeong, H. J. Yang, Y. T. Kim, and Y. S. Lee (2009) Effects of amino acids on the activities of alcohol metabolizing enzyme alcohol dehydrogenase (ADH) and acetaldehyde dehydrogenase (ALDH). J. Life Science 19: 1321-1327. 8. Yin, M., K. Ikejima, G. E. Arteel, V. Seabra, B. U. Bradford, H. Kono, I. Rusyn, and R. G. Thurman (1998) Glycine accelerates recovery from alcohol-induced liver injury. J. Pharacol. Exp. Ther. 286: 1014-1019. 9. Lee, J. H., N. K. Kim, D. Y. Lee, and C. H. Lee (1999) Protective effect of selscted amino acids and food extracts on ethanol toxicity determent in rat liver. Kor. J. Food. Sci. Technol. 31: 802-808. 10. Kang, B. K., S. T. Jung, and S. J. Kim (2002) Effects of vegetable extracts by solvent separation on alcohol dehydrogenase activity from Saccharomyces cerevisiae. Kor. J. Food. Sci. Technol. 34: 244-248. 11. Park, Y. J., M. H. Kim, and S. J. Bae (1992) Enhancement of anticarcinogenic effect by combination of Lycii fructus with vitamin C. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 31: 143-148. 12. Na, Y. G. and K. H. Kim (1987) Effect of Atractylis Rhizoma and Lycii fructus on cell-mediated and humoral immune response in mice. K. H. Univ. O. Med. J. 10: 579-587. 13. Kang, K. I., J. Y. Jung, K. H. Koh, and C. H. Lee (2006) Hepatoprotective effects of Lycium chinense Mill fruit extracts and fresh fruit juice. Kor. J. Food Sci. Technol. 38: 99-103. 14. Shon, Y. G., K. H. Cho, Y. S. Kim, H. S. Bae, and K. S. Lee (2007) Experimental studies of the effects of Lycii fructus, Lycii cortex radicis and Lycii folium on hypertension, hyperglycemia and hy-
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