Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(6): 437-442 (2014) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2014.29.6.437 ISSN 1225-7117 / eissn 2288-8268 연구논문 알로에베라젤및껍질추출물의생리활성평가 조은혜 1, 김소영 1, 방순일 1,2, 김동청 3, 인만진 3, 채희정 1,2 * Biological Activity of Aloe Vera Gel and Skin Extracts Eunhye Cho 1, Soyoung Kim 1, Soonil Bang 1,2, Dong Chung Kim 3, Man-Jin In 3, and Hee Jeong Chae 1,2 * Received: 9 June 2014 / Accepted: 12 December 2014 2014 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: In vitro biological activities of Aloe vera gel and skin extracts were evaluated. Total polyphenol contents of Aloe vera skin were measured 41.12 mg/g. DPPH radical scavenging activity of Aloe vera skin-70% EtOH extract, Aloe vera skin-water extract, Aloe vera gel-70% EtOH extract and Aloe vera gel-water extract were 55%, 38%, 11% and 10%, respectively. In addition, 70% EtOH extract and water extract were compared with respect to SOD-like antioxidant activity of Aloe vera-70% EtOH extract has higher activity than Aloe vera water extract. Tyrosinase inhibition rate of Aloe vera gel extract was higher than Aloe vera skin extract. Alcohol dehydrogenase (ADH) and Acetaldehyde dehydrogenase (ALDH) relative percentage activity of Aloe vera gel extract were 126% and 216%, respectively. It was suggested that Aloe vera gel and skin extracts could be used as a functional biomaterial for functional food and cosmetics. Keywords: Aloe vera, Aloe vera gel and skin extracts, DPPH radical scavenging activity, ALDH relative percentage activity 1 내추럴초이스 ( 주 ) 1 Research & Development, Natural Choice Co., Ltd, Asan 336-795, Korea 2 호서대학교식품공학과 2 Department of Food Science and Technology, Hoseo University, Asan 336-795, Korea Tel: +82-41-533-5642, Fax: +82-41-534-5642 e-mail: hjchae@hoseo.edu 3 청운대학교식품영양학과 3 Department of Human Nutrition and Food Science, Chungwoon University, Hongseong 350-701, Korea 1. INTRODUCTION 알로에 (aloe) 는열대지방에서식하는백합과 (Liliaceae 계 ) 의알로에속 (Aloineae) 에속하는식물로 [1-3], 약 500 종이상이알려져있으나전세계적으로식용및약용으로사용되는것은 6~7 종에불과하다. 식용알로에는미국의폴로리다와텍사스, 뉴멕시코를중심으로대량재배되는알로에베라, 일본구주지방에서자생하는아보레센스, 미국폴로리다와하와이에서자생되는사포나리아등이있다. 약용알로에는남아프리카의스코트라섬을중심으로자생하는스코트라알로에와동아프리카케이프타운에자생하는알로에페록스 (Aloe ferox) 등이있다. 국내에서는 1976 년부터알로에베라와아보레센스두종류가제주도등지에서재배되고있다 [4]. 알로에는지방산, 유기산, 플라보노이드등 200 여가지의화합물을함유되어있다고알려져있으며, 당단백, 다당체등의저분자물질인안트라퀴논 (anthraquinone) 류, 안트론 (anthrone) 류, 크로몬 (chromone) 류, 피론 (pyrone) 류, 아미노산, 비타민과미네랄등의성분들이포함되어있다고알려져있다 [5-7]. 알로에잎에서압착한액에함유되는강한완화작용 ( 변비완화작용 ) 을나타내는안트라퀴논계 ( 알로인, 알로에이모딘및이소발바로인 ) 물질을주체로한것이약전알로에이다. 의약품과식품으로구분짓는지표물질인알로인은알로에의쓰고떫은맛을내는성분으로 1~5% 가함유되어있다 [8]. 알로인은알로에의황색수액층에대부분이존재하는데, 항균작용이있다고알려져있다. 그리고알로에의안트라퀴논류와폴리페놀물질들은대부분수산기를가지고있어이에의한항산화작용이기대되는데최근연구에의하면알로인의페놀산에스터들도매우강력한항산화작용을갖는것으로알려져있다 [9]. 그리고알로에베라로부터분리된당단
438 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(6): 437-442 (2014) 백인 NY 945 가히스타민등의매개체분비를억제하며호산구의조직내침윤을억제함으로써항알레르기효과를나타낸다고보고되었다 [10]. 알로에로부터추출한단일물질인 alprogen 은 IgE 항체에결합함으로써알러지과민반응을억제한다는연구도보고되어있다 [11]. 그밖에알로에젤추출물은섬유모세포의성장을촉진시키고재생조직의탄력성을증가시키며콜라겐분해및재생을촉진시킨다고알려져있다 [12]. 피부에발랐을때도자외선에대한보호작용이있는것으로알려졌는데이는대식세포를활성화시켜콜라겐 (collagen) 생합성을증가시키고랑게르한스 (Langerhans) 세포의기능을항진시키는것으로보인다 [13]. 알로에는최근국내많은연구를통해그효능이입증되었으나알로에로부터추출한단일성분에관한연구가대부분이어서알로에추출물에대한생리활성규명이충분하지않다. 또한주로알로에의껍질을제거한알로에젤성분을중심으로연구가이루어져있어껍질에대한약리효과에대한연구가미비한상황이다. 이에본연구에서는이미효능이입증된단일물질이아닌알로에베라껍질과젤의추출물이갖는생리활성을확인하고자하였다. 2. MATERIALS AND METHOD 2.1. 재료및시약본연구에서사용한알로에는국내에서식용으로사용되고있는거제산알로에베라이다. 알로에베라 ( 거제영농조합법인, 거제, 한국 ) 를추출하기위하여증류수, 70% 에탄올 ( 한국알콜, 울산, 한국 ) 을사용하였다. 생리활성분석을위해사용된 Folin-Ciocalteu's phenol reagent와 ursolic acid, ascorbic acid, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), N-succinyl-Ala- Ala-Ala-p-nitroanilide (SANA), elastase, collagenase, 4-phenylazobenzyl-oxycarbonyl-pro-leu-gly-pro-d-ar는 Sigma사 (Louis, MO, USA) 의제품을구입하여사용하였다. 그밖의모든시약은 1급이상의것을사용하였다. 2.2. 알로에베라추출물의제조알로에베라잎의부착토양및기타부착물을흐르는물로 2 회세척하여제거하였고, 알로에젤과껍질을분리하여분쇄한후 20 mesh 로체질하여알로에의입도를균일하게하였다. 알로에젤과껍질을진탕항온수조에서각각증류수 (distilled water, DW) 와 70%(v/v) 에탄올을추출용매로 70 o C 의온도와 110 rpm 의속도로진탕교반하면서 4 시간동안추출한후종이여과지 (Whatman No. 2, Whatman, Piscataway, New jersey, USA) 를이용하여여제를분리하였다. 여과한추출액을동결건조하여분말화한후기능성평가의재료로사용하였다. 2.3. 총폴리페놀함량측정총폴리페놀함량은 Folin-Denis 법 [14] 으로측정하였다. 추출하여건조된알로에베라추출물을농도별로희석하여시 료희석액 0.1 ml에 Folin-ciocalteu's 50 µl를첨가하여혼합한후 4분간실온에서반응시킨다음, 20% sodium carbonate 무수포화용액 1.5 ml를첨가하여 2분간반응시키고 microplate reader (VERSAmax, Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA) 를이용하여 760 nm에서흡광도를측정하였다. 총폴리페놀함량은 chlorogenic acid를이용하여작성한표준곡선으로부터산출하였다. 실험결과는 3회반복측정하여함량을나타내었다. 2.4. DPPH radical 소거능측정 DPPH radical 소거능은 Heo 등의방법 [15] 에따라메탄올 0.4 mm 의농도로용해한 DPPH 용액 160 µl 와시료 40 µl 를첨가하여암소에서 30 분간방치하고반응시킨다음 microplate reader 를이용하여 515 nm 에서흡광도를측정하였다. 2.5. SOD 유사활성측정 SOD 유사활성측정은 Lee 등의방법 [16] 에따라 Tris-HCl 완충용액 (ph 8.5) 120 µl 에 40 µl 의시료와 7.2 mm pyrogallol 40 µl 를가하여 25 에서 10 분간반응시킨후 420 nm 에서흡광도를측정하였다. 2.6. Elastase 저해능측정 Elastase 저해능측정은 Hong 등의방법 [17] 을응용하여 Tris- HCl 완충용액 (ph 8) 140 µl 에 20 µl 의시료와 2 mm SANA 20 µl 를가하여 25 에서 10 분간정치시킨후 20 µl 의 elastase (0.18 unit) 을가하여다시 37 o C 에서 15 분간반응시킨다음 410 nm 에서흡광도를측정하였다. 2.7. 탄닌함량측정탄닌함량은 Folin-Denis 법 [14] 을응용하여시료 1 ml 에 95% ethanol 1 ml 와증류수 5 ml 을혼합한후, 5% sodium carbonate 무수포화용액 1 ml 와 folin-ciocalteu's 0.5 ml 를첨가하여 1 시간실온에서반응시킨다음 725 nm 에서흡광도를측정하였다. 탄닌함량은 gallic acid 를이용하여작성한표준곡선으로부터산출하였다. 2.8. Tyrosinase 저해능측정 Tyrosianse 저해활성은 L-tyrosine 으로부터멜라닌생성과정에 tyrosinase 효소작용에의해생성되는 dihydroxyphenylalanine (DOPA) 생성물을측정하는방법으로측정하였다 [18]. Tyrosinase 저해활성은 0.5 M 인산완충용액 (ph 6.5) 0.5 ml 에 10 mm L-DOPA 를녹인기질액 0.2 ml 및시료용액 0.1 ml 의혼합액에 mushroom tyrosinase (110 U/mL) 0.2 ml 를첨가하여 25 o C 에서 2 분간반응시킨다음반응액중에생성된 dopachrome 을 475 nm 에서측정하였다. 2.9. 알콜대사활성 2.9.1. Alcohol dehydrogenase(adh) 효소활성측정알콜대사활성을측정하기위해서 alcohol dehydrogenase 법
알로에베라젤및껍질추출물의생리활성평가 439 [19] 을이용하였다. 기질인에탄올이조효소 β-nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) 의존재하에서대사되면서생성되는 NADH 양을 340 nm 에서흡광도를측정하여 ADH 활성을측정하였다. 우선 50 mm sodium pyrophosphate 완충액 (ph 8.8) 1.3 ml 에 15 mm β-nad 1.5 ml 씩혼합한후 95% 에탄올 0.1 ml 과시료를농도별로 0.1 ml 첨가한후 25 로예열된항온수조에넣어온도를유지시켜주었다. 이반응액에 0.1% bovine serum albumin (BSA, ph 7.5) 에녹인 alcohol dehydrogenase 용액 (ADH, 0.75 U/mL) 0.1 ml 를신속하게혼합한다음분광광도계로 340 nm 에서 5 분간흡광도를측정하였다. 대조군에서 ADH 대신 0.1% bovine serum albumin 을첨가하여흡광도를측정하였다. 2.9.2. Acetaldehyde dehydrogenase(aldh) 효소활성측정 ALDH 의활성측정은 Tottmar 의방법 [20] 을변형하여측정하였다. 즉, 기질인 acetaldehyde 에서 acetate 를생성하는조효소 NAD 의존재하에서대사되면서생성되는 NADH 양을 340 nm 에서흡광도를측정하여 ALDH 의활성을측정하였다. 1 M Tris-HCl 완충용액 (ph 8.0) 100 µl 에 20 mm β-nad 를 20 µl 씩혼합한후 100 mm acetaldehyde 10 µl, 3 M KCl 20 µl, 1 M 2-mercaptoethanol 10 µl 및농도별시료 20 µl 를모두첨가하였다. 이반응액을 37 o C 로예열된배양기에넣어 2 분간온도를유지시켜주고 0.02% BSA (ph 8.0) 에녹인 ALDH 용액 (ALDH, 0.5 unit/ml) 20 µl 을신속하게혼합한다음분광광도계로 340 nm 에서 5 분간흡광도를측정하였다. 대조군에는 ALDH 대신 0.02% BSA 을첨가하여흡광도를측정하였다. 2.10. 통계처리각실험군간의비교분석은 SPSS 14.01 프로그램 (Version 14.01, SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) 을이용하여 ANOVA 분석을실시한후 α=0.05 에서 Duncan's multiple range test 로유의성을검증하였다. 있다 [21]. Table 1 에서보는바와같이총폴리페놀함량은물추출물의경우알로에베라껍질, 알로에베라젤의순으로존재하였으며, 그함량은각각 38.81 mg/g 과 10.49 mg/g 로나타났다. 70% 에탄올추출물의경우에서도알로에베라껍질, 알로에베라젤의순으로측정되었으며, 각각의함량은 41.12 mg/g 과 15.38 mg/g 로나타났다. 이와같이알로에베라젤보다알로에베라껍질이 2.5~3 배높은총폴리페놀함량을갖는것으로나타났다. 알로에의생리적활성을나타내는화합물중폴리페놀류의화합물들이대개 hydroxyl group 을갖고있으며이에의한항산화효과에대한연구 [22] 가보고된바있다. 또한알로에베라껍질이알로에베라젤의항산화활성에비해상대적으로높은억제율을보인것은식물체추출물의항산화활성이페놀류나플라보노이드물질에기인하여나타내는것으로볼때 [23,24], 이에함유된높은총폴리페놀함량에기인된것으로판단된다. 알로에의폴리페놀화합물은활성산소나히드록시라디칼 (hydroxyl radical) 에대한소거작용을한다고보고 [25] 된바있다. 알로에베라젤뿐만아니라껍질에서도폴리페놀류에의한항산화활성을기대할수있음을확인하였다. DPPH radical 은안정한 free radical 로다른원자및분자로부터전자나양성자를받아들여안정한분자로변하는성질이있다. 이러한 DPPH radical 을이용하여알로에추출물의 DPPH 에대한소거활성을여러농도에서분석한활성을 Fig. 1 에나타내었다. 대조군인 ascorbic acid 는 120 µg/ml 의농도에서 90% 이상의활성을나타내었다. 시료는 1,000~4,000 µg/ml 의농도에서분석하였다. 실험결과알로에베라껍질 4,000 µg/ml 의 70% 에탄올추출물에서가장높은 55% 의 DPPH radical 소거능을나타내었으며, 알로에베라껍질의물추출물, 알로에베라젤의 70% 에탄올추출물및알로에 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 항산화활성추출용매에따른알로에베라추출물로서껍질추출물 (aloe skin extract) 과젤추출물 (aloe gel extract) 의항산화능을조사하기위하여, 증류수와 70% 에탄올로추출한알로에베라추출물 ( 껍질, 젤 ) 의총폴리페놀함량을분석하여 Table 1 에나타내었다. 천연항산화제의대부분은식물체의줄기, 잎, 꽃등에존재하며주로폴리페놀류의물질인것으로알려져 Fig. 1. DPPH radical scavenging activity of aloe gel and aloe skin. Table 1. Total polyphenol contents of aloe gel and aloe skin Aole gel Aloe skin DW 70% ethanol DW 70% ethanol Total polyphenol (mg/g) 10.49±0.06 d 15.38±0.45 c 38.81±0.12 b 41.12±0.47 a
440 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(6): 437-442 (2014) 하고있는지에대한평가로널리사용되고있다. 알로에베라추출물의 elastase 저해능을분석한결과, 알로에베라껍질의 70% 에탄올추출물의경우 2,000 µg/ml 의농도에서최대 19% 의 elastase 저해활성을보였으며, Choi [27] 의연구에따르면알로에베라에탄올추출물 10 µg/ml 농도에서약 22% 의 elastase 저해활성을보인다고보고한바있다. Fig. 2. SOD-like activity of aloe gel and aloe skin. 베라젤의물추출물의순으로높았으며각각 38%, 11% 및 10% 의 DPPH radical 소거능을나타내었다. 70% 에탄올을추출용매로사용하는것이물을사용하는것보다높은 DPPH 활성의추출물을확보하는데유리한것으로나타났다. 또한알로에베라젤보다껍질에서높은 DPPH 활성을나타냈다. 이러한결과는 Shin 등 [26] 이보고한바와같이손바닥선인장추출물 3,200 µg/ml 농도에서 44.57% 의활성을보이는것과유사한결과이다. 반면알로에베라젤의에탄올추출물이 100 µg/ml 의낮은농도에서 56% 이상의억제작용을나타냈다고보고한 Choi [27] 의연구결과와대비되는결과이다. 알로에추출물이 SOD 와유사한산화억제작용을갖는지알아보기위해 superoxide 와반응하여갈변물질을나타내는 pyrogallol 자동산화반응을측정하여 SOD 유사활성을측정하였다 [28,29]. Fig. 2 에서보는바와같이알로에베라껍질의 70% 에탄올추출물은 4,000 µg/ml 의농도에서 50% 의활성으로나타냈으며이값은대조군인 ascorbic acid 값은농도가 120 µg/ml 일때와유사한활성이었다. 또한알로에베라껍질의물추출물, 알로에베라젤의 70% 에탄올추출물및알로에베라젤의물추출물의순으로 SOD 유사활성이높았으며그값은각각 44%, 27% 및 16% 이었다. DPPH 소거능과마찬가지로 70% 에탄올로추출하는것이물로추출하는것보다높은 SOD 유사활성을보였고, 젤보다껍질이더높은활성을보였다. 3.2. Elastase 저해활성피부노화, 특히주름생성에는활성산소에의한작용과 matrix metalloproteinase (MMPs: collagenase, elastase 등 ) 에의한세포의매트릭스의파괴가주원인으로간주되고있다 [30]. Elastase 는진피내피부탄력을유지하는기질단백질인엘라스틴 (elastin), 피브로넥틱 (fibronectin) 을포함한다양한단백질을분해하며, 콜라겐 (collagen) 을분해할수있는비특이적가수분해효소이다 [31]. 또한피부의주름및탄력성소실등을유발한다. 따라서특정물질에의한 elastase 저해능의측정은그물질이피부의주름을개선하는효과를보유 3.3. 미백활성알로에베라추출물의미백활성을확인하기위하여알로에베라추출물의탄닌함량을분석하여 Table 2 에나타내었다. 천연미백제의대부분은탄닌류의물질인것으로알려져있다. 탄닌함량은물추출물의경우알로에베라젤, 알로에베라껍질의순으로존재하였으며, 그함량은각각 4.14 mg/g 과 1.14 mg/g 로나타났다. 70% 에탄올추출물의경우에서도알로에베라젤, 알로에베라껍질의순으로측정되었으며, 각각의함량은 3.91 mg/g 과 1.11 mg/g 로나타나알로에베라껍질보다알로에베라젤이 3.5~4 배높은탄닌함량을갖는것을확인할수있었다. 이는 tyrosinase 저해활성결과와유사한경향을나타내는것으로알로에의미백활성은탄닌함량에기인된것으로판단된다. 피부가자외선에노출되면멜라닌세포내의 tyrosine 이 tyrosinase 의생합성작용으로산화반응을일으켜멜라닌을생성하며과잉생산된멜라닌은피부에기미, 주근깨등의색소침착을일으키게된다 [32]. 멜라닌생성의효소인 tyrosinase 효소자체를억제하면미백효과를기대할수있다. 현재 tyrosinase 활성저해를통해 melanin 의합성을억제하는미백제에관한연구가활발히진행중에있는데미생물이나식물에서분리된 tyrosinase inhibitor 중에알로에에서추출된순수물질인 aloesin 역시 tyrosinase inhibitor 로서의활성이알려져있다. Tyrosinase 저해활성실험결과, Fig. 3 에서와같이알로에베라젤의물추출물의경우 2,000 µg/ml 의농도에서 28% 의 tyrosinase 저해활성을보였으며대조군인 kojic acid 와비교하여 62.5 µg/ml 의농도에서비슷한활성을나타내었다. 또한알로에베라젤의 70% 에탄올추출물, 알로에베라껍질의물추출물및알로에베라껍질의 70% 에탄올추출물의순으로각각 17%, 10% 및 4% 의 tyrosinase 저해활성을나타내었다. 알로에베라추출물의 tyrosinase 저해능은알로에베라껍질추출물보다알로에베라젤에서더높은미백활성이있음을확인할수있었다. Choi [27] 의연구에따르면알로에젤추출물 100 µg/ml 농도에서 28% 의멜라닌저해활성을나타냈다고보고하였다. 3.4. 알콜대사활성측정체내의알코올은대부분간에서 alcohol dehydrogenase (ADH) Table 2. Tannin contents of aloe gel and aloe skin Tannin (mg/g) Aole gel Aloe skin DW 70% ethanol DW 70% ethanol 4.14±0.28 a 1.14±0.03 b 3.91±0.35 a 1.11±0.04 b
알로에베라젤및껍질추출물의생리활성평가 441 Fig. 3. Tyrosinase inhibition rate of aloe gel and aloe skin. 데이용된다. 알콜대사효과는 100% 이상일때시료의활성이있다고판단할수있는데 Fig. 4 에서보는바와같이알로에베라젤의물추출물은 600 µg/ml 의농도에서 126% 정도의알콜대사효과가있었으나알로에베라젤의 70% 에탄올추출물, 알로에베라껍질의물추출물및알로에베라껍질의 70% 에탄올추출물에서 ADH 효소활성이없는것으로나타났다. 또한 ALDH 효소활성도알로에베라젤의물추출물 600 µg/ml 의농도에서 216% 정도의알콜대사효과가있었으나알로에베라젤의 70% 에탄올추출물, 알로에베라껍질의물추출물및알로에베라껍질의 70% 에탄올추출물에서는 ALDH 효소활성이없는것으로나타났다. 본연구에서의시험결과에의하면알로에베라젤추출물에서알로에베라껍질추출물보다 ADH 활성이높은것으로나타났다. 또한물추출물이에탄올추추물보다높은 ADH 활성을보인것으로나타났다. Cheong 등 [34] 은알로에베라가에탄올대사에있어서크게영향을주지않는다고보고하였다. 반면 Sakai 등 [35] 은알로에젤물추출물이흰쥐에서 ethanol 대사를증가시킨다고보고하였다. 에탄올추출물보다물추출물에서높은활성이나타난것은물을용매로사용하여추출할경우알로에에함유된 quinone 유도체가다량추출되었기때문인것으로판단된다 [36]. 4. CONCLUSION Fig. 4. ADH and ALDH relative percentage of activity of aloe gel and aloe skin. 본연구에서는이미효능이입증된단일물질이아닌알로에베라껍질과젤의추출물이갖는생리활성을확인하였다. 총폴리페놀함량은알로에베라껍질에서 41.12 mg/g 으로가장높게나타났다. 항산화활성은알로에베라껍질 70% 에탄올추출물에서가장높은 55% 의 DPPH radical 소거능을나타내었으며, 알로에베라껍질의물추출물, 알로에베라젤의 70% 에탄올추출물및알로에베라젤의물추출물의순으로각각 38%, 11% 및 10% 의 DPPH radical 소거능을나타내었다. 또한, SOD 유사활성의경우도마찬가지로 70% 에탄올로추출하는것이물로추출하는것보다높은활성을나타내었다. 알로에베라추출물의 tyrosinase 저해능은알로에베라껍질추출물보다알로에베라젤부분에더효과적인활성이있음을확인할수있었다. 알로에베라젤의물추출물에서 ADH 활성은 126%, ALDH 활성은 216% 으로효과적이었다. 이상의결과로부터알로에베라껍질과젤추출물의항산화활성, 미백활성및알콜대사활성을확인할수있었으며소재에대한활용가능성을확인할수있었다. 와 aldehyde dehydrogenase (ALDH) 에의해산화되어 acetic aicd 로되고일부는뇨와 CO 2 로배출되어혈중농도가낮아진다 [33]. ADH 와 ALDH 효소는각각 acetaldehyde 와 acetate 를형성하며 acetate 는 acetyl-coa 로전환되어 TCA 회로를거쳐에너지를발생하거나콜레스테롤과지방을합성하는 Acknowledgements 본연구는 2012 년도거제알로에테마파크영농조합법인의지원을받아수행하였습니다.
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