세포치료제시험정보집 7 줄기세포치료제의 간세포분화능평가시험 2015. 4. 30. 식품의약품안전평가원 차세대줄기세포기반제제평가연구사업단
목차 1. 서론 --------------------------------------------- 1 2. 줄기세포의간세포분화능평가시고려사항 --------------- 2 3. 간세포분화능평가시험법 ----------------------------- 8 3.1. 분화지표를이용한분화능평가 ------------------------ 9 3.1.1. 간세포의형태학적특징관찰 ---------------------- 9 3.1.2. 간세포특이분화지표확인시험 --------------------- 14 3.2. 기능적활성을이용한분화능평가 --------------------- 25 3.2.1. ICG-uptake 시험 -------------------------------- 25 3.2.2. Urea 합성능시험 -------------------------------- 27 3.2.3. Glucose-6-phosphatase 활성시험 ----------------- 30 3.2.4. 간독성물질반응시험 (MTT 법 )---------------------- 32 4. 실제분석사례 ----------------------------------------- 34 참고문헌 ------------------------------------------ 43
이시험정보집은식품의약품안전처에서수행한줄기세포치료제심사평가기반연구사업단의세부과제인 줄기세포의분화능평가연구 ( 차의과학대학교김기진교수 ) 의연구결과를바탕으로, 전문가협의체의검토를거쳐마련되었다. 앞으로관련분야의과학기술발전에따라다른시험방법이사용될수있다. 여기에제시한내용은식품의약품안전처의정책이나심사방향과는다를수있음을밝힌다.
1. 서론 1) - 1 -
2. 줄기세포의간세포분화능평가시고려사항 - 2 -
년 등은 골수 및 지방조직에서 유래한 중간엽 줄기세포의 분화를 유도한 세포에서 알부민과 시토크롬 그리고 등과 같은 간세포 특이적인 유전자들이 발현됨을 정량 로 분석하여 간세포로의 분화능을 평가한 바 있다 그러나 여러 연구결과들을 통해 줄기세포로부터 간세포로 분화를 유도할 때 줄기세포의 기원 분화 유도 조건 원료 줄기세포 및 분화유도 후 얻어진 세포의 분화정도 등에 따라 분화지표의 발현 양상이 다양하게 나타나는 것이 보고되고 있다 그림 또한 각기 다른 분화기간과 배지조성을 이용한 분화 효율이 문제점으로 인식되고 있기도 하다 따라서 초창기의 간세포 분화 연구에서와 같이 소수의 지표 발현을 확인하는 것만으로는 분화된 세포가 간세포임을 입증하기는 어렵다는 것이 현재 학계의 인식이다 2006 Talens-Visconti (cytochrome), hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF-4a) RT-PCR 8).,,, 9),10)) ( 2)., 11),12).,. A. NDESM 배양 조건 B. HIM 배양 조건 그림 마우스 배아줄기세포로부터 간세포로의 분화과정 중 분화 지표의 발현 양상의 예 [ 2. mrna ] 그림 설명 마우스 배아줄기세포로부터 배양조건에서 분화를 유도한 경우와 배양조건에서 분화를 유도한 경우에 분화 시기에 따라 역전사 로 분화지표를 확인한 결과로 분화 유도 조건에 따라 표지자의 발현 양상에 차이가 존재한다 그림에 표기된 약어는 다음과 같다 16) : (B) (A) NDESM, HIM PCR(RT-PCR),.. NDESM = = non-differentiated hepatocyte cytochrome P450-3a, carboxykinase, amino nuclear transferase, TDO medium, β, factor-3 G6Pase Pou5f1 ES = = = POU AFP HIM = = hepatocyte α-fetoprotein, glucose-6-phosphatase, domain tryptophan class5-3 - ALB Pepck transcription 2,3-dioxygenase, inducing Liver = = factor = medium, albumin, HNF-3b Cyp3a = phosphoenolpyruvate 1, intact TAT mouse = tyrosine liver. EB =
,,,., - 4 -
,,, - 5 -
- 6 -
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3. 간세포분화능평가시험법 α - 8 -
3.1. 분화지표를이용한분화능평가 3.1.1. 간세포의형태학적특징관찰 - 9 -
(Condition media) - 10 -
μ [ 3. ] [ 3. ] - 11 -
[ 4. ] - 12 -
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3.1.2. 간세포특이분화지표확인시험 α - 14 -
AFP Albumin G6Pase TAT Anti-trypsin ABC G1/G2 [ 4. ] - 15 -
3.1.2.1. 유전자분석을위한 RNA 분리및 cdna 합성 - 16 -
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3.1.2.2. 역전사 PCR 방법 [ 5. ] - 18 -
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3.1.2.3. Western blot 방법 β ] - 20 -
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3.1.2.4. 면역형광염색법 [ 7. ] - 23 -
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3.2. 기능적활성을이용한분화능평가 3.2.1. ICG-uptake 시험. - 25 -
[ 5. ICG-uptake ] - 26 -
3.2.2. Urea 합성능 시험 가 목적. 인간은 체내에 단백질이나 아미노산을 저장할 수 없다 과잉의 단백질을 섭취할 경우 소화 흡수된 단백질로부터 생성된 과잉의 아미노산은 간으로 이동되며 일련의 반응을 거쳐 최종적으로 암모니아를 생성한다 독성이 있는 암모니아는 간세포에서 오르니틴 회로 로 알려져 있는 일련의 효소반응을 통해 독성이 낮은 로 전환된 후 간세포에서 분비되어 혈류를 타고 최종적으로는 소변으로 배출된다.,. (ornithine urea cycle),. 그림 합성 및 배출 모식도 그러므로 세포가 분비한 를 분석함으로써 분화 유도된 세포가 간세포로서의 암모니아 해독기능을 가지고 있는지 여부를 평가할 수 있다 본 정보집에서는 를 이용하여 배양액 중에 분비된 를 정량적으로 평가하는 방법을 소개하고자 한다 [, 6. Urea ] urea. ELISA urea. 나 시험재료. Quantichrom Urea assay kit (Bioassay systems, DIUR-500) Microplate Spectrophotometer (BiotTek, EpochR) - 27 -
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3.2.3. Glucose-6-phosphatase 활성시험. - 30 -
G6Pase : << [ 7. G6Pase ] - 31 -
3.2.4. 간독성물질반응시험 (MTT 법 ). - 32 -
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4. 실제 분석 사례17) 가 형태학적 관찰. 본 자료집에 제시된 이하 분석 자료들은 다양한 중간엽줄기세포로부터 다음의 과정으로 간세포로 분화를 유도하고 분화 전과 후를 비교한 것이다 그림,. ( 8) 그림 8. 실험에 사용된 간세포 분화 유도 과정 모식도] [ 분화를 유도한 후에는 세포의 형태학적 변화를 가장 기본적으로 확인할 수 있다. 그림 9. 분화 전후의 형태학적 변화] [ 그림 설명 : 는 분화 유도 후 a~g (a: AE-MSC, b: CP-MSCs, CV-MSC, 는 분화 유도 전 WJ-MSC, e: AD-MSC, f: BM-MSC, g: UCB-MSC), h - 34 - c: d: CP-MSC
. [ 10. ( PCR)] - 35 -
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줄기세포치료제의간세포분화능평가시험 발행일 : 2015년 4월 30일발행인 : 식품의약품안전평가원장왕진호편집위원장 : 의료제품연구부장서경원편집위원 : 첨단바이오제품과서수경, 류승렬, 김재옥, 이보연, 김병철, 박지원, 백정희, 최민정외부전문가차의과학대학교김기진가톨릭대학교권오주, 조미영한양대학교최동호차세대줄기세포기반제제평가연구사업단 발행부서 : 식품의약품안전평가원첨단바이오제품과 연락처 : 식품의약품안전평가원첨단바이오제품과전화번호 : 043) 719-4751~7 팩스번호 : 043) 719-4750