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- Appl. Chem. Eng., Vol. 23, No. 1, February 2012, 100-104 누룩으로부터분리한알긴산분해효소생산균주인 Erwinia tasmaniensis 의특성 김현지 이성목 김성구 * 이재화 신라대학교의생명과학대학생명공학과, * 부경대학교수산과학대학생물공학과 (2011 년 10 월 14 일접수, 2011 년 11 월 10 일심사, 2011 년 11 월 16 일채택 ) Characterization of Erwinia tasmaniensis Isolated from Nuruk Producing Alginate Lyase Hyun Ji Kim, Sung-Mok Lee, Sung-Koo Kim*, and Jae-Hwa Lee Department of Bioscience and Biotechnology, College of Medical and Life Science, Silla University, Busan 617-736, Korea *Department of Biotechnology, Pukyong National University, Busan 608-737, Korea (Received October 14, 2011; Revised November 10, 2011; Accepted November 16, 2011) 알긴산올리고당은생체에다양한생리활성효과를나타내는기능성식품의소재나고부가가치재료로서활용가능성이높아여러응용범위내에서사용될수있다. 알긴산은해조류의주요구성성분으로주로갈조류에많이존재한다. 해조류로부터다양하게활용이가능한알긴산올리고당을제조하기위해 Erwinia tasmaniensis 균주가생성하는효소를이용하여알긴산을효소적으로분해하고자하였다. 따라서본연구에서는 E. tasmaniensis 의최적배양조건과균주가생성해내는알긴산분해효소의성질및특성을알아보았다. 실험결과, 이균주의최적배양을위한배지내알긴산의최적농도는 1.0%, 최적시간은 36 h 이었으며, 알긴산분해효소의활성은알긴산이 1.0% 포함된배지에서 72 h 동안배양했을때가장높았다. 이효소의최적 ph 는 6.0, 최적온도는 20 로확인되었다. 또한효소의활성은 20 에서 60 min 까지지속됨을확인했다. Oligosaccharides production showed various biological activities in vivo like functional foods and industrial materials utilized available within many practical applications which have obtained from the degradation of alginate. Alginate is rich in the main component of seaweeds especially the brown algae. We investigated what degrading alginate from seaweeds to make alginate oligosaccharides can utilize in various fields using enzyme secreting Erwinia tasmaniensis. In this study, we observed an optimal culture condition of E. tasmaniensis, and characteristics of alginate lyase secreting E. tasmaniensis. These bacteria, E. tasmaniensis, were isolated from Nuruk. In this case, a suitable growth factor for E. tasmaniensis was culture it for 36 h in broth media on concentration of 1.0% (w/v) alginate. The enzyme showed the highest level of alginate lyase activity when cultured on broth media containing 1.0% (w/v) sodium alginate for 72 h. Optimal condition of ph, temperature and duration time for alginate lyase activity were found to be ph 6.0, 20 and 60 min, respectively. Keywords: alginate, alginate lyase, Erwinia tasmaniensis, oligosaccharide 1) 1. 서론 해조류내탄수화물의주요구성성분으로는 alginaic acid, laminaran 및 mannitol이있다. 이중해조류의주요구성성분은알긴산 (alginic acid) 으로특히갈조류에많이존재한다 [1]. 또한해조류는현재활발히연구되고있는전분질계와목질계바이오매스의문제점을극복하기위한대안으로주목을받고있다. 해조류는육상식물에비해단위면적당생산수율이높으며이산화탄소흡수능력이뛰어나환경친화적이자비식량계바이오매스로식량수급불균형문제를초래하지않는다. 특히우리나라는 3면이바다로이루어져있어재배가능한면적이넓고해조류양식기술및생산량측면에서세계 4위라는장점을지니고있다 [2]. 이러한해조류중에서도특히갈조류는홍조류와녹조류에비해성장이빠르고단위면적당생산성이높아새로운바이 교신저자 (e-mail: jhalee@silla.ac.kr) 오매스자원중매우유력한후보로각광받고있다. 갈조류내알긴산함량은해조의수확시기와종류, 부위등에따라차이가있으나보통 1 3월에가장높고 8 10월에가장낮으며건조중량기준으로 30 67% 를차지한다 [3,4]. 알긴산은갈조류세포벽의 40% 를차지하는겔특성을가진다당류이다. β-d-mannuronic acid와 α-l-guluronic acid가 polymannuronate 또는 polyguluronate 형태로결합된 homopolymer 형태또는두형태가혼합된 heteropolymer 형태가존재하며, homopolymer 형태와 heteropolymer 형태의구성비율에따라겔강도가다르게형성된다 [1, 5,6]. 알긴산은겔형성능뿐만아니라고점성, 필름형성능등의특성이있어식품첨가제, 의약품소재및기능성식품소재로사용되며, 혈청및간장지질의콜레스테롤저하, 지방세포분화억제, 체내중금속흡수제거, 세포내지방세포유전인자단백질인렙틴 (leptin) 함량감소등의우수한효과들이보고되고있다 [7,8]. 그러나상온이나알코올류가함유된용매에용해시키기어렵고농도증가에따른점성의증 100

누룩으로부터분리한알긴산분해효소생산균주인 Erwinia tasmaniensis 의특성 101 가로인해사용이제한적이다. 알긴산의이용도를높이기위한방법의하나로, 알긴산분해에의한저분자화를들수있다. 알긴산을저분자화하는방법으로물리화학적 [9-12] 또는효소적가수분해 [13-15] 를들수있다. 물리화학적가수분해는처리시간이짧고간단하지만산또는열처리를통해생성되는독성부산물의작용및중화시발생하는염등에의해영향을받을수있으며정제가어렵다는단점이있다. 반면효소적가수분해는물리화학적가수분해에비해비용이많이들고열에대한안전성및활성이약하며생산속도가느리다는단점이있으나목적으로하는올리고당생산에유리하고반응조건이온화하며다른부산물의생성을줄일수있다. 알긴산을가수분해하여생성되는알긴산의저분자형태인 polymannuronate와 polyguluronate는항균및항암작용, 항콜레스테롤및장내세균군집개선효과등다양한생체조절기능을나타낸다 [7]. 또유화능, 용해도및담즙산결합능을증가시키며, 혈청및간장의지질조성개선효과와비만방지효과그리고중금속등의유해한물질을흡착하는능력이뛰어나다 [16-18]. 따라서본연구에서는해조류로부터얻을수있는알긴산을저분자로가수분해하여조금더효율적으로활용하기위해누룩으로부터선별한알긴산분해효소를생산하는균주 Erwinia tasmaniensis의성장과이균주가생산하는알긴산분해효소의활성및안정성등을위한최적조건을확립하고자하였다. Figure 1. 16S rdna nucleotide sequence of E. tasmaniensis. 2. 실험 2.1. 균주의배양조건알긴산분해효소의활성을확인하기위해누룩으로부터분리된 E. tasmaniensis를이용하였다 [19]. 균주의동정은 16S rdna 염기서열을 ( 주 ) 마크로젠에의뢰하여결정하였으며 NCBI의 blast search를이용하여동정하였다. 균주의보관은 20% glycerol을첨가하여 -70 에서보관하였으며, shaking incubator에서 30, 150 rpm 조건으로 sodium alginate 1.0%, peptone 0.5% 가포함된배지에서 3일간전배양하여사용하였다. 2.2. 알긴산농도및배양시간에따른세포성장배지내알긴산농도에따른알긴산분해효소활성을알아보기위해전배양한균주를다양한농도의알긴산배지에접종하여세포성장및효소활성을측정하였다. 0.5% 의 peptone을함유한배지에 0.2 1.0% 까지다양한농도의알긴산이첨가된배지에서배양하였다. UV/ Vis spectrophotometer를이용하여 600 nm에서흡광도를측정하는것으로배양시간에따른세포성장을알아보았다. 2.3. 알긴산분해효소활성측정배양액을 14,000 rpm, 4, 5 min의조건으로원심분리하여균체를제거하고얻은상층액을조효소액으로사용하였으며, 1.0% sodium alginate를포함한 ph 6.0의 GTA buffer (3,3-dimethylglutaric acid, Tris(hydroxymethyl) aminomethane, 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol) 를기질용액으로하고, 알긴산가수분해에따른환원당생성량을 DNS법에따라측정하였다 [20]. GTA buffer는 3,3-dimethylglutaric acid 16.02 g/l, Tris(hydroxymethyl) aminomethane 12.11 g/l, 2- amino-2-methyl-1,3-propanediol 10.51 g/l를혼합하여 NaOH 또는 HCl을첨가하여목적으로하는 ph로맞추어사용하였다. 효소활성은 GTA buffer 500 µl에조효소액 250 µl를혼합하여 30 항온조에 서 30 min 동안반응시킨후 14,000 rpm, 4, 5 min 동안원심분리하여얻은상층액 500 µl에 2 ml DNS용액을가한후 100 에서 10 min 동안반응시켜 540 nm에서흡광도를측정하였다. 이때 blank 는항온조에서반응시키지않고바로 DNS를측정한것으로하여두시료의흡광도차이를효소의활성능으로간주하였다. 표준당으로 mannuronic acid을이용하여표준검량선을작성하였고 1 unit는 1 min 동안 1 µmol의환원당을생산하는효소량으로정의하였다. 실험결과는각각의조건에서최대활성을보인결과를 100% 로간주하고다른결과들을백분율로비교하는상대활성으로나타내었다. 2.4. ph에따른알긴산분해효소의활성다양한범위 (ph 5 9) 의 GTA buffer를이용하여 ph에따른알긴산분해효소의활성을측정하였다. 알긴산이포함된 GTA buffer에조효소액을첨가하여 30 에서 30 min 동안반응시킨후효소활성을측정하였다. 2.5. 온도에따른알긴산분해효소의활성및안정성 20 60 의온도에서효소의활성능측정을통해온도에따른알긴산분해효소의안정성을알아보았다. 알긴산이포함된 GTA buffer 에조효소액을첨가하여각각의온도에서반응시키면서 30 min 간격으로효소의활성을측정하였다. 3. 결과및고찰 3.1. 알긴산농도따른 E. tasmaniensis의성장누룩은일반적으로다양한균주의혼합으로이루어져있으며이러한군집은다양한가수분해균주및에탄올생산균주, 산발효균주등을포함하고있다. 따라서누룩에서알긴산분해활성을가진균주를분리하기위해 20 g/l의다시마에서열수추출한추출물을이용하여다시마배지를만들어 screening에사용하였다. 누룩을멸균수에 Appl. Chem. Eng., Vol. 23, No. 1, 2012

102 김현지 이성목 김성구 이재화 Figure 2. Effect of alginate concentration (%) on cell growth of E. tasmaniensis. Cells were cultured in alginate of various concentration (0.2 1.0%) and peptone 0.5% media at 30 and 150 rpm for 84 h. (a) 희석하여다시마배지에도말한후 30 배양기에서균주를배양하였다. 다시마배지에서총 4종의균주를분리하였으며이중 plate assay를통하여알긴산분해능을가진균주한종을선별하였다 [19]. 분리된균주의 16s rdna 염기서열은 1469 bp로결정되었으며, NCBI blast search로분석한결과 E. tasmaniensis로확인되었다 (Figure 1). Yonemoto, Uo 등의연구에서알긴산분해균의성장및알긴산분해능은배지내알긴산농도가 1.0% 까지는증가하다가알긴산의농도가 1.0% 이상이되면상대적으로배지의점성이높아지기때문에균체의성장및알긴산분해활성이급격히저해된다고보고하였다 [21,22]. 따라서본연구에서는배지내알긴산농도를 1.0% 이하의수준에서실험을진행하였다. Peptone 0.5%, sodium alginate 1.0% 의배지에서 3일간전배양한 E. tasmaniensis를서로다른농도 (0.2 1.0%) 의알긴산이포함된배지에각각접종하여알긴산농도에따른 E. tasmaniensis 의성장을 Figure 2로나타내었다. 세포성장은알긴산이 1.0% 포함된배지에서 36 h 배양했을때최대성장을보였으며이후점차감소하는것으로나타났다. 1.0% 이하의다른농도에서도각각의조건에서 36 48 h을기점으로최대의세포성장을보였다가점차세포성장이저하되는양상을보였다. 또한배지내알긴산농도가높아질수록세포성장역시유의적으로증가하는경향이나타났다. 그러나이러한세포성장의증가는 0.6% 농도까지급격히증가하는것으로나타났으며그이상의농도에서는증가량이크게감소하는것으로확인되었다. 이는 Yonemoto, Uo 등의연구결과에서와같이알긴산의높은점성이배지내의교반에문제를일으키기때문인것으로보인다 [21,22]. 따라서 E. tasmaniensis의배양에적합한알긴산의농도를 1.0% 로결정하고이후연구에서는알긴산농도 1.0% 의배지에배양한배양액을사용하여생산되는알긴산분해효소의물리적특성을확인하였다. 3.2. 알긴산농도에따른 E. tasmaniensis의알긴산분해효소활성누룩으로부터분리된 E. tasmaniensis는다시마를이용한해조류에탄올생산에서 Candida 속균주와의동시당화발효를통해에탄올생산효율을증가시키는것으로확인되었으며, Lee and Lee의연구에서 plate assay를통하여알긴산분해효소의활성이정성적으로확인되었다 [19]. 따라서효소의활성을정량적으로확인하고알긴산분해 (b) Figure 3. Effect of incubation time on the activity of extracellular alginate lyase from E. tasmaniensis. (a) Relative activities are shown as percentages of the enzyme activity observed at alginate 1.0%, peptone 0.5% media, 30 and 150 rpm for 84 h. (b) Relative activities are shown as percentages of the enzyme activity observed at alginate 1.0%, peptone 0.5% media, 30 and 150 rpm at 72 h. 를위한 E. tasmaniensis 효소활성의최적조건을확립하기위한실험을진행하였다. E. tasmaniensis의알긴산분해효소활성을확인한결과, 세포의최대성장에달하는시간이 36 48 h인것과는다르게효소의활성은모든조건에서 72 h일때가장높은것으로나타났다 (Figure 3(a)). 알긴산분해효소활성이최대로나타났던 72 h에서의상대적인효소활성은 Figure 3(b) 에나타나있다. 알긴산분해효소의활성은 48 h까지는거의나타나지않다가 60 72 h 사이에급격하게나타났다. 또한 0.2% 의알긴산배지에서효소활성이 43.6% 에서배지내알긴산농도가높아짐에따라알긴산분해효소활성또한유의적으로증가하여 1.0% 로배지내알긴산농도가높아졌을때약효소활성이약 2.3배까지증가하는것으로나타났다. 공업화학, 제 23 권제 1 호, 2012

누룩으로부터분리한알긴산분해효소생산균주인 Erwinia tasmaniensis 의특성 103 Figure 4. Effect of various initial ph on activity of extracellular alginate lyase from E. tasmaniensis. Cells were cultured in alginate 1.0% and peptone 0.5% media at 30 and 150 rpm. Used buffer was GTA buffer (ph 5 9). Relative activities are shown as percentages of the enzyme activity observed at 30 for 30 min. (a) 3.3. 알긴산분해활성에미치는 ph의영향각각의 ph에따른효소의활성을알아본결과는 Figure 4에나타내었다. 완충용액은 300 mm GTA buffer를사용하였다. 기존에알려진다른알긴산분해효소의활성은대부분 ph 7 9 사이의약알칼리조건에서최대활성을보이는것을나타났으며 [25-29], 약산성인 ph 6에서최대활성을보이는효소도있는것으로보고되어있다 [30]. 알긴산분해효소의활성이주로약알칼리에서최대인것은 ph 3 이하의산성조건에서알긴산이침전하는것과관련된것으로보인다. E. tasmaniensis를이용한실험결과약산성영역인 ph 5.0 6.0에서활성이크게나타났으며, 특히, ph 6.0에서가장높은활성을보였다. 한편, ph 7.0 이상의알칼리영역에서는알긴산분해효소의활성이현저히낮아지며, ph가알칼리영역으로올라갈수록활성은점차낮아지는것을확인했다. 또한, ph 6.0에서의효소활성을 100% 로봤을때 ph 5.0에서효소의활성은 93.4% 로크게차이가나지않는것에비해 ph 6.0과 ph 7.0간의활성이약 3배정도차이가나는것으로보아이효소는약산성에서효과적으로작용이가능하며효소활성에 ph의영향을많이받는것으로사료된다. 3.4. 알긴산분해활성및안정성에미치는온도의영향 Figure 5는 20 60 의다양한온도에따른 E. tasmaniensis 조효소액의알긴산분해활성및안정성을나타낸결과이다. 그결과비교적낮은온도인 20 에서가장활성이높았으며, 온도가높아질수록활성이낮아지는것을확인할수있었다 (Figure 5(a)). 이전에보고된알긴산분해효소활성에의하면 Vibrio와 Enterobacter 속균주및 B. licheniformis 등의균주는비교적저온인 25 30 에서효소활성이가장높은것으로나타났으며 [20,23,24], 특이적으로 Streptomyces sp. MET 0515는 70 의고온에서활성이가장높다고보고되어있다 [25]. 본연구에서도온도에대한효소의안정성을평가하기위해가장활성이뛰어났던 20 의조건에서조효소액을알긴산과반응하여 30 min 간격으로반응액을채취해시간에따른환원당변화를측정하여효소활성의변화를확인했다. 그결과, 0 60 min까지는안정적인효소활성을나타내다가 90 min에측정했을때효소활성이급격하게 (b) Figure 5. Effect of reaction temperature on activity of extracellular alginate lyase from E. tasmaniensis. Cells were cultured in alginate 1.0% and peptone 0.5% media at 30 and 150 rpm. Relative enzyme activities were obtained to observe at 1.0% alginate, 0.5% peptone media and 30 at 72 h. (a) Relative activities are shown as percentages of the enzyme activity observed at various temperature (20 60 ) for 30 min. (b) Relative activities are shown as percentages of the enzyme activity observed at 20 for 150 min. 감소하여 20% 정도의잔존활성이나타나는것을확인하였다 (Figure 5(b)). 따라서이효소는고온에민감한내열성이낮은효소라고생각된다. 열에대한효소의안정성은효소의활성이 35 37 의중온성에서가장활성이높다고하더라도각각의온도에대한안정성은 10 20 에서가장높고그이상의온도에서효소의활성이급격히떨어지는것으로보고되어있다 [27,28]. 4. 결론 본연구는여러범위에서다양하게이용되는알긴산올리고당을얻기위해알긴산분해효소를생산하는균주를이용한효소적방법에대해실험하였다. 누룩으로부터선별한균주 E. tasmaniensis가생산 Appl. Chem. Eng., Vol. 23, No. 1, 2012

104 김현지 이성목 김성구 이재화 해내는알긴산분해효소의활성, ph, 온도등의조건에따른영향및 안정성등을성장양상및환원당측정을통해알아보았으며, 이를통 해최적조건을확립하고자하였다. 누룩으로부터분리된균주 E. tasmaniensis 의배양조건중최적성장을위한배지내알긴산의최적 농도는 1.0% 였으며 36 h 동안배양했을때최대성장을보였다. 알긴 산분해효소생산조건을탐색한결과, 배지의알긴산농도가 1.0% 일 때활성이가장높았으며효소활성은배양한지 72 h 이되던시점에 최대의활성을나타냈다. 최적 ph 는 6.0, 활성이가장높게나타났던 온도는 20 로확인되었으며, 60 min 까지는효소의활성이지속되 다가이후로는급격하게저하됨을확인했다. 감 본연구는국토해양부소관해양생명공학기술개발사업의연구비 지원에의해수행되었습니다. 사 참고문헌 1. D. S. Lee, H. R. Kim, D. M. Cho, T. J. Nam, and J. H. Pyeun, J. Kor. Fish. Soc., 31, 1 (1998). 2. J. I. Park, H. C. Woo, and J. H. Lee, Korean Chem. Eng. Res., 46, 833 (2008). 3. S.-M. Lee, J.-H. Kim, H. Y. Cho, H. Joo, and J. H. Lee, J. Korean Ind. Eng. Chem., 20, 517 (2009). 4. M. O. Yoon, S. C. Lee, J. W. Rhim, and J. M. Kim, J Korean Soc Food Sci Mutr., 33, 747 (2004). 5. D. S. Joo, S. Y. Cho, and E. H. Lee, Kor. J. Biotechnol. Bioeng., 13, 477 (1998). 6. B. Hu, Q. Gong, Y. Wang, Y. Ma, J. Li, and W. Yu, Anaerobe., 12, 260 (2006). 7. J. H. Lee, M. J. Bae, Y. C. Kim, and S. W. Nam, Kor. J. Microbiol. Biotechnol., 37, 350 (2009). 8. J. H. Lee and E. Y. Lee, Kor. J. Life Sci., 13, 718 (2003). 9. H.-M. Chen, L. Zheng, and X.-J. Yan, Food Technol. Biotechnol., 43, 29 (2005). 10. S. J. Horn, I. M. Aasen, and K. Østgaard, J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 25, 249 (2009). 11. S.-L. Kim, W.-J. Kim, S.-Y. Lee, and S. M Byun, J. Korean Agric. Chem. Soc., 27, 139 (1984). 12. S.-K. Paik, H.-S. Yun, K.-H. Sa, I.-S. Kim, I.-K. Rhee, H.-D. Park, C.-B. Yu, and I. Jin, Kor. J. Microbiol. Biotechnol., 31, 63 (2003) 13. J.-Y. Kong, New Informations of Oligosaccharides, 359, Yelim media, Seoul (2007) 14. M.-K. Jang, O. H. Lee, K. H. Yoo, D.-G. Lee, and S. H. Lee, J. life. Sci., 17, 1601 (2007). 15. J.-Y. Kong, S.-K. Bae, S.-H. Hwang, S.-D. Ha, H.-T. Kim, S.-K. Kim, and B.-J. Kim, Kor. J. Biotechnol. Bioeng., 11, 37 (1996). 16. T. Suzuki, K. Nagai, Y. Toshie, T. Shirai, and T. Hirono, Nippon Suisan Gakkaishi., 59, 879 (1933). 17. D. S. Lee, T. J. Nam, and J. H. Pyeun, J. Kor. Fish Soc., 31, 309 (1998). 18. I. H. Kim, D. S. Lee, J. Y. Kwon, M. T. Kwon, and T. J. Nam, J. Kor. Fish Soc., 36, 568 (2003). 19. S.-M. Lee and J.-H. Lee, Bioresour. Technol., 102, 5962 (2011). 20. O. J. Kim, D.-G. Lee, S.-M. Lee, S. J. Lee, H. J. Do, H. J. Park, A. Kim, J.-H. Lee, and J.-M. Ha, Kor. J. Microbiol. Biotechnol., 38, 144 (2010). 21. Y. Yonemoto, K. Mutata, A. Kimura, H. Yamaguchi, and K. Okayama, J. Ferm Bioeng., 72, 152 (1991). 22. M. H. Uo, D. S. Joo, and S. Y. Cho, J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 35, 109 (2006). 23.S. Joo, S. Y. Cho, and E. H. Lee, Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 21, 207 (1993). 24. M. H. Uo, D. S. Joo, and S. Y. Cho, J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 35, 109 (2006). 25. H. K. Kim, J. C. Lee, N. H. Kang, S. H. Kim, J. G. Kim, and K. C. Chung, J. Life Sci., 17, 625 (2007). 26. Y.-O. Kim, G.-T. Kim, H.-K. Kim, D.-K. Kim, S.-H. Huh, and I.-S. Kim, J. Korean Fish. Soc., 29, 637 (1996). 27. D.-S. Joo, J.-S. Lee, J.-J. Park, S.-Y. Cho, C.-B. Ahn, and E.-H. Lee, Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 23, 432 (1995). 28. D.-S. Joo, S.-Y. Cho, and E.-H. Lee, J. Korean Soc. Food Nutr., 22, 240 (1993). 29. T. Kobayashi, K. Uchimura, M. Miyazaki, Y. Nogi, and K. Horikoshi, Extremophiles, 13, 121 (2009). 30. M. H. Uo, D. S. Joo, S. Y. Cho, and T. S. Min, J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 35, 231 (2006). 공업화학, 제 23 권제 1 호, 2012