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주이 어금
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1 Kor. J. Microbiol. Biotechnol. Vol. 37, No. 4, (2009) Alginate Lyase 생산균주 Pseudomonas sp. N 의분리및특성 이재형 1 배민지 2 김양춘 3 남수완 1,2 * 1 동의대학교바이오물질제어학과, 2 동의대학교생명공학과, 3 기장물산 ( 주 ) Identification and Characterization of Alginate Lyase Producing Pseudomonas sp. N Lee, Jae Hyung 1, Min Ji Bae 2, Yang-Choon Kim 3, and Soo-Wan Nam 1,2 *. 1 Department of Biomaterial Control, Dong-Eui University, Busan , Korea, 2 Department of Biotechnology & Bioengineering, Dong-Eui University, Busan , Korea, 3 Gijang Local Products Co., Ltd., Busan , Korea - A Gram-negative, alginate lyase-producing bacterium was isolated from the Haeundae Coast, Korea. The isolated strain N produced alginate lyase. The optimal temperature and ph for growth were found to be 30 o C and ph 8.0, respectively. This strain can be grown at the NaCl concentration of 0-7% (w/v). Analysis of 16S rdna sequence and physiological profiling indicated that the strain N belonged to Pseudomonas sp. The enzyme alginate lyase produced by Pseudomonas sp. N was partially purified by ultrafiltration (MWCO= 30 kda). The optimum ph and temperature for the activity of the purified enzyme were found to be 7.0 and 30 o C, respectively. The enzyme was stable at the ph range of and temperature range of o C. The total activity of alginate lyase produced was reached about 110 unit/l. Key words: Alginate lyase, Pseudomonas sp., 16S rdna, physiological reaction profiling 서 알긴산 (alginic acid) 은갈조류의세포벽구성다당류로건조중량의약 40% 에달하는것도있다고알려져있다. 알긴산은조류의주요구성성분으로주로갈조류에존재하고생산용갈조류에는곰피 (Ecklonia stolonifera) 와감태속 (Ecklonia) 미역속 (Undaria) 등이있다. 알긴산은해초산이라고도하며, 만뉴론산 (D-mannuronic acid) 과글루론산 (L-gluluronic acid) 이 β- 1, 4 결합으로이루어진이형다당류이다 [2, 7-9, 21]. 알긴산은혈청및간장지질의콜레스테롤농도를감소시키고, 지방세포분화억제효과와세포내지방세포유전인자단백질인렙틴 (leptin) 의함량을감소시키며, 체내중금속흡수제거효과, 젤형성능, 상처봉합제등의의약품소재및기능성식품소재로응용되는등, 알긴산의약학적, 식품적효능또한우수한것으로알려져있다 [11, 15, 19]. 만뉴론산과글루론산의중합으로되어있는거대분자인알긴산을폴리만뉴론산 (polymannuronate) 과폴리글루론산 (polyguluronate) 으로저분자화하면, 항암및항균작용, 면역증강, 장내세균군집개선효과, 항콜레스테롤효과, 기타다양한생체조절기능성이월등히높게나타나고있음이보고되고있다 [2, 5, 12, 15]. 하지만다당류인알긴산의분해의어려움및기존의분해방법은산또는염기가수분해방법을쓰기때문에정제에어 론 *Corresponding author Tel: , Fax: swnam@deu.ac.kr 려움이있었다. 알긴산분해효소를이용한방법으로최근신규미생물과효소를이용한방법등이국내외적으로보고되어 Alginovibrio aquatilis, Alteromonas sp., Pseudomonas aeruginosa, Vibrio sp. 등이있으나 [1, 3, 4, 6, 10, 13, 15, 16, 17, 20, 22, 24], 알긴산분해효소를고효율로생산하는미생물을분리하는연구보고는거의없는실정이거나미생물에서의알긴산분해효소활성이상대적으로낮은편이다. 이에본연구에서는알긴산분해효소를생산하는미생물을분리하기위해부산연안에서알긴산이풍부한미역에서식하는알긴산분해능이우수한세균을검색하고자하였으며, 분리한알긴산분해세균의분류학적위치와생육및알긴산분해효소의생산최적조건등을조사하여산업적응용의가능성을검토하고자하였다. 재료및방법 세균분리및배양배지부산해운대해안에서채취기통에미역고형물을바닷물속에정치후채취한샘플을 1/1000으로희석한후, 1차선별배지 (Alginate-Na 1.00%, Yeast extract 0.20%, NaCl 0.20%, K 2 HPO %, MgSO 4 7H 2 O 0.10%, KCI 0.10%, CaCl %) 로분리한후, 2차선별배지 ( 상층배지- Alginate-Na 1.00%, Bacto-Agar 2.00%, ph 7.5; 하층배지 -KH 2 PO %, K 2 HPO %, NaCl 2.00%, FeSO %, MgSO 4 7H 2 O 0.05%, KCI 0.05%, Bacto-Agar 2.00% ph 7.5) 에도말하여, 30 o C에서 3일간배양하여알긴산분해

2 ISOLATION OF ALGINATE LYASE PRODUCING BACTERIUM 351 미생물을분리하였다. 표현형적특성 (phenotypic characteristics) 조사미생물균주를배양배지에서 30 o C, 2 일동안배양한후, 주사전자현미경 (Scanning Electron Microscope) 을통해크기와길이를조사하였다. 현적법 (hanging-drop technique)[23] 으로광학현미경하에서균주의운동성 (motility) 을조사하였다. 영양배지 (Difco, U.S.A.) 에서각온도별 (4, 15, 23, 25, 28, 30, 37, 42 및 48 o C) 로 3 일간배양하여생장온도범위를조사하였다. NaCl 농도에따른성장효과를조사하기위해 0-10%(w/v) 의 NaCl 을포함하는 trypticase soy broth(difco, U.S.A.) 에서 30 o C 로 3 일간배양하였다. 또한각 ph(4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0) 의배양배지에서 3 일간배양하여생장 ph 범위를조사하였다. 탄소원의이용능력테스트는 Table 1 에기재된총 17 개의기질을포함하는 API 50CH 시스템을이용하여수행하였다. 우레아제 (urease) 활성은 Lanyi 의방법 [14] 에따라측정하였다. DNA 염기조성및 16S rdna 서열결정및계통수분석미생물균주의게노믹 DNA 의염기조성은 Tamaoka 등의방법 [25] 에따라결정하였다. 16S rdna 염기서열분석은균주로부터게노믹 DNA 를추출한후, 16S rdna sequencing 을통하여균주를동정하였다. 계통수 (phylogentic tree) 분석은 CLUSTAL W 프로그램을이용하여각 16S rdna 염기서열을배열하고, bootstrap analysis 를통해분석한후, TREEVIEW 프로그램으로계통수를조사하였다. 균주로부터알긴산분해효소활성측정균주의알긴산분해능을확인하기위한고체배지 (Alginate- Na 0.50%, Yeast extract 0.50%, K 2 HPO %, MgSO 4 7H 2 O 0.10%, KCl 0.10%, CaCl %, Agar 1.50%) 에서대조군으로 E. coli를 CPC(cetylpyridinium chloride) 10% 로알긴산분해능을확인하였다. 세포성장은흡광도가 0.5 이하가되도록배양액을희석한후분광광도계를이용하여 660 nm에서흡광도를측정하였다. 3일간배양한배양액으로부터한외여과 (ultrafiltration; MWCO=30 kda) 을통해부분정제하여알긴산분해효소활성을측정하였다. 알긴산분해효소활성은기질로써 0.25% alginate-na 0.9 ml에배양상등액 0.1 ml를첨가하여, 37 o C에서 1시간반응시킨후 DNS법 [18] 에의해흡광도 (550 nm) 를측정하여우론산으로 D-글루코론산생성량을측정하였다. 효소 1 unit는 1분에 1 µmole의환원당을생산하는효소량으로정의하였다. 후, 채취한샘플들로부터분리한균주로부터알긴산분해효소활성이가장좋은균주를선택하여조사하였다. 선택균주는광학현미경과그람염색에의해막대형 (rod) 의그람 - 음성균이었으며, 배지상에자라난콜로니는평평하고밝은노란색이었다. 전자현미경을통해확인한크기는직경이 µm 이고, 길이는 µm 이었다. 또한비운동성 (nonmotility) 이었고, 포자 (spore) 를형성하지않았다. 균주의최적생장온도는영양배지에서 30 o C 이었으며, 10 o C 이하또는 42 o C 이상에서는전혀생장하지않았다 (Fig. 1). 해양세균의경우일반적으로 NaCl 3% 내외에서최적생육조건이나, 분리한균주의생장을위한최적 NaCl 의농도는 0.5%(w/w) 인것으로조사되어해양에서분리하였지만전형적인해양세균은아니었으며, 8% 까지도생장은가능하나그이상의농도에서는생장하지않았다 (Fig. 2). 최적생장 ph 는 8 인것으로조사되었으며, ph 4 이하와 ph 10 이상에서는생장이억제되었다 (Fig. 3). 표현형적특성 (phenotypic characteristics) 분리한균주는생장을위한탄소및에너지원으로조사한기질에서 Table 1 과같은결과를얻었다. 또한, 아르기닌가수분해 (arginine hydrolase) 반응에양성반응을, 노바바이신 (novobiocin), 페니실린에는내성을가지며, 우레아제 (urease) 반응에서는음성으로나타났다. 분리한균주의대사는호기성으로조사되었다. 16S rdna 서열분석및 DNA 염기조성분리한균주의 16S rdna 염기서열을확보하기위하여 PCR 에의한 16S rdna 의 1530 bp 염기서열을 NCBI GenBank 데이터베이스의 BLASTN 을이용하여분석하였다 (Fig. 4). 그결과, 다양한 Pseudomonas 속미생물중에서도 결과및고찰 균주의분리및최적생장온도, ph, NaCl 농도부산해운대해안에서미역고형분을일주일동안정치 Fig. 1. Effect of temperature on the growth of Pseudomonas sp. N in growth medium.

3 352 LEE et al. Table 1. Biochemical reaction profiles of Pseudomonas sp. N by using API 50CH systems. Substract Pseudomonas sp. N Substract Pseudomonas sp. N D-Glucose + Arabinose - Pyruvate + Raffinose + Pullulan + Ribose + Sucrose + Salicin + Mannitol + Melibiose + Cellobiose + Melezitose + Trehalose + Sorbitol + Xylose + Lactose - Inulin + +, Positive reaction; -, negative reaction. Fig. 2. Effect of NaCl concentration (%) on cell growth and alginate lyase activity of Pseudomonas sp. N in growth medium at 30 o C and ph 7 (cell growth, alginate lyase activity [unit/l]). 은 95.6% 로조사되었다. 또한생화학적특성을비교시에도분리한균주는 Pseudomonas aeruginosa 종이아닌알긴산분해효소를생산하는신균주로조사되었다. 그외 DNA G+C 조성은 63.5% 로조사되었다. Fig. 3. Effect of various ph on cell growth and alginate lyase activity of Pseudomonas sp. N in growth medium at 30 o C and 2% NaCl (cell growth, alginate lyase activity [unit/l]). Pseudomonas flavescens B62 T, Pseudomonas straminea IAM 1598 T 와각각 97.3% 와 96.9% 의높은상동성을나타내어, 분리된균주의 16S rdna의염기서열은 Pseudomonas 속으로조사되었다. 이에분리된균주를 Pseudomonas sp. N7151-6라명명하였다. 또한계통수를통해 Pseudomonas 속에속한종들과비교하였다 (Fig. 5). 현재 Pseudomonas 속에서는학명으로인정된종으로는 Pseudomonas aeruginosa 에서알긴산분해효소가생성된다는것이보고되어있는데 [3, 4, 16], Pseudomonas aeruginosa는병원성균주로인식되어있어알긴산분해효소를산업적으로생산하기에는가능성이떨어지며, 분리된 Pseudomonas sp. N 균주와 Pseudomonas aeruginosa의 16S rdna 염기서열의상동성 알긴산분해효소의생산조건 Pseudomonas sp. N 에서알긴산분해효소생성의최적조건을조사한결과, 균주의배양시 ph 8 일때균주의성장이가장좋으나, ph 7 일때가장높은알긴산분해효소의활성을보여, 알긴산분해효소의최적발현 ph 의값은 7 로조사되었다 (Fig. 3). Pseudomonas sp. N 균주의성장은 NaCl 농도가 0.5% 일때가장높으나, 알긴산분해효소의생산은 2% 가가장높은활성을보였다 (Fig. 2). 이는해양환경조건하의갈조류에서분리되어최적성장조건과알긴산분해효소의활성정도가차이가있는것으로사료된다. 알긴산분해효소의활성이가장좋았던 ph 와 NaCl 의조건인 ph 7, NaCl 2% 의농도에서배양시 110 unit/l 로알긴산분해효소활성을나타내었다. 이는앞서보고된 Alginovibrio aquatilis 균주 [24] 로부터알긴산분해효소의최대활성인 2,360 unit/l 와비교시본연구에서분리된효소의활성은다소낮은편이었으나, 본연구에서는 3 일간배양한배지로부터알긴산분해효소를부분정제한효소의활성이다. Alginovibrio aquatilis 균주의경우배양후 5 일 (120 시간 ) 의배양액에대한활성이다. 따라서앞으로질소원과탄소원, 온도에따른알긴산분해효소에대한연구가뒷받침되고, 분리정제에대한연구가진행되어, 순도높은알긴산분해효소를추출할경우활성은더개선될것으로본다. 또한본균주에서분리된알긴산분해효소에의한만뉴론산과글루론산의생성비율에대한연구를수행하여 polyg 또는 polym 특이성효소인지에대한효소동정에대한연구를수행할예정이며, 더나아가알긴산분해유전자를클로닝하여대장균과같은숙주에적용할경우대량생산하여알긴산의저분자화에응용가능할것으로사료된다.

ISOLATION OF ALGINATE LYASE PRODUCING BACTERIUM 353 Fig. 4. 16S rdna nucleotide sequence of Pseudomonas sp. N7151-6. 알긴산분해효소를생산하는세균은해양생태계에서영양재순환에있어서중요한역할을한다.

4 ISOLATION OF ALGINATE LYASE PRODUCING BACTERIUM 353 Fig S rdna nucleotide sequence of Pseudomonas sp. N 알긴산분해효소를생산하는세균은해양생태계에서영양재순환에있어서중요한역할을한다. 그러나몇몇종에서만알긴산분해효소를생산하는해양세균에대한정보가있음으로인해알긴산분해효소를이용한식품학적, 약학적, 미용학적등의용도의적용이적은편이다. 본연구에의해동정된균주를이용하면해조류에포함된다당류인알긴산을효소적으로가수분해함으로써알긴산의저분자화를통해응용을할수있을것으로사료된다. 요 약 Fig. 5. Phylogenetic tree analysis of the strain N based on 16S rrna sequence with other members of Pseudomonas sp. 해운대연안에서그람음성균이면서알긴산분해효소를생산하는세균을분리하였다. 분리된 N 균주의성장을위한최적온도는 30 o C, 최적 ph 는 8.0 으로조사되었다. 또한 0-7%(w/v) NaCl 농도에서도성장가능하다. 16S rdna 염기서열분석과생화학적분석에의해이균주는 Pseudomonas 속

5 354 LEE et al. 으로동정되어 Pseudomonas sp. N 으로명명하였다. Pseudomonas sp. N 에서생산하는알긴산분해효소를한외여과 (ultrafilteration; MWCO=30 kda) 방법에의해부분정제하였다. 분리된효소의최적 ph 는 7.0 으로최적온도는 30 o C 로조사되었다. ph 5.0 에서 9.0 까지이효소는안정하였으며, 23 o C 에서 37 o C 까지의범위에서도안정성을보여주었다. 알긴산분해효소의전체활성은 110 unit/l 이었다. 감사의글 본연구는 2007 년중소기업청산학연공동기술개발컨소시엄사업의지원을받아수행되었습니다. REFERENCES 1. Anzai, H., N. Uchida, and E. Nishida Determination of D-mannuronic to L-guluronic acids ratio in acid hydrolysis under improved conditions. Nippon Suisan Gakkaishi. 56: Davidson, I. W., I. W. Sutherland, and C. J. Lawson Purification and properties of an alginate lyase from a marine bacterium. Biochem. J. 159: Dunne, W. M. and F. L. Buckmire Partial purification and characterization of a polymannuronic acid depolymerase produced by a mucoid strain of Pseudomonas aeroguinosa isolated from a patient with cystic fibrosis. Appl. Environ. Microbiol. 50: Franklin, M. J., C. E. Chitnis, P. Gacesa, A. Sonesson, D. C. White, and D. E. Ohman Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase. J. Bacteriol., 186: Guven, K. C., Y. Ozsoy, and O. N. Ulutin Anticoagulant, fibrinotic and antiaggregant activity of carrageenans and alginic acid. Biotanica. Marina. 34: Hansen, J. B. and L. K. Nakamura Distribution of alginate lyase activity among strains of Bacillus circulans. Appl. Environ. Microbiol. 49: Haug. A., B. Larsen, and O. Smidsrod A study of constitution of alginic acid by partial acid hydrolysis. Acta. Chemica. Scandinabica. 20: Haug, A., B. Larsen, and O. Smidsrod Studies on the sequence of uronic acid residues in alginic acid. Acta. Chemica. Scandinabica. 21: Hirst, E. L. and D. A. Rees The structure of alginic acid. Part V. Isolation and unambiguous characterization of some hydrolysis products of the methylated polysaccharide. J. Chem. Society. 7: Iwamoto, Y., R. Araki, K. Iriyam, T. Oda, H. Fukuda, S. Hayashida, and T. Muramatsu Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain no. 272 and its action on saturated oligomeric substrates. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65: Jeong, H. J., S. A. Lee, P. D. Moon, H. J. Na, R. K. Park, J. Y. Um, H. M. Kim, and S. H. Hong. Alginic acid has antianaphylactic effects and inhibits inflammatory cytokine expression via suppression of nuclear factor-kappab activation Clin. Exp. Allergy. 36: Joo, D. S., J. S. Lee, J. J. Park, S. Y. Cho, C. B. Ahn, and E. H. Lee Purification and characterization of the intracellular alginase from Vibrio sp. AL-145. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 23: Joo, D. S., S. Y. Cho, and E. H. Lee Isolation of alginate-degrading bacteria and production of alginatedegrading activities by the bacteria. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 21: Lanyi, B Classical and rapid identification methods for medically important bacteria. pp In Colwell, R.R and R. Grigorova (ed.), Methods in Microbiology, vol. 19, Academic Press Ltd., London. 15. Lee, J. H. and E. Y. Lee Isolation of alginatedegrading marine bacteria and characterization of alginase. J. Life Science. 13: Linker, A. and L. R. Evans Isolation and characterization of an alginase from mucoid strains of Pseudomonas aeroguinosa. J. Bacteriol. 159: Nakagawa A., T. Ozaki, K. Chubachi, T. Hosoyama, T. Okubo, S. Iyobe, and T. Suzuki An effective method for isolating alginate lyase-producing Bacillus sp. ATB-1015 strain and purification and characterization of the lyase. J. Appl. Microbiol. 84: Miller, G. L Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 31: Paxman, J. R., J. C. Richardson, P. W. Dettmar, and B. M. Corfe. Alginate reduces the increased uptake of cholesterol and glucose in overweight male subjects: a pilot study Nutr. Res. 28: Pecina, A., A. Pascual, and A. Paneque Cloning and expression of the algl gene, encoding the Azotobacter chroococcum alginate lyase: purification and characterization of the enzyme. J. Bacteriol. 181: Penman, A. and G. R. Sanderson A method for the determination of uronic acid sequence in alginates. Carbohydrate Res. 25: Sawabe, T., H. Takahashi, Y. Ezura, and P. Gacesa Cloning, sequence analysis and expression of Pseudoalteromonas elyakoii IAM gene (alypeec) encoding the extracellular alginate lyase. Carbohydr. Res. 335: Skerman, V. B. D A Guide to the Identification of the Genera of Bacteria, 2nd edn. Batimore: Williams & Wilkins. 24. Stevens, R. A. and R. E. Levin Purification and characteristics of an alginate from Alginovibrio aquatilis. Appl. Environ. Microbiol. 3: Tamaoka, J. and K. Komagata Determination of DNA base composition by reversed-phase high-performance liquid chromatography. FEMS Microbiol. Lett. 25: (Received Oct. 14, 2009/Accepted Nov. 10, 2009)

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hwp - Appl. Chem. Eng., Vol. 23, No. 1, February 2012, 100-104 누룩으로부터분리한알긴산분해효소생산균주인 Erwinia tasmaniensis 의특성 김현지 이성목 김성구 * 이재화 신라대학교의생명과학대학생명공학과, * 부경대학교수산과학대학생물공학과 (2011 년 10 월 14 일접수, 2011 년 11 월 10 일심사,