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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(4): 352-360 (2017) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2017.32.4.352 ISSN 1225-7117 / eissn 2288-8268 Research Paper 대식세포에서 MAPKs 및 NF-κB 신호전달저해를통한서실에탄올추출물의항염증효과 김민지 1, 박선희 1, 김꽃봉우리 2, 최정수 3, 안동현 1 * Anti-Inflammatory Effect of Chondria crassicaulis Ethanol Extract on MAPKs and NF-κB Signaling Pathway in LPS-Induced RAW 264.7 Macrophages Min-Ji Kim 1, Koth-Bong-Woo-Ri Kim 2, Sun-Hee Park 1, Jung-Su Choi 3, and Dong-Hyun Ahn 1 * Received: 23 October 2017 / Revised: 14 December 2017 / Accepted: 22 December 2017 2017 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: The anti-inflammatory effect of Chondria crassicaulis ethanol extract (CCEE) was investigated using croton oil-induced ICR mice and LPS-induced RAW 264.7 cells. The CCEE showed inhibitory effect on the production of proinflammatory cytokines (IL-6, IL-1β, and TNF-α) and nitric oxide (NO) in LPS-induced inflammatory response as well as inducible nitric oxide, cyclooxygenase-2 via inactivation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and nuclear factor-kappa B (NF-κB). In croton oil-induced ear edema test, the edema formation of CCEE treatment group (10-250 mg/kg body weight) was lower than that of the positive control and 250 mg/kg body weight treatment group appeared similar effects compared with prednisolone (10 mg/kg body weight). The results in photomicrograph of mice ear tissue showed the reduction in dermis thickness and the number of infiltrated 1 부경대학교식품공학과 / 식품연구소 1 Department of Food Science & Technology/Institute of Food Science, Pukyong National University, Busan 48513, Korea Tel: +82-51-629-5831, Fax: +82-51-629-5824 e-mail: dhahn@pknu.ac.kr 2 부경대학교수산과학연구소 2 Institute of Fisheries Sciences, Pukyong National University, Busan 46041, Korea 3 경남정보대학교호텔외식조리계열 3 Subdivision of Culinary Arts, Kyungnam College of Information and Technology, Busan 47011, Korea mast cells. Therefore, these results indicate that CCEE exerts anti-inflammatory effect via inhibition of NF-κB and MAPKs activation and can be applied as a natural anti-inflammatory resource. Keywords: anti-inflammatory activity, nuclear factor-kappa B, mitogen-activated protein kinases, Chondria crassicaulis, ear edema 1. INTRODUCTION 염증반응이란외부로부터물리적, 화학적자극이나세균감염에대해면역세포가이를인지하여다양한염증매개물질을분비함으로써손상된조직을수복하거나재생하려는기전이며, 임상적으로는발적, 발열, 종창, 동통, 기능장애등의증상이나타난다 [1]. 핵전사인자인 nuclear factor-κb (NFκB) 는염증조절인자로서다양한 pro-inflammatory cytokine 및 inducible nitric oxide synthase (inos), cyclooxygenase-2 (COX-2) 의전사를유도하여 interleukin (IL)-6, IL-1β, tumor necrosis factor (TNF)-α 및 nitric oxide (NO) 와 prostaglandin E 2 (PGE 2 ) 의분비를증가시킨다 [2]. MAPK (mitogen-activated protein kinase) 는 ERK (extracellular signal-regulated kinase), JNK (c-jun N-terminal kinases), p38 의단백질을포함하며, lipopolysaccharide (LPS) 등다양한자극에의해활성화되면핵내전사인자로서염증반응에중요한역할을하게된다

서실에탄올추출물의항염증효과 353 [3]. LPS 는 gram-negative 세균의세포벽구성성분으로강한염증반응을일으키며대식세포표면의 TLR4 를자극하여하부세포신호전달경로인 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 의활성화를유도하며활성화된신호전달경로는 pro-inflammatory cytokines, NO, prostaglandin (PG)s 와같은여러가지염증성매개인자들을발현시킴으로써면역계기능의장애를초래하게된다 [4]. 따라서, NF-κB 와 MAPKs 의활성억제는염증반응을치료하는데있어중요한이점이된다. 최근에는국내에서식하고있는해조류로부터항염증활성탐색에대한연구가많이보고되고있다 [5-7]. 서실 (Chondria crassicaulis) 은홍조류에속하는해조류이며, 우리나라중부산, 남해안, 제주도에서서식하고있는자홍색또는자갈색이며연골질이고조금납작한막대모양으로가장자리에서마주나기또는어긋나기형태로가지를많이내는형태이다. 서실의기능성으로항산화와항균 [8] 및항암활성 [9] 이있다. 또한, Kim 등 [10] 이서실에탄올추출물에서 NF-κB 활성조절에의한 COX-2 와 inos 발현및 NO 와 pro-inflammatory cytokine 의분비량이조절된다고보고하였다. 본연구에서는더나아가 croton oil 로유도된귀부종마우스모델에대한서실에탄올추출물의항염증활성을알아보고, 염증의활성경로중 NF-κB 이외에 MAPKs 의활성조절에대해서도밝힘으로써 LPS 로염증을유도한 RAW 264.7 cell 에대하여 inos 와 COX-2 의발현량및 NO 와 pro-inflammatory cytokines 분비량억제효과를통해항염증효과를알아보고자하였다. 2. MATERIALS AND METHOD 2.1. 실험재료본실험에사용한서실 (C. crassicaulis) 은 2014 년부산청사포에서채취한것으로담수로깨끗하게수세한후동결건조하여분말화하고진공포장상태로 -20 o C 에서저장하여사용하였다. 2.2. 추출물의제조서실건조분말에 10 배의 95% 에탄올을가하고, 교반기 (H- 0820, Dongwon Science Co., Busan, Korea) 를이용하여 24 시간동안상온에서교반하여추출하였다. 원심분리기 (UNION 32R, Hanil Co., Incheon, Korea) 를이용하여 1,977 g 에서 10 분간원심분리한후상층액을취하였고, 이후남은잔사를이와동일한방법으로 2 회반복추출하였다. 추출한상층액은 37 o C 에서감압농축기 (RE200, Yamoto Co., Tokyo, Japan) 로농축하였으며, 농축하여건조된시료는 -20 o C 에서보관하여실험에이용하였다. 2.3. 세포배양 Murine 의대식세포주인 RAW 264.7 세포는한국세포주은행 (KCLB 40071, Seoul, Korea) 에서분양받아사용하였으며, DMEM 에 10% inactivated fetal bovine serum 과 1% penicillinstreptomycin 을첨가한배지를배양액으로 37 o C, 5% CO 2 incubator (MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan) 에서배양하였다. 실험과정의모든세포는 80~90% 정도의밀도로자랐을때계대배양하였고, 20 passages 를넘기지않은세포만사용하였다. 2.4. 세포독성측정시료의세포독성을평가하기위해 MTT assay 를실시하였다. RAW 264.7 cell 을 1 10 6 cells/ml 농도로 well plate 에분주하고 20 시간전배양후, 1 μg/ml 의 LPS 와서실에탄올추출물 (CCEE) 을농도별 (0.1, 1, 10, 50, 100 μg/ml) 로첨가하여 37 o C, 5% CO 2 incubator (MCO-15AC, Sanyo) 에서 22 시간본배양하였다. 배양후 5 mg/ml MTT (thiazolyl blue tetrazolium bromide, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 용액을첨가하고 2 시간재배양하였다. 이를 4 o C, 879 g 에서 10 분간원심분리하여상층액을제거하였다. 그후, 각 well 에 DMSO 를첨가하고이를 microplate reader (Model 550, Bio-rad, Hercules, CA, USA) 를이용하여 540 nm 에서흡광도를측정하였다. 세포증식능은다음식에의해계산하였다. Proliferation Index (% of control) = (sample absorbance / control absorbance) 100 2.5. NO 생성량측정배양액내의 nitrite 농도를 griess 반응을이용하여측정하였다 [11]. RAW 264.7 cell 은 DMEM 배지를이용하여 2.5 10 5 cells/ml 로조절한후 24-well plate 에접종하고 5% CO 2 incubator 에서 20 시간전배양하였다. 세포에 1 μg/ml 의 LPS 와 CCEE 를농도별 (0.1, 1, 10, 50, 100 μg/ml) 로처리하여 24 시간재배양하였다. 배양액의상층액을얻은후, 동량의 griess 시약 (1% sulfanilamide + 0.1% naphthylendiamine dihydrochloride, 1:1) 을첨가하여실온에서 10 분간반응시키고, microplate reader 를이용하여 540 nm 에서흡광도를측정하였다. 세포배양액내 NO 의농도는 sodium nitrite (NaNO 2 ) 의농도별표준곡선과비교하여산출하였다. 2.6. 전염증성사이토카인분비량측정 LPS 에의해염증이유도된 RAW 264.7 cell 로부터생성된염증관련사이토카인의분비량측정은다음과같이실시하였다. DMEM 배지를이용하여 2.5 10 5 cells/ml 로조절한후 24-well plate 에접종하고 5% CO 2 incubator 에서 18 시간전배양한후, 1 μg/ml 의 LPS 와 0.1, 1, 10, 50, 100 μg/ml 의 CCEE 를처리하여 12 시간재배양하였다. 세포배양액내의 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 사이토카인의분비량을 ELISA kit (Mouse ELISA set, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) 를이용하여측정하였다. 이를위해 ELISA microplate 에 capture antibody 로 anti-mouse TNF-α, IL-6 및 IL-1β 를분주하여 4 o C 에

354 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(4): 352-360 (2017) 서하룻밤동안 coating 시켰다. 이를 0.05% Tween 20 이포함된 PBST 로세척하고 10% FBS 용액으로 blocking 하였다. PBST 로세척한뒤, 각 microplate 에배양상층액을분주하고실온에서 2 시간반응시켰다. 반응후 PBST 로세척하고희석한 biotinylated anti-mouse TNF-α, IL-6 및 IL-1β detection antibody 와 streptavidin-horseradish peroxidase conjugate 를분주하여실온에서 1 시간반응시켰다. 그후다시 PBST 로세척하고 OPD 용액을첨가하여실온에서 30 분동안암반응시켰다. 반응종료를위해 2 N H 2 SO 4 을분주한뒤 microplate reader 를이용하여 490 nm 에서흡광도를측정하였다. 2.7. MAPKs (JNK, ERK, p-38) 발현량측정인산화된 MAPKs의발현량을알아보기위하여 RAW 264.7 세포를 1 10 6 cells/ml으로 18시간전배양하고 CCEE를처리하여 30분동안배양하였다. 배양이끝난세포를수집하여 3 회 phosphate buffered saline (PBS) 으로세척한후, cytosol lysis buffer [50 mm HEPES (ph 7.4), 150 mm NaCl, 5 mm EDTA, 1% deoxycholate, 5 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 μg/ml aprotinin, 1% Triton X-100, 0.1% NP-40] 을이용하였으며, 30분간 4 o C에서 lysis시킨후 15,520 g에서 20분간원심분리하여세포막성분등을제거하였다. BCA protein assay kit (Pierce, USA) 을사용하여단백질을정량하였으며 30 μl 의 lysate를 Laemmli [12] 의방법을사용하여 10% SDS- PAGE로분리하였다. 전기영동한겔은 Towbin 등 [13] 의방법을참고하여 polyvinylidene difluoride membrane (Bio-Rad) 에 1시간동안전사시켜 5% skim milk가함유된 tris-buffered saline (TBSS, ph 7.5) 용액으로상온에서 2시간동안 blocking 하였다. 인산화된 JNK, ERK, p38 및 JNK, ERK, p38의발현양을검토하기위하여 anti-mouse p-jnk, JNK, p-erk, ERK, p-p38 및 p38 (Cell Signaling Technology Inc., USA) 항체를 1:500으로희석하여상온에서 2시간반응시킨후 TBSS로 3 회세정하였다. 2차항체로 horseradish peroxidase가결합된 anti-mouse IgG 및 anti-rabbit IgG를 1:2,000으로희석하여상온에서 1시간반응시킨다음 TBSS로 3회세정하여 ECL 기질과 1~3분간반응후각각의단백질밴드는 Gene tool (GeneGnome5, Syngene, Cambridge, UK) 을이용하여가시화하였다. 2.8. inos, COX-2 및 NF-κB p65 발현량측정세포질내생성되는 inos, COX-2 및세포핵내 NF-κB의발현량에 CCEE가미치는영향을알아보기위하여세포에 LPS (1 μg/ml) 와 CCEE (0.1, 1, 10, 50, 100 μg/ml) 를처리한후, inos, COX-2 단백질발현량측정을위해서는 18시간동안배양하고, NF-κB의경우 30분동안본배양을하였다 [14]. inos 및 COX-2의경우 MAPKs 발현측정방법과같이 cytosol lysis buffer을이용하였으며, NF-κB의경우 nucleus lysis buffer (10 mm HEPES, 100 mm NaCl, 1.5 mm MgCl 2, 0.1 mm EDTA, 0.1 mm dithiothreitol) 를첨가하여 30분간 4 o C에서 lysis 시킨후 15,520 g에서 20분간원심분리하여세포막성 분등을제거하였다. inos, COX-2 및 NF-κB p65 의발현량을검토하기위한항체로는 anti-mouse inos, COX-2 및 NF-κB p65 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA) 를사용하여 1:500 으로희석하여사용하였다. 2 차항체로 horseradish peroxidase 가결합된 anti-mouse IgG 및 anti-rabbit IgG 를 1:2,000 으로희석하여실험을진행하였다. 2.9. 실험동물생후 8 주령의수컷, ICR 마우스를오리엔트바이오 (Orient Co., Seongnam, Korea) 로부터구입하여귀부종실험에사용하였다. 마우스는온도 20±2 o C, 습도 50±10%, 12 시간명암주기가유지되는동물실에서 1 주일간예비사육한후실험에사용하였다. 본실험은부경대학교동물윤리실험윤리위원회로부터동물실험승인을받아수행하였다 ( 승인번호 2015-04). 2.10. 귀부종및귀조직관찰 CCEE 의항염증효과를 in vivo 상에서알아보기위하여 Kim 등 [7] 와 Saraiva 등 [15] 의방법으로귀부종측정실험을실시하였다. 생후 8 주령의수컷, ICR 마우스에 CCEE 를 10, 50 및 250 mg/kg body weight 농도로 200 μl 씩단회경구투여하고한시간후, 오른쪽귀에 2.5% croton oil 을 20 μl/ear 농도로도포하였다. 도포 5 시간후귀두께를측정하였고 croton oil 의처리로귀두께가증가한것을부종의형성으로간주하였다. 귀조직관찰은 ICR 마우스의오른쪽귀에에탄올추출물을 100 mg/ml 농도로 20 μl 씩도포하고 15 분뒤, 5% croton oil 을 20 μl 씩도포하였다. 6 시간뒤, diethylether 로마취사시키고, 귀조직을절제하여 10% formaldehyde 에 72 시간고정하였다. 고정후파라핀블록을만들어박편을제조하고 hematoxylin-eosin 과 toluidine-blue 염색을하여조직을관찰하였다. 부종생성율은다음과같은식에의해계산하였다. Edema formation (% of control) = Ear thickness of sample / Ear thickness of control 100 2.11. 통계처리실험결과의통계처리는 SAS program (Statistical analytical system V8.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 을이용하여평균값을분산분석한후, Duncan 의다중검정법으로 p<0.05 수준에서항목들간의유의적차이를검정하였다. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 세포독성 CCEE 를 0.1~100 μg/ml 의농도로 RAW 264.7 세포에처리하여 MTT 방법으로세포독성을확인하였다. MTT 측정결과 0.1~100 μg/ml 농도에서 PBS 처리구와유의적인차이가나타나지않아 0.1~100 μg/ml 농도에서는세포독성이없음을

서실에탄올추출물의항염증효과 355 확인하였다 (Fig. 1). 따라서 CCEE 는 0.1~100 μg/ml 농도에서세포독성이나타나지않음을확인하고 in vitro 상에서항염증효과를분석하였다. 3.2. Pro-inflammatory cytokines 분비억제효과 TNF-α, IL-6, IL-1β 과같은 pro-inflammatory cytokine 의증가는초기염증반응의발달에중요한역할을한다 [16]. LPS 에의해자극된단핵구와대식세포에서생성된 TNF-α 는자가면역질환, 류마티스관절염, 염증성장질환등주요염증질환과관련되어있기때문에염증반응에있어중요한역할을한다 [17]. 또한 TNF-α 는다른 cytokine 의생성을유도함으로써염증반응을지속시키게된다 [18]. IL-6 및 IL-1β 도 LPS 에의해염증반응이과다하게분비하게되면발열의증상을나타나게된다 [19]. 따라서항염증치료에있어 pro-inflammatory cytokine 의분비량을감소시키는것이중요하다. 이에 RAW 264.7 cell 에서 LPS 에의해생성된 pro-inflammatory cytokine 을억제하는지알아보기위하여 IL-6, IL-1β, TNF-α 의생성량을측정하였다 (Fig. 2). IL-6 의경우 CCEE 를 0.1~ 100 μg/ml 농도로처리한결과 LPS 에의해증가된분비량이 10~100 μg/ml 농도에서유의적인감소효과를나타내었다. 특히, LPS 단독처리구는 1296.78±41.64 pg/ml 이였으나, 50 과 100 μg/ml 처리구는각각 798.14±20.28 pg/ml 및 632.78 Fig. 1. Effect of ethanolic extract from Chondria crassicaulis on proliferation of RAW 264.7 cells. Proliferation index (% of control) = sample absorbance / control absorbanne 100. ND: not significantly different. ±17.08 pg/ml 로 38% 와 51% 의저해효과를나타내었다. IL- 1β 의경우는 0.1~100 μg/ml 농도로 CCEE 를처리시 LPS 에의해증가된 IL-1β 분비량이농도의존적으로감소하였으며, 특히 100 μg/ml 처리구 (29.91±4.33 pg/ml) 에서 LPS 단독처리구 (53.20±2.60 pg/ml) 와비교시 44% 의감소효과를나타 Fig. 2. Inhibitory effect of ethanolic extract from Chondria crassicaulis on production of NO, IL-6, IL-1β, and TNF-α in RAW 246.7 cells. (a-f) Means with different superscripts are significantly different (p<0.05).

356 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(4): 352-360 (2017) 효과가나타났으며, 100 μg/ml 처리구에서 1114.90±4.12 pg/ ml 로 LPS 단독처리구 (1523.31±2.35 pg/ml) 와비교시 26% 의감소효과를나타내었지만큰감소효과는나타내지않았다. 이상으로, CCEE 는 IL-6, IL-1β, TNF-α 의분비량조절을통해염증반응을효과적으로조절할수있으며, 이러한결과는 NF-κB 와 MAPKs 조절을통해염증반응이억제됨을의미한다. 3.3. NO 분비억제효과 NO 는정상상태에서는신호전달및박테리아를죽이는등중요한역할을하지만과도한 NO 의생성은조직손상, 유전자변이등을일으키기때문에 NO 생성의억제는염증반응의조절에서중요한의미를지닌다 [20,21]. 본연구에서 CCEE 가 LPS 로활성화된 RAW 264.7 세포에서 NO 분비량에미치는영향을알아본결과 (Fig. 2), LPS 로염증이유도된 RAW 264.7 세포는 NO 의생성이 21.97±0.36 μm 로현저히증가되었으며, CCEE 를 50~100 μg/ml 로처리하였을때 16.56±0.00 μm 과 14.71±0.29 μm 의 NO 분비량을나타내었다. 따라서 CCEE 는염증매개물질인 NO 의분비량을유의하게억제하였으며, 이는 inos 의발현억제에기인하는것임을나타낸다. 3.4. MAPKs (JNK, ERK, p-38) 발현량억제효과 MAPKs (JNK, ERK, p38) 는세포질에서인산화되지않은상태로존재하다가 LPS 등에의해자극이가해지면인산화되어핵으로전위하게된다. MAPKs 의신호전달경로는염증반응의활성화에중요한역할을하는것으로알려져있으며, Schnyder-Candrian 등 [22] 은 LPS 에의해유도된 cytokine 의분비에 p38 MAPK 가중요한역할을한다고보고하였다. 또한폐와관련된염증질환에서는 p38, JNK, ERK 신호경로가중요한역할을한다고알려져있다 [23-25]. 한편, MAPKs 는 NFκB 와 activator protein 1 (AP-1) 을포함한전사인자들의활성화를유도하는데관여함으로써염증관련매개물질들의분비들을증가시킨다 [26]. 따라서, CCEE 가인산화된 MAPKs 의활성화에미치는영향을알아보기위해, LPS 에의해증가하는 MAPKs 의인산화변화를 western blot 을통해확인하였다. 그결과 (Fig. 3), LPS 에의해증가한 p-p38, p-erk 및 p-jnk 의발현이 CCEE 의처리에의해뚜렷하게감소하였다. LPS 처리에의해증가된 p-p38 의발현은 0.1 μg/ml 농도에서유의적인감소를보였으며, 특히 50 및 100 µg/ml 농도에서뚜렷한감소효과를나타내었다. p-erk 와 p-jnk 의경우에도 50 및 100 µg/ml 농도에서뚜렷한발현감소를나타내었다. 이러한결과는 CCEE 가대식세포에서 LPS 에의해활성화되는 MAPKs 의활성경로억제를통해항염증효과를나타내는 Fig. 3. Inhibitory effects of ethanolic extract from Chondria crassicaulis on the protein expression of p-p38, p-erk, and p-jnk in RAW 264.7 cells. The levels of p-p38, p-erk, and p-jnk in the cytosolic protein were determined by western blot analysis. RAW 264.7 cells were treated with the indicated concentrations of CCEE (0.1, 1, 10, 50, and 100 μg/ml) and LPS (1 μg/ml) for 30 min, and the proteins were detected using specific antibodies. For quantification, the expression data were normalized to the total MAPKs signal. Data are obtained from three independent experiments and expressed as means±sd. Means with different letters (a-f) above the bars are significantly different (p<0.05).

서실에탄올추출물의항염증효과 357 것으로사료된다. 3.5. inos, COX-2 및 NF-κB p65 발현량억제효과 inos 는 LPS, cytokine 및박테리아독소같은자극들에노출되는경우발현되며 L-arginine 을 NO 로전환시켜염증반응에관여하게된다 [21]. COX 는 COX-1 과 COX-2 로전환되는데, COX-2 는염증반응이일어날경우에만생성되어전구염증매개인자에의해일시적으로빨리유도되어 PGs 의생합성을자극하여염증반응을일으킨다 [27]. NF-κB 는염증과관련된매개인자들의발현을유도하는전사조절인자로알려져있으며, LPS 에의해활성화되면 inos, COX-2, pro-inflammatory cytokine 등의유전자발현에관여한다 [1]. 일반적인세포에서 p65 와 p50 의 heterodimer 형태로 cytosol 에존재하며, 염증반응에의해 IκB 가인산화되면핵으로이동하여전사인자로써의역할을하게된다 [28]. 본연구에서는 RAW 264.7 세포에 CCEE 를 0.1~100 μg/ml 농도로처리하여세포질에서의 inos, COX-2 와핵내에서의 NF-κB p65 의발현에미치는영향을살펴보았다 (Fig. 4). inos 의경우, LPS 처리에의해발현이증가하였으며, 1~100 μg/ml 농도범위에서유의적인발현감소를보였다. 이에, Fig. 2 에서의 NO 분비량감소는 inos 의발현저해에의한것임을확인하였다. COX-2 의발현은 LPS 단독처리에의해증가하였으며, 1 μg/ml 농도에서 발현감소가나타나기시작하여, 10~100 μg/ml 농도에서는발현저해효과가크게나타났다. NF-κB p65 에서는 1 μg/ml 농도에서발현이감소효과가나타났으며, 10~100 μg/ml 농도에서는발현저해효과가크게나타났다. 이상의결과, CCEE 는 LPS 에의해활성화되는 NF-κB 및 MAPK 의활성억제를통해 inos, COX-2 의발현이억제되는것으로사료된다. 3.6. 귀부종억제효과및조직관찰피부염증에서일어나는대표적반응으로염증반응시혈관확장, 세포막유동성증가, 부종등의생리현상이수반되며이반응을억제하는효과를실험적으로검증함으로써특정물질의항염증효능을증명할수있다 [29]. Croton oil 은 Croton tiglium L. 에서추출된염증자극제로서, 피부를자극시켜부종을유발하는물질이다 [30]. Croton oil 은 phorbol esters 성분인 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) 에의해피부에도포시조직의혈관확장, 다형핵백혈구침윤에의한부종을일으켜급성염증반응을유도하게된다. 이와같은반응은 protein kinase C (PKC) 활성화에의해유발되며, phospholipase A2 의활성증가를촉진시키고, 이는 arachidonic acid 와 prostaglandin 및 leukotriene 과같은대사물질을증가시킨다 [31,32]. 또한 PKC 는 cytokine 및 chemokine 과같은 Fig. 4. Inhibitory effects of ethanolic extract from Chondria crassicaulis on the protein expression of inos, COX-2 and NK-κB p65 in RAW 264.7 cells. The levels of inos and COX-2 in the cytosolic protein, and the NF-κB p65 in nuclear protein were determined by western blot analysis. RAW 264.7 cells were treated with the indicated concentrations of CCEE (0.1, 1, 10, 50, and 100 μg/ml) and LPS (1 μg/ml) for 18 h or 30 min and the proteins were detected using specific antibodies. For quantification, the expression data were normalized to the β-actin or Lamin b signal. Data are obtained from three independent experiments and expressed as means±sd. Means with different letters (a-f) above the bars are significantly different (p<0.05).

358 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(4): 352-360 (2017) Fig. 5. Inhibition of ethanolic extract from Chondria crassicaulis (CCEE) against croton oil-induced mouse ear edema. Means with different superscript (a-e) are significantly different (p<0.05). 염증매개물질의분비를증가시켜염증반응을증가시킨다 [33]. 따라서 CCEE 를 10, 50 및 250 mg/kg 농도가되도록 200 μl 씩 ICR 마우스에경구투여한후, croton oil 로염증을유발하여, 귀두께변화를측정하였다 (Fig. 5). Control 구와비교하였을때, 모든농도에서유의적으로귀두께가감소한것을확인하였다. 특히, CCEE 를 250 mg/kg 농도로경구투여하였을때, positive control 인 prednisolone 10 mg/kg 처리구와유사한귀부종억제효과를나타내었다. 또한조직관찰결과에서, croton oil 만을처리한경우에진피의두께가증가하였으나, CCEE 를 100 mg/ml 농도로처리한경우진피두께가얇아진것을확인하였다 (Fig. 6A). 이와더불어조직내의 mast cell 침윤정도를 toluidine-blue 염색을통해확인한결과 (Fig. 6B), prednisolone 처리구와유사한정도로진피에서의 mast cell 침윤이억제됨을확인하였다. 따라서 CCEE 는천연항염증소재로서염증반응의하나인부종완화에효과적임을확인하였다. 4. CONCLUSION 항염증효과를확인하기위해 LPS 로 RAW 264.7 세포를자극하여염증매개인자들의활성을측정한결과, 염증반응의주요경로인 NF-κB 와 MAPKs 활성이억제되어 inos, COX- 2 의발현이감소되고, NO 와 pro-inflammatory cytokine (IL-6, IL-1β, TNF-α) 의생성이억제됨을확인하였다. 또한, CCEE 는 croton oil 로유도된귀부종에서농도의존적으로귀부종형성을억제하였으며, 250 mg/kg body weight 투여군은시판항염증제인 prednisolone 10 mg/kg body weight 투여군과유사한효과를나타내었다. 귀조직관찰에서도 croton oil 에의해증가된진피의두께가 CCEE 에의해감소됨을확인하였고, 진피에침윤된 mast cell 의수도현저히감소됨을확인하였다. 따라서 CCEE 는 in vivo 와 in vitro 실험결과를통해염증반응을예방하거나치료하는데있어효과적인천연항염증제로서이용할수있음을나타낸다. Acknowledgements 이논문은 2016 년도정부 ( 교육부 ) 의재원으로한국연구재단의지원을받아수행된기초연구사업임 (2012R1A6A1028677). Fig. 6. Photomicrograph of transverse sections of mice ears sensitized with topical application of 5% croton oil (v/v) in acetone (a-c) or vehicle acetone (d), stained with (A) hematoxylin-eosin and (B) toluidine-blue examined under light microscopy (magnification: 200 ). Treatments: vehicle 2% Tween 80 (a), prednisolone 0.08 mg/ ear (b) and ethanolic extract from Chondria crassicaulis (CCEE) 20 μl/ear (c). The numbers 1 and 2 indicate dermis and epidermis, respectively and the arrow in (B) means infiltration of mast cells. REFERENCES 1. Hawiger, J. (2001) Innate immunity and inflammation: A transcriptional paradigm. Immunol. Res. 23: 99-109. 2. Yun, H. Y., V. L. Dawson, and T. M. Dawson (1996) Neurobiology of nitric oxide. Crit. Rev. Neurobiol. 10: 291-316. 3. Song, H. Y., J. A. Lee, S. M. Ju, K. Y. Yoo, M. H. Won, H. J. Kwon, W. S. Eum, S. H. Jang, S. Y. Choi, and J. Park (2008) Topical trans-

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