대한한방내과학회지제 35 권 3 호 (2014 년 9 월 ) J. Int. Korean Med. 2014:35(3)244-261 製何首烏加味方이고지혈증및산화적손상에미치는영향 윤현덕, 조현경, 유호룡, 설인찬, 김윤식대전대학교한의과대학심계내과학교실 The Effects of Jehasuogamibang on Antioxidation Activity and Dietary Hyperlipidemia-induced Mice Hyeon-deok Youn, Hyun-kyung Jo, Ho-ryong Yoo, In-chan Seol, Yoon-sik Kim Dept. of Internal Medicine, College of Oriental Medicine, Dae-Jeon University ABSTRACT Objectives: This experiments were performed to determine the effects of the Jehasuogamibang ( 製何首烏加味方 : JHGB) on antioxidationactivity and hyperlipidemia induced by a hypercholesterolemic diet in mice. Methods: After treatment with JHGB expert safety in cytotoxicity and toxicity of Human fibroblast cells and liver and kidney, effect on Reactive Oxygen Species, serum total cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride, glucose, HDL-cholesterol, lipid peroxid of liver tissue, significantly increased SOD and catalase. Results: 1. JHGB showed safety in cytotoxicity and toxicity of human fibroblast cells and liver and kidney. 2. JHGB showed significant inhibitory effect on reactive oxygen species. 3. JHGB significantly decreased serum total cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride, and glucose, and significantly increased serum HDL-cholesterol. 4. JHGB significantly decreased lipid peroxide of liver tissue and significantly increased SOD and catalase. Conclusions: These results suggest that Jehasuogamibang is effective in antioxidationactivity and dietary hyperlipidemia-induced mice. Key words: Hyperlipidemia, Antioxidation Activity, Jehasuogamibang Ⅰ. 緖論 뇌졸중과관상동맥질환을포함한심혈관계질환은암과함께우리나라의주요사망원인이며 1, 동맥벽이비후하고굳어지는동맥경화성질환이가장큰비중을차지하고있다 2. 고지혈증은혈청중 triglyceride, cholesterol, 교신저자 : 김윤식대전시동구대학로 62 대전대학교한의과대학심계내과학교실 TEL: 053-759-8875 E-mail: manchonhani@naver.com phospholipid, free fatty acid 등의지질이혈액내에과도하게증가되어있는상태를말하는것으로 3-5, 고혈압, 흡연, 당뇨, 고요산혈증, 비만, 운동부족과함께동맥경화증의주요위험인자이며 2, 유병률이점차많아지고, 그정도가심해지고있다 6. 고지혈증치료에사용되는주요약물로는 HMG CoA reductase inhibitors(statins), micronized fenofibrate (Lipidil), bile acid sequestrants(resins), Nicotininc acid, probucol, 어유또는오메가-3 지방산등이있다 7,8. 그러나소화불량, 간독성, 근육통, 횡문근변성, 광과민성등부작용이유발될수있어장기간 244
윤현덕 조현경 유호룡 설인찬 김윤식 복용은문제점이있는것으로알려져있다 9-11. 한의학에서고지혈증이란병명은없으나 靈樞 衛氣失常論 12 에서 肥人多, 有膏, 有肉 라고하여지질에대해오래전부터인식하고있었다. 대개痰飮, 瘀血등의범주에속하며, 嗜食肥甘厚味의外的要因과肝脾腎機能失調의內的要因에의해發病되는本虛標實의병리적특성이있다 13. 製何首烏加味方 (JHSB) 은 心血管科專病中醫臨床診治 14 에기록된처방으로, 製何首烏, 枸杞子, 決明子, 茵蔯, 山査肉, 蘿葍子, 免絲子, 白茯苓, 黃芩, 淫羊藿등으로구성되었으며, 滋補肝腎, 利濕化痰하는효능이있어대전대학교한방병원에서고지혈증과관련된질환에다용되고있다. 본연구는製何首烏加味方이고지혈증과산화적손상에미치는영향을과학적으로증명하고자세포의생존율및간 신의기능평가를통해안전성을확인한후, human umbilical vein endothelial cell( 이하 HUVEC) 에서항산화활성, apoptosis를, rat에서몸무게및간무게, 콜레스테롤, triglyceride, glucose, albumin, globulin, albumin/globulin ratio 변화, 간조직의과산화지질함량, 항산화활성등에미치는영향등을관찰하여유의성있는결과를얻었기에보고하는바이다. Ⅱ. 實驗 1. 재료 1) 동물및사육조건본실험에사용된실험용쥐는체중 300-350 g의웅성 Sprague-Dawley(SD) rat은실험당일까지고형사료와고콜레스테롤식이사료 (Bio-serv, USA) 를자유식이하면서물을충분히공급하였다. 실온 22± 2, 상대습도 50±10%, 조명시간 12시간 (07:00~19:00), 조도 150~300 Lux로설정하여 2 주일간실험실환경에적응시킨후체중변화가일정하고건강한쥐만을선별하여실험에사용하였다. 일반사료와고콜레스테롤식이사료의조 성내용과분량은다음과같다 (Table 1). Table 1. Composition of Basal Diet, Prescription of Hyperlipidemic Diet Composition Content (%) Crude protein above 22.1 Crude fat above 8.0 Crude fiber below 5.0 Crude ash below 8.0 Calcium above 0.6 Phosphorus above 0.4 Diets ingredient Concentration (g/kg) Purina mouse cow 750.0 Casein 75.0 Cocoa butter 75.0 Dextrose 25.0 Dextrin 16.25 Cholesterol 12.5 Cellulose 12.5 Sucrose 16.25 Mineral mix #200000 8.75 Sodium cholate 5.0 Vitamin mix #310035 2.5 Choline chloride 1.25 2) 약재본실험에사용한製何首烏加味方 (Jehasuogamibang, JHSB) 의구성약물은대전대학교둔산한방병원에서구입하여정선한후사용하였다 (Table 2). Table 2. The Compositions of Jehasuogamibang- (JHSB) Herb name Scientific name Amount (g) 製何首烏 Polygonum multiflorum Thunb 20 拘杞子 Lycium chinense Miller 15 免絲子 Cuscuta japonica Chois 12 決明子 Cassia obtusifolia 15 白茯苓 Poria cocas Wolf 10 山査肉 Crataegus pinnatifida 15 黃芩 Scutellaria baicalensis GEORGE 10 茵蔯 Artemisia capillaris Thunb 15 蘿葍子 Raphanus sativus L 15 淫羊藿 Epimedium koreanum Nakai 9 總量 136 245
製何首烏加味方이고지혈증및산화적손상에미치는영향 3) 시약및기기 (1) 시약 Dulbecco's phosphate buffered saline, RPMI 1640, Collagenase A, Penicillin, pyrogallol, Ethylenediaminetetraacetic acid(etda), 3-(4,5-Dimethyl -2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT), Heparin, ECGS, Sodium citrate, LPS, N-2-hydroxylethyl-piperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) 는 sigma 사 (USA) 제품을, Dimethyl sulfoxide (DMSO) 는 Sowa chemical 사 (Japan) 제품을, Ethylacrtate 는 Junsei사 (Japan) 제품을, Potassium Phosphate Monobasic(KH 2PO 4) 는 Yakuri 사 (Japan) 제품을, ACAT, HMG-CoA reductase 는바이오니아사 (Korea) 제품을, 이밖에일반시약은특급시약을사용하였다. (2) 기기본연구에사용된기기는 Ice-maker(Vision, Korea), Centrifuge(Hanil Co., Korea), Rotary vaccum evaporator (Büchi 461, Switzerland), Deep freezer(sanyo Co., Japan), Autoclave(Sanyo, Japan), Ultrasonic cleaner (Branson Ultrasonics Co., USA), ELISA reader (Molecular Divice., USA), Roller Mixer(Gowon scientific technology Co., Korea), 한약유출기 (DWP-1800T, 웅진, Korea), HPLC(CMB-20A, Shimadzu, Japan), Spectrophotometer(UV-2450, Shimadzu, Japan), cell cytometery(facs, Beckman Co., USA), Balance(Cass, Korea), 생화학기 (AU400, Olympus, USA), 감마카운터기 (WIZARD 1470, Finland) 등을사용하였다. 2. 방법 1) 약물추출 JHSB 2첩을한약약탕기에넣고, 증류수 1500 ml와같이혼합하여 3시간열탕하여추출한후흡입여과하였다. 이를 rotary vacuum evaporator 에서감압농축하여분말 13.75 g을얻었으며, 얻어진분말은초저온냉동고 (-80 ) 에서보관하면서, 실험에따라필요한농도로증류수에희석하여사용하였다. 2) 안전성검사 (1) 세포독성측정세포독성측정은인간제대혈관내피세포 (Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC) 및인간단핵구세포주 (THP-1 cell) 를사용하였다. 96 well plate 에 5 10 3 cell/100 μl 의농도로 HUVEC 또는 THP-1 세포를분주한다음각각 48시간과 24 시간동안 37, 5% CO 2 배양기에서배양 (HUVEC 의 monolayer 형성 ) 한후새배지로교환한다음에 JHSB 를 culture media 에녹여각각 10, 20, 50 (μg/ml) 의농도로처리한후 48시간배양하였다. MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoli um bromide) 용액을 10 μl 첨가하여 37, 5% CO 2 배양기에서 4시간을배양한다음, 100 μl의 solubilization 용액을추가로첨가하였다. 37, 5% CO 2 배양기에서 24시간배양한다음 ELISA reader 를이용하여 550-600 nm에서흡광도를측정하였다. (2) 간기능측정실험종료후혈액을채취해혈청을분리하여 AST, ALT 검사를실시하였다. (3) 신기능측정실험종료후혈액을체취해혈청을분리하여 creatinine, uric acid 검사를실시하였다. 3. In vitro 실험 1) 항산화활성측정 (1) 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 소거능측정 150 mm DPPH/EtOH 150 μl에 JHSB를 200, 100, 50, 25 μg/ml 농도로희석하여 100 μl씩첨가한후 37 에서 30분간반응시켰다. 이를흡광도 517 nm에서측정하여아래의방법으로계산하였다. DPPH 소거능 (%) = ( 대조군의흡광도 -JHSB 투여군의흡광도 ) 100 대조군의흡광도 (2) Superoxide dismutase(sod) 유사활성측정 JHSB 0.2 ml에 tris-hcl buffer(ph 8.5) 2.6 ml 246
윤현덕 조현경 유호룡 설인찬 김윤식 과 7.2 mm pyrogallol 0.2 ml를가하여 25 에서 10분간반응후 1 N HCl 0.1 ml로반응을정지시켰다. 반응액을 420 nm 에서흡광도를측정하고, buffer 를첨가한것을대조군으로하여아래와같이활성도를측정하였다. SOD 유사활성 (%) = 100-{( JHSB 투여군의흡광도 ) 100} buffer 첨가군의흡광도 (3) 세포내 reactive oxygen species(ros) 활성측정 96 well plate 에 5 10 3 cell/100 μl 의농도로 HUVEC 을분주한다음 24시간동안 37, 5% CO 2 배양기에서배양한후새배지로교환한다음에 JHSB 를 culture media에녹여 50 (μg/ml) 의농도로처리하였다. 1시간배양후 TNF-α 10 (ng/ml) 처리하여 1시간배양한다음에 Trypsin-EDTA 를이용하여세포를모아 10 μm의 2',7'-dichlorofluorescein diacetate(dcfda) 를첨가하여실온에서 5~30분배양하고 FACS 를이용하여형광측정하고분석하였다. 2) 세포고사측정 (apoptosis assay) 24 well plate 에 4 10 4 cell/500 μl 의농도로 HUVEC 을분주한다음 24시간동안 37, CO 2 배양기에서배양한후새배지로교환한후 JHSB 를 50 (μg/ml) 농도로처리하였다. 1시간배양후 LPS 10 (μg/ml) 처리하여 24시간배양하였고, Trypsin-EDTA를이용하여세포를모아 PBS로세척하여 1x binding buffer 로 4 10 4 cells/100 μl이되게희석하여 Annexin V-FITC 와 propidium(pi) 을각각 2.5 μl씩첨가하여실온에서 15분간방치한후 FACS 를이용하여형광측정하고분석하였다. 4. In vivo 실험 1) 고콜레스테롤사료에의한고지혈증유발과약물투여각실험군은정상군, 대조군그리고 JHSB 투여군으로나누어정상군은일반사료와식수를충분 히공급하였다대조군과 JHSB 투여군은 Table 2의조성으로만들어진고콜레스테롤사료와식수를충분히공급하였으며 JHSB 투여군은고콜레스테롤투여 2주후부터 209 mg/kg/0.5 ml의양으로정해진시간에매일투여하였다. 2) 체중증가량및간장무게측정체중증가량은고콜레스테롤식이투여를시작한주부터매주같은시간에측정하여평균값을산출하였고실험종료후몸의혈액을제거한후간장을적출하여무게를측정하였다. 3) 채혈및혈청성분측정 JHSB 의투여종료후 12시간절식후 ether로마취시킨다음심장에서 12 ml이상의혈액을취하여 5 ml을 15 ml conical tube에넣어 6,500 rpm에 15분간원심분리시켜혈청을분리하였다. 분리한혈청은생화학기기 (AU400, Olimpus, USA) 를이용하여 Total cholesterol, LDL cholesterol, HDL cholesterol, Triglyceride, Glucose 그리고 Albumin 등을측정하였다. 4) 간조직의효소활성측정 (1) 효소원제조적출한간은 PBS로세척하여수분을제거하고, 1 g의간조직에 10 ml의 0.25 M sucrose/0.5 mm ethylene diamine tetraacetic acid(edta)/5 mm N-2-hydro-xylethyl-piperazine-N-2-ethane sulfonic acid(hepes) 용액을가하여 ultraturax homogenizer 를이용하여빙냉하에서마쇄하였다. 마쇄한용액을마쇄한용액을 4, 600 xg로 15분간원심분리하여핵및미마쇄부분을제거한후 4, 8000 xg 로 30분간원심분리하여 1 ml의상등액을 TBARS 함량측정에사용하였다. 나머지는 4, 10000 xg에서 30분간원심분리하여상등액중일부를취하여 0.4배양의 ethanol:chloroform(5:3) 냉혼합액을가하여 2분간진탕한다음다시 4, 10000 xg에서 30분간원심분리하여얻은상등액을 superoxide dismutase(sod) 활성도측정에사용하였다. Catalase 활성은마쇄액을 4, 10000 xg로 30분간원심분 247
製何首烏加味方이고지혈증및산화적손상에미치는영향 리하여얻은침전물을 0.25 M sucrose 용액에현탁시키는과정을 2회반복후아래의방법으로측정하였다. (2) 지질과산화도측정간조직의과산화지질정량은 Sato법을이용하여측정하였다. 제조한간조직효소원 0.5 ml에 TCA용액 2.5 ml를가하여잘섞은다음, 실온에서 10분간방치한후 1500 xg에서 10분간원심분리하여상등액을버렸다, 남은침전물은 0.05 M 황산으로 1회세척후침전물에 0.05 M 황산 2.5 ml 와 0.6% TBA 3.0 ml를가하여잘섞은후 95 의항온수조에서 30 분간방치하였다. 여기에 n-butanol :pyridine(15:1) 혼합액 3.0 ml를가하여잘섞은후 1500 xg에서 10분간원심분리하고, 상등액을취하여 530 nm에서흡광도를측정하였다. (3) 항산화효소 (SOD) 활성측정 Oyanagui 의방법에준하여 Cytochrome c, 2 μm xanthine sodium, 50 mm sodium phosphate buffer 의기질액에효소액을넣고안정화시킨후 xanthine oxidase 0.2 unit/ml 를넣고흡광도를사용하여 550 nm에서 2분간의흡광도를측정하였다. Xanthine/ xanthine oxidase 반응으로생성된 superoxide anion 에의해 cytochrome c가환원되는것을측정하는데, SOD에의해 superoxide anion의양이감소하여 cytochrome c가변화는현상을이용하여 SOD 활성을측정하였다. Cytochrome C의환원을 50% 억제하는양을 SOD의 1 unit로정의하였다. (4) Catalase 활성측정 Aebi 의방법을이용하여 50 mm potassium phosphate buffer(ph 7.0) 2.89 ml에기질 30 mm H 2O 2 100 μl 를넣어 25 에서 5분간반응시켰다. 여기에효소액 10 μl를가하여다시 25, 240 nm에서 5분간흡광도를측정하였다. H 2O 2 흡광도변화와 H 2O 2 의몰흡광계수로농도를구하여효소활성도를측정하였다. 효소활성의단위는 1분당 1 mg protein 이분해하는 hydrogen peroxide의양을 μmole로표시하였다. 5. 통계처리본실험에서얻은결과를 Student s t-test로분석하여 p값을구하였다. 각대조군을정상군과, 실험군을대조군과비교하여 p<0.05 일때유의성이있는것으로판정하였다. Ⅲ. 實驗結果 1. 안전성검사 1) 세포독성에미치는영향 (1) HUVEC에서의세포독성에미치는영향 HUVEC에대한세포독성에서는대조군의세포생존율을 100±1.4(%) 로하였을때, JHSB 10, 20, 50 (μg/ml) 농도처리군에서는생존율이각각 99.3 ±6.2, 94.7±3.7, 107.9±6.8(%) 로나타났다 (Fig. 1). Fig. 1. Effects of JHSB on the viability of HUVEC. HUVEC were cultured with various concentration of JHSB extract for 48 hr and the cell viability was measured by cytotoxicity assay. The results were presented by the mean ± S.D. (2) THP-1 세포에서의세포독성에미치는영향 THP-1 세포에대한세포독성에서는대조군의세포생존율을 100±0.0(%) 로하였을때, JHSB 5, 10, 20, 50 (μg/ml) 농도처리군에서는생존율이각각 89.8±4.4, 92.8±3.8, 87.8±4.2, 91.2±5.6(%) 로나타났다 (Fig. 2). 248
윤현덕 조현경 유호룡 설인찬 김윤식 compared with normal group by Student's t-test (++p<0.01). Statistically significant value was calculated by compared with control group by Student's t-test (**p<0.01). Fig. 2. Effects of JHSB on the viability of THP-1 cells. HUVEC were cultured with various concentration of JHSB extract for 24 hr and the cell viability was measured by cytotoxicity assay. The results were presented by the mean ± S.D. 2) 간기능에미치는영향 (1) AST 수치에미치는영향 AST는정상군이 136.7±20.1 (IU/L) 대조군이 333.0±25.12 (IU/L) 로나타나정상군에비하여대조군에서유의성있는 (++p< 0.01) 증가를나타냈다. JHSB 투여군에서는 207.7±33.3 (IU/L) 로나타나대조군에비하여유의성있게 (**p<0.01) 감소하였다 (Fig. 3). (2) ALT 수치에미치는영향 ALT는정상군이 37.3±1.2 (I.U/L), 대조군이 230.0±25.51 (I.U/L) 로나타나정상군에비하여대조군에서유의성있는 (++p <0.01) 증가를나타냈다. JHSB 투여군에서는 67.7±35.0 (I.U/L) 로나타나대조군에비하여유의성있게 (**p<0.01) 감소하였다 (Fig. 4). Fig. 4. Effect of JHSB on the ALT in hyperlipidemia rat. JHSB : Hyperlipidemic diet and JHSB (209 mg /0.5 ml/day) treated group The results were presented by the mean ± S.D. compared with normal group by Student's t-test (++p<0.01). Statistically significant value was calculated by compared with control group by Student's t-test (**p<0.01) Fig. 3. Effect of JHSB on the AST in hyperlipidemia rat. JHSB : Hyperlipidemic diet and JHSB (209 mg /0.5 ml/day) treated group The results were presented by the mean ± S.D. (3) Alkaline phosphatase(alp) 수치에미치는영향 ALP는정상군이 127.3±24.5 (IU/L), 대조군이 221.7±9.1 (IU/L) 로나타나정상군에비하여대조군에서유의성있는 (++p<0.01) 증가를나타냈다. JHSB 투여군에서는 155.0±19.1 (IU/L) 로나타나 249
製何首烏加味方이고지혈증및산화적손상에미치는영향 대조군에비하여유의성있게 (**p<0.01) 감소하였다 (Fig. 5). JHSB : Hyperlipidemic diet and JHSB (209 mg /0.5 ml/day) treated group. The results were presented by the mean ± S.D. Fig. 5. Effect of JHSB on the ALP in hyperlipidemia rat. (2) Uric acid 수치에미치는영향 Uric acid는정상군이 2.10±0.11 (mg/dl), 대조군이 2.36±0.01 (mg/dl) 로나타나정상군에비하여대조군에서유의성있는 (+p<0.05) 증가를나타냈다. JHSB 투여군에서는 1.78±0.16 (mg/dl) 로나타나대조군에비하여유의성있게 (**p<0.01) 감소하였다 (Fig. 7). JHSB : Hyperlipidemic diet and JHSB (209 mg /0.5 ml/day) treated group The results were presented by the mean ± S.D. compared with normal group by Student's t-test (++p<0.01). Statistically significant value was calculated by compared with control group by Student's t-test (**p<0.01). 2) 신장기능에미치는영향 (1) Creatinine 수치에미치는영향 Creatinine 은정상군이 0.49±0.02 (mg/dl), 대조군이 0.50±0.07 (mg/dl) 로나타나정상군에비하여대조군에서증가를나타냈다. JHSB 투여군에서는 0.50±0.03 (mg/dl) 로감소하였다 (Fig. 6). Fig. 7. Effect of JHSB on the Uric acid in hyperlipidemia rat. JHSB : Hyperlipidemic diet and JHSB (209 mg /0.5 ml/day) treated group The results were presented by the mean ± S.D. compared with normal group by Student's t-test (+p<0.05). Statistically significant value was calculated by compared with control group by Student's t-test (**p<0.01). Fig. 6. Effect of JHSB on the creatinine in hyperlipidemia rat. 2. 항산화활성에미치는영향 1) DPPH 소거능에미치는영향 DPPH 의소거활성은 200, 100, 50, 25 (μg/ml) 농도에서각각 55.0±3.5, 38.2±1.1, 19.9±3.5, 8.3±1.2 (%) 로농도의존적으로증가하였다 (Fig. 8). 250
윤현덕 조현경 유호룡 설인찬 김윤식 mins at 25 and determined at 420 nm after stopping the reaction by adding 0.1 ml of 1 N HCl. The results were presented by the mean ± S.D. Fig. 8. Scavenging activity of JHGB. 3) HUVEC에서 ROS 생성에미치는영향대조군의 ROS 생성율이 1.00±0.00일때, TNF-α 처리군은 2.43±0.23 으로나타나대조군에비하여유의성있는 (++p<0.01) 증가를나타내었고, JHSB 50 (μg/ml) 농도에서 1.47±0.30으로 TNF-α 처리군에비하여유의성있게 (*p<0.05) 감소하였다 (Fig. 10). JHGB were reacted with DPPH for 30 minutes at 37, and the absorbance at 517 nm due to DPPH radical was determined. The results are the mean ± S.D. 2) SOD 유사활성에미치는영향 SOD나 SOD 유사물질에의해서만항산화활성을나타내는 pyrogallol 을이용하여 JHGB 의항산화활성을측정한결과 200, 100, 50, 25 (μg/ml) 농도에서각각 29.4±3.0, 21.4±2.4, 14.4±2.2, 12.2±2.4 (%) 의항산화활성효과를나타내었다 (Fig. 9). Fig. 10. Effects of JHSB on ROS production of HUVEC induced by TNF-α The results represent the mean ± S.D. Statistically significant value was calculated by compared with control group by Student's t-test (++p<0.01). compared with TNF-α group by Student's t-test (*p<0.05). Fig. 9. Effects of JHGB on superoxide dismutase like activity. JHGB were reacted with tris-hcl buffer (ph 8.5) 2.6 ml and 7.2 mm pyrogallol 0.2 ml for 10 3. HUVEC에서 apoptosis에미치는영향대조군이 15.43±2.93(%) 일때, LPS 처리군은 58.47±2.74(%) 로대조군에비하여유의성있는 (++p<0.01) 증가를나타내었고, JHSB 50 (μg/ml) 농도에서 45.65±2.98(%) 로나타나대조군에비해유의성있는 (**p<0.01) 감소를나타내었다 (Fig. 11). 251
製何首烏加味方이고지혈증및산화적손상에미치는영향 Fig. 11. Effects of JHSB on apoptosis of HUVEC induced by LPS. The results represent the mean ± S.D. compared with control group by Student's t-test (++p<0.01). compared with LPS group by Student's t-test (**p<0.01). 4. 콜레스테롤변화에미치는영향 1) Total cholesterol 의변화에미치는영향혈청내 total Cholesterol의변화는, 정상군은 77.7±7.1 (mg/dl), 대조군은 179.7±13.4 (mg/dl) 으로나타나정상군에비해유의성있는 (++p<0.01) 증가를나타냈으며, JHSB 투여군에서는 131.0±15.5 (mg/dl) 로나타나대조군에비해유의성있게 (**p<0.05) 감소하였다 (Fig. 12). JHSB : Hyperlipidemic diet and JHSB (209 mg /0.5 ml/day) treated group The results represent the mean ± S.D. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by Student's t-test (++p<0.01). compared with control group by Student's t-test (**p<0.01). 2) LDL cholesterol 의변화에미치는영향혈청내 LDL Cholesterol 의변화는, 정상군은 12.7±1.5 (mg/dl), 대조군에서 127.3±15.0 (mg/dl) 으로나타나정상군에비하여유의성있는 (++p<0.01) 증가를나타냈으며, JHSB 투여군에서는 83.3±7.2 (mg/dl) 로나타나대조군에비하여유의성있게 (**p<0.01) 감소하였다 (Fig. 13). Fig. 12. Effect of JHSB on the total-chol. level in hyperlipidemia rat. 252
윤현덕 조현경 유호룡 설인찬 김윤식 JHSB : Hyperlipidemic diet and JHSB (209 mg /0.5 ml/day) treated group The results represent the mean ± S.D. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by Student's t-test (++p<0.01). Statistically significant value was calculated by compared with control group by Student's t-test (**p<0.01). Fig. 13. Effect of JHSB on the LDL-Cholesterol level in hyperlipidemia rat. JHSB : Hyperlipidemic diet and JHSB (209 mg /0.5 ml/day) treated group The results represent the mean ± S.D. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by Student's t-test (++p<0.01). compared with control group by Student's t-test (**p<0.01). 3) HDL cholesterol 에미치는영향혈청내 HDL Cholesterol 의변화는, 정상군은 42.8±1.6 (mg/dl), 대조군은 32.0±2.3 (mg/dl) 로나타나정상군에비해유의성있는 (++p<0.01) 감소를나타냈으며, JHSB 투여군에서는 42.7±4.3 (mg/dl) 로나타나대조군에비해유의성있게 (**p<0.05) 증가하였다 (Fig. 14). Fig. 14. Effect of JHSB on the HDL-Chol. level in hyperlipidemia rat. 5. Triglyceride 변화에미치는영향 Triglyceride 의변화는, 정상군은 33.8±6.2 (mg/dl), 대조군은 320.4±43.7 (mg/dl) 로나타나정상군에비해유의성있는 (++p<0.01) 증가를나타냈으며, JHSB 투여군에서는 34.0±10.6 (mg/dl) 로나타나대조군에비하여유의성있게 (**p<0.01) 감소하였다 (Fig. 15). Fig. 15. Effect of JHSB on the triglyceride level in hyperlipidemia rat. JHSB : Hyperlipidemic diet and JHSB (209 mg /0.5 ml/day) treated group The results represent the mean ± S.D. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by Student's t-test (++p<0.01). compared with control group by Student's t-test (**p<0.01). 12. Glucose 변화에미치는영향 Glucose의변화는, 정상군의 138.7±12.5 (mg/dl), 대조군은 183.3±9.5 (mg/dl) 로나타나정상군에비하여유의성있는 (++p<0.01) 증가를나타냈으며, JHSB 투여군에서는 157.0±2.6 (mg/dl) 로나타나대조군 253
製何首烏加味方이고지혈증및산화적손상에미치는영향 에비하여유의성있게 (*p<0.05) 감소하였다 (Fig. 16). reactive substance (TBARS) value in hyperlipidemia rat. JHSB : Hyperlipidemic diet and JHSB (209 mg /0.5 ml/day) treated group The results represent the mean ± S.D. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by Student's t-test (++p<0.01). compared with control group by Student's t-test (**p<0.01). Fig. 16. Effect of JHSB on the glucose level in hyperlipidemia rat. JHSB : Hyperlipidemic diet and JHSB (209 mg/ 0.5 ml/day) treated group The results represent the mean ± S.D. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by Student's t-test (++p<0.01). Statistically significant value was calculated by compared with control group by Student's t-test (*p<0.05). 8. 간조직의항산화활성에미치는영향 1) SOD의변화에미치는영향간조직내 SOD 의함량은정상군은 9.9±0.4 (unit/mg protein), 대조군은 5.1±0.7 (unit/mg protein) 로나타나정상군에비하여유의성있게 (++p<0.01) 감소하였으며, JHSB 투여군에서는 7.3±0.8 (unit/mg protein) 로나타나대조군에비하여유의성있게 (*p<0.05) 증가하였다 (Fig. 18). 7. 간조직의과산화지질함량에미치는영향간조직내과산화지질의함량은정상군은 5.6±0.7 (nmol/mg), 대조군은 31.1±2.9 (nmol/mg) 으로나타나정상군에비하여유의성있게 (++p<0.01) 증가하였으며, JHSB 투여군에서는 15.4±1.0 (nmol/mg) 으로대조군에비하여유의성있게 (**p<0.01) 감소하였다 (Fig. 17). Fig. 18. Effect of JHSB on hepatic SOD level in hyperlipidemia rat. Fig. 17. Effect of JHSB on hepatic thiobarbituric acid JHSB : Hyperlipidemic diet and JHSB (209 mg /0.5 ml/day) treated group The results represent the mean ± S.D. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by Student's t-test (++p<0.01). compared with control group by Student's t-test (*p<0.05). 254
윤현덕 조현경 유호룡 설인찬 김윤식 2) Catalase 의변화에미치는영향간조직내 Catalase 의함량은정상군은 14.0±0.4 (nmol/mg protein), 대조군은 7.9±0.7 (nmol/mg protein) 로나타나정상군에비해유의성있게 (++p<0.01) 감소하였으며, JHSB 투여군에서는 11.1±1.0 (nmol/mg protein) 로대조군에비하여유의성있게 (**p<0.01) 증가하였다 (Fig. 19). Fig. 19. Effect of JHSB on hepatic catalase level in hyperlipidemia rat. JHSB : Hyperlipidemic diet and JHSB (209 mg /0.5 ml/day) treated group The results represent the mean ± S.D. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by Student's t-test (++p<0.01). Statistically significant value was calculated by compared with control group by Student's t-test (**p<0.01). V. 考察 우리나라에서뇌졸중과관상동맥질환을포함한심혈관계질환은암과함께주요사망원인이며, 일반적으로흡연, 고혈압, 고지혈증이관상동맥질환의 3대위험요인이므로, 고지혈증을조기에치료하는것은동맥경화증, 나아가서관상동맥질환의발병을예방하게된다 15,16. 고지혈증이란혈중 total cholesterol 이나 LDL- cholesterol, TG 농도의증가를의미하지만, HDLcholesterol 의경우농도가감소하는것으로관상동맥질환의발생을증가시키는이상지질혈증을의미하며이를조절하여죽상경화증에의한관상동맥질환의발생을예방하는것이치료의목표가된다 17. 지질은인체에너지의주요공급원이며, 또몸의중요한구성성분이기도하다. 지질의대사는여러대사과정및호르몬분비에의하여조절되고있으며, 중추신경계 간 지방조직뿐만아니라근육등거의모든장기의상황에따라직 간접적영향을받는다. 장관에서흡수된지질은그대로는체내순환이불가능하므로지단백질과결합하여킬로미크론 (chylomicreon) 을형성하여혈중으로들어오게된다. 이렇게흡수된지질은직접에너지원으로쓰이거나세포목이나호르몬의재료로쓰이며, 남는경우는지방조직내에중성지방의형태로저정하였다가필요한때에다시쓰이기도한다, 이러한지질대사가장애를받으면혈청중의콜레스테롤과중성지방이증가하게되어관상동맥과뇌혈관의죽상경화를유발한다 2,19. 고지혈증은원발성과속발성으로분류되며원발성은선천적으로지질대사에관여하는유전인자의결함에의해발생한것이고, 속발성은당뇨, 만성신부전, 과음, 비만, 약물과용, 갑상선기능저하증, 신증후군, 부신피질호르몬과다, 부적절한음식섭취등으로인하여지질성분이이차적으로증가하여발생한것이다 19. 고지혈증의치료는우선적으로식이요법을실시하는것이기본이며중증인경우나합병증의위험이현저할때는약물치료등을병행하여상승된혈중지방을정상범위로내려서동맥경화성심장질환의위험및진행을감소시킨다. 심혈관질환의다른위험인자가없는 35세미만의남자나폐경이전의여자인경우 LDL-cholesterol 의농도가 190 mg/dl을넘어 220 mg/dl까지되더라도약물요법은가급적연기하고식이요법이나운동등의비약물요법을최대한권장하도록한다. 3-6개월간의 255
製何首烏加味方이고지혈증및산화적손상에미치는영향 식이요법및운동, 금연등의비약물요법에도불구하고 LDL-cholesterol의농도가 190 mg/dl 이상이거나, 심혈관질환의위험인자를 2가지이상가지고있으면서 LDL-cholesterol 의농도가 160 mg/dl 이상인경우는약물요법이고려되어야한다. 약물요법의목표는일반환자인경우 LDL-cholesterol 의농도를 160 mg/dl 미만, 2가지이상의위험인자를가지고있는환자인경우는 130 mg/dl 미만으로유지하도록하여야한다. 관상동맥질환을가지고있는환자인경우는 LDL-cholesterol 의농도가 130 mg/dl 이상인경우약물요법의대상이되며, 100 mg/dl 이하로유지시키는것이치료의목표가된다 20. 고지혈증치료에사용되는주요약물로는 HMG CoA reductase inhibitors(statins), micronized fenofibrate (Lipidil). bile acid sequestrants(resins), Nicotininc acid, probucol, 어유또는오메가-3 지방산등이있다 7,8. 1950년대부터식이나운동요법과같은비약물요법이나 niacin, fibrate, resin 등의약제를사용하여혈중콜레스테롤농도를낮춰서관상동맥질환을예방하고자하는연구들이시작되었고, 최근에 HMG-CoA reductase 억제제 (Statins) 가콜레스테롤농도를 20-30% 감소시킬수있게되어관상동맥질환의발생을 30% 정도감소시켰다 9-11. 이중가장효과적인 HMG-CoA reductase는 cholesterol 합성의반응속도를조절하는효소이며, 이효소의억제는 cholesterol 합성을저하시킨다. HMG-CoA reductase inhibitor(statin) 는 cholesterol 합성을억제하여간의 LDL 수용체활성을증가시켜순환 LDL 대사를촉진하여 LDL-cholesterol 을저하시키고, 혈장 TG도저하시키며, HDL-cholesterol 을증가시킨다 21. 최근에는천연항산화제로각광받는비타민류 ( 비타민 A, C, E), EGCG(epigallocatechin -3-gallate), 이소플라본 (genistein, daidzein, glycitein) 등이심혈관계질환의저감인자로검토되고있다 22. 한의학에서고지혈증이라는용어는찾아볼수 없으나이로인하여나타나는증상들에준하여痰證, 心悸, 眩暈, 頭痛, 胸痞, 眞心痛, 中風등의범주에해당된다볼수있으며, 고지혈증으로인한동맥경화증은주로水濕, 痰濁, 瘀血이체내에발생하여脾虛痰沮, 濕熱鬱結, 胃熱腑實, 氣滯血瘀등의병리기전을수발함으로써발생하는것으로인식하였다 23,24. 고지혈증은本虛標實證으로볼수있는데肝脾腎虛는本虛에, 痰濕, 瘀血은標實에속한다. 治法에있어서滋補肝腎, 調理脾胃로扶正하고, 活血化瘀, 利濕化痰으로祛邪하여標本同治, 補瀉兼施하므로高脂血症의治方은補益藥, 利濕化瘀藥, 活血化瘀藥等이相互組合되어構成되어있는것이많다 13. 본실험에사용된製何首烏加味方 (JHSB) 은 心血管科專病中醫臨床診治 14 에기록된처방으로대전대학교한방병원에서순환기계질환에다용되는처방이다. 구성은製何首烏 20 g, 拘杞子 15 g, 免絲子 12 g, 決明子 15 g, 白茯苓 10 g, 山査肉 15 g, 黃芩 10 g, 茵蔯 15 g, 蘿葍子 15 g, 淫羊藿 8 g으로, 滋補肝腎, 利濕化痰의효능이있어본연구를통하여고지혈증치료제로서의과학적근거를마련하고자하였다. 이에저자는 JHSB 에대해 HPLC 패턴분석, 독성평가를시행한후고cholesterol 식이로유발된고지혈증백서모델을이용하여실험을진행하였다. in vitro에서항산화활성, HUVEC 에서 apoptosis, THP-1 세포의 transmigration, LPS로유도된부착분자의발현, NF-kB 활성, 케모카인및염증성사이토카인생성량, THP-1 세포에서의 MCP-1 에의한세포유주운동을, in vivo에서몸무게및간무게, 콜레스테롤변화, Triglyceride 변화, Glucose 변화, Albumin 변화, Globulin 변화, Albumin/ Globulin ratio 변화, 간조직의과산화지질함량, 간조직의항산화활성, 간조직의콜레스테롤인자발현, 조직변화등에미치는영향등을측정하였다. 세포독성평가결과, 대조군의 HUVEC 세포 256
윤현덕 조현경 유호룡 설인찬 김윤식 생존율을 100±1.4(%) 로하였을때, JHSB 10, 20, 50 (μg/ml) 농도처리군에서는생존율이각각 99.3 ±6.2, 94.7±3.7, 107.9±6.8(%) 로나타났다. THP-1 세포에대한세포독성에서는대조군의세포생존율을 100±0.0(%) 로하였을때, JHSB 5, 10, 20, 50 (μg/ml) 농도처리군에서는생존율이각각 89.8± 4.4, 92.8±3.8, 87.8±4.2, 91.2±5.6(%) 로나타나세포에독성영향을주지않는것으로평가할수있다. 약물이간과신장의독성에미치는영향을확인하기위해, 간기능의변화를확인한결과, AST 는 JHSB 투여군에서는 207.7±33.3 (IU/L) 로나타나대조군에비하여유의성있게 (**p<0.01) 감소하였다. ALT는 JHSB 투여군에서는 67.7±35.0 (I.U/L) 로나타나대조군에비하여유의성있게 (**p<0.01) 감소하였다. ALP 는 JHSB 투여군에서는 155.0±19.1 (IU/L) 로나타나대조군에비하여유의성있게 (**p<0.01) 감소하였다. 신장기능의변화를알아본결과 creatinine 은 JHSB 투여군에서는 0.50±0.03 (mg/dl) 로감소하였다. Uric acid는 JHSB 투여군에서는 1.78±0.16 (mg/dl) 로나타나대조군에비하여유의성있게 (**p<0.01) 감소하였다. JHSB를투여한군에서 HUVEC 및 THP-1 세포의생존율변화에영향은없었고, AST, ALT, creatinine, uric acid를모두감소시켜, JHSB에의해유발된세포독성, 간독성신독성은없는것으로평가할수있으며, 본처방이고지혈증치료제가갖는간독성이나신장독성에대해보다더안전하게사용될가능성이있다고사료된다. 과다한유리기 (free radical) 는조직손상을유발하여허혈-재관류손상뿐만아니라각종성인병, 발암및노화에이르기까지다양한질병을유발하며, 과다하게생성된유리기에의한산화성스트레스에기인한다고생각된다 25. 특히지질과산화 (lipid peroxidation) 는산화성스트레스의주요원인으로 26, 지질과산화에의해생성된활성알데히드는교원질유전자의발현을증가시키고섬유화성사이토카인 (profibrogenic cytokine) 의분비 를촉진시키는것으로보고되고있다 27-29. Superoxide dismutase(sod) 와 catalase는효소계항산화계에해당되며, SOD는해로운환원산소종을과산화수소로변환시키는반응을촉매하는효소이며, CuZn-SOD 와 Mn-SOD 두종류가있고 30, SOD에의하여생성된과산화수소는 peroxidase 나 catalaase 에의하여무해한물분자와산소분자로전환되어산소상해로부터생체를보호하는것으로알려져있다. SOD 유사활성물질은 SOD와유사한활성을가지면서, SOD의단점을보완할수있으며산화방지는물론노화방지와도밀접한관계가있는것으로알려져있다 31. 세포질내에존재하는 catalase 는세포소기관인 peroxisome 내에서과산화수소를물과산소로분해하는효소로과산화수소에의한산화적손상으로부터세포를보호해주는중요한역할을한다 32. 산화적손상은고지혈증이진행에있어초기에나타나는현상이며, 항산화제의복용은고지혈증으로유발되는질병들의여러과정에작용하여질병을예방하는효과를나타내는것으로알려져있다 33-35. 따라서약리학적으로항고지혈효과를나타내며, 동시에항산화효과를나타내는약물을개발하기위한연구가지속되고있다 36. 본실험에사용된 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 방법은항산화성물질과반응시받아들이는전자로인해그자체의정체성을상실하는정도를측정함으로서간접적인항산화효과를확인할수있다. DPPH 를환원시키거나상쇄시키는능력이크면높은항산화활성및활성산소를비롯한다른 radical 에대한소거작용을기대할수있다 37. 항산화활성에미치는영향을알아보기위해 DPPH 소거능, SOD 유사활성, HUVEC 에서 ROS 생성에미치는영향을측정하였다. DPPH 의소거활성은 200, 100, 50, 25 (μg/ml) 농도에서각각 55.0±3.5, 38.2±1.1, 19.9±3.5, 8.3±1.2 (%) 로농도의존적으로증가하였다. SOD나 SOD 유사물질에의해서만항산화활성을나타내는 257
製何首烏加味方이고지혈증및산화적손상에미치는영향 pyrogallol 을이용하여 JHGB의항산화활성을측정한결과 200, 100, 50, 25 (μg/ml) 농도에서각각 29.4±3.0, 21.4±2.4, 14.4±2.2, 12.2±2.4(%) 의항산화활성효과를나타내었다. HUVEC에서 ROS 생성에미치는영향은대조군의 ROS 생성률이 1.00± 0.00일때, TNF-α 처리군은 2.43±0.23으로나타나대조군에비하여유의성있는 (++p<0.01) 증가를나타내었고, JHSB 50 (μg/ml) 농도에서 1.47±0.30 으로 TNF-α 처리군에비하여유의성있게 (*p<0.05) 감소하였다. 이로미루어볼때 JHSB 는세포내항산화활성을증가시킨다고보인다. Apoptosis는세포사멸에관계하는신호전달체계로써우연히일어나는 necrosis 와달리 target 에서생성되는 trophic(survial) factor 의부족에의해일어나는세포사이며 gene-directed cellular self-destruction 또는 programmed cell death 로도불리운다 38,39. 원래성숙한세포가특정한 cell death gene의발현에의해오랜기간에걸쳐사멸하는현상으로세포예정사 (programmed cell death) 에있어필수적인과정이다. 이는세포가능동적으로죽음에참여하는과정으로유도가가능하고질서정연하며, 조혈계를포함한많은종류의세포집단의항상성조절에중요한인자이다 40. HUVEC에서 apoptosis 에미치는영향을알아본결과대조군이 15.43±2.93(%) 일때, LPS 처리군은 58.47±2.74(%) 로대조군에비하여유의성있는 (++p<0.01) 증가를나타내었고, JHSB 50 (μg/ml) 농도에서 45.65±2.98(%) 로나타나대조군에비해유의성있는 (**p<0.01) 감소를나타내었다. 혈중의 total cholesterol 농도는주로간, 장관에서의 total cholesterol 생성과흡수및이상에관여하는여러인자에좌우되고, 체내지질대사이상의지표로서중요하며, 혈액내에필요이상많이존재하게되면고지혈증이유발되고죽상동맥경화증의주요원인이된다 41. 고Cholesterol 식이에의한고지혈유발쥐의간장의무게를측정한결과, 정상군은 2.3±0.2(g) 로, 대조군은 5.0±0.4(g) 으로나타나정상군에비해유의성있는 (++p <0.01) 증가를나타냈고, JHSB 투여군에서는 3.4±0.7(g) 로나타나대조군에비하여유의성있게 (**p<0.05) 감소하는것으로나타났다. 지속적인고Cholesterol 식이는간에지방을축적시키는데 JHSB가간의지방축적에대한억제작용이있을것으로판단된다. 고지혈증이란혈중 total cholesterol, LDL-cholesterol, TG 농도가증가하거나 HDL-cholesterol 이감소하는것 26 이므로, 본연구에서혈청내직접적인함량분석을시행하였다. 혈청내 total Cholesterol 의변화는, 정상군은 77.7±7.1 (mg/dl), 대조군은 179.7 ±13.4 (mg/dl) 으로나타나정상군에비해유의성있는 (++p<0.01) 증가를나타냈으며, JHSB 투여군에서는 131.0±15.5 (mg/dl) 로나타나대조군에비해유의성있는 (**p<0.05) 감소효과를나타내었다. LDL Cholesterol 의변화는, 정상군은 12.7± 1.5 (mg/dl), 대조군에서 127.3±15.0 (mg/dl) 으로나타나정상군에비하여유의성있는 (++p<0.01) 증가를나타냈으며, JHSB 투여군에서는 83.3±7.2 (mg/dl) 로나타나대조군에비하여유의성있는 (**p<0.01) 감소를나타내었다. 혈청내 HDL Cholesterol 의변화는, 정상군은 42.8±1.6 (mg/dl), 대조군은 32.0 ±2.3 (mg/dl) 로나타나정상군에비해유의성있는 (++p<0.01) 감소를나타냈으며, JHSB 투여군에서는 42.7±4.3 (mg/dl) 로나타나대조군에비해유의성있는 (**p<0.05) 증가를나타내었다. Triglyceride 의변화는, 정상군은 33.8±6.2 (mg/dl), 대조군은 320.4±43.7 (mg/dl) 로나타나정상군에비해유의성있는 (++p<0.01) 증가를나타냈으며, JHSB 투여군에서는 34.0±10.6 (mg/dl) 로나타나대조군에비하여유의성있는 (**p<0.01) 감소를나타냈다. 이와같은결과로미루어볼때혈청내 total Cholesterol, LDL Cholesterol, Triglyceride는감소시키고 HDL Cholesterol 은증가시키는 JHSB의혈청내의지질에대한유의성있는조절효과를확인하였다. Glucose의변화는, 정상군의 138.7±12.5 (mg/dl), 258
윤현덕 조현경 유호룡 설인찬 김윤식 대조군은 183.3±9.5 (mg/dl) 로나타나정상군에비하여유의성있는 (++p<0.01) 증가를나타냈으며, JHSB 투여군에서는 157.0±2.6 (mg/dl) 로나타나대조군에비하여유의성있는 (*p<0.05) 감소를나타내었다. 이로미루어볼때 JHSB 가혈중Glucose 를조절하여순환계질환및대사증후군에이용할수있을것으로보인다. 간조직의항산화활성에미치는영향을알아보기위해 SOD 의변화에미치는영향을알아본결과간조직내 SOD의함량은정상군은 9.9±0.4 (unit/mg protein), 대조군은 5.1±0.7 (unit/mg protein) 로나타나정상군에비하여유의성있게 (++p<0.01) 감소하였으며, JHSB 투여군에서는 7.3±0.8 (unit/mg protein) 로나타나대조군에비하여유의성있는 (*p<0.05) 증가를나타냈다. 간조직내 Catalase 의함량은정상군은 14.0±0.4 (nmol/mg protein), 대조군은 7.9±0.7 (nmol/mg protein) 로나타나정상군에비해유의성있게 (++p<0.01) 감소하였으며, JHSB 투여군에서는 11.1±1.0 (nmol/mg protein) 로대조군에비하여유의성있는 (**p<0.01) 증가를나타내었다. 이는 JHSB 투여가지질과산화도를억제하고항산화활성을증가시키는효과를가지고있음을확인할수있었다. 이상의실험내용을종합해보면 JHSB 은 in vitro에서항산화활성을증가시키고, HUVEC에서 apoptosis 를저하시켰다. 또한고cholesterol 식이로유발된고지혈증백서에투여한결과 total cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride, glucose 를감소시키고, HDL- cholesterol 을증가시켰다. 이러한변화를근거로고지혈증으로인하여발생할수있는다양한질환을예방할수있을것으로사료된다. 또한 SOD와 catalase 의조직내수치증가로미루어보아항산화활성을증가시키는데유효한효과를가지고있었다. 이로미루어보아 JHSB 는혈관내손상과노화현상을막아순환기계질환에유효한효과가있을것으로기대되며, 고지혈증으로야기할수있는 죽상동맥경화증, 허혈성심질환, 뇌경색, 고혈압, 비만, 당뇨병, 지방간, 간경변등의예방에도응용할수있을것이라사료된다. 향후이연구결과를바탕으로하여고지혈증에대한처방에대한추가적인한의학적실험연구가이어지길바란다. V. 結論製何首烏加味方 (JHSB) 이고지혈증에미치는영향을알아보기위하여세포와간 신의독성을평가한후, in vitro에서항산화활성, HUVEC 에서 apoptosis, in vivo에서콜레스테롤변화, Triglyceride 변화, 간조직의과산화지질함량, 간조직의항산화활성등에미치는영향등을관찰하여다음과같은결과를얻었다. 1. 製何首烏加味方은세포독성및간독성, 신독성이없었다. 2. 製何首烏加味方은 ROS 생성을유의성있게억제하였다. 3. 製何首烏加味方은혈청내의 total cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride, glucose를유의성있게감소시켰으며, HDL-cholesterol 을유의성있게증가시켰다. 4. 製何首烏加味方은간조직의과산화지질을유의성있게감소시켰으며, SOD와 catalase를유의성있게증가시켰다. 이상으로製何首烏加味方은항산화능및항고지혈증효과가있는것으로생각되며고지혈증에대한예방및치료에응용될수있을것으로사료된다. 參考文獻 1. http://kosis.kr/metadata/main.jsp?surv_id=19&cur Year=2008, 통계청. 사망원인통계. 2008. 2. 전국한의과대학심계내과학교실. 한방순환신경 259
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