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1 대한한방내과학회지제 35 권 2 호 (2014 년 6 월 ) J. Int. Korean Med. 2014:35(2) 고지방식이로유발된고지혈증동물모델에서四物活血湯의효과연구 강성순, 신용진, 조재준, 전상윤동신대학교한의과대학내과학교실 Study of the Effects of Samulhwalhyeol-tang in Hyperlipidemic Animal Model Induced with a High-Fat Diet Seong-sun Kang, Yong-jin Shin, Jae-joon Jo, Sang-yun Jeon Dept. of Internal Medicine, College of Korean Medicine, Dong-Shin University ABSTRACT Objectives : This study was undertaken to investigate the effects of Samulhwalhyeol-tang (SM) in a hyperlipidemic animal model induced by a high-fat diet using diverse biological methods. Methods : This study was to determine whether fractionated EtOH extracts of SM inhibit reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO) in RAW cells. Hyperlipidemia was induced by a high-fat diet fed for 6 weeks. Total cholesterol, LDL cholesterol, HDL cholesterol, triglyceride, glucose, liver function, cholesterol gene revelation control efficiency, and histologic change of liver were measured after oral administration of SM. Results : 1. Compared to the control group, ROS production (%) and NO production (%) were decreased significantly by SM. 2. Total cholesterol, LDL cholesterol, triglyceride were decreased significantly by SM. 3. HDL cholesterol was increased significantly by SM. 4. Rats' body weight and glucose were decreased significantly by SM. 5. AST, ALP were decreased significantly by SM. 6. In histopathologic examination, fatty liver and fiver fibrosis were inhibited, almost eliminated as round of fat was observed in the liver. Conclusions : SM would appear that effective in the prevention and treatment of atherosclerosis, ischemic heart disease, other cardiovascular diseases, fatty liver and nephrotic syndrome caused by hyperlipidemia. Key words : Samulhwalhyeol-tang, hyperlipidemia, RAW cell, C57BL/6J, antioxidant activity Ⅰ. 서론 2012 년통계청에서발표한사망원인통계에따 교신저자 : 전상윤광주시남구월산로 141 동신대부속광주한방병원 2 내과 TEL: damiano70@hanmail.net 르면, 국내 3대사망원인질환으로암과함께심장질환과뇌혈관질환을꼽을수있어 1, 순환기계질환의중요성이강조되고있으며그중심혈관계질환의중요한발병인자로비만및고지혈증이잘알려져있다 2. 고지혈증은동맥경화의중요한인자중의하나로동맥혈관벽에콜레스테롤등의지질이침착 119

2 고지방식이로유발된고지혈증동물모델에서四物活血湯의효과연구 하여혈관을협착시키거나경화시켜혈액의흐름을악화시키는것으로순환기질환의공통병인으로인식되고있다. 특히암과함께순환기질환이사망률의수위를차지하고있어고지혈증에대한근본적이고효율적인대책이요구되고있다 3,4. 고지혈증은한의학적으로痰濁, 濕熱, 瘀血의범주에속하고, 嗜食肥甘厚味의外因과, 肝脾腎機能失調의內因에의해痰濁, 濕熱, 瘀血이生하여발병한다고보았다. 따라서滋補肝腎, 調理脾胃로扶正하고, 利濕化痰, 活血化瘀로祛邪하는補瀉兼施의治法을응용할수있다 5. 최근고지혈증에대한한의학연구로는茵蔯蒿, 枳實, 白何首烏, 丹蔘등의한약재 6-9 와防風通聖散, 加味除濕順氣湯, 柴苓湯등의처방 에관한실험적연구가있다. 四物活血湯은郭등 13 의 < 心血管病妙法良方大全 - 高脂血症編 > 에수록된임상처방에決明子, 何首烏, 菊花를가미한처방으로임상적으로항고지혈증의효과가있는것으로알려져이를실험적으로규명하고, 기전을밝히고자연구하게되었다. 이에저자는四物活血湯추출물을 RAW 세포를이용하여항산화효과를측정하고, 고지혈증질환모델동물인 6주령의수컷 C57BL/6J 생쥐를이용하여혈액화학적인자, 체중변화, 간에대한효과, 간조직의 cholesterol 인자발현에미치는영향등을관찰하여유의한결과를얻었기에보고하는바이다. Ⅱ. 재료및방법 1. 재료 1) 약재본실험에사용한四物活血湯 (Samulhwalhyeol-tang 이하 SM으로표기 ) 의구성약재들은 옴니허브 (Korea) 에서구입하였고, 동신대학교부속순천한방병원에서정선후사용하였다. 그내용과분량 (1 첩 ) 은다음과같다 (Table 1). Table 1. The Prescription of SM. Herbal medicine name Pharmacognostic name Weight (g) 丹蔘 Salviae Miltiorrhizae Radix 30 當歸 Angelicae Giantis Radix 30 山査 Crataegi Fructus 30 生地黃 Rehmanniae Radix Drudus 30 桔梗 Platycodi Radix 20 桃仁 Persicae Semen 20 白芍藥 Paeoniae Radix Alba 20 牛膝 Achyranthis Bidentatae Radix 20 枳實 Aurantii Immaturus Fructus 20 川芎 Cnidii Rhizoma 20 蒲黃 Typhae Pollen 20 甘草 Glycyrrhizae Radix 12 柴胡 Bupleuri Radix 12 紅花 Carthami Flos 12 決明子 Cassiae semen 5 何首烏 Polygoni Multiflori Radix 5 菊花 Chrysanthemi Flos 3 Total amount 309 2) 세포실험에사용된 RAW 세포는한국세포주은행 (Korea) 에서구입하였다. 3) 동물및사료본실험을위하여사용된 C57BL/6J(6 주령, 수컷, 18~22 g) 는 중앙실험동물 (Korea) 에서구입하여사용하였다. 실험동물은 2주간의안정기를가지면서순화를시켰으며, 안정기동안모든실험군에는일반사료 ( 퓨리나, Korea) 를자유식이하였다. 안정기를마친후정상군에는일반사료를, 고지혈증을유도하기위한대조군과 SM 투여군에는고지방사료 ( 중앙실험동물, Korea) 를 2주간자유식이하면서물을충분히공급하였다. 동물사육실의조건은 conventional system으로 22±2, 1 일중 12시간은 Lux로조명하고, 12시간은모든빛을차단하였다. 본실험은대전대학교동물실험윤리위원회의승인 ( 동물사용윤리위원회승 120

3 강성순 신용진 조재준 전상윤 인번호 DJUARB ) 을받아동물윤리준칙에의거하여실험하였다. 일반사료, 고지방사료 의kg당조성의내용과분량은다음과같다 (Table 2, Table 3). Table 2. The Components of Normal Diet. Nutrients Protein % Arginine % 1.26 Cystine % 0.37 Glycine % 0.87 Histidine % 0.50 Isoleucine % 0.82 Leucine % 1.47 Lysine % 1.01 Methionine % 0.33 Phenylalanine % 0.98 Tyrosine % 0.63 Threonine % 0.72 Tryptophane % 0.25 Valine % 0.91 Fat (etheretract) % 4.50 Linoleic Acid % 1.10 Linolenic Acid % 0.12 Arachidonic Acid % 0.02 Omega-3 Fatty acid % 1.11 Fiber (Crude) % 3.70 Minerals Ash % 7.25 Calcium % 1.20 Phosphorus % 0.62 Phosphorus (non-phytate) % 0.40 Potassium % 0.82 Magnesium % 0.16 Sulfur % 0.22 Sodium % 0.34 Chlorine % 0.47 Fluorine ppm Iron ppm Zinc ppm Manganese ppm Copper ppm Cobalt ppm 0.78 Iodine ppm

4 고지방식이로유발된고지혈증동물모델에서四物活血湯의효과연구 Chromium ppm 0.00 Selenium ppm 0.32 Vitamins Vitamin K ppm 6.69 Thyamin hydrichloride ppm Riboflavin ppm Niacin ppm Pantothenic acid ppm Choline chioride ppm 3, Folic acid ppm Pyridoxine ppm Biotin ppm 0.12 Vitamin B12 ppm Vitamin A IU/g Vitamin D3 (added) IU/g 4.00 Vitamin E IU/kg Calories provided by : Protein % Fat (ether extract) % Carbohydrates % Nutrients expressed as percent of ration except where otherwise indicated. Moisture content is assumed to be 10.0% for the purpose of calculations. Table 3. The Components of High Cholesterol Diets. Components Weight (gm) Casein, 80 Mesh L-Cystine 3.00 Maltodextrin Sucrose Cellulose, BW Soybean Oil Lard Mineral Mix S DiCalcium Phosphate Calcium Carbonate 5.50 Potassium Citrate, 1 H Vitamin Mix V Choline Bitartrate 2.00 FD & C Blue Dye # Total amount 방법 1) High performance liquid chromatography (HPLC) 분석 SM 에탄올추출물 30 mg을 80% 주정 1 ml에녹여 0.45 μm membrane filter로여과후 10 μl를 HPLC 시료로사용하였다. HPLC 는 Shimadzu(Japan) 사의 system controller(cbm-20a), pump(lc-20ad), column oven(cto-20a), diode array detector(spd -M20A) 를사용하였으며, column은 ZORBAX Eclipse Plus C18( mm, 5 μm) 을사용하였다. 이동상은 water(a) 와 acetonitrile(b) 로 gradient elution system 을적용시켜 0~5 분 (0% B), 5~40 분 (30% B), 40~60분 (80% B), 60~80분 (100% B) 로설정하였다. 유속은 1.0 ml/min이었으며 column 온도는 40 를유지하였고, UV wavelength는 210 nm로설정하여분석하였다. 122

5 강성순 신용진 조재준 전상윤 2) In vitro (1) 세포배양동결된 RAW 세포를해동시킨후 50 ml 튜브에옮기고, PBS 9 ml을넣어세포를부유시킨뒤 1,200 rpm에서 5분간원심분리하여상등액을제거하였다. 세포가있는튜브에 10% fetal bovine serum(fbs) 와 1% penicillin으로조성된 dulbecco's modified eagle's medium(dmem) 배지 1 ml을넣어부유시켰다. 100 mm dish에 9 ml의배지를넣고, 부유시킨세포 1 ml을넣어세포배양기 (37, 5% CO 2) 에서배양하였다. 계대배양횟수는 5회이상으로하였고, 시료들을처리하기전에 24시간을적응시켰다. (2) 세포독성측정 RAW 세포는 96 well plate에 cells/well 로분주하여 24시간동안배양하였다. 실험을하기전에새로운배양액으로교체하였고, SM를각각 1, 10, 100(μg/ml) 의농도로처리하여다시 24시간동안배양하였다. 배양후 10 μl의 WST solution 을첨가하여세포배양기 (37, 5% CO 2) 에서 30분간반응시켰다. 반응후 450 nm에서흡광도의변화를측정하여대조군에대한세포생존율을백분율로표시하였다. (3) 항산화효능측정 1 세포내 reactive oxygen species(ros) 생성측정 RAW 세포에서 ROS를측정하기위하여 2',7'-dichlorofluorescin diacetate(dcf-da) 를이용하였다. 12 well plate에 RAW 세포를 cells/well 이되게분주하여 24시간동안배양하였다. 배양후새로운배양액으로교체하였으며, SM 추출물을 1, 10, 100(μg/ml) 의농도로처리하고, Lipopolysaccharide(LPS) 1 μg/ml의농도로처리한후, 다시 24시간동안 37, 5% CO 2 배양기에서배양하였다. 배양후, 1,200 rpm에서 5분간원심분리하여모은세포를차가운 PBS로 2회세척하고, DCF-DA 10 μm이되도록첨가하여 15분동안 암소, 상온에두었다. 염색후차가운 PBS를넣어 1,200 rpm에서 5분간원심분리한다음상청액을제거하고다시 PBS 400 μl를부유시켜유세포분석기 (Flow cytometer, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ U.S.A) 를이용하여형광강도의세기에따른변화를분석하였다. 2 Nitric oxide(no) 측정 NO의농도는 griess reagent system 을이용하여측정하였다. RAW 세포는 96 well plate에 cells/well로분주하여 24시간동안배양후새로운배양액으로교체하였고, SM 추출물을 1, 10, 100(μg/ml) 의농도로처리하고, LPS 1 μg/ml 의농도로처리하여다시 24시간동안세포배양기 (37, 5% CO 2) 에서배양하였다. N1 buffer 50 μl 를각 well에처리하여 10분간상온에서반응한후, N2 buffer 50 μl를각 well에처리하고 10분간반응시켰다. 반응후 540 nm에서흡광도를측정하였다. Nitrite standard 의농도별표준곡선을이용하여배양액의 NO 농도를결정하였다. 3) In vivo (1) 고지혈유발및약물투여실험군의구분은일반식이를투여한정상군, 2 주간의고지방식이사료로고지혈증유도한쥐를대조군과 SM 추출물을투여한실험군으로각 8마리씩나누어진행하였고, 실험이진행되는동안자유식이를하였다. 정상군과대조군에는증류수를실험군에는 SM 추출물을매일 1회, 오전 10시에 200 μl(200 mg/kg) 씩투여하였다. SM 추출물투여량은 1첩을성인체중 60 kg에 1회투여용량으로하고, 1첩으로부터얻은시료를마우스체중 30 g 으로기준하여산출하였다. (2) 혈액화학적검사혈중내의 total cholesterol, high density lipoprotein cholesterol(hdl cholesterol), low density lipoprotein cholesterol(ldl cholesterol), triglyceride(tg), glucose 의함량을측정하기위해실험종료후심장천자법을이용하여혈액을채취하여, 그혈액을 30분간 123

고지방식이로유발된고지혈증동물모델에서四物活血湯의효과연구 상온에서굳힌뒤 3,000 rpm에서 15분간원심분리후혈청을분리하여서울의과학연구소 (Korea) 에분석의뢰하였다. (3) 체중측정안정기 2주와고지혈증유발기 2주를거친후, 고지혈증유발쥐에 SM 추출물을 4주간투여하였으며, 0주부터실험이진행되는 8주까지매주체중을측정하였다.

6 고지방식이로유발된고지혈증동물모델에서四物活血湯의효과연구 상온에서굳힌뒤 3,000 rpm에서 15분간원심분리후혈청을분리하여서울의과학연구소 (Korea) 에분석의뢰하였다. (3) 체중측정안정기 2주와고지혈증유발기 2주를거친후, 고지혈증유발쥐에 SM 추출물을 4주간투여하였으며, 0주부터실험이진행되는 8주까지매주체중을측정하였다. (4) 간기능검사혈청내에서 aspartate aminotransferase(ast), alanine aminotransferase(alt), alkaline phosphatase (ALP) 의활성도를측정하기위해실험종료후심장천자법을이용하여혈액을채취하였다. 혈액을 30분간상온에서굳힌뒤 3,000 rpm에서 15분간원심분리후혈청을분리하여, 서울의과학연구소 (Korea) 에분석의뢰하였다. AST, ALT, ALP의활성도는 JSCC UV method 의원리를이용하여생화학자동분석기로측정하였다. (5) 조직병리학적검사 Ether 로마취하여심장천자법를통해혈액을채혈하고흉부및복강을절개하여간조직을적출하였다. 각실험군별로적출한조직은 10% 중성포르말린에 48시간고정하고, 바이오톡스텍 (Korea) 에 hematoxyline 과 eosin(h&e) 을의뢰하여관찰및사진촬영하였다. Fig. 1. HPLC chromatogram of 80% ethanol extract of SM. Column; ZORBAX Eclipse Plus C18( mm, 5 μm), sample injection volume; 10 μl, mobile phase; H 2O(A)/ACN(B) gradient elution : 0~5min (0% B), 5~40min(30% B), 40~60min(80% B), 60~80min(100% B), flow rate; 1.0 ml/min, detector; PDA detector 2. In vitro 1) 세포독성 RAW 세포주에서세포생존율을측정한결과, 대조군을 100.0±12.6% 로나타냈을때 SM 추출물은각각 1, 10, 100(μg/ml) 농도에서 146.1±21.4%, 136.1±18.6%, 125.1±16.8% 의세포생존율을나타내었다 (Fig. 2). 3. 통계처리실험결과는 SPSS 17.0의 Student T-test 를사용하여통계처리하였으며 P<0.05, P<0.01 및 P<0.001 수준에서유의성을검정하였다. Ⅲ. 실험결과 1. HPLC pattern 분석 SM 주정추출물을 HPLC 를이용하여 pattern 분석한결과, 210 nm에서 retention time이 38.76분, 분, 분대에 peak 를확인할수있었다 (Fig. 1). Fig. 2. Cell viability of SM extract in RAW cells. RAW cell was treated with 1, 10 and 100 (μg/ml) of SM extract for 24hr. Cell viability was measured using an MTT assay. The results were expressed as mean ± SD from three independent experiments. 124

7 강성순 신용진 조재준 전상윤 2) 항산화효능에미치는영향 (1) ROS의생성에미치는영향 SM 추출물의 ROS 생성저해활성은대조군을 100.2±0.2% 로나타냈을때정상군은 51.6±15.8%, SM 투여군은 1 μg/ml 농도에서 93.5±14.9%, 10 μg/ml 농도에서 90.3±5.3%, 100 μg/ml 농도에서 81.8±4.9% 로나타났으며, 100 μg/ml 농도에서유의성있게 (* : P<0.05) 감소하였다 (Table 4). (2) NO의생성에미치는영향 RAW 세포주에서 SM 추출물의 NO 생성량은대조군을 100.0±3.7% 로나타냈을때정상군은 39.7±4.1%, SM 투여군은 1 μg/ml 농도에서 96.7 ±4.8%, 10 μg/ml 농도에서 94.5±5.9%, 100 μg/ml 농도에서 81.1±7.8% 로나타났으며, 100 μg/ml 농도에서유의성있게 (*** : P<0.001) 감소하였다 (Table 4). Table 4. Effect of SM Extract on LPS-induced ROS and NO Production in RAW Cells. ROS NO Normal (%) 51.6± ±4.1 Control (%) 100.2± ±3.7 SM1 (%) 93.5± ±4.8 SM10 (%) 90.3± ±5.9 SM100 (%) 81.8±4.9* 81.1±7.8*** The results were expressed as mean ± SD. * : P<0.05 compared with control *** : P<0.001 compared with control 4. In vivo 1) 혈중콜레스테롤에미치는영향 (1) total cholesterol의변화에미치는영향혈청내 total cholesterol 함량을측정한결과, 정상군은 85.99±9.54 mg/dl, 대조군은 ±35.96 mg/dl, SM 투여군은 ±18.54 mg/dl으로나타나, 대조군에비해유의성있게 (*** : P<0.001) 감소하였다 (Table 5). (2) LDL cholesterol 함량혈청내 LDL cholesterol 함량을측정한결과, 정상군은 32.71±7.70 mg/dl, 대조군은 ±16.12 mg/dl, SM 투여군은 ±9.55 mg/dl으로나타나, 대조군에비해유의성있게 (*** : P<0.001) 감소하였다 (Table 5). (3) HDL cholesterol 함량혈청내 HDL cholesterol 함량을측정한결과, 정상군은 40.00±2.83 mg/dl, 대조군은 27.25±2.44 mg/dl, SM 투여군은 36.88±2.32 mg/dl 으로나타나, 대조군에비해유의성있게 (* : P<0.05) 증가하였다 (Table 5). (4) TG 변화에미치는영향혈청내 TG 함량을측정한결과, 정상군은 ±6.10 mg/dl, 대조군은 ±14.46 mg/dl, SM 투여군은 ±11.44 mg/dl으로, 대조군에비해유의성있게 (* : P<0.05) 감소하였다 (Table 5). Table 5. Effect of SM Extract on the Serum Biomedical Levels in High-fat Diet Induced Hyperlipidemia Mice. Nor Con SM total cholesterol (mg/dl) 85.99± ± ±18.54*** LDL cholesterol (mg/dl) 32.71± ± ±9.55*** HDL cholesterol (mg/dl) 40.00± ± ±2.32* TG (mg/dl) 94.71± ± ±11.44* The results were expressed as mean ± SD (n=8). Nor : Normal C57BL/6J mice group Con : Induced by high fat diet C57BL/6J hyperlipidemia mice group SM : Induced by high fat diet C57BL/6J hyperlipidemia mice group treated with SM extract * : P<0.05 compared with control *** : P<0.001 compared with control 125

8 고지방식이로유발된고지혈증동물모델에서四物活血湯의효과연구 2) 체중변화에미치는영향고지혈증을유발시킨쥐의체중증가에미치는영향을측정한결과, 실험종료후정상군은 24.81± 0.37 g, 대조군은 26.48±0.53 g, SM 투여군은 24.60± 1.01 g으로고지혈증을유발하기전체중에비해증가함을나타내었고, SM 투여군은대조군에비하여 8주에서는유의성있는 (* : P<0.05) 체중감소를나타내었다 (Table 6). Table 6. Effect of SM Extract on the Increase of Body Weight in High-fat Diet Induced Hyperlipidemia Mice. Nor Con SM Initial body weght (g) 18.78± ± ±0.21 Final body weight (g) 24.81± ± ±1.01* Weight gain (g) 6.10± ± ±1.10 The results were expressed as mean ± SD (n=8). * : P<0.05 compared with control 3) Glucose 변화에미치는영향혈청내 glucose 함량을측정한결과, 정상군은 64.60±4.22 mg/dl, 대조군은 ±13.14 mg/dl, SM 투여군은 ±11.59 mg/dl으로대조군에비해유의성있게 (** : P<0.01) 감소하였다 (Fig. 3). Fig. 3. Effect of SM extract on the serum glucose levels in high-fat diet induced hyperlipidemia mice. The results were expressed as mean ± SD (n=8). Nor, Normal C57BL/6J mice group; Con, Induced by high fat diet C57BL/6J hyperlipidemia mice group; SM, Induced by high fat diet C57BL/6J hyperlipidemia mice group treated with SM extract. (Significance of results, ** : P<0.01) 4) 간기능에미치는영향 (1) AST 변화에미치는영향혈청중의 AST를측정한결과, AST는정상군이 65.4±4.7 U/L, 대조군이 153.0±8.2 U/L, SM 투여군이 114.8±8.5 U/L로나타나, 대조군에비하여유의성있게 (** : P<0.01) 감소하였다 (Table 7). (2) ALT 변화에미치는영향혈청중의 ALT를측정한결과, ALT는정상군이 31.7±1.7 U/L, 대조군이 47.6±4.7 U/L, SM 투여군이 43.8±4.9 U/L로나타났으며, 대조군에비하여유의한차이가나타나지않았다 (Table 7). (3) ALP 변화에미치는영향혈청중의 ALP를측정한결과, ALP는정상군이 93.8±6.7 U/L, 대조군이 180.4±8.9 U/L, SM 투여군은 122.7±15.9 U/L로나타나, 대조군에비하여유의성있게 (* : P<0.05) 감소하였다 (Table 7). 126

강성순 신용진 조재준 전상윤 Table 7. Effect of SM Extract on the AST, ALT and ALP Levels in High-fat Diet Induced Hyperlipidemia Mice. Nor Con SM AST(U/L) 65.4±4.7 153.0±8.2 114.8±8.5** ALT(U/L) 31.7±1.7 47.6±4.

Nor : Normal C57BL/6J mice group Con : Induced by high fat diet C57BL/6J hyperlipidemia mice group SM : Induced by high fat diet C57BL/6J hyperlipidemia mice group treated with SM extract * : P<0.

하지만대조군은간세포에서지방공포가관찰되었으며, 이로인해세포의핵이세포질안에서가장자리로밀려난것을알수있었고, 정상군에비해쿠퍼세포의수도현저히감소함을볼수있었다. SM 투여군에서는간세포내의지방공포로인해세포의크기는커져있지만, 대조군에비해지방공포가적어졌으며, 세포핵도중앙에위치하여있는호전현상을보였다 (Fig. 4).

9 강성순 신용진 조재준 전상윤 Table 7. Effect of SM Extract on the AST, ALT and ALP Levels in High-fat Diet Induced Hyperlipidemia Mice. Nor Con SM AST(U/L) 65.4± ± ±8.5** ALT(U/L) 31.7± ± ±4.9 ALP(U/L) 93.8± ± ±15.9* The results were expressed as mean ± SD from three independent experiments. Nor : Normal C57BL/6J mice group Con : Induced by high fat diet C57BL/6J hyperlipidemia mice group SM : Induced by high fat diet C57BL/6J hyperlipidemia mice group treated with SM extract * : P<0.05 compared with control ** : P<0.01 compared with control 5) 간조직염색관찰 (1) 간조직의세포형태변화에미치는영향간의조직을 H&E 염색하여관찰한결과, 정상군은간세포의핵이세포의중앙에위치하고있으며, 세포의크기도일정하고, 쿠퍼세포는간세포사이에전체적으로고르게분포되어있었다. 하지만대조군은간세포에서지방공포가관찰되었으며, 이로인해세포의핵이세포질안에서가장자리로밀려난것을알수있었고, 정상군에비해쿠퍼세포의수도현저히감소함을볼수있었다. SM 투여군에서는간세포내의지방공포로인해세포의크기는커져있지만, 대조군에비해지방공포가적어졌으며, 세포핵도중앙에위치하여있는호전현상을보였다 (Fig. 4). H&E staining Normal Control SM Fig. 4. Histology of liver section on normal and high-fat diet induced hyperlipidemia mice. Paraffin sections were stained with hematoxylin & eosin. The panels were representative photomicrographs of each of these risk at light microscope (Zeiss, 400). Normal, C57BL/6J mice group; Control, Induced by high fat diet C57BL/6J hyperlipidemia mice group; SM, Induced by high fat diet C57BL/6J hyperlipidemia mice group treated with SM extract. Ⅳ. 고찰 고지혈증 (hyperlipidemia) 이란혈액속에중성지방이나콜레스테롤이정상보다많은상태를말하며그원인에따라유전적결함에의한 1차성고지혈증과질병, 약물, 식이등의환경인자와관련이있는 2차성고지혈증으로분류되고있다 14. 1차성은 lipid나 lipoprotein 대사에서유전적형질의결손에의한이상으로유발되는것이고, 2차성은신증후군, 요독증, 갑상선기능저하증, 통풍, 담즙울체, 조절이잘안되는당뇨병, 비만, 알코올중독, 췌장염, 폐색성간장애, 말단비대증, 홍반성낭창등의질환외에임신이나경구피임약복용등으로인하여발생되는것을말한다 15. 고지혈증자체로는임상증상이없으나 2002년제정된한국인의고지혈증치료지침에의하면 total cholesterol의경우 240 mg/dl 이상, TG의경우 200 mg/dl 이상, 저밀도지단백 (LDL) 의경우 160 mg/dl 127

10 고지방식이로유발된고지혈증동물모델에서四物活血湯의효과연구 이상으로제시하고있다 16. 이는죽종형성을촉진하는지단백의증가와죽상경화증의진행및심혈관질환의발생은밀접한연관성이있기때문이다. 죽상경화증은선진국에서사망과장애의가장중요한원인으로관상동맥에서는심근경색증과협심증을일으키고, 뇌신경계에서는뇌졸중이나일과성허혈발작을일으킨다. 사지동맥의동맥경화는간헐성파행과괴저를일으키고, 사지의생활력에장애를줄수있다 17. 지질은식사로섭취되거나세포에서합성되는데, 생체에서에너지원및세포막의중요한구성성분이자호르몬의전구물질로서중요한역할을담당하고있다 18. 체내의각기관과조직에서사용, 저장되기위해혈장을통하여이동및교환되어야하는데일반적으로지질은지단백질안에존재하여이동된다 19,20. 각지단백의특성은구성된지질및고유의아포지단백에따라달라지는데, 아포지단백은각지단백질의대사를조절하고조직의지단백수용체의인식부위로작용하게됨으로써중성지방과콜레스테롤을간에서말초조직으로운반또는말초조직에서간으로역수송함으로써지질을재분배시킨다 21. 고지혈증의양방적치료에는리피토나크레스토등스타틴계의 HMG-CoA 환원효소저해제, 담즙산제거제, 피브린산유도체, 니코틴산유도체, 프로브콜 (probucol) 등여러가지제제들이사용되고있으나, 투여를중지할경우혈중지질치가다시상승되므로지속적장기간의투여를요한다. 그러나장기간투여할경우약에따라피로, 수면장애, 오심, 피부발진, 근육통, 위장장애, 두통, 소양증, 변비또는설사등의부작용이있는것으로보고되고있다. 따라서혈중지질을낮추면서부작용없이장복할수있는치료약이요구되고있다 22. 한의학에서고지혈증은痰濁, 濕熱, 瘀血등의범주에속하는것으로보고있다 23. < 靈樞五癃津液別 > 24 에서는五穀의津液이和合되어膏로되어骨空의내부에삼투되어腦髓를補益하다고하였 는데膏는진액의일종으로水穀에서來原하고脾의散精作用과三焦의運化作用등에의해혈중에滲入하여형성되는인체의영양물질로脂血로인식할수있다. 따라서高脂血은인체에대한여러因素作用에의해발생하는혈중의痰濁이라할수있다. 고지혈증은嗜食肥甘之味의外因과肝脾腎機能失調의內因에의해痰濕, 濕熱, 瘀血이생성하여발병되며그병리기초는本虛標實인데肝脾腎虛가本虛에속하고痰濁, 濕熱, 瘀血은標實에속한다. 滋補肝腎, 調理脾胃로扶正하고活血化瘀, 利濕化痰으로祛邪하여치료한다 23. 四物活血湯은郭등 13 의 < 心血管病妙法良方大全 - 高脂血症編 > 에수록된임상처방에決明子, 何首烏, 菊花를가미한처방으로임상적으로고지혈증에다용되는처방이다. 처방구성으로丹蔘, 當歸, 山査, 生地黃, 桔梗, 桃仁, 白芍藥, 牛膝, 枳實, 川芎, 蒲黃, 甘草, 柴胡, 紅花, 決明子, 何首烏, 菊花로되어있다. 丹蔘은活血祛瘀, 調經止痛, 活血安神, 凉血消腫하며, 當歸는補血和血, 調經止痛, 潤燥滑腸하며, 山査는消食健胃, 行氣散瘀하며, 生地黃은淸熱凉血, 養陰生津하며, 桔梗는宣肺利咽, 祛痰排膿하며, 桃仁은活血祛瘀, 潤腸通便하며, 白芍藥은活血柔肝, 緩中止痛, 斂陰收汗하며, 牛膝은補肝腎, 强筋骨하며, 枳實은破氣消積, 化痰散痞하며, 川芎는活血行氣, 祛風止痛하며, 蒲黃는止血, 化瘀, 通淋하며, 甘草은和中緩急, 潤肺, 解毒, 調和諸藥하며, 柴胡는和解表裏, 疎肝, 升陽하며, 紅花는活血通經, 散瘀止痛하며, 決明子는淸肝明目, 平肝潛陽, 潤腸通便하며, 何首烏는補肝, 益腎, 養血, 祛風하며, 菊花는散風淸熱, 平肝明目의효능 25 을가지고있다. 이에저자는四物活血湯추출물을 RAW 세포를이용하여세포독성, ROS 및 NO 생성저해활성효과를측정하고, 고지혈증질환모델동물인 6주령의수컷 C57BL/6J 생쥐를이용하여체중변화, 혈액학적인자, 간에대한효과, 간조직의 cholesterol 인자발현에미치는영향등을관찰하여다음과 128

11 강성순 신용진 조재준 전상윤 같은결과를얻었다. SM의안전성검증을위하여 RAW 264.7세포에대한세포독성을관찰한결과대조군의세포생존율에비하여 SM의 1, 10, 100(mg/dl) 농도에서높은세포생존율을보여세포독성이없는것으로생각된다 (Fig. 2). 활성산소는인체의생명유지과정에서필연적으로발생하는물질로, 사용되는산소량의 2~3(%) 가활성산소로전환되며이러한활성산소는반응성이매우높은특징을가지고있다 26,27. 이렇게생성된활성산소는생체내에서산화적손상 (oxidative stress) 을유발하기때문에적절한과정을통하여제거되어야하나 28, 만약제거하지못한다면그세포또는조직은산화적스트레스에의하여손상을입게되고결국사멸하게된다 29. 산화적손상은노화와관련이크며, 체내 DNA 손상, 지질의과산화로인한세포막의손상, 단백질과지질의산화등을가져와동맥경화, 암, 류마티스관절염, 백내장, 노인성치매및파킨슨씨병과같은질환등을유발시킨다 30. SM의항산화활성에미치는영향을알아보기위해 ROS 생성능, NO 생성능을조사하였다. ROS 는세포내에존재하는 mitochondria, peroxisome, xanthine oxidase(xod), NADPH oxidase 및 cyclooxygenase (COX) 등의효소들에의해생성되는 O2-, H2O2, OH 등을일컫는데, 이는산화적손상을일으키는주범이된다. ROS 중 superoxide radical 은산소를이용하는생체내의정상적인대사과정에서생성될뿐만아니라, organic compound 들의자동산화, 외부로부터침입한이물질에대한대식세포의탐식작용및효소반응에의하여생성될수있다 31. NO 는내피세포, 호중구등에서생성되며 L-arginine 에서 nitric oxide synthase(nos) 에의해 citruline 으로전환시에도생성된다. 또한 NO는대부분의기관에서 intercelluar messenger 로서작용하고혈관의항상성, 혈관내피세포에백혈구나혈소판의부착억제와혈소판응집억제및신경전달물질로서작 용한다 32. 아울러면역계에서는대식세포및미생물방어에관여하며 ROS와쉽게반응하여반응성이매우높은산화제인 peroxynitrite(onoo-) 를생성하기도한다 33,34. RAW 264.7세포에서 ROS의생성량 (%) 및 NO 의생성량 (%) 을측정한결과, 대조군에비해 SM100 에서모두유의성있게감소하였다 (Table 4). Cholesterol 변화에미치는영향을관찰하기위하여실험종료후혈청내화학적성분을측정한결과 total cholesterol, LDL cholesterol 와 TG의변화는 SM 투여군에서대조군에비하여유의성있게감소하였으며, HDL cholesterol 의변화는 SM 투여군에서대조군에비하여유의성있게증가하였다 (Table 5). 체내과도한지방의축적및혈중지질농도의증가는당뇨병, 고혈압, 심혈관질환을포함한만성질병을유발하게되는원인으로알려져있으며, 피하조직이외의부위에축적된복부비만은당및지질대사에장애를초래하는인슐린비의존형당뇨병, 고혈압, 고지혈증등의대사성질환과심혈관질환의발병률과사망률을증가시킨다고보고되고있다 35,36. SM의비만에대한효과를알아보기위하여쥐의체중변화및 glucose 를측정한결과 SM 투여군은대조군에비하여 8주에서는유의성있게체중이감소하였고 (Table 6), 혈청내 glucose 의변화는 SM 투여군에서대조군에비하여유의성있게감소하였다 (Fig. 3). 비만, 당뇨, 고지혈증등의유병률이증가하면서만성간질환의원인으로지방간이차지하는비중이점차높아지고있다 37. 지방간은여러가지원인에의해간세포에지방질, 특히 TG가많이축적되는질환이다. 비교적가벼운경우에는단순지방간 (steatosis) 소견만을나타내기도하지만, 염증을동반하는지방간염 (steatohepatitis) 으로나타날수있으며, 염증이장기간에걸쳐유지되거나반복될경우에는섬유화 (fibrosis) 및간경변증 (cirrhosis) 으로 129

12 고지방식이로유발된고지혈증동물모델에서四物活血湯의효과연구 진행될수도있다 38. SM의간에대한효과를관찰하기위하여 AST, ALT, ALP를측정하고, 간조직를염색하여관찰하였다. 실험종료후혈청내 AST, ALP의변화는 SM 투여군에서대조군에비하여유의성있게감소하였으며, ALT의변화는 SM 투여군에서대조군에비하여감소하였다 (Table 7). 간의조직을 H&E 염색하여관찰한결과, 대조군은간세포에서지방공포가관찰되었으며, 이로인해세포의핵이세포질안에서가장자리로밀려났으며, 정상군에비해쿠퍼세포의수도현저히감소함을관찰할수있었다. SM 투여군에서는간세포내의지방공포로인해세포의크기는커져있지만, 대조군에비해지방공포가적어졌으며, 세포핵도중앙에위치하는호전현상이관찰되었다 (Fig. 4). 이상의결과들을종합해보면, 四物活血湯은세포독성이없으며, ROS의생성량 (%) 및 NO 생성량 (%) 을유의성있게감소시키는효과가있는것으로보아四物活血湯은항산화효과가있음을알수있었고, total cholesterol, LDL-cholesterol, TG 를유의성있게감소시키고, HDL-cholesterol 유의성있게증가시키는것으로보아四物活血湯이혈중지질의농도를감소시키는효과가있음을알수있었다. 또한 AST, ALT, ALP의유의성있게감소시켰으며, 간조직의지방질분포가감소된것으로보아간조직을보호하는효과가있을것으로생각되어진다. 이러한결과는四物活血湯이임상에서고지혈증으로야기되는동맥경화, 허혈성심질환, 기타심혈관계질환, 지방간등의예방과치료에효과가있을것으로사료되며, 향후보다지속적이고심도있는연구가필요하리라생각된다. Ⅴ. 결론四物活血湯이항산화와항염증에미치는영향 및고지혈증에대한효과를알아보기위하여고지혈증질환모델동물인 6주령의수컷 C57BL/6J 생쥐에고지혈식이를경구투여한후, in vitro에서는세포독성및항산화활성측정을, in vivo에서는혈중지질인자, 간에미치는효과및간조직에대한영향등을관찰하여다음과같은결론을얻었다. 1. 四物活血湯은대조군에비해 ROS 생성량 (%) 및 NO 생성량 (%) 은유의성있게감소시켰다. 2. 四物活血湯은 in vivo 에서혈청내 total cholesterol, LDL cholesterol, TG를유의성있게감소시켰다. 3. 四物活血湯은 in vivo 에서혈청내 HDL cholesterol 를유의성있게증가시켰다. 4. 四物活血湯은 in vivo에서쥐의체중과 glucose 를유의성있게감소시켰다. 5. 四物活血湯은 in vivo에서 AST, ALP를유의성있게감소시켰다. 6. 四物活血湯은간의조직학적검사상대조군에비해지방공포가적어지면서세포핵을중앙에위치하는호전현상이나타났다. 이러한결과에따라四物活血湯이임상에서고지혈증으로야기되는동맥경화, 허혈성심질환, 기타심혈관계질환, 지방간등의예방과치료에효과가있을것으로기대된다. 참고문헌 1. 통계청. 2012년사망원인통계. 한국개발연구원 김미현, 장소영, 이연숙. 고지방식이로유도된고지혈증모델흰쥐에서지방과제니스테인섭취가지질대사및항산화능에미치는영향. 한국영양학회지 2006:39(2): Chun SI, Min WK, Park HS, Song JH, Kim JQ, Min YI, et al. The risk groups for coronary 130

13 강성순 신용진 조재준 전상윤 heart disease in Koreans. Assessment by distribution of serum lipid concentrations. Clin Chem Lab Med 1999;37(10): Kim JQ, Song JH, Park YB, Lee HK, Kim YS, Ryoo UH, et al. National cholesterol treatment guidelines in Korean population-setting-up the cutpoints for high blood cholesterol-. J Korean Med Sci 1997;12: 方惠貞, 卓宜洙, 洪律喜, 姜允皓. 高脂血症에對한韓醫學的考察. 東西醫學 1995;20(1): 함인혜, 정성웅, 이경진, 박규하, 최호영. 茵蔯蒿와韓茵蔯이 Triton WR-1339 로유도된고지혈증흰쥐에미치는영향. 대한본초학회지 2005;20(1) : 함인혜, 이웅철, 이병희, 최호영. 국산과중국산枳實이 Triton WR-1339 유발高脂血症흰쥐에대한효능연구. 대한본초학회지 2007;22(3): 함인혜, 이주영, 윤예진, 양갑식, 태진, 부영민, 등. 국산및중국산白首烏의 Triton WR-1339 유발高脂血症흰쥐에대한효능연구. 대한본초학회지 2007;22(4): 김형철, 김형우, 조수인, 김용성, 이장식, 권정남, 등. 丹蔘이고지혈증흰쥐의혈중지질변화에미치는영향. 대한본초학회지 2007;22(4): 이장천. 加味防風通聖散이고지방식이급여흰쥐의체지질구성과항산화능에미치는영향. 대한본초학회지 2005;20(2): 박종광, 최학주, 김동희. 加味除濕順氣湯이高脂血症을유발시킨高血壓白鼠에서의血液學的變化에미치는影響. 대전대학교한의학연구소논문집 2006;15(1) 김정수, 김병탁. 柴苓湯이고혈압및고지혈증에미치는영향. 대전대학교한의학연구소논문집 1997;5(2): 郭雪申, 抲源, 廖春莲. 心血管病妙法良方大全. 華中科技大學出版社 ; 2010, p 김도국, 김세건, 암릿파우델, 정태숙, 정현주. Poloxamer-407로유도한고지혈증동물모델에서 Quercetin-3-O-rhamnoside 및어성초분획물의항고지혈증효과. 생약학회지 2012;43(2) : 박성우. 속발성고지혈증. 서울 : 임상의학 ; 1991, p 한국지질 동맥경화학회, 유언호, 고지혈증치료지침제정위원회. 고지혈증과동맥경화. 서울 : 韓國脂質動脈硬化學會, 고지혈증치료지침제정위원회 ; 2003, p. 11, 83, Daniel J. Rader, Helen H. Hobbs. Harrison s Principles of Internal medicine. Section 3 Disorders of Intermediary Metabolism. 16th edition: MIP; 2006, p , , 윤건호, 손호영. 고지혈증치료의최신지견. 가정의학학회지 2002;21(5): 울산의대서울아산병원내과. 내과학의최신지견Ⅴ. 서울 : 도서출판한국의학 ; 2002, p 이귀녕, 권오헌. 임상병리파일. 제3판. 서울 : 의학문화사 ; 2000, p , , , 182, Spady DK, Woollett LA, Dietschy JM. Regulation of plasma LDL-cholesterol level by dietary cholesterol and fatty acids. Annu Rev nutr 1993;13: 고지혈증치료지침제정위원회. 고지혈증의진단과치료. 서울 : 한의학 ; 2000, p. 59, 杜鎬京. 동의신계학. 서울 : 東洋醫學硏究院 ; 1993, p 黃帝內經靈樞. 金達鎬編. 서울 : 醫聖堂 ; 2002, p 전국한의과대학공동교재편찬위원회. 본초학. 서울 : 영림사 ; 2004, p , , 233-4, 395-6, 414-5, 445-6, 450-1, 461-2, 465-7, , , 552-4, 586-8, 632-4, Lee SO, Kim MJ, Kim DG, Choi HJ. Antioxidative activities of temperature-stepwise water extracts 131

14 고지방식이로유발된고지혈증동물모델에서四物活血湯의효과연구 from Inonotus obliquus. Korean J Food Sci Nutr 2005;34(2): 조숙현, 최용조, 노치웅, 최철웅, 김덕송, 조성환. 대나무수액의활성산소소거활성과세포독성. 한국식품저장유통학회지 2008;15(1): PaPa S, Skulachev VP. Reactive oxygen species, mitochondria, apoptosis and aging. Mol Cell Biochem 1997;174: Slavić M, Appiah I, Nikolić-Kokić A, Radojicić R, Jones DR, Spasić MB, Milovanović S, Blagojević D. The anti-oxidative defence system in the isolated rat uterus during spontaneous rhythmic activity. Acta Physiol Hung 2006;93(4): 정일민, 김광호, 안종국. 한국약용및식용식물들의항산화성식물탐색. 한국약용작물학회지 1998;6(4): Kujala TS, Loponen JM, Klika KD, Pihlaja K. Phenolics and betacyanins in red beetroot(beta vulgaris) root: distribution and effect of cold storage on the content of total phenolics and three individual compound. J Agric Food Chem 2000;48(11): Channon KM, Qian H, George SE. Nitric oxide synthase in atherosclerosis and vascular injury: insights from experimental gene therapy. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000;20: Virag L, Szabo E, Gergely P, Szabo C. Peroxynitrite -induced cytotoxicity: metabolism and opportunities for intervention, Toxocol. Lett 2003;140-1: Patel RP, McAndrew J, Sellak H, White CR, Jo H, Freeman BA, Darley-Usmar VM. Biological aspects of reactive nitrogen species. Biochimica et Biophysica Acta(BBA) - bioenergetic 1999; 1411(2-3): Björntorp P. The associations between obesity, adipose tissue distribution and disease. Acta Med Scand Suppl 1988;723: Visscher TL, Seidell JC. The public health impact of obesity. Annu Rev Public Health 2001;22: 김홍규, 서찬종, 윤효종, 황용하, 이기영, 박혜영, 등. 비알코올성지방간과대사성질환들과의연관성. 대한내분비학회지 2002;17(4): Angulo P. Nonalcoholic fatty liver disease. N Engl J Med 2002;346(16):

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α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를