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The Korean Journal of Microbiology (2011) Vol. 47, No. 4, pp. 316-322 Copyright c 2011, The Microbiological Society of Korea 김치유래 Lactobacillus sakei OPK2-59 의 γ-aminobutyric Acid 생성및 Glutamate Decarboxylase 활성 유진주 오석흥 * 우석대학교식품생명공학과 γ-aminobutyric Acid Production and Glutamate Decarboxylase Activity of Lactobacillus sakei OPK2-59 Isolated from Kimchi Jin-Ju Yu and Suk-Heung Oh * Department of Food and Biotechnology, Woosuk University, Jeonju 565-701, Republic of Korea (Received November 30, 2011 / Accepted December 20, 2011) Lactobacillus sakei OPK2-59 isolated from kimchi was found to have γ-aminobutyric acid (GABA) producing ability and glutamate decarboxylase (GAD) activity. When the Lactobacillus sakei OPK2-59 was cultured in MRS broth with 59.13 mm and 177.40 mm monosodium glutamate (MSG), the optimum temperature range and ph for growth were 25-37 C and ph 6.5, respectively. GABA conversion rates in MRS broth with 59.13 mm and 177.40 mm MSG were 99.58% and 31.00%, respectively at 25 C and 48 h of cultivation. By using the cell free extract of Lactobacillus sakei OPK2-59, MSG was converted to GABA and the conversion rate was 78.51% at 30 C, ph 5. Conversion of MSG to GABA was enhanced by adding salts such as CaCl 2, FeCl 3, MgCl 2. These data suggest that the ability of Lactobacillus sakei OPK2-59 to produce GABA results from the activity of GAD in the cells and GABA conversion by the cell extract containing GAD can be enhanced by CaCl 2, FeCl 3, MgCl 2. Keywords: Lactobacillus sakei, GABA, GAD, kimchi 김치는한국의대표적인발효식품으로비타민 A, B, C 등이풍부하며건강에좋은박테리아인유산균을많이함유하고있어세계 5대건강식품중의하나로선정된바있다 (12). 또한 2001년 7월에는 Codex 국제식품규격을획득하였다 (10). 김치에는주로 Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Weissella 등의 genera가있어이들이김치발효에있어중요한역할을하는것으로알려져있다 (6, 7, 16, 17). 이들젖산균은김치발효과정중젖산을포함하는각종유기산, γ -aminobutyric acid (GABA) 등의생리활성물질을분비하여김치에맛과기능을부여해주는역할을하는것으로밝혀지고있다 (9, 11, 24). 또한김치내풍부한유산균은장내의유해미생물의생육을억제하여장내균총을개선하는 probiotic 효과와항 avian influenza 효능을갖는것으로도알려져있다 (16). 실제로김치를하루에 300 g 먹으면안먹은사람에비하여대장에유산균이 100배가량증가하는것으로알려져있다 (29). * For correspondence. E-mail: shoh@woosuk.ac.kr; Tel.: +82-63-290-1433; Fax: +82-63-290-1429 GABA는자연계에널리분포하는비단백태아미노산으로동물의경우주요흥분억제성신경전달물질이다 (13, 15). 또한 GABA는혈압상승억제, 시력증진, 항불안, 항경련등인체의많은생리적인메카니즘의조절에관여하는것으로알려져있고, 성장호르몬의분비조절에도관여하며통증완화에도효과가있는것으로알려져있어약리적으로매우주목받는물질이다 (15, 18). 이러한 GABA의역할로인해최근에는기능성식품소재로서의 GABA에대한관심이고조되고있다 (1, 2, 8, 19, 22, 32). GABA는뇌와척수등중추신경계전체신경전달물질중약 30% 를차지하며다른신경전달물질에비하여약 200-1,000배의고농도로존재한다. 그외췌장, 심장, 담낭등에서발견되며, 식물의경우발아현미를비롯한발아곡류, 녹차, 배추뿌리등에서많이검출되고있다 (22, 23). GABA는세균, 곰팡이, 효모등과같은미생물에의해서도생산된다. 최근많은연구자들이 GABA를생성할수있는유산균에대한연구를수행한바있으며, 이는유산균이생리적인활성을가지고있어유제품, 김치, 빵과같은발효식품에서스타터로사용될

Lb. sakei OPK2-59 의 GABA 생성및 GAD 활성 317 수있기때문이다 (6, 27, 28, 29). GABA를생산하는특성이있는유산균에는 Lactobacillus strains (6, 27, 28, 33), Lactococcus strains (20, 21) 등이보고되어있으며, 이들중김치유래의 GABA 생성균주는 Lactobacillus buchneri, Lactobacillus brevis, Lactobacillus sakei 등의균주가보고된바있다 (6, 28, 29, 31). 유산균의 GABA 생성능은 glutamate decarboxylase (GAD) 기질인 monosodium glutamate (MSG) 를배지에첨가한후배양하여 MSG의 GABA로의전환율에따라판단한다. 또한유산균의 GABA 생성능은균주가보유하고있는 GAD의활성화정도에따라서도크게달라질수있는것으로예측되고있다. 따라서본연구는우리고유의김치로부터분리한유산균의 GABA 생성과 GAD 활성화에관한것으로김치유산균 Lactobacillus sakei OPK2-59를이용한효율적인 GABA 생성을위한기초자료를마련하고자수행하였다. 재료및방법균주및시약본실험에서사용한 Lb. sakei OPK2-59는김치유래의유산균으로균주의형태학적및생화학적특성이조사된바있다 (3, 26). 본실험에사용한배지및배지첨가시약은 MRS broth (Difco, USA), monosodium glutamate (MSG) (Daeyoung Chemicals, Korea), CaCl 2, FeCl 3, MnCl 2, MgCl 2 (Sigma Chemical Co., USA) 등이다. 균주성장의최적 ph 및온도균주성장을위한최적 ph를조사하기위하여 100 mm sodium acetate/100 mm acetate 완충액 (ph 3.0, 4.0, 5.0), 100 mm NaH 2PO 4/100 mm Na 2HPO 4 완충액 (ph 6.5, 7.0), 100 mm Tris-HCl/200 mm HCl 완충액 (ph 8.0), 100 mm glycine/200 mm NaOH 완충액 (ph 9.0), 25 mm sodium bicarbonate/100 mm NaOH 완충액 (ph 10.0) 으로 modified MRS 배지를조제하여균주를 30 C에서 24시간배양하였다. 최적온도를조사하기위하여 MRS 배지 (Difco, ph 6.5) 를이용하여 4, 10, 25, 30, 37, 40 C 범위에서균주를배양하였다. MSG 농도에따른균주성장및 ph 변화 MSG 농도에따른균주성장및 ph 변화를조사하기위하여 MSG가 0, 59.13, 177.40 mm 첨가된 MRS 배지 (ph 6.5) 에균주를접종한후 25, 30, 37 C 조건에서 0, 6, 12, 24, 30, 36, 48 시간배양하면서 600 nm에서흡광도를측정하여균주의성장과 ph변화를모니터링하였다. 조효소액의조제세포추출액을제조하기위하여 MSG가 59.13 mm 첨가된 MRS 배지 (ph 6.5, 37 C) 에서 48시간배양하여 600 nm에서흡광도를측정하고원심분리 (4 C, 13,000 g, 15 min) 하여세포를수집한후멸균수로 2회이상세척하였다. 수집된세포 에 cell lysis 완충액 [20 mm sodium phosphate buffer, 0.1 mm PLP (pyridoxal-5-phosphate), 1% triton X-100, 1 mm PMSF, ph 7.0] 를세포무게와동일한양첨가하여혼합후 lysozyme (200 μg/ml) 을넣고 37 C에 30분간 lysis 하여얼음에 5분간정치후 sonication (500 W, 1분, 5회 ) 을얼음에서반복실시하였다. 파괴된세포에서추출액을회수하기위하여원심분리 (4 C, 13,000 g, 15분 ) 하여상등액을취한뒤세포추출액 ( 조효소액 ) 으로사용하였으며, 얻어진추출액은 Bradford 측정법 (5) 을이용하여단백질양을정량하였고, 각분석에사용하였다. GAD 분석 GAD 분석을위하여기질완충액 [100 mm sodium acetate/ 100 mm acetate 완충액 (ph 3.0, 4.0, 5.0, 6.0), 59.13 mm glutamate, 0.01 mm PLP] 를조효소액과 2:1 (v/v) 비율로혼합하여 25, 30, 37, 40 C에서각각 60분간반응시킨후끓는물에 2분간넣어효소반응을정지시켰다. 반응이종료된효소반응액을 0.45 μm PVDF 막을통과시켜 TLC와 GABase 분석시료로사용하였다 (6). GAD 효소활성에미치는 ph, 온도의영향을조사하기위하여기질완충액 (100 mm sodium acetate/100 mm acetate 완충액 ) 의 ph를 ph 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 온도를 25, 30, 37, 40 C 범위에서 MSG를첨가하여반응시킨반응액을 TLC와 GABase로 GABA를측정하여비교하였다. 무기염이효소활성에미치는영향을알아보기위해 MgCl 2, NaCl, MnCl 2, CaCl 2, FeCl 3 을각반응액에 20 mm의농도로첨가하고조효소액과혼합후 37 C, 60분간반응하여생성된 GABA를 GABase로정량하였다 (6, 13). GAD 효소활성은효소추출액중의단백질 mg당 GABA 생성량혹은무기염무첨가군에대한상대적인 GABA 생성량으로표기하였다. GABA 및 glutamic acid 분석 TLC를이용한분석을위해각균주배양액혹은효소반응액 0.9 μl를 TLC 판에분주하여아래의조건에서분석을실시하였다. 각시료를 TLC 판에분주한후 butanol:acetic acid:water=4:1:1를전개용매로사용하여전개하였다. 전개된 TLC 판을 0.2% ninhydrin을이용하여발색하여생성물 GABA spot과기질 glutamic acid spot을확인하였다. GABase 를이용한 GABA의정량은반응액 ( 총 1 ml) 에시료 20 μl, 1 unit GABase [Pseudomonas fluorescens (Sigma)] 40 μl, 10 mm β-nadp + (Sigma) 140 μl, 100 mm potassium pyrophosphate (ph 8.6) 780 μl, 100 mm α-ketoglutamate 20 μl 를 96 well plate에넣고혼합하여 37 C에 60분간반응시킨후 340 nm에서흡광도를측정하였다. GABase를이용한 GABA 정량은 GABA 표준곡선 (Abs=0.0004 X mm+0.028, R 2 =0.9878) 을이용하여산출하였다 (6). HPLC를이용한 GABA 및 glutamate 정량은 Baum 등 (4) 이사용한아미노산분석방법을기초로하여약간수정한방법 (27) 을사용하였다. 간략하게 methanol:chloroform:water가 12:5:3으로혼합된용매 800 μl를효소반응액혹은배양액시료 200 μl에가하여 vortex로

318 Yu and Oh 7 6 5 OD 600 4 3 2 1 0 OD 600 Fig. 1. Effects of ph (A) and temperature (B) on the growth of Lactobacillus sakei OPK2-59. Growth was estimated by monitoring the OD 600 after 24 h. 혼합하였다. 혼합액을원심분리 (13,000 g, 4 C, 15분 ) 하여수용액층인상등액을 1차회수하였고, 유기용매층에클로로포름과물 (1:2) 혼합액 600 μl을가하여혼합한후원심분리하여상등액을 2차회수하였다. 1, 2차회수한상등액을합하여동결건조하였고, 초순수로용해하여 0.45 μm PVDF 막을통과시켜 HPLC 분석용시료로사용하였다. HPLC (Waters, Milford, USA) 분석을위해시료는 6-aminoquioly-N-hydroxysuccinimidyl carbonate (AQC) 로유도체화하였고, 3.9 150 mm AccQ Tag TM (Nova-Pak TM C 18, Waters) 칼럼으로유도체들을분리하였다 (31). GABA 및 glutamic acid 함량은표준 GABA 및 glutamic acid (Sigma) 의 HPLC 및 GABase 분석결과를토대로작성한표준곡선을이용하여산출하였다. 결과및고찰균주성장및 GABA 생성을위한배양조건김치로부터분리한 Lb. sakei OPK2-59 균주의성장을위한 ph 및온도의영향을조사한결과 ph 6.5와 25 C, 30 C, 37 C에서 24시간배양으로다른 ph와온도에비하여최적의성장율을기록하였다 (Fig. 1). Lb. sakei OPK2-59 균주에의한 GABA 생성능을조사하기위해 MSG가 0, 59.13, 177.40 OD 600 Fig. 2. Growth and ph changes of Lactobacillus sakei OPK2-59 in MRS broth at different temperatures and MSG concentrations. (A) 25 C; (B) 30 C; (C) 37 C., cell growth of 0 mm MSG;, cell growth of 59.13 mm MSG;, cell growth of 177.40 mm MSG;, ph of 0 mm MSG;, ph of 59.13 mm MSG;, ph of 177.40 mm MSG. mm 첨가된 MRS 배지 (Difco, ph 6.5) 를이용하여 25, 30, 37 C 조건에서균주를배양후 TLC와 GABase를이용하여 GABA 분석을실시하였다. Lb. sakei OPK2-59 균주는배양온도및 MSG 첨가와는상관없이배양시작 6시간을기점으로대수증식기가시작되었으며, 24시간을기점으로정지기에접어드는것으로나타났다 (Fig. 2). ph의변화의경우배양 6

Lb. sakei OPK2-59 의 GABA 생성및 GAD 활성 319 Fig. 3. GABA production by Lb. sakei OPK2-59 in MRS broth at different temperatures and MSG concentrations. (A), 25 C; (B), 30 C; (C), 37 C. Lane M, spot of standard MSG; G, spot of standard GABA; 1, 2, 3, spots of Lb. sakei OPK2-59 cultures at 0 mm MSG, 59.13 mm MSG, 177.40 mm MSG concentrations, respectively. The spots with circles are in the same locations as the standard GABA. 시간을기점으로감소하여정지기에접어드는 24시간까지감소하다가 MSG의존재유무와함량에따라서약간씩다른변화패턴을보였다. 즉, MSG가첨가되지않은배지의경우 24 시간부터 48시간까지약간의감소가관찰되었고, 59.13 mm MSG 첨가의경우는첨가하지않은경우에비하여 ph 감소폭이줄었으며, 177.40 mm MSG 첨가의경우는 24시간이후약간씩증가하는경향을보였다 (Fig. 2). 이와같은경향은 37 C보다는 25 C와 30 C에서뚜렷하게나타나고있음을알수있었다. 배양에따른 ph 감소는수소이온농도의증가를가져와 GAD에의한 glutamate의 GABA 전환시필요한 proton을제공해주게된다 (6). 따라서 MSG 존재하에서필요한 proton이공급되면 GAD는 glutamic acid를이용하여 GABA를생성하게될것이다. GABA 생성과더불어 proton 공급이감소하면 ph는다시증가하게될것이다 (6, 14). 따라서, MSG가첨가된경우 25 C와 30 C에서배양하는동안 MSG의소모및 GABA 생성과더불어시간경과에따른 ph 의점진적증가 (Figs. 2 and 3) 는이를설명하고있다고판단 된다. TLC 분석을통한 GABA 생성패턴을보면 59.13 mm MSG 첨가의경우 25 C와 30 C 배양조건에서 24시간동안배양으로 MSG의소모가현저하고 GABA 생성이뚜렷하게관찰됨을알수있었다. 37 C 배양의경우는상대적으로 MSG의소모가적고생성된 GABA도생성도미미한것으로나타났다 (Fig. 3). 이는 GABase를이용한분석에서도확인할수있었다. 59.13 mm MSG 첨가의경우 25 C와 30 C 배양조건에서 48시간배양으로각각 99.58% 와 87.84% 전환율을보임을확인하였다. 또한 177.40 mm MSG 첨가의경우 25 C와 30 C 배양조건에서 48시간배양으로 31.00% 와 31.52% 전환율을보임을확인하였다 (Table 1). 이결과를통해 25 C와 30 C 배양조건에서는 59.13 mm과 177.40 mm MSG첨가의경우 GABA로의전환율이큰차이를보이지않고있음을알수있다. 그러나 37 C 배양의경우는 MSG 농도에상관없이 GABA 전환율이매우미미하였다 (Table 1). 37 C 배양의경우 25 C와 30 C 배양과비교하여균주성장율에있어서는차이를보이지않는것으로조사되었기에 (Fig.

320 Yu and Oh Table 1. Conversion yields of MSG to GABA by Lb. sakei OPK2-59 in MRS broth at different temperatures and MSG concentrations Temp ( C) MSG (mm) OD 600 production GABA (mm) 25 GABA conversion yield (%) 0 2.33 0.70-59.13 2.37 58.88 99.58 177.40 2.35 55.00 31.00 0 2.38 0.48 - GABA content (mm) 30 25 20 15 10 25 30 37 40 30 59.13 2.37 51.94 87.84 177.40 2.38 55.92 31.52 5 37 0 2.40 0.49-59.13 2.37 0.76 1.29 177.40 2.38 0.85 0.48 0 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 ph 2), 온도에따른 GABA 전환율의차이는 GABA 전환을담당하는효소인 GAD의활성화에온도가영향을주었을것으로판단된다. 실제로 Lb. sakei OPK2-59로부터얻은 GAD 조효소액은온도에따라 GABA 전환력이크게달라짐을알수있었다 ( 아래 GAD 활성화에미치는온도및 ph의영향 ). 또한 Cho 등 (6) 은 5% MSG가첨가된 MRS 배지에 1% NaCl, 1% glucose를첨가하고배양초기 ph를 5.0, 온도를 30 C 조건으로하여 48시간배양하여 MSG의 GABA로의전환율 94% 를얻을수있다고보고하였다. Kook 등 (14) 은 Lb. sakei B2-16 균주와 4% sucrose, 1% yeast extract, 12% MSG를함유하는 rice bran extract을이용하여최대 660 mm GABA를얻을수있다고보고하였다. 또한 4% sucrose, 1% yeast extract, 5% MSG를함유하는 MRS 배지를이용하여최대 272 mm GABA를얻을수있다고보고하였다 (14). 이와같은높은전환율은탄소원과질소원의보강, 배양조건차이 ( 예, slow agitation 등 ) 그리고 rice bran extract 유래의인자등에기인된것으로판단된다. 예를들면, rice bran extracts에는 GAD 가존재하여 GABA 전환율에영향을미칠수있는것으로알려져있으며 (25), 어떤인자는유산균 GAD 활성에도영향을미칠수있을것으로판단된다. 따라서 MSG 고함유배지에서 Lb. sakei OPK2-59 균주의 GABA 전환율증진을위한연구가탄소원과질소원조절등배양조건조절에따른영향및 GAD 효소특성등과연계하여수행된다면균주의활용가치를더높일수있을것이다. Lb. sakei OPK2-59 균주배양을통해얻은스타터는동물실험을통한효능평가에서만성적인알코올에의해손상된간기능을개선하는효과가있었고 (3), 김치제조에활용하면발효김치중의 GABA 함량을증진시키는것으로조사된바있다 (31). GAD 활성에미치는온도및 ph 의영향기질용액과조효소액을혼합하여각온도별로 ph를달리하여 60분간반응시킨뒤 2분끓여반응종료후 GABA를분석하였다. Fig. 4에서와같이 30 C, ph 5.0 반응액의조건에서 GABA 생성이가장많이생성됨을확인하였다 (GABA 전 Fig. 4. Changes in the production of GABA by Lb. sakei OPK2-59 cell free extract at different ph and temperatures. GABA levels were assayed as described in Materials and Methods.' All values are expressed as means±se of three assays. 환율 78.51%). 또한기질용액에첨가한 MSG는 30 C, ph 5.0 조건에서상대적으로적게잔존하는것으로나타났다 ( 자료미제시 ). 유산균유래의 GAD 활성에미치는최적 ph는다양하게나타나고있다. 예를들면, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus brevis, Lactococcus lactis 유래의 GAD는각각 ph 5.0, 4.2, 4.7에서최적의활성을보였다 (13). 또한 Lb. paracasei 와 Lb. brevis 유래 GAD의최적온도는각각 50 C와 30 C로차이를보인바있다 (13). 따라서, Lb. sakei OPK2-59 유래의 GAD 조효소액의경우최적온도는 Lb. brevis GAD 특성을, 최적 ph는 Lb. paracasei 특성과유사한것으로나타났다. GAD 활성에미치는무기염이온의영향 Lb. sakei OPK 2-59 유래의 GAD 조효소활성에미치는무기염이온의영향을조사한결과는 Fig. 5와같다. 20 mm 무기염 (MgCl 2, FeCl 3, CaCl 2) 을첨가한효소반응액에서는무기염무첨가반응액에서보다 GABA 생성량을기준으로한 GAD 활성이 2-3배가량높은것으로조사되었다 (Fig. 5). 또한 NaCl은효소활성을약간증진시킨반면 MnCl 2 는감소시키는것으로조사되었다. Lb. paracasei GAD의경우 10 mm Ca 2+ 에의해서 114% 까지효소활성화가일어난반면 10 mm NaCl에의해서는 38.5% 로활성이감소했음을보고한바있다 (13). 이와같은효소활성화양상은유산균의출처에따른차이라고판단되며, 이들무기염이온들이어떤작용에의해서유산균 GAD 활성에영향을미치는지는아직알려지지않고있다. 다만유산균의배양을통한 GABA 생성의경우 Cl - 에의해서 Lactococcus lactis GAD의발현이유도되어 GABA 생성량이많아짐이보고된바있다 (30). 또한 Lactobacillus buchneri의경우 1% NaCl의첨가로세포증식이증가하고 MSG의 GABA로의전환율도 NaCl 무첨가에비하여약간증진되는경향을나타내는것으로보고되었다 (6). 식물

Lb. sakei OPK2-59 의 GABA 생성및 GAD 활성 321 350 감사의말 GAD activity (%) 300 250 200 150 100 본논문은 2008년도정부 ( 교육과학기술부 ) 의재원으로한국연구재단 (No. 2008-0061604) 연구비및 2011학년도우석대학교교내학술연구비지원에의하여수행되었으며지원에감사드립니다. 참고문헌 50 0 Control MgCl 2 NaCl MnCl2 CaCl 2 FeCl 3 Fig. 5. Influences of salts on the activity of Lb. sakei OPK2-59 GAD. Control, no salt added; MgCl 2, NaCl, MnCl 2, CaCl 2, FeCl 3, 20 mm of each salt added. The influences of salts on GAD activity were assayed at 37 C, ph 5 buffer condition and expressed as relative values on control activity. All values are means±se of three assays. 유래 GAD는칼슘결합단백질인 calmodulin에의해서활성화되기때문에보편적으로칼슘에의한활성화가관찰되고있지만 (4, 23), 아직유산균유래의 GAD가또다른결합단백질에의해서활성화되는지, 칼슘등의결합부위를가지고있는지등에대한보고는없어이들을포함한활성화메커니즘연구가진행되어야할것이다. 적요 김치로부터분리한유산균 Lactobacillus sakei OPK2-59는 γ-aminobutyric acid (GABA) 생성능력과 glutamate decarboxylase (GAD) 활성을보유하고있음이확인되었다. Lactobacillus sakei OPK2-59를 59.13 mm과 177.40 mm monosodium glutamate (MSG) 가함유된 MRS 배지에서배양하면균주의성장을위한최적온도범위와 ph는각각 25-37 C와 6.5였다. 59.13 mm과 177.40 mm MSG 함유 MRS 배지에서배양온도 25 C 조건에서, 48시간배양하였을경우 MSG의 GABA 전환율은각각 99.58% 와 31.00% 였다. 또한 Lactobacillus sakei OPK2-59 세포추출액을이용하여 MSG를 GABA 로전환할수있었으며, 추출물에의한 GABA 전환율은 30 C, ph 5 조건에서 78.51% 로가장높았다. 세포추출액에의한 MSG의 GABA 전환에미치는무기염의영향을조사한결과 CaCl 2, FeCl 3, MgCl 2 를첨가한반응액에서염을넣지않고반응한 control보다 GABA 전환율이 2-3배증진되는것으로조사되었다. 이러한결과들은김치유산균 Lactobacillus sakei OPK2-59의 GABA 생성능은유산균세포내에존재하는 GAD에의한것이며, GAD에의한 GABA 전환율은무기염에의하여증진될수있음을제안해주는것이다. 1. Abe, Y., S. Umemura, K. Sugimotto, N. Hirawa, Y. Kato, T. Yokoyama, J. Iwai, and M. Ishii. 1995. Effect of green tea rich in γ-aminobutyric acid on blood pressure on dahl salt-sensitive rats. Am. J. Hypertens. 8, 74-79. 2. Aoki, H., Y. Furuya, Y. Endo, and K. Fujimoto. 2003. Effect of γ-aminobutyric tempeh-like fermented soybean (GABA-tempeh) on the blood pressure of spontaneously hypertensive rats. Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, 1806-1808. 3. Bae, M.O., H.J. Kim, Y.S. Cha, M.K, Lee, and S.H. Oh. 2009. Effects of kimchi lactic acid bacteria Lactobacillus sp. OPK2-59 with high GABA producing capacity on liver function improvement. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 38, 1499-1505. 4. Baum, G., L.Y. Simcha, Y. Fridmann, T. Arazi, H. Katsnelson, and M. Zik. 1996. Calmodulin binding to glutamate decarboxylase is required for regulation and GABA metabolism and normal development in plants. EMBO J. 15, 2988-2996. 5. Bradford, M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254. 6. Cho, Y.R., J.Y. Chang, and H.C. Chang. 2007. Production of γ -aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus buchneri isolated from kimchi and its neuroprotective effect on neuronal cells. J. Microbiol. Biotechnol. 17, 104-109. 7.Han, H.L. 1991. The ecology of kimchi lactic acid bacteria. Korean J. Microbiol. 7, 68-75. 8. Hayakawa, K., M. Kimura, K. Kasaha, K. Matsumoto, H. Sansawa, and Y. Yamori. 2004. Effect of a gamma-aminobutyric acid-enriched dairy product on the blood pressure of spontaneously hypertensive and normotensive Wistar-Kyoto rats. Br. J. Nutr. 92, 411-417. 9. Hur, H.J., K.W. Lee, H.Y. Kim, D.K. Chung, and H.J. Lee. 2006. In vitro immunopotentiating activities of cellular fractions of lactic acid bacteria isolated from kimchi and bifidobacteria. J. Microbiol. Biotechnol. 16, 661-666. 10. Kim, S., M.Y. Cho, J.H. Lee, and S.Y. Lee. 2006. Studies on the activities and prospects of the Codex alimentarius commission. Food Sci. Indus. 39, 25-40. 11. Kim, J.H., M.J. Kwon, S.Y. Lee, J.D. Ryu, G.S. Moon, H.S. Cheigh, and Y.O. Song. 2002. The effect of kimchi intake on production of free radicals and anti-oxidative enzyme actitivies in the liver of SAM. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 31, 109-116. 12. Kim, S.H., J.Y. Yang, S.A. Kang, H.K. Chun, and K.Y. Park. 2007. Current state and improvement for Korean kimchi industry. Food Indus. Nutr. 12, 7-13. 13. Komatsuzaki, N., T. Nakamura, T. Kimura, and J. Shima. 2008. Characterization of glutamate decarboxylase from a high γ -aminobutyric acid (GABA)-producer, Lactobacillus paracasei. Biosci. Biotechnol. Biochem. 72, 278-285. 14. Kook, M.C., M.J. Seo, C.I. Cheigh, Y.R. Pyun, S.C. Cho, and H. Park. 2010. Enhanced production of γ-aminobutyric acid

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