사상체질의학회지 2010;22(4):77-84 J of Sasang Constitutional Medicine Vol. 22, No. 4, 2010:77-84 http://www.esasang.com 소양인양격산화탕의면역활성화연구 정다영 하혜경 이호영 이진아 이남헌 이준경 황대선 신현규 Abstract 한국한의학연구원한약 EBM 연구센터 Stimulation of the Immune Response by Yanggyuksanhwa-tang Da Young Jung, Hyekyung Ha, Ho-Young Lee, Jin-Ah Lee, Nam-Hun Lee, Jun Kyoung Lee, Dae Sun Huang, Hyeun-Kyoo Shin Herbal Medicine EBM Research Center, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon, 305-811, Korea 1. Objectives Yanggyuksanhwa-tang for Soyangin was applied to investigate the immunological activities on antigen (Ag)-specific or Ag-non-specific immune responses on murine macrophage cell line (RAW 264.7) and ovalbumin/aluminium (OVA/Alum)-immunized mice. 2. Methods This study were carried out in nitric oxide (NO) synthesis on RAW 264.7 cells and cellular proliferation on mouse splenocytes. C57BL/6 mice were immunized intraperitonially with OVA/Alum (100 μg/200 μg) on day 1, 8, and 15. Yanggyuksanhwa-tang was administrated to mice orally for 3 weeks from day 1. On day 22, OVA-, lipopolysaccharide (LPS)-, and concanavalin A (Con A)-stimulated splenocyte proliferation and antibodies (OVA-specific antibodies of the IgG, IgG1, and total IgM classes) in plasma were measured. 3. Results Yanggyuksanhwa-tang significantly enhanced cellular proliferation by LPS and Con A on splenocytes from OVA/Alum-immunized mice (p<.001). Yanggyuksanhwa-tang also significantly enhanced plasma OVA-specific IgG (p<.001), IgG1 (p<.001), and total IgM (p<.01) levels compared with the OVA/Alum group. 4. Conclusions These results suggested that Yanggyuksanhwa-tang for Soyangin could be used as immunopotent. Key Words : Yanggyuksanhwa-tang (Lianggesanhuo-tang), Antibodies, LPS, Con A, OVA 1) 접수일 2010 년 05 월 17 일 ; 심사일 2010 년 05 월 24 일 ; 승인일 2010 년 06 월 25 일 교신저자 : 신현규대전시유성구엑스포로 483 한국한의학연구원한약 EBM 연구센터 Tel : +82-42-868-9464 Fax : +82-42-864-2120 E-mail : hkshin@kiom.re.kr * 본연구는한국한의학연구원에서지원하는 표준한방처방 EBM 구축사업 에의해수행되었다.
78 사상체질의학회지 2010;22(4):77-84 소양인양격산화탕의면역활성화연구 Ⅰ. 緖論 凉膈散火湯은李濟馬의 東醫壽世保元 에少陽人胸膈熱證을치료하는처방으로처음기재되었으며, 胃受熱裏熱病중上消에쓰이며 1, 그구성약물의효능들을살펴보면, 淸熱凉血, 瀉火解毒, 除煩解鬱, 祛風解表, 勝濕解痙하는효능을가지고있다 2. 전통의학에서는인체에대해불리한반응을초래하는환경인자를 邪氣 라고규정하고이에대한방어작용을하는인체의모든기전과물질은 正氣 라고하여正氣와邪氣의抗爭이란관점에서인체의면역현상을설명하였다. 正氣는인체면역계통의정상적인기능이며, 扶正祛邪의원칙에따라질병의치료와예방작용을하게된다. 그러나특정邪氣가모든사람에게동일한가치를지니지않는다. 동일한邪氣라할지라도체질에따라나타나는邪氣에대한반응에는차이가있게된다. 四象醫學에서는각체질의병증을表病과裏病으로분류하고체질에따른臟腑의상호관계를정상화시켜면역계의균형을회복하여抗病力을증강시킴으로써病邪에대항할수있다고하여면역에대한치료의근거를제시하고있다 3. 凉膈散火湯은少陽人에게사용되는처방으로임상및실험연구결과들이발표되었으나, 正氣를보존하고邪氣를제거하여항상성을유지하는가장기본적인면역활성에대한연구는없었다. 체질을기준으로투여하는체질처방도면역활성에기여하는지에대한연구가필요한바, 본논문에서는면역반 응에관여하는대식세포및비장세포의증식효과, 면역글로불린의생성량변화를통해대표적인少陽人체질처방인凉膈散火湯이면역반응에미치는영향을연구하고자하였다. Ⅱ. 材料및方法 1. 재료 1) 처방추출양격산화탕의처방구성약재들은 ( 주 ) 옴니허브 (Yeongcheon, Korea) 와 ( 주 )HMAX (Jecheon, Korea) 에서각각구입하였다. 각각의처방에따른구성비는 Table 1과같다. 이들처방구성약재를배합하고 10배의물을가한후 100 C에서 2시간동안무압환류추출법 ( 추출기 : 경서메디텍 COSMOS660) 을이용하여추출하였다. 추출액은 sieve를사용하여거르고동결건조기 ( 일신동결건조기 PVTFD100R) 를사용하여처방추출물분말을얻었으며수득율은 16.2% 였다. 2. 실험방법 1) 대식세포의활성화검색 (1) 대식세포의증식능검색양격산화탕이대식세포주의증식에미치는효과를검색하기위하여 murine macrophage cell line인 RAW 264.7 세포를 96-well plate에 3 10 3 cells/well로분주하고양격산화탕추출물을 PBS에용해하여농도별로첨가하였다. 세포증식효과에대한비교물질로 lip- Table 1. The Amount and Composition of Yanggyuksanhwa-tang Herbal Name Scientific Name Weight (g) 생지황 ( 生地黃 ) Rehmanniae Radix 7.5 인동등 ( 忍冬藤 ) Lonicerae Flos 7.5 연교 ( 連翹 ) Forsythiae Frucus 7.5 산치자 ( 山梔子 ) Gardeniae Fructus 3.75 박하 ( 薄荷 ) Menthae Herba 3.75 지모 ( 知母 ) Anemarrhenae Rhizoma 3.75 석고 ( 石膏 ) Gypsum 3.75 방풍 ( 防風 ) Saposhnikoviae Radix 3.75 형개 ( 荊芥 ) Schizonepetae Spica 3.75 Total (g) 45 Yield (%) 16.2
정다영외사상체질의학회지 2010;22(4):77-84 79 opolysacharide (LPS, Sigma Chemical Co, MO, U.S.A.) 를사용하였다. 2일간배양한후 tetrazolium salt인 CCK-8 kit (Cell Counting Kit-8, Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan) solution을첨가하여 4시간더배양한다음 ELISA reader (Ceres UV 900C, Bio-tech instrument, U.S.A.) 를이용하여 450 nm에서흡광도를측정하였다. Control 흡광도에대한양격산화탕흡광도의비를 % 로계산하였다. (2) Nitric oxide (NO) 생성량측정 RAW 264.7 세포를 48-well plate에 2.5 10 5 cells/well 로분주한후 12시간배양하여안정화시키고약물독성이없는범위내에서농도별 (2-200 μg /ml) 로처리하였다. 양성대조군으로 LPS를농도별 (1-1000 ng/ml) 로처리하였으며 18 시간배양후상층액을수집하여 NO 생성량을측정하였다. NO 생성량은 Griess reagent (Promega, WI, U.S.A) 를이용하여 nitrite 양을측정하여계산하였다. 2) 생쥐비장세포분리및증식능검색 (1) 비장세포의분리및배양 6주령의수컷 ICR 생쥐 ( 오리엔트바이오, 성남 ) 를경추탈골하여희생한후비장을적출하였다. 적출한비장을 HBSS (Hank's Balanced Salt Solution, Sigma- Aldrich Co, MO, U.S.A.) 로세척하고주사기를이용하여비장세포를분리한후 RBC lysing buffer (Sigma Chemical Co, MO, U.S.A.) 로적혈구를제거하였다. 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Gbico BRL. NY, U.S.A.) 와 1% penicillin-streptomycin(gbico BRL. NY, U.S.A.) 을함유하는 RPMI 1640 배지 (Gbico BRL. NY, U.S.A.) 에비장세포를부유시켜 5% CO 2, 37 C에서배양하였다. (2) 비장세포의증식능검색양격산화탕이비장세포증식을검색하기위하여분리한비장세포를 96-well plate에 5 10 5 cells/well로분주하고양격산화탕추출물을 PBS에용해하여농도별로첨가하였다. 세포증식효과에대한비교물질로 B cell lymphocyte에대한 mitogen인 LPS와 T cell lymphocyte에대한 mitogen인 Con A를사용하였다. 2일간배양한후 CCK-8 kit solution을첨가하여 4시간더 배양한후 450 nm에서흡광도를측정하였다. Control 흡광도에대한양격산화탕흡광도의비를 % 로계산하였다. 3) OVA/Alum 감작생쥐에서면역활성화검색 (1) 실험동물및항원물질투여 7주령 (19 20 g) 의수컷 C57BL/6 생쥐 ( 오리엔트바이오, 성남 ) 를 1주일간순화시킨다음대조군, Ovalbumine (Thermo, IL, U.S.A.) /Aluminium (Sigma-Aldrich Co, MO, U.S.A.)/Saline 투여군인 OVA/Alum 군, OVA/Alum 및양격산화탕투여군 ( 처방투여군 ) 으로분리하여실험에사용하였다. OVA/Alum은항원으로생쥐당 100 μg /200 μg /100 μl 용량을 1일, 8일, 15일에복강투여하여항체생성을유도하였으며대조군은동일량의 saline을복강투여하였다. 대조군과 OVA/Alum 군은증류수를, 처방투여군은양격산화탕추출물을 1 g/kg/day 용량으로 OVA 감작과동시에 21일간투여하였다. 22일에엔토발 (pentobarbital, 한림제약, 용인, 150 μg /mouse) 을복강투여한후마취하에복강절개하여후대정맥에서채혈한후비장을적출하고방혈치사하였다. 채혈된혈액은전혈구수측정후원심분리하여혈장을분리하고다음실험시까지 -80 C에보관하였다. (2) OVA/Alum 감작된마우스비장세포의증식능검색 (mitogen effect) 적출한비장에서앞에서와같은방법으로비장세포를분리하여 96-well plate에분주한다음대조군, OVA (10 μg /ml), LPS (2 μg /ml) 와 Con A (4 μg /ml) 를각각첨가하였다. 2일간배양한후 CCK-8 kit를사용하여세포증식능을검색하는방법으로양격산화탕투여에대한 mitogen effect를검색하였다. (3) 혈중항체생성량측정생체내항체생성량을측정하기위하여감작항원으로사용한 OVA에대한특이적 (OVA-specific) 또는비특이적 (total) 면역글로불린의양을측정하였다. 생쥐 OVA-specific IgG, OVA-specific IgG1, total IgM level 은 enzyme linked immunosorbent assay kit (ELISA; Bethyl Laboratory, Inc., Texas, USA) 를사용하여측정하였다.
80 사상체질의학회지 2010;22(4):77-84 소양인양격산화탕의면역활성화연구 OVA-specific IgG 및 IgG1을검색하기위하여 microtiter plate에 OVA (10 μg /ml in carbonate buffer, ph 9.6) 용액을 100 μl /well씩가한후 4 C에서 24시간반응시켜 OVA를부착시켰다. Total IgM을측정하기위하여 IgM capture antibody (Ab) 를 carbonate buffer (ph 9.6) 에 1:100 으로희석하여 100 μl /well씩가한후 4 C에서 24시간반응시켜 Ab를부착시켰다. 각각 wash buffer (50 mm Tris, 0.14 M NaCl, 0.05% Tween 20, ph 8.0) 로 3번세척한후 blocking buffer (50 mm Tris, 0.14 M NaCl, 1% BSA, ph 8.0) 를 200 μl /well씩첨가하여상온에서 30분간방치하여비특이적인결합부위를차단하였다. Wash buffer로세척한후혈장을 1:1000 (OVA-specific IgG, OVA-specific IgG1) 또는 1:10,000 (total IgM) 으로희석한후 100 μl /well씩가하고상온에서 1시간방치하였다. 세척후 horseradish peroxidase (HRP) 가결합된 goat anti-mouse IgG, IgG1 또는 IgM을 1:100,000으로희석하여 100 μl /well씩가하고상온에서 1시간방치한후세척하였다. 3,3',5,5'-Tetramethyl-benzidine (TMB) 용액을 100 μl /well로가하여빛을차단하고실온에서 5분간반응시킨후. 2 M H 2SO 4 를 100 μl /well로가하여 450 nm에서흡광도를측정하였다. (4) 혈중 Cytokine (IL-2, IL-4) 측정혈중 IL-2, IL-4 level은 Duoset mil-2 및 mil-4 ELISA kit (R&D systems, MN, U.S.A.) 를이용하여측정하였다. 4) 통계처리모든측정결과는 mean±sem으로나타냈으며실험군간의차이는 Student's t-test를이용하여유의성을검증하였다. Ⅲ. 結果 1. 양격산화탕이대식세포활성화에미치는영향대식세포는 1차적인면역반응과관련되므로양격산화탕이대식세포의증식및활성화에미치는영향을검색하였다. 양격산화탕은 200 μg /ml이상에서 20% 이상의세포독성을나타냈으므로 100 μg /ml 이하의농도를사용하였다. 대조군 ( 무처리군 ) 과비교하여 10 μg /ml에서 27.1±3.2% (p<.001) 로증식효과를나타냈다 (Figure. 1). 대식세포의활성화지표인 NO 생성량을측정한결과, 대조군은 0.65±0.12 µm, 양성대조군 (LPS 1-1000 ng/ml) 은농도의존적으로증가하여 1000 ng/ml에서 23.78±1.34 µm 생성되었으나 (p<.001) 양격산화탕 (2-100 μg /ml) 은 100 μg /ml에서 0.54±0.07 µm로 NO 생성을유발하지않았다 (Figure. 2). Figure 1. The proliferation of RAW 264.7 cells treated with Yanggyuksanhwa-tang. Cells (3x10 3 cells/well) were seeded into 96-well plates and treated with Yanggyuksanhwa-tang for 48 hr. The values are presented as means±sem. *p<.05, **p<.01, and ***p<.001 compared with control. Figure 2. The stimulation of NO production on RAW 264.7 cells treated with Yanggyuksanhwa-tang. Cells (2.5x10 5 cells/well) were seeded into 48-well plates and treated with Yanggyuksanhwa-tang for 18 hr. LPS was used as positive control. The units of concentrations of LPS and Yanggyuksanhwa-tang are ng/ml and µg/ml, respectively. The values are presented as means±sem. ***p<.001 compared with LPS 0.
정다영외사상체질의학회지 2010;22(4):77-84 81 Figure 3. The proliferation of mouse splenocytes treated with Yanggyuksanhwa-tang. Isolated mouse splenocytes (5x10 5 cells/well) were seeded into 96-well plates and treated with Yanggyuksanhwa-tang for 48 hr. The unit of concentrations of Con A and herbal formulas for taeumin is µg/ml. **p<.01 and ***p<.001 compared with control (Con A 0). Figure 4. Effects of Yanggyuksanhwa-tang on OVA- or mitogen-stimulated splenocyte proliferation. Splenocytes were prepared from control, OVA/Alum or Yanggyuksanhwa-tang-administrated mice on Day 22 and cultured with OVA, Con A or LPS for 48 h. Cellular proliferation was shown as a percentage of the proliferation of cells cultured without a mitogen (% of control). The values are presented as means±sem. Differences between OVA/Alum and Yanggyuksanhwa-tang-administrated groups were evaluated in each group. ***p<.001 2. 양격산화탕이생쥐비장세포증식능에미치는영향분리한비장세포에양격산화탕을처리하여비장세포의증식능을검색한결과, 양성대조군으로사용한 Con A는 0.5 또는 1 μg /ml 처리시 40% 이상의비장세포증식효과를나타냈다 (p<.001). 양격산화탕 (15.6-250 μg /ml) 은 62.5 μg /ml에서 19.7±3.4% (p<.01) 의비장세포증식효과를나타냈다 (Figure. 3). 3. 양격산화탕이 OVA/Alum- 감작된생쥐에서비장세포증식능에미치는영향양격산화탕이생체내에서면역반응에미치는영향을검색하기위하여양격산화탕을투여한생쥐의비장세포를분리하여항원으로사용한 OVA, B cell mitogen인 LPS와 T cell mitogen인 Con A에대한 mitogen effect를검색하였다. 각투여군에서 mitogen을처리하지않은무처리군을대조군으로하여이에대한세포증식효과를 Figure. 4에나타냈다. 대조군에서항원인 OVA에대한반응은나타나지않았고, Con A와 LPS 처리시각각 38.32±10.38%, 49.96±7.43% 로비장세포의증식을유발하였다. OVA/Alum 군에서는 OVA 처리시 15.95±4.85%, LPS 처리시 50.58±4.98% (p<.01), Con A 처리시 53.61±2.00% (p<.01) 로세포증식이유발되었다. 양격산화탕은각각 23.95±8.62%, 134.08±11.95% (p<.001), 193.70±11.52% (p<.001) 로비장세포의증식을유발하였다 (Figure.4). 이상의결과를종합하면 OVA/Alum 군에서 OVA에대한비장세포증식이약 16% 증가되었고양격산화탕투여시 24% 증가되었으나통계적인의미는없는것으로나타났다. 반면 OVA/Alum군과비교하여양격산화탕투여군에서 LPS와 Con A에대해서 mitogen effect를증가시키는것으로나타났다 ( 각 p<.001). 4. 양격산화탕이생체내에서항체생성능에미치는영향혈장에서 OVA-specific IgG, IgG1을정량한결과 OVA/Alum 군에서각각 5.53±1.30 μg /ml, 48.33± 11.64 μg /ml로 OVA에감작되었음을나타냈다. OVA/Alum 감작생쥐에처방을투여한결과양격산화탕은각각 18.71±2.13 μg /ml (p<.001), 141.79±5.92 μg /ml (p<.001) 으로 OVA/Alum군과비교해서각각 3.4 배및 2.9배증가되었다 (Figure.5-A). 초기면역반응에서증가하는혈중 total IgM을정량한결과대조군과 OVA/Alum군에서각각 231.80±9.63 μg /ml와 333.79±29.35 μg /ml으로대조군과비교하여
82 사상체질의학회지 2010;22(4):77-84 소양인양격산화탕의면역활성화연구 A B Figure 5. The plasma levels of OVA-specific IgG, OVA-specific IgG1, (A) and total IgM (B) on OVA/Alum-immunized mice. Data represent the means±sem (n=5 6) **p<.01 and ***p<.001 compared with OVA/Alum OVA 감작시 1.4배증가된것으로나타났으며, 양격산화탕군에서 473.52±55.55 μg /ml (p<.005) 으로 OVA/Alum군과비교하여 1.4배증가되었다 (Figure. 5-B). 따라서본연구에사용한양격산화탕은 OVA-specific IgG, IgG1 및 total IgM level을상승시켜체액성면역을증가시키는것으로나타났다. Ⅳ. 考察 대표적인少陽人처방인凉膈散火湯은임상적연구에서소양인외전신경마비사시환자를胸膈熱證으로치료하고, 사시의빠른회복과제반증상을호전시키고 4, 뇌경색환자의치료에효과적인것으로보고되었으며 5, 급성기중풍환자에서중풍진행을억제시키고운동기능을호전시켰으며 6, 중풍으로유발된배뇨ㆍ배변장애를만족할만큼호전시킨다고보고되었다 7. 少陽人上消의小便頻數, 渴而多飮등의증상을호전시키며, 혈중 glucose, 혈압을감소시키는것으로알려져있다 8. 또한실험적연구로 Allergy성접촉피부염에서일어나는면역과민반응억제와항염증작용을통해 Allergy성접촉피부염으로기인된피부손상을완화시키는효과를보였고 9, 허혈로유발된뇌손상에방어적인효과가있으며 10, 白鼠의뇌허혈로인한뇌혈류량감소의회복, 뇌손상면적과체적의축소및 TNF-α의억제에유효하였으며 11, 당뇨유발흰쥐의국소뇌허혈모델에서신경세포유해스트레스와자연사를억제함을보고하였고 12, 아토피피부염에 유발모델에서각질층내지방방어구조의회복과그로인한급성염증유발기전의조절을통해피부손상을완화시켰다고보고된바있다 13. 또한간 glucokinase 활성도를증가시켜혈당을조절하며 14, 공간기억능력및불안반응억제에모두유의한효과가있음을확인하여스트레스로인한증상완화및항우울효과가있다고보고되었다 15. 본연구에서는凉膈散火湯에대해인체방어에가장기본적인면역활성을검색하기위하여대식세포및비장세포의활성화효과, 면역글로불린의생성량변화등을확인하였다. 대식세포는면역초기단계에서중요한역할을하는것으로활성화된면역반응산물이 T cell을활성화하여세포성면역반응이유도되므로면역활성검색에주로이용된다 16. 대식세포활성화지표중의하나인 NO는 cytokine이나미생물의영향을받아대식세포에서생성되는반응질소중간체 (Reactive nitrogen intermediates, RNI) 로서 nitric oxide synthase (NOS) 와산소와결합하여 L-알지닌을산화시켜 NO가생성된다. 생성된 NO는체내에서면역기능조절물질로서작용한다고보고되고있다 17, 18, 19. 양격산화탕의 NO 생성능을검색한결과 NO 생성능이나타나지않아대식세포의활성화로인한효과는아니며다른기전의면역세포를활성화하는것으로사료된다. 비장은생체내면역방어기능을담당하고있는 2차면역기관으로외부로부터유입된항원에대한초기면역반응을담당하고특히세포성면역반응과체액성면역반응에관여하는주요기관이다 20. 또한 T 세포,
정다영외사상체질의학회지 2010;22(4):77-84 83 B 세포, 대식세포등의여러가지림프구가밀집되어있는비장의크기및세포의수는면역반응에밀접한관련이있으므로 21, 22 면역증진능을관찰하기위한지표로비장세포증식능을평가한다. 이에양격산화탕에대한비장세포증식효과를검색한결과의미있는비장세포증식효과를나타내었다. 생체내에서면역반응에미치는영향을확인하고자 OVA/Alum를외부항원으로사용하여감작시킨생쥐에양격산화탕을투여한후비장세포의 mitogen effect를검색하였다. 감작항원으로사용한 OVA, 각각 T 세포와 B 세포의 mitogen인 Con A와 LPS에대한 mitogen effect를상승시키는것으로나타나비장내 T 세포와 B 세포를매개로하는면역반응, 즉세포성면역과체액성면역을증가시키는것으로판단된다. 생체내에서체액성면역의조절효과를검색하고자혈장내항체생성능을검색한결과, 양격산화탕은일차적인항체반응에관련된 IgM level을상승시켰고, 그후항원에대한 2차항체반응에서중요한부분을차지하는 OVA-specific IgG 및 OVA-specific IgG1 level 또한증가시키는것으로나타나양격산화탕은항원특이적면역반응을활성화시키는것으로판단된다. 이외에 Th1 또는 Th2 type의분화차이를측정하고자혈중 IL-2 및 IL-4 level을측정하였으나검출되지않아 (data not shown) 각처방의자세한작용경로는언급할수없었다. 양격산화탕은대식세포의 NO 생성에대해활성화효과를나타나지않았고비장세포증식능은상승시켰다. OVA/Alum로감작된생쥐에투여시비장세포에서 Con A 및 LPS에대해 mitogen effect를나타냈으며, 혈중 OVA-specific IgG, OVA-specific IgG1 및 total IgM level을모두증가시켰으므로면역반응의 1차단계인항원비특이적면역반응보다는항원특이적면역반응을활성화시키는것으로판단된다. 따라서본연구에대한결과로소양인대표처방인양격산화탕은면역활성을증가시키는효과가있는것으로판단되며면역저하로인해발생될수있는질환들에적용할수있을것으로기대된다. Ⅴ. 結論 소양인양격산화탕의면역반응조절효과를연구한결과대식세포를활성화시키지않으나 OVA/Alium 감작된생쥐에투여시 B cell의 mitogen인 LPS와 T cell 의 mitogen인 Con A에대해비장세포증식효과를상승시켰으며혈중 OVA-specific IgG, OVA-specific IgG1 및 total IgM level을증가시키는것으로나타나양격산화탕은면역반응의 1차단계인항원비특이적면역반응보다는항원특이적면역반응을활성화시키는것으로판단된다. Ⅵ. 感謝의글 본연구는한국한의학연구원에서지원하는 표준한방처방 EBM 구축사업 (K10030) 에의해수행되었으며, 이에감사드립니다. Ⅶ. 參考文獻 1. Lee JM. Dongeuisusebowon. Seoul:Yeogang Publishing Co. 1992:243-271.(Korean) 2. Lee JM. Dongeuisusebowon. Seoul:Shinil Publishing Co. 1964:70.(Korean) 3. Kim KY. The approach of Sasang constitutional medicine in incurable disease and immunity. J Sasang Constitut Med. 1995;7(2):113-128.(Korean) 4. Choi AY, Ha JH, Lee JH, Jang WS, Goo DM. A clinical study on strabismus patient of abducence nerve paralysis in Soyangin improved with Yangkyuksanhwa-tang. J Sasang Constitut Med. 2008;20 (3):176-183.(Korean) 5. Lo HS, Lee SM, Bae YC, Park HS, Lee JS, Song SG, et al. The Effect of Yangkyuksanhwa-tang on cytokine production in the patients with cerebral infarction J Sasang Constitut Med. 2004;16(1):120-129. (Korean) 6. Choi DJ, Ryu SH, Jung WS, Moon SK, Cho KH, Kim YS. The clinical efficacy of Yangkyuksanwha-tang on acute stroke. J Korean Oriental Med. 2004;25(1):111-116.(Korean) 7. Kim SJ, Kim MS, Seo BI, Gu DM, Seo HY, An HD.
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