9 생물반응기 우리는이미 5장발효공학에서발효또는세포배양법에는회분식배양 (batch culture), 연속식배양 (continuou culture), 유가식배양 (fed-batch culture) 이있고발효조의종류에는통기교반형발효조 (tirred tank fermentor), 기포탑형발효조 (air-lift fermentor) 과유동층발효조 (fluidized fermentor) 등이있음을설명하였다. 이장에서는이러한배양법과발효조 ( 생물반응기 ) 의특성을수식을이용하여정량적으로기술하였다. 생물반응기 (bioreactor) 에사용되는생체촉매는효소, 미생물, 동물세포및식물세포가있으며이생체촉매를현탁 (upenion) 상태또는고정화하여 (immobilized) 사용한다. 생물공학제품을생산하기위하여생물반응기를설계, 제작및운전하는것은생물공학도가해야할일중의하나이다. 생물반응기를설계할때고려해야하는중요한사항은기질 (ubtrate) 을생성물로전환시키는속도 (converion rate), 생성물수율 (product yield), 생성물농도, 생산성 (productivity) 을높이는것이며연속배양인경우에는장기간교체없이사용할수있는효소고정화또는세포고정화방법을활용하는것이다. 생물반응기는발효조 (fermentor) 라고도부르며이상적인생물반응기의종류는다음과같이네가지로나눌수있다. 1 회분식배양기 (batch fermentor) 2 연속교반배양기 (continuou tirred tank fermentor) 3 플러그흐름배양기 (plug flow fermentor) 4 유가식배양기 (fed-batch fermentor) 이들배양기에관하여이장에서제시될식들은균일반응 (homogeneou reaction) 에대한식들이다. 여기서균일반응이란효소나세포가액상에균일하게분포되어있어반 - 169 -
170 9 장생물반응기 응이액상에서균일하게일어나는반응을말한다. 다음장에서다룰고정화효소 ( 세포 ) 반응은불균일반응 (heterogeneou reaction) 이라하며이경우에반응은액상이나기상에서가아니라효소또는세포가고정화된고체부위에서일어난다. 9.1 회분식배양기 회분식배양기 (batch fermentor) 란배양이완전히끝난후다시배지를교체하는방식이다. 즉, 초기에한번배지를채운후배양이끝날때까지더이상영양물질을공급하거나제거하지않는배양기를말한다. 회분식배양기에는교반기가설치되어있어내용물의조성이균일하다고가정한다. 회분식배양의전형적인공정도가그림 9.1에표시되어있다. 이러한형태의배양기는단순하기때문에실험실과산업계에서널리사용된다. 회분식배양 (batch culture) 에서미생물의생장곡선은여섯구간으로구분된다 ( 그림 9.2). 지연기 (lag phae) 동안세포는새로운배지에서생장하는데필요한효소를합성하는등의준비작업을한다. 가속생장기 (accelerating growth phae) 를거쳐지수생장기 (eponential growth phae) 가시작되면세포의수효는지수적으로급속히증가한다. 감속생장기 (decelerating growth phae) 를거쳐세포의수가더이상증가하지않는정지기 (tationary phae) 로들어가고결국은세포가사멸하는쇠퇴기 (decline phae) 로한사이클을마친다. 동물세포나식물세포도유사한생장곡선을나타낸다. 종균배양 접종 종균배양조 산 / 알칼리 균주보존 배지원료저장탱크 순수분리 미생물반응 증기 공기 세균여과기 통기 주반응조 증기살균 연속살균장치 배지제조탱크 균체분리및후처리공정 그림 9.1 전형적인회분식배양공정도
9.1 회분식배양기 171 1 2 3 4 5 6 log 균수 시간 1 지연기, 2 가속생장기, 3 지수생장기, 4 감속생장기, 5 정지기, 6 사멸기 그림 9.2 회분식생장곡선 여기서지수생장기가가장중요한구간으로이구간에서세포균체량 (X) 과기질의양 (S) 에관한상관관계를수학적으로표현해보자. 그런데배지의부피가불변이라고가정하면균체량 (X) 을부피로나눈균체의농도 () 로, 기질의양 (S) 도부피로나눈기질의농도 () 로표시할수있다. 단, 여기서기질은균체의생성에만사용된다고가정한다 ( 즉, 생성물을만드는데사용되지않는다고가정한다 ). 우선비생장속도 (μ) 의정의에의하여단위시간 ( ) 에일어나는균체농도의변화 () 는다음과같이표현된다. = μ (9.1) 세포의생장이모노드속도식 (Monod kinetic) 을따른다고가정하면 μ = μ m + K (9.2) 위식에서 μ m 은최대생장속도, K 는모노드상수이다. 여기서, 기질소모량에대한생성된균체의양의비 (ratio) 를 라하면 - 0 = ( 0 - ) (9.3) 0 : 최초의균체량 0 : 생장제한기질 (growth limiting ubtrate) 의초기량
172 9 장생물반응기 는세포수율 (bioma yield) 이라하며기질소모량에대한생성된균체량의비 (ratio) 를나타낸다. 예를들어, 1 g의포도당이소모되어 0.5 g의세포건조중량이만들어졌다면 = 0.5 이다. 식 (9.2) 를 (9.1) 에대입하고식 (9.3) 을이용하여 를 로표시하면다음과같다. = μ m ( 0 - + 0 ) (K + 0 + 0 - ) 이식의양변을변수분리하여적분하면 0 (K + 0 + 0 -) 0 + 0 - t = μ m 0 정리하면 A 0 + B 0 0 + 0 - = t μ m (9.4) 0 단, A = K + 0 + 0 0 + 0 B= K 0 + 0 미분방정식 (9.4) 를풀면해는다음과같다. A ln ( 0 ) [ - B ln 0 + 0-0 ] = μ m t (9.5) 식 (9.5) 에서 와 t 는변수이며그이외에다른기호에대한값은상수로주어진다. 이해는회분식배양에서균체의농도 ( ) 가시간 ( t ) 에따라변하며 S자모양으로이루어짐을보여준다. X에대응하는기질의농도 () 를구하려면다음식을쓴다. = ( 0 + 0 ) - (9.6) 9.2 연속식배양기 회분식배양기는배양시작후일정한시간이지나면세포가생장을멈추고그후기질이더이상소비되지않음과동시에생성물도만들어지지않는다. 그러나연속식배양
9.2 연속식배양기 173 기 (continuou fermentor) 에서는새로운배지 (freh medium) 가계속적으로공급되며동시에세포가배양기로부터빠져나온다. 따라서연속식배양기에있어서는생장 (growth) 과산물생성 (product formation) 이오랫동안유지될수있다. 연속식배양기가정상상태 (teady tate) 에도달하면세포 (cell ma), 생성물 (product), 기질 (ubtrate) 의농도가일정하게유지된다. 연속식배양기는플러그흐름배양기 (plug flow fermentor) 와연속교반배양기 (continuou tirred tank fermentor) 가있는데플러그흐름배양기를생물반응기에사용하는예는거의없으므로연속교반배양기만을설명한다. 연속식배양기를이해하기위해서는반응기부피와배지공급속도사이의관계를설명하는희석률 (dilution rate) 의개념을알아야한다. 희석률이란단위시간에공급되는배지의부피 ( F ) 를배양기부피 (V ) 로나눈것으로 D 로표시한다. 희석률은반응공학에서사용하는공간속도 (pace-velocity) 란개념과동일하다. D = F V = 배지공급속도배양기부피 (9.7) 9.2.1 연속교반배양기 연속교반배양기는배양기내용물이잘혼합되므로배출흐름 (effluent) 중의성분농도는배양기내의성분농도와동일하다. 연속교반배양기는키모스텟 (chemotat) 과터비도스텟 (turbidotat) 으로구분된다. 키모스텟 (chemotat) 은기질의농도 (), 생성물의농도 (p), ph 등배양액중의모든환경인자를일정하게유지하는방법이다 ( 그림 9.3). 펌프가가동되어새로가해진배지만큼 배지 S0, X=0, P=0 S, X, P S, X, P (a) 키모스텟 그림 9.3 키모스텟의모식도
174 9 장생물반응기 배지 S0, X=0, P=0 S X P S, X, P pectrophotometer (b) 터비도스텟 그림 9.4 터비도스텟의모식도 배양액이제거됨으로써항상일정한부피를유지한다. 정상상태 (teady tate) 에도달한키모스텟에서배지공급속도 ( 즉, 희석률 ) 를조절하면쉽게세포생장속도도조절된다. 키모스텟은화학공학자들에게잘알려져있는연속교반탱크반응기 (continuou tirred tank reactor, CSTR) 와같다. 터비도스텟 (turbidotat) 은배양액중의균체농도가일정하게유지되도록배지공급속도및배출속도를제어하는연속배양방법이다 ( 그림 9.4). 분광광도계 (pectrophotometer) 로배양액의탁도 (turbidity) 를조절하여균체농도를일정하게유지한다. 조업 (operation) 측면에서터비도스텟보다키모스텟이더편리한데, 이것은터비도스텟이분광광도계와제어기가필요한반면키모스텟은유속을일정하게유지하는펌프설치로가능하기때문이다. 터비도스텟은세포농도가일정하게유지되므로높은에탄올농도와같은스트레스조건을견딜수있는세포그룹을선택하는데있어서매우유용할수있다. 9.2.2 키모스텟배양기의물질수지 키모스텟배양에서균체와기질에대한물질수지를세우면다음과같다. 우선여기서는문제를단순화하기위하여기질은균체를만드는데만소모된다고가정한다. 다음절에서는보다일반적인경우로서기질이균체생산뿐만아니라제품의생성에도소모되는경우에대한물질수지를설명한다.
9.2 연속식배양기 175 기질이균체생산에만소모되는경우 (1) 균체에대한물질수지전체배양액 (V ) 에대해미분시간 에대해균체에대한물질수지 (material balance) 를세우면다음과같다. 시간에따른균체의변화량 ( dx ) = 생장한균체의양 ( dx ) - 유출된균체의양 ( dx ) 이므로 dx = (dx ) 생장 -(dx ) 유출 V = V μ - F (9.8) V : 배양액의부피, : 세포의농도, μ : 비생장속도, F : 배지공급속도 단, 여기서 V = X, F = dv임에유의하라. 또한식 (9.8) 의우변의첫째항은비생장속도의정의 μ = 1 에서얻어짐에주목하라. X 식 (9.8) 의양변을 V 로나누면 = μ - F V (9.9) 여기서, F / V 를 D 로표시하면 =(μ - D) (9.10) 정상상태에서시간에따른균체량의변화가없으므로 따라서 =0 (9.11) μ = D (9.12) (2) 기질에대한물질수지전체배양액의미분시간 에대해제한기질 ( S ) 의양에대한물질수지를세우면다음과같다. 시간에따른기질의변화량 = 유입된기질의양 - 유출된기질의양 - 생장에소모된기질의양이므로 V d = F 0 - F - V μ (9.13) 여기서, 는기질소모량에대한생성된균체의양의비 (ratio) 이다.
176 9 장생물반응기 양변을 V 로나누면 d = D ( 0 - ) - μ (9.14) 정상상태에서시간에따른기질농도의변화가없으므로 d =0 (9.15) 따라서 D ( 0 - )- μ =0 (9.16) 식 (9.16) 에는두개의미지수 와 가있다. 여기서 를구하기위해 Monod kinetic를사용한다. Monod kinetic는다음식으로주어진다. μ = μ m + K 여기서, μ m 은최대생장속도, K 는 Monod 상수이다. 이식을다음과같이변형한다. + K = μ m μ 1+ K = μ m μ (9.17) 식 (9.17) 에식 (9.12) 를대입하여정리하면 K = μ m D -1= μ m - D D 이식으로부터정상상태에서키모스텟내의기질의농도는다음식으로표현된다. = K D μ m - D (9.18) 식 (9.18) 과식 (9.12) 를 (9.16) 에대입하여정리하면정상상태에서키모스텟내의균체의농도는다음식으로표현된다. = ( 0 - )= ( 0 - K D μ m - D ) (9.19) 식 (9.18) 과 (9.19) 에서기질의농도 ( ) 와세포의농도 ( ) 를 D 의함수로나타낼수있
9.2 연속식배양기 177 균체농도 X [g/l] 5 4 3 2 1 0 DX S X 10 제 8 한기 6 질농도 4 S [g/l] 2 0 0 0.5 1.0 wah out 희석률 D[hr -1 ] μ m =1hr -1, =0.5, K = 0.2 g/ L, 0 =10g/L 그림 9.5 키모스텟에서희석률에따른세포농도 ( ) 와기질농도 () 의변화 으며이것을도시하면그림 9.5와같다. D =0일때 =0이며, D =μ m 일때식 (9.18) 에의하면 는무한대값을가지나실제는공급되는기질의농도 (10 g/l) 를초과할수없으므로 =10 g/l 가된다. 또한 D=0 일때 = 0 = 0.5 10 g/l = 5g/L이며, D =μ m 일때 S = 10 g/l 이므로 = 0.5(10-10) = 0이된다. 키모스텟에있어서세포는생장속도와같은속도로배양기로부터제거되며따라서생장속도 (μ) 는희석속도 (D) 와같다. 그런데만약 D가 μ m 만큼증가하면배양기에서나가는세포수에비하여생장되는세포수가더적기때문에시간이지남에따라배양기내의세포수가점차로줄어들어세출현상 (wahout) 에발생한다.