5 발효공학 5.1 미생물이용의역사인류는발효의의미를알지못하던시절부터이미미생물을이용한자연발효를실생활에이용해왔다. 구약성경의창세기편에롯이술을마신이야기가등장하며우리조상들은먼옛날부터김치, 간장등을발효에의해만들어사용하였다. 미생물은네덜란드의레벤후크 (Leeuwenhoek) 에의해 1676년처음발견된후이미생물이발효, 부패, 전염병등의원인임이파스퇴르 (Pasteur) 와코크 (Koch) 에의해밝혀지기까지 200여년의시간이소요되었다. 파스퇴르는프랑스포도주양조자들의고충인포도주산패를해결하기위하여연구하던중발효는효모의생활작용이며부패는잡균에의해일어난다는것을발견하였다. 그리고플라스크의목을가늘고길게한장치를사용하여 생명현상은생명으로부터 라는사실을입증하였고저온살균법 (pasteurization) 의발명, 광견병백신 (vaccine) 에대한면역개념도입, 발효현상의학문적해명등많은업적을남겼다. 코크는현미경을통하여탄저균의수포 (spore) 를발견하고생활상을밝혔으며감자절편을이용한미생물순수분리 (1880년), 폐결핵균의발견등의업적을남겼다. 한편부흐너 (Buchner) 는효모추출액으로부터알코올발효과정을입증함으로써생명현상은생물체에함유된효소에의해이루어진다는가설을주장하였다 (1897년). 그후플레밍 (Fleming) 은 1928년푸른곰팡이로부터페니실린을발견하였고, 스텐리 (Stanley) 의바이러스발견 (1935년), 크렙스 (Krebs) 의산소호흡대사과정규명 (1954년) 을거치며생명현상에대한많은연구가이루어졌다. 1944년그리피스 (Griffith) 는폐렴균에의한형질전환실험에서유전물질의존재를확인했고에버리 (Avery) 에의해유전물질의본질이 DNA임이밝혀졌다. 그리고 1950년에와트슨 (Watson) 과크리크 (Crick) 에의한 DNA 이중나선구조의규명은현 - 1 -
2 5 장발효공학 대분자생물학 (molecular biology) 의근간을이루게되었다. 5.2 미생물이용의장단점 미생물을공업적생산수단으로이용할때화학공정에비하여장단점이있다. 5.2.1 미생물이용의장점 미생물을이용한생산공정의장점은그내부에있는효소의촉매로서의장점과관련이있다. 즉, 다양한기질을이용할수있고반응에특이성이있다. 미생물은또한동 식물세포에비하여증식이빠르므로사용에유리하다. 1) 다양한기질 (substrate) 의이용 : 다양한기질의이용이가능하여공업적생산이나환경적인측면에서미생물이용이효과적일수있다. 2) 반응의특이성 (specificity) : 미생물특유의생리적활성으로화학공정을통한화학합성보다비교적쉽게생산물을얻을수있다. 3) 빠른증식성 : 한세대 (generation) 가약 30분에서수시간안에분열을함으로써빠른증식이가능한데이는단위시설에대한생산성 (productivity) 이중요시되는공업에서대단히유리하다. 4) 변이주 (mutant) 를인공적으로만들기용이 : 유용한미생물변이주육성이유전자조작을통하여가능하다. 5) 생화학적반응 : 화학공정과달리상온과상압에서반응이진행되어효율면에서유리하다. 이외에도다양한부산물이다른목적으로재사용이가능하고미생물배양시방출되는열을이용할수있으며몇단계의화학반응을단일반응과같은조작으로달성할수있는장점이있다. 5.2.2 미생물이용의단점 미생물을이용한생산공정이화학공정에비해갖는두드러진단점은무엇보다도오염의문제이다. 왜냐하면목적하는생성물을만들어내는균주이외의오염균의침입은전공정을무효화하는데, 공기, 물, 흙등도처에이러한오염균이존재하기때문이다. 1) 오염문제 : 철저한관리로잡균이나파아지 (phage) 에의한오염을방지하고항상최적의배양조건을유지하여야한다.
5.4 미생물의생육속도론 3 2) 생산물분리정제의어려움 : 배양액중에다양한성분이있으므로특정산물의정제 (purification) 에적합한방법을강구하여야한다. 3) 균주의변이 : 종균 (inoculum) 을연속적으로사용할경우자연적인돌연변이에의해성질이변할수있다. 4) 반응최적화의어려움 : 미생물반응은시시각각으로변하여최적화 (optimization) 가어려워자동제어에의한방법이강구된다. 5.3 미생물을이용한산업분야 미생물을이용한발효산업이주류및발효식품분야에는예전부터이용되었다. 근래에는의약용및각종고부가가치생산물을얻기위하여여러분야로발효산업의발전폭이넓어지고있다. 표 5.1 미생물을이용한산업분야 분야알코올제조및주류발효식품의약아미노산발효공업효소산업생리활성물질균체제조업기타분야 생산물포도주, 맥주, 소주, 주류용주정간장, 된장, 김치, 빵효모, 치즈, 요구르트 penicillin, streptomycin 등라이신 (lycine) 과같은각종아미노산 amylase, protease 등비타민류, 호르몬효모균체생산 (single cell protein, SCP) 미생물에의한환경정화, 대체에너지 ( 알코올, 메탄, 수소 ) 의생산등 5.4 미생물의생육속도론 미생물을특정배양조건 (culture condition) 에서배양하는경우시간에따른균체농도 (cell concentration) 의증가및배양액중의기질 ( 탄소원, 질소원, 인등 ) 감소등을정량화하여표현함으로서배양과정을속도론 (kinetics) 적으로해석할수있다. 5.4.1 증식속도 (growth rate) 미생물을회분식으로증식시킬경우시간에따른균체의변화를보면다음과같다.
4 5 장발효공학 1 2 3 4 5 6 log 균수 시간 1 지연기, 2 가속생장기, 3 지수생장기, 4 감속생장기, 5 정지기, 6 사멸기 그림 5.2 미생물의생장곡선 대수증식기의균체증가가전체성장의핵심부분에해당되므로대수증식기동안의세포증식에관하여수식으로표현하면다음과같다. N = N 0 2 n (5.1) 여기서 N : n 세대후의세포수, N 0 : 최초의세포수, n : 세대수그러나배지중의영양물질의소모, 세포생장을저해하는대사산물의축적등으로인하여이와같은대수증식기를오래지속시킬수는없다. 이문제를부분적으로해결하기위해서는유가식 (fed-batch) 배양에의해배지를일부제거하고새로운배지를조금씩추가함으로써세포생장을지속시킬수있다. 5.4.2 비증식속도 (specific growth rate) 단위시간당배양조건의효율을나타내는것으로세포의비증식속도를사용한다. 시간 t 에대한균체량 X의평균변화율, 즉미소시간 dt 동안에증식하는균체량 dx는그시점에존재하는균체량 X에정비례한다고생각하면다음식으로표시된다. dx dt μx (5.2) 또는
5.4 미생물의생육속도론 5 μ 1 X dx dt (5.3) 여기서 μ : 비증식속도 (h -1 ) X : 균체량 ( 건조균체량또는흡광도로표시 ) t : 시간 (h) 예를들어, 비증식속도 (μ) 가 0.1 h -1 이면시간당 10 % 증식함을의미하며비증식속도값이클수록증식속도가크다. 이비증식속도는미생물의경우대개 0.2~1.0 h -1 이다. 이것은다음절에서설명되는증배시간이대개 30분에서수시간이내인것과연관된다. 5.4.3 증배시간 (doubling time) 미생물을배양하여원래균체량의 2배가되는시간을증배시간 (t d) 이라하고비증식속도에관한식 (5.3) 을적분하여증배시간을알아낼수있다. 식 (5.3) 을적분하기위하여변형하면 식 (5.4) 를적분하면 dx X = μ dt, t =0 일때 X = X 0 (5.4) ln X X 0 = μ t (5.5) 여기서 X : 시간 t 에서의균체량 X 0 : t =0 에서의균체량 식 (5.5) 에서미생물의질량이두배로증가하면좌변은 ln 2 이므로 ln 2 = μ t d (5.6) t d : 세포의증배시간 t d = ln 2 μ = 0.693 μ (5.7) 식 (5.7) 에서세포의증배시간은비증식속도에의해서결정됨을알수있다. 그리고미생물의경우증배시간은대개 30분에서수시간이내이다. 대수생장기간에는 X를시간에대하여반로그플롯 (semilogarithm plot) 을했을때직선이되며이때그직선의기울기가비생장속도이다.
6 5 장발효공학 5.5 미생물의영양과배지 미생물은생장을위하여무기또는유기영양물질을섭취해서에너지원으로이용하거나세포구성성분을합성한다. 대표적인영양원으로탄소원, 질소원, 미량영양소또는비타민과같은생육인자, 그리고에너지원등으로나눌수있다. 무기원소중 P, S, Mg 및 K는비교적다량이필요하고, Ca, Mn, Co, Cu, Zn 등이미량금속원소로서요구된다. 그리고비타민류, 핵산등과같은생육인자는단순히증식촉진효과뿐만아니라대사조절물질로서생산물의양에영향을미치는경우가있어서최적의농도로조절할필요가있다. 세포가필요로하는영양소에대해서는제1장에자세히설명되어있다. 가장흔히사용되는실험실용배지에는 Beef Extract medium, Corn Steep Liquor medium, Glucose-Yeast Extract medium, Mineral Salt Agar medium 등이있다. 이중에 Glucose-Yeast Extract 배지의조성은다음과같다. Yeast extract Peptone KH 2 PO 4 NaCl 증류수 Noble agar 5.0 g 1.0 g 1.0 g 1.0 g 950.0 ml 13.0 g 이배지의 ph를 6.8로조정하고 121 에서 15분간멸균한다. 그리고 10 % 의포도당을별도로멸균하여 50 ml를가한다. 산업용으로사용되는미생물배지의탄소원으로는사탕수수폐당밀 (sugar cane molasses), 사탕무폐당밀 (sugar beet molasses), 옥수수폐기물 (corn waste) 등이있다. 또한산업용질소원으로는암모늄염, 요소, 질산염, 옥수수침출액 (corn steep liquor), 콩가루 (soya bean meal) 등이있다. 5.6 미생물의생장온도와 ph 5.6.1 온도미생물은생장가능한온도의범위에따라저온균, 중온균및고온균으로분류된다. 저온균은 - 10 에서도증식하는가하면고온균은 85 에서도생장이가능하다. 그러나이온도범위는무기촉매에의한반응에서사용하는온도범위에비하여좁으며특히고온부분의온도가일반적인화학반응에비하여훨씬낮다. 미생물의생장속도는
5.7 기본발효공정 7 표 5.2 미생물의증식온도 구분 저온균 (Psychrophile) 중온균 (Mesophile) 고온균 (Thermophile) 증식온도 ( ) 최저최적최고 -10~0 10~20 20~30 균 Pseudomonas, Vibrio, Candida, Torulopsis, Cladosporium 균중일부 5~15 25~40 40~55 대부분의세균, 방선균, 곰팡이, 효모 25~40 50~60 75~85 Thermus, Bacillus, Clostridium 균중일부, 고온성곰팡이 주 가능한온도범위내에서는온도에따라지수적으로 (exponentially) 증가한다. 이것은세포의대사과정에관여하는효소의반응속도가온도에따라지수적으로증가하기때문이다. 그러나그범위를초과하면생장속도는급격히저하되는데그이유는세포를구성하는단백질과세포구성물질이열변성 (thermal degradation) 되기때문이다. 5.6.2 ph 미생물의증식및대사반응에대한 ph의영향은매우크며생산물의생성속도에도많은영향을미친다. 박테리아나방선균은 ph 5~9, 효모나곰팡이는 ph 1.5~9 에서생육하지만그최적 ph는각각 6.5~7.5 와 4~6 으로알려져있다. 그러나 Thiobacillus thiooxidans처럼강한산성인 ph 0.5~1에서생육하거나 Nitrobacter, Nitrosomonas 등처럼강한알카리성인 ph 13에서도생육할수있는미생물도알려져있다. 일반적인박테리아라도유산균 (lactic acid bacteria) 이나초산균등과같이산을생산하는균은낮은 ph에대해서저항성이있다. 미생물의생장이 ph에의존하는것은세포내효소의활성이 ph에따라변하기때문이다. 5.7 기본발효공정미생물의발효공정은다음과같은 6가지기본적인단계로구성되어있다 ( 그림 5.2). 1) 배지의조제 : 균의증식이나발효생산물을만들기위하여필요한각종영양분을용해시켜배지를만든다. 이때균의증식을위한배지와발효를위한배지는그구성성분에차이가있는것이보통이다. 2) 설비의살균 : 발효장비및배지를살균한다. 보통 15 psi 수증기로 121 에서 15~30 분간멸균하는데멸균시간은배지의양이많을수록증가시켜야한다. 3) 종균의준비 : 주발효에사용할종균 (inoculation) 을 slant나동결건조상태에서취하여
8 5 장발효공학 배지준비 ( 멸균 ) 공기 주발효조 균체 배양액 (broth) 균체분리 보존균주 종균배양 ( 플라스크 ) 종균배양 ( 발효조 ) 생성물의분리 - 정제 균체가제거된배양액 그림 5.2 세포외생성물 (extracellular product) 에대한미생물발효공정단계 플라스크진탕배양과소규모종배양발효조에서증식시킨다. 4) 균의증식 : 주발효조내에서배양조건을최적화하여박테리아를증식시킨다. 5) 생산물의추출과정제 : 배양액에서균체를분리한다. 생성물이세포외부로자연적으로유출되는경우에는균체가제거된배양액을분리정제하는공정이사용된다. 그러나생성물이세포내부에갖혀있는경우에는우선세포를파쇄하고나서그것으로부터생성물을분리정제해야한다. 6) 발효폐기물의처리 표 5.3 미생물의생장속도에영향을주는인자 구분배지온도산소접종균 ph 고려사항 영양원의종류와농도탄소원, 질소원, 무기염류, 필수영양소등 물리적성상 - 고체, 액체, 점도 그외의첨가물 - 전구물질, 소포체등 경제성 ( 저렴한원료의사용 ) 미생물마다요구하는최적온도를사용 호기성균의경우 - 배양기의종류, 교반속도, 통기량, 공기의압력등 혐기성균의경우 - 산소를제거한다. 배양조건, 접종량 미생물마다요구하는최적 ph 사용