(72) 발명자 김대진 경기도화성시병점동안화동마을주공 5 단지 506 동 1901 호 정성엽 경기도수원시팔달구권광로 373, 월드메르디앙 109 동 105 호 ( 우만동 ) 임창기 경기도화성시영통로 27 번길 53, 신영통현대아파트 207 동 904 호 ( 반월동 )

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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 9/38 ( ) A61K 47/30 ( ) A61K 38/28 ( ) A61K 31/722 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2010 년 06 월 08 일 심사청구일자 2011 년 05 월 04 일 (65) 공개번호 (43) 공개일자 2011 년 12 월 14 일 (56) 선행기술조사문헌 KR A* WO A1* * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2013년11월01일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2013년10월28일 (73) 특허권자 한미사이언스주식회사 경기도화성시동탄면동탄기흥로 550 (72) 발명자 김진선 경기도용인시기흥구보라동 553 민속마을쌍용아파트 103 동 1501 호 허용호 서울특별시구로구신도림로 110, 101 동 1403 호 ( 신도림동, 우성아파트 ) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 전체청구항수 : 총 21 항심사관 : 윤동준 손민 (54) 발명의명칭면역글로불린단편을이용한단쇄인슐린아날로그약물결합체 (57) 요약 본발명은단쇄인슐린아날로그 (single-chain insulin analog), 비펩타이드성중합체및면역글로불린 Fc 영역이상호공유결합에의해연결되어있어생체내지속성및안정성이향상된단쇄인슐린아날로그결합체및그이용에관한것이다. 본발명의단쇄인슐린아날로그결합체는생체내에서인슐린과유사한활성을나타내고, 혈중반감기가현저히증가된인슐린아날로그지속형제형으로인슐린치료의단점인저혈당을유도하지않는획기적인단쇄인슐린아날로그결합체에관한것이다. 대표도 - 도 8-1 -

2 (72) 발명자 김대진 경기도화성시병점동안화동마을주공 5 단지 506 동 1901 호 정성엽 경기도수원시팔달구권광로 373, 월드메르디앙 109 동 105 호 ( 우만동 ) 임창기 경기도화성시영통로 27 번길 53, 신영통현대아파트 207 동 904 호 ( 반월동 ) 권세창 서울특별시광진구아차산로 552, 10 동 1204 호 ( 광장동, 극동아파트 ) - 2 -

3 특허청구의범위청구항 1 단쇄인슐린아날로그및면역글로불린 Fc 영역이링커인폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜-프로필렌글리콜공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성고분자, 지질중합체, 키틴류, 히아루론산및이들의조합으로이루어진군으로부터선택되는비펩타이드성링커를통해연결되는단쇄인슐린아날로그결합체. 청구항 2 제1항에있어서, 상기단쇄인슐린아날로그는천연형프로인슐린, 천연형프로인슐린에서일부아미노산의치환 (substitution), 추가 (addition), 제거 (deletion), 수식 (modification) 및배열순서의변환중에서선택되는어느하나의방법또는이들방법의조합을통해제조된아날로그, 변이체, 또는이들의단편인단쇄인슐린아날로그결합체. 청구항 3 제 1 항에있어서, 상기단쇄인슐린아날로그는 C 펩타이드의 55 번라이신잔기및 56 번아르기닌잔기가제거된 단쇄프로인슐린아날로그 (A-CΔKR-B) 인단쇄인슐린아날로그결합체. 청구항 4 제 1 항에있어서, 비펩타이드성중합체의각말단이각각면역글로불린 Fc 영역과단쇄인슐린아날로그의아민 그룹또는티올그룹 (Thiol group) 에결합된단쇄인슐린아날로그결합체. 청구항 5 제 1 항에있어서, 면역글로불린 Fc 영역이비당쇄화됨을특징으로하는단쇄인슐린아날로그결합체. 청구항 6 제 1 항에있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로이루어진군으로부터 1 개내지 4 개 선택되는도메인으로이루어진단쇄인슐린아날로그결합체. 청구항 7 제 6 항에있어서, 면역글로불린 Fc 영역이힌지영역을추가로포함하는단쇄인슐린아날로그결합체. 청구항 8 제 1 항에있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM 에서유래된 Fc 영역인단쇄인슐린아날 로그결합체. 청구항 9-3 -

4 제 8 항에있어서, 면역글로불린 Fc 영역의각각의도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM 로이루어진군에서선택 되는면역글로불린에서유래된상이한기원을가진도메인의하이브리드인단쇄인슐린아날로그결합체. 청구항 10 제 8 항에있어서, 면역글로불린 Fc 영역이동일한기원의도메인으로이루어진단쇄면역글로불린으로구성된이 량체또는다량체인단쇄인슐린아날로그결합체. 청구항 11 제 8 항에있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 IgG4 Fc 영역인단쇄인슐린아날로그결합체. 청구항 12 제 11 항에있어서, 면역글로불린 Fc 영역이인간비당쇄화 IgG4 Fc 영역인단쇄인슐린아날로그결합체. 청구항 13 제 1 항에있어서, 비펩타이드성중합체의반응기가알데히드그룹, 프로피온알데히드그룹, 부틸알데히드그룹, 말레이미드그룹및석시니미드유도체로이루어진군으로부터선택되는단쇄인슐린아날로그결합체. 청구항 14 제 13 항에있어서, 석시니미드유도체가석시니미딜프로피오네이트, 석시니미딜카르복시메틸, 하이드록시석시 니미딜또는석시니미딜카보네이트인단쇄인슐린아날로그결합체. 청구항 15 제 13 항에있어서, 비펩타이드성중합체가양말단에반응알데히드그룹의반응기를갖는단쇄인슐린아날로그 결합체. 청구항 16 제 1 항내지제 15 항중어느한항의단쇄인슐린결합체를포함하는생체내지속성및안정성이증가된단쇄 인슐린지속성제제. 청구항 17 제 16 항에있어서, 당뇨병치료용인지속성제제. 청구항 18 (1) 각말단에알데히드, 말레이미드, 또는석시니미드유도체반응기를갖는비펩타이드성중합체를사용하여면역글로불린 Fc 영역의아민그룹또는티올그룹에공유결합으로연결하는단계 ; (2) 상기 (1) 의반응혼합물로부터비펩타이드성중합체가공유결합된면역글로불린 Fc 영역을포함하는연결 - 4 -

5 체를분리하는단계 ; 및 (3) 분리된연결체의비펩타이드성중합체의다른쪽말단에프로인슐린을공유결합으로연결하여비펩타이드성중합체의양쪽말단이각각면역글로불린 Fc 영역및프로인슐린과결합된펩타이드결합체를생성하는단계를포함하는, 제1항의단쇄인슐린아날로그결합체의제조방법. 청구항 19 (1) 각말단에알데히드반응기를갖는비펩타이드성중합체를사용하여면역글로불린 Fc의 N-말단에 ph6.0에서공유결합으로연결하는단계 ; (2) 상기 (1) 의반응혼합물로부터 N-말단에비펩타이드성중합체가공유결합된면역글로불린 Fc 영역을포함하는연결체를분리하는단계 ; 및 (3) 분리된연결체의비펩타이드성중합체의다른쪽말단에프로인슐린을공유결합으로연결하여비펩타이드성중합체의양쪽말단이각각면역글로불린 Fc 영역및프로인슐린과결합된펩타이드결합체를생성하는단계를포함하는, 제1항의단쇄인슐린아날로그결합체의제조방법. 청구항 20 (1) 각말단에알데히드, 말레이미드, 또는석시니미드유도체반응기를갖는비펩타이드성중합체를사용하여프로인슐린의아민그룹또는티올그룹에공유결합으로연결하는단계 ; (2) 상기 (1) 의반응혼합물로부터비펩타이드성중합체가공유결합된프로인슐린을포함하는연결체를분리하는단계 ; 및 (3) 분리된연결체의비펩타이드성중합체의다른쪽말단에면역글로불린 Fc 영역을공유결합으로연결하여비펩타이드성중합체의양쪽말단이각각면역글로불린 Fc 영역및프로인슐린과결합된펩타이드결합체를생성하는단계를포함하는, 제1항의단쇄인슐린아날로그결합체의제조방법. 청구항 21 (1) 각말단에알데히드반응기를갖는비펩타이드성중합체를사용하여프로인슐린의아민그룹에공유결합으로연결하는단계 ; (2) 상기 (1) 의반응혼합물로부터비펩타이드성중합체가공유결합된프로인슐린을포함하는연결체를분리하는단계 ; 및 (3) 분리된연결체의비펩타이드성중합체의다른쪽말단에면역글로불린 Fc 영역을공유결합으로연결하여비펩타이드성중합체의양쪽말단이각각면역글로불린 Fc 영역및프로인슐린과결합된펩타이드결합체를생성하는단계를포함하는, 제1항의단쇄인슐린아날로그결합체의제조방법. 명세서 [0001] 기술분야본발명은단쇄인슐린아날로그 (single-chain insulin analog), 비펩타이드성중합체및면역글로불린 Fc 영역이상호공유결합에의해연결되어있어생체내지속성및안정성이향상된단쇄인슐린아날로그결합체및그이용에관한것이다. 더욱구체적으로본발명은생체내에서인슐린과유사한활성을나타내고, 혈중반감기가현저히증가된인슐린아날로그지속형제형으로서, 인슐린치료의단점인저혈당을유도하지않으며지속성특성이부여되어인슐린치료의부작용및투여편의성을향상시킨획기적인단쇄인슐린아날로그결합체및이의제조방법에관한것이다. 배경기술 - 5 -

6 [0002] 인슐린은인체의췌장에서분비되는혈당조절호르몬으로혈액내의잉여포도당을세포로옮겨세포에에너지원을공급하는한편혈당을정상수준으로유지시켜주는역할을한다. 그러나당뇨환자의경우이러한인슐린이부족하거나인슐린저항성및베타세포의기능소실로인하여인슐린이정상적인기능을나타내지않아혈액내의포도당을에너지원으로이용하지못하고혈중포도당수준이높은고혈당증세를나타내어결국소변으로당을배출하게되며여러합병증과연계되어있다. 따라서인슐린이부족하거나정상적인기능을나타내지못하는당뇨환자에게는인슐린치료가필수적이며, 인슐린투여시정상수준으로혈당을조절할수있다. [0003] 인슐린제제는선천적으로인슐린생성에이상이있는일형 (Type Ⅰ) 당뇨환자나, 인슐린내성, 인슐린분비 부족등에의해 2 차적으로혈당치가상승하는이형 (Type Ⅱ) 당뇨이면서경구용당뇨약으로조절이잘안되거 나금기인환자, 임신성당뇨환자에게투여하는혈당조절제이다. [0004] 초기에는소나돼지의인슐린을정제하여쓰는방법을이용했지만, 유전공학및 DNA 조작기술의발달로세균, 효모등을이용하여사람인슐린의대량생산이가능하게되었고 ( 참조 : EP ), 사람인슐린을변형시켜 작용시간등을개선한인슐린아날로그등을생산할수있게되었다. [0005] 유전자재조합기술에의한최초의사람인슐린변형체는일라이릴리사 (Eli lilly) 의인슐린리스프로 (Lispro) 로 B쇄카복실말단두번째라이신잔기와세번째프롤린잔기를순서를바꾸어인슐린이량체및육량체의형성을막아주사투여시혈당강하활성이좋은단량체인슐린의양을늘린인슐린변형체이다. 노보노디스크사 (Novo Nordisk) 의인슐린아스파트 (aspart) 는 B쇄 28번프롤린잔기를아스파틱산잔기로치환하여, 전하의반발력 (repulsion) 을증가시켜인슐린육량체의형성을막아초속효성활성을나타내도록만들어진변형체이다. 사노피아벤티스사의인슐린글루이진 (Glulisine) 은 B쇄 3번아스파라진 (asparagine) 잔기를라이신 (Lysine) 잔기로치환하고, B쇄 29번라이신 (Lysine) 잔기를글루탐산 (glutamic acid) 잔기로치환하여빠른혈당강하효과를나타내도록만들어진변형체이다. [0006] 그러나, 인슐린의경우다른단백질및펩타이드호르몬과마찬가지로체내의반감기가극히짧아치료학적효과를지속적으로나타내기힘들며, 효과를나타내기위해서는지속적으로반복투여를해야한다는단점이있다. 또한단백질및펩타이드약물은대부분주사제형태로환자에게투여되며, 따라서생리활성펩타이드의혈중농도를유지하기위하여자주주사하게되는데, 이는환자에게엄청난고통을야기하게된다. 따라서, 단백질의생체내반감기를증가시켜투여횟수를줄임으로써치료학적효과를높이며환자의삶의질을높이기위해여러단백질제형화연구와화학변형이연구되어왔다. [0007] [0008] 이러한인슐린제제의투여상의문제점을극복하기위하여다양한시도중하나로인슐린약물의생체막투과도를증가시켜구강또는비강을통한흡입으로인슐린약물을체내로전달하는시도가있었다. 화이자사의흡입형당뇨병인슐린치료제 ' 엑수베라 (Exubera)' 는주사투여의불편함을개선한획기적인흡입형속효성인슐린제제로주사형인슐린제제와유사한혈당강하효과를나타내어주목받았으나, 폐암발병위험등의안전성문제및매출부진으로인하여시장에서철수되었다. 또한노보노디스크사, 릴리사등여러제약회사에서흡입형인슐린개발에착수하였다가중단한바있다. [0009] 이러한흡인형투여방법은간단하고환자스스로도고통없이투여할수있는방법을제공하여기존의주사투여보다는확실하게선호되고있지만주사제에비해약물의체내전달효율이낮으며약물의체내활성을요구되는조건으로유지하는데아직까지는어려움이많다. 또한미생물및병원균에의한오염, 안정성및내구성등흡입형투여에알맞은조성물을준비하는데어려움이있다. 그리고흡입형제품을폐로전달하는것은부종, 세포손상및조직에염증을유발할수있는부작용으로인하여폐흡수메카니즘에대한연구가더필요하며, 현재흡수메커니즘, 흡수율및범위를예측하는능력은초기단계에있다

7 [0010] 그러나아직도많은연구자및제약사들은인슐린제제의호흡기전달을가능한것으로보고계속해서개발노력 을쏟고있으며, 현재엑수베라의단점을극복한맨카인드 (mannkind) 사의흡입형인슐린제제아프레자 (Afrezza) 가 FDA 승인대기중에있다. [0011] 이외투여편의성을향상시키고효과적인치료에충분한수준의생물학적이용가능성을가진투여방법의개발 은지난수년간진행되어왔으며, 경구, 비강및경피흡수등의투여경로가인슐린제제가현재임상시험진 행중에있다. (E.-S. Khafagy et al., Advanced Drug Delivery Reviews ; 59, (2007) ) [0012] [0013] 한편, 인슐린제제약물의혈중안정성을증가시키고혈중약물농도를오랫동안높게지속시켜약효극대화및 투여편의성을향상시키려는노력이계속되어왔는데, 인슐린약물의지속형제제는인슐린의안정성을높이는 동시에약물자체의역가가충분히높게유지되고, 환자에게저혈당반응을유발하지않아야한다. [0014] 현재시판중인지속형인슐린제제는사노피-아베티스사 (sanofi-aventis) 의인슐린글라진 (insulin glargine, lantus) 과노보노디스크사 (Novo Nordisk) 의인슐린디터미르 (insulin detemir, levemir) 가있다. 사노피-아벤티스사의인슐린글라진은최초의지속형인슐린으로 A쇄의 21번째아스파라진을글라이신으로치환하고, B쇄에 2개의아르지닌잔기를추가하여산성 ph에서가용성성질을가지며생체내의 ph에서는낮은가용성성질을나타내어, 피하투여시에인슐린의침전을유도하여천천히흡수되도록제조되었다. 인슐린글라진의지속시간은약 20~22시간으로속효성 (5~8시간) 및초속효소성 (3~5시간) 인슐린대비작용시간이길고인슐린농도의피크가없어저혈당이발생하지않는다는장점을가지고있다. 노보노디스크사의인슐린디터미르는가장최근에개발된지속형인슐린제제로 B쇄의 30번째트레오닌잔기를제거하고 B쇄의 29번라이신잔기에아실화를시켜인체투여시에알부민과결합할수있도록제작하여지속형의특성을부여하였다 (Allison J. et al, DM , 2010). 지속시간은인슐린글라진보다약간짧은 18~22시간으로하루 1회또는 2회제형으로개발되었다. 이들지속성인슐린들은혈중인슐린농도의피크가없어기저인슐린으로적합하다. 그러나이러한지속형인슐린들은충분히반감기가길지않아매일 1회또는 2회투여해야하는불편함이여전히존재하여장기간투여해야하는당뇨병환자의경우투여빈도를획기적으로낮추어환자의편의성을증가시킬수있는제제의필요성이매우요구되고있다. [0015] 인슐린제제의지속형및저혈당문제를해결하기위한방법으로단쇄인슐린아날로그를사용할수있다. 단쇄인슐린은기존의 A 쇄와 B 쇄로구성된인슐린을단쇄로제조하여사용함으로써반감기및효력을조절할수있다. 단쇄인슐린은 A 쇄와 B 쇄순으로연결하거나 B 쇄와 A 쇄순으로연결할수있으며각쇄의연결시펩타이드가링커로삽입될수있다. 또한 A 쇄와 B 쇄어느하나만을사용할수있으며이의아날로그도이에포함된다. [0016] [0017] 인슐린제제의지속형을향상시키기위한다른방법은인슐린의전구물질인프로인슐린의이용이다. 프로인슐린그자체는약한인슐린아고니스트로서인슐린에비하여활성은낮지만인슐린대비더긴반감기를가진다 (William F. et al., The journal of biological chemistry, vol. 267; , 1992). 프로인슐린은인슐린과달리 B쇄와 A쇄가인슐린의안정성유지에중요한역할을하는 C 펩타이드에의해연결되어있어혈중반감기가인슐린대비더길다. 따라서많은연구자들에의해프로인슐린을지속형인슐린으로개발하려는여러시도가있었다. 그러나활성에중요한역할을하는 A쇄의아미노말단글라이신잔기가 C 펩타이드에가려져있어인슐린에비해활성이낮은단점이있어 (William F. et al., The journal of biological chemistry, vol. 267; , 1992) 아직약물로개발되지못하였다. [0018] 이에, 본발명자들은프로인슐린아날로그의혈당강화효과및혈중지속성향상으로투여의편의성을증대시키고, 생체내활성유지및인슐린의부작용인저혈당효과를감소시킬수있는프로인슐린아날로그결합체를제작하였다. 프로인슐린아날로그결합체에새로운특성을부여하기위한방법으로면역글로불린 Fc 영역, 비펩타이드성중합체및프로인슐린아날로그를공유결합에의해부위선택적으로상호연결시키는제조방법을사 - 7 -

8 용하였고, 그결과인슐린아날로그결합체의혈중반감기를획기적으로증가시켜기존의지속형인슐린제제보 다월등히개선된혈중반감기증가효과및저혈당감소효과를확인함으로써본발명을완성하였다. 발명의내용 [0019] 해결하려는과제본발명의목적은인슐린과유사하거나또는우월한생체내혈당강하효력을유지하면서혈중반감기를월등히연장시켜투여의편의성향상및인슐린의부작용을개선한우수한단쇄인슐린아날로그지속형제제및이의제조방법을제공하는것이다. [0020] [0021] 과제의해결수단상기목적을달성하기위하여, 본발명은단쇄인슐린아날로그및면역글로불린 Fc 영역이양말단에반응기를갖는비펩타이드성중합체를통하여상호공유결합에의해연결되어있는지속형단쇄인슐린아날로그결합체및그의변이체그리고이의제조방법을제공한다. 상기목적을달성하기위한하나의양태로서, 본발명은프로인슐린아날로그 (pro-insulin analog) 및면역글로불린 Fc 영역이비펩타이드성링커를통해연결된프로인슐린아날로그결합체를제공한다. [0022] 이하, 본발명을상세히설명한다. [0023] 한다. 본발명은단쇄인슐린아날로그결합체를제공하며보다구체적으로프로인슐린아날로그결합체를제공 [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] 본발명은단쇄인슐린아날로그및면역글로불린 Fc 영역이양말단에반응기를갖는비펩타이드성중합체를통하여상호공유결합에의해연결되어있는지속형단쇄인슐린아날로그결합체에관한것이다. 또한, 본발명은프로인슐린아날로그및면역글로불린 Fc 영역이양말단에반응기를갖는비펩타이드성중합체를통하여상호공유결합에의해연결되어있는지속형프로인슐린아날로그결합체에관한것이다. 본발명의 단쇄인슐린 은천연형인슐린과유사한생체내혈당강화특성을보유하며 A 쇄와 B 쇄가하나의쇄로연결된인슐린아날로그이다. 바람직하게본발명의단쇄인슐린아날로그는프로인슐린아날로그이다. 본발명의 프로인슐린아날로그 는프로인슐린과유사한생체내혈당강하특성을보유한사람의프로인슐린변이체로서, 천연형프로인슐린과 A쇄, B쇄, 그리고 C 펩타이드배열이하나이상다른펩타이드를의미한다. 본발명의프로인슐린아날로그는 A쇄, B쇄, C 펩타이드각각의아미노산서열은천연형이거나아미노산이추가또는삭제된형태모두가능하다. 바람직하게본발명의프로인슐린아날로그는인슐린과유사한생체내혈당강하특성을보유한사람의프로인슐린변이체로서, 천연형프로인슐린의 B쇄- C 펩타이드- A쇄의배열과달리 A쇄- C 펩타이드 -B쇄의배열을가지며, A쇄의아미노말단부위가자유롭다. 본발명의프로인슐린아날로그는상기기술한프로인슐린과동일한생체내의혈당조절기능을보유한펩타이드로서, 이러한펩타이드는프로인슐린아고니스트 (agonist), 유도체 (derivatives), 단편 (fragments), 변이체 (variants) 등을포함한다. 본발명의프로인슐린아고니스트는프로인슐린의구조와상관없이인슐린의생체내수용체에결합하여인슐린과동일한생물학적활성을나타내는물질을의미한다. 본발명의프로인슐린아날로그는천연형프로인슐린의 A쇄, B쇄그리고 C 펩타이드와각각최소한 80% 이상아미노산서열에서상동성을보이며, 아미노한잔기의일부그룹이화학적으로치환 ( 예 ; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거 ( 예 ;deamination) 또는수식 ( 예 ; N-methylation) 된형태일수있고, 체내에서혈당을조절하는기능을보유한펩타이드를의미한다. 본발명의프로인슐린단편은프로인슐린에하나또는그이상아미노산이추가또는삭제된형태를의미하며추가된아미노산은천연에존재하지않는아미노산 ( 예 ; D형아미노산 ) 도가능할수있고, 이러한인슐린단편 - 8 -

9 은체내에서혈당조절기능을보유한다. [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] 본발명의프로인슐린변이체는, 프로인슐린과아미노산서열이하나이상다른펩타이드로서, 체내에서혈당조절기능을보유한펩타이드를의미한다. 본발명의인슐린아고니스트, 유도체, 단편및변이체에서각각사용된제조방법은독립적으로사용될수있고조합도가능하다. 예를들어아미노산서열이하나이상다르고아미노말단아미노산잔기에탈아미노화 (deamination) 된체내에서혈당조절기능을보유한펩타이드도포함된다. 구체적인일양태로서본발명에서사용한프로인슐린아날로그는재조합방법을통하여생산될수있으며, Solid phase 합성법을통하여합성하는방법으로도생산가능하다. 바람직하게본발명에서사용된프로인슐린아날로그결합체는프로인슐린아날로그의라이신잔기에비펩타이드성중합체가결합된것을특징으로한다. 바람직하게본발명에서사용된프로인슐린아날로그결합체는, A쇄- C 펩타이드 -B쇄의배열을가지며 A 쇄의아미노말단부위가자유로운프로인슐린의 A쇄의아미노말단에비펩타이드성중합체가결합된것을특징으로한다. 구체적인일실시예로서, 본발명자는면역글로불린 Fc 영역의아미노말단에 PEG를결합시키고여기에프로인슐린아날로그특정라이신잔기에선택적으로커플링하여프로인슐린아날로그-PEG-면역글로불린 Fc 결합체를제조하였다. 또다른구체적인일실시예로서, 본발명자는면역글로불린 Fc 영역의아미노말단에 PEG를결합시키고여기에프로인슐린아날로그 A쇄의아미노말단에선택적으로커플링하여프로인슐린아날로그-PEG-면역글로불린 Fc 결합체를제조하였다. 본발명에서제조한프로인슐린아날로그-PEG-면역글로불린 Fc 결합체및프로인슐린아날로그 (55번라이신잔기와 56번아르기닌잔기가제거된프로인슐린아날로그 )-PEG-면역글로불린 Fc 결합체의혈중반감기는천연형인슐린및프로인슐린대비월등히증가하였고, 질환모델동물에서혈당강하효과를보여생체내활성이유지된새로운지속형인슐린제형을제조할수있었다. 면역글로불린 Fc 영역은생체내에서대사되는생분해성의폴리펩타이드이기때문에, 약물의캐리어로사용하기에안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은면역글로불린전체분자에비해상대적으로분자량이적기때문에결합체의제조, 정제및수율면에서유리할뿐만아니라, 아미노산서열이항체마다다르기때문에높은비균질성을나타내는 Fab 부분이제거되기때문에물질의동질성이크게증가되고혈중항원성의유발가능성도낮아지게되는효과도기대할수있다 [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] 본발명에서사용되는단쇄인슐린아날로그는캐리어물질과비펩타이드성중합체로연결된다. 본발명에사용가능한캐리어물질은면역글로불린 Fc 영역, 알부민, 트랜스페린및 PEG로구성된군에서선택될수있으며, 바람직하게는면역글로불린 Fc 영역이다. 본발명에서, " 면역글로불린 Fc 영역 " 은, 면역글로불린의중쇄와경쇄가변영역, 중쇄불변영역 1(CH1) 과경쇄불변영역 (CL1) 을제외한, 중쇄불변영역 2(CH2) 및중쇄불변영역 3(CH3) 부분을의미하며, 중쇄불변영역에힌지 (hinge) 부분을포함하기도한다. 또한본발명의면역글로불린 Fc 영역은천연형과실질적으로동등하거나향상된효과를갖는한, 면역글로불린의중쇄와경쇄가변영역만을제외하고, 일부또는전체중쇄불변영역 1(CH1) 및 / 또는경쇄불변영역 1(CL1) 을포함하는확장된 Fc영역일수있다. 또한, CH2및 / 또는 CH3에해당하는상당히긴일부아미노산서열이제거된영역일수도있다. 즉, 본발명의면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인및 CH4 도메인, 2)CH1 도메인및 CH2 도메인, 3)CH1 도메인및 CH3 도메인, 4)CH2 도메인및 CH3 도메인, 5)1개또는 2개의이상의도메인과면역글로불린힌지영역 ( 또는힌지영역의일부 ) 와의조합, 6) 중쇄불변영역각도메인과경쇄불변영역의이량체일수있다. 또한, 본발명의면역글로불린 Fc 영역은천연형아미노산서열뿐만아니라이의서열유도체 (mutant) 를포함한 - 9 -

10 다. 아미노산서열유도체란천연아미노산서열중의하나이상의아미노산잔기가결실, 삽입, 비보전적또는보전적치환또는이들의조합에의하여상이한서열을가지는것을의미한다. 예를들면, IgG Fc의경우결합에중요하다고알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번아미노산잔기들이변형을위해적당한부위로서이용될수있다. [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] [0056] [0057] [0058] 또한, 이황화결합을형성할수있는부위가제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의몇몇아미노산이제거되거나또는천연형 Fc의 N-말단에메티오닌잔기가부가될수도있는등다양한종류의유도체가가능하다. 또한, 이펙터기능을없애기위해보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가제거될수도있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가제거될수도있다. 이러한면역글로불린 Fc 영역의서열유도체를제조하는기술은국제특허공개제WO 97/34631호, 국제특허공개제96/32478호등에개시되어있다. 분자의활성을전체적으로변경시키지않는단백질및펩타이드에서의아미노산교환은당해분야에공지되어있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,197 9). 가장통상적으로일어나는교환은아미노산잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의교환이다. 경우에따라서는인산화 (phosphorylation), 황화 (sulfation), 아크릴화 (acrylation), 당화 (glycosylation), 메틸화 (methylation), 파네실화 (farnesylation), 아세틸화 (acetylation) 및아밀화 (amidation) 등으로수식 (modification) 될수도있다. 상기기술한 Fc 유도체는본발명의 Fc 영역과동일한생물학적활성을나타내나 Fc 영역의열, ph 등에대한구조적안정성을증대시킨유도체다. 또한, 이러한 Fc 영역은인간및소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아픽등의동물의생체내에서분리한천연형으로부터얻어질수도있고, 형질전환된동물세포또는미생물로부터얻어진재조합형또는이의유도체일수있다. 여기서, 천연형으로부터획득하는방법은전체면역글로불린을인간또는동물의생체로부터분리한후, 단백질분해효소를처리하여얻을수있다. 파파인을처리할경우에는 Fab 및 Fc로절단되고, 펩신을처리할경우에는 pf'c 및 F(ab)2로절단된다. 이를크기배제크로마토그래피 (size-exclusion chromatography) 등을이용하여 Fc 또는 pf'c를분리할수있다. 바람직하게는인간유래의 Fc 영역을미생물로부터수득한재조합형면역글로불린 Fc 영역이다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은천연형당쇄, 천연형에비해증가된당쇄, 천연형에비해감소한당쇄또는당쇄가제거된형태일수있다. 이러한면역글로불린 Fc 당쇄의증감또는제거에는화학적방법, 효소학적방법및미생물을이용한유전공학적방법과같은통상적인방법이이용될수있다. 여기서, Fc에서당쇄가제거된면역글로불린 Fc 영역은보체 (c1q) 의결합력이현저히저하되고, 항체-의존성세포독성또는보체-의존성세포독성이감소또는제거되므로, 생체내에서불필요한면역반응을유발하지않는다. 이런점에서약물의캐리어로서의본래의목적에보다부합하는형태는당쇄가제거되거나비당쇄화된면역글로불린 Fc 영역이라할것이다. 본발명에서당쇄의제거 (Deglycosylation) 는효소로당을제거한 Fc 영역을말하며, 비당쇄화 (Aglycosylation)" 는원핵동물, 바람직하게는대장균에서생산하여당쇄화되지않은 Fc 영역을의미한다. 한편, 면역글로불린 Fc 영역은인간또는소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아픽등의동물기원일수있으며, 바람직하게는인간기원이다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래또는이들의조합 (combination) 또는이들의혼성 (hybrid) 에의한 Fc 영역일수있다. 바람직하게는인간혈액에가장풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며가장바람직하게는리간드결합단백질의반감기를향상시키는것으로공지된 IgG 유래이다. 한편, 본발명에서조합 (combination) 이란이량체또는다량체를형성할때, 동일기원단쇄면역글로불린 Fc 영역을암호화하는폴리펩타이드가상이한기원의단쇄폴리펩타이드와결합을형성하는것을의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로이루어진그룹으로부터선택된 2개이상의단편으로부터이량체또는다량체의제조가가능하다. 본발명에서 " 하이브리드 (hybrid)" 란단쇄의면역글로불린 Fc 영역내에 2개이상의상이한기원의면역글로불린 Fc 단편에해당하는서열이존재함을의미하는용어이다. 본발명의경우여러형태의하이브리드가가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로이루어진그룹으로부터 1개내지 4개도메인으로이루어진도메인의하이브리드가가능하며, 힌지를포함할수있다

11 [0059] 한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의서브클래스로나눌수있고본발명에서는이들의조합또는이들의혼성화도가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장바람직하게는보체의존적독성 (CDC, complementdependent cytotoxicity) 과같은이펙터기능 (effector function) 이거의없는 IgG4의 Fc 영역이다. 즉, 가장바람직한본발명의약물의캐리어용면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간유래의 Fc 영역은인간생체에서항원으로작용하여이에대한새로운항체를생성하는등의바람직하지않은면역반응을일으킬수있는비-인간유래의 Fc 영역에비하여바람직하다. [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] 본발명에서비펩타이드성중합체는반복단위가 2개이상결합된생체적합성중합체를의미하며, 상기반복단위들은펩타이드결합이아닌임의의공유결합을통해서로연결된다. 본발명에사용가능한비펩타이드성중합체는폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜과프로필렌글리콜의공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, PLA( 폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA( 폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid) 와같은생분해성고분자, 지질중합체, 키틴류, 히아루론산및이들의조합으로구성된군으로부터선택될수있으며, 바람직하게는폴리에틸렌글리콜이다. 당해분야에이미알려진이들의유도체및당해분야의기술수준에서용이하게제조할수있는유도체들도본발명의범위에포함된다. 기존인프레임퓨전 (inframe fusion) 방법으로제조된융합단백질에서사용된펩타이드성링커의단점은생체내에서단백질분해효소에의해쉽게절단되어캐리어에의한활성약물의혈중반감기증가효과를기대만큼얻을수없다는것이다. 그러나, 본발명에서는단백질분해효소에저항성있는중합체를사용하여캐리어와유사하게펩타이드의혈중반감기를유지할수있다. 그러므로, 본발명에서사용될수있는비펩타이드성중합체는상기와같은역할, 즉생체내단백질분해효소에저항성있는중합체이면제한없이사용될수있다. 비펩타이드성중합체의분자량은 1 내지 100 kda 범위, 바람직하게는 1 내지 20 kda 범위이다. 또한, 상기면역글로불린 Fc 영역과결합되는본발명의비펩타이드성중합체는한종류의중합체뿐만아니라상이한종류의중합체들의조합이사용될수도있다. 본발명에사용되는비펩타이드성중합체는면역글로불린 Fc 영역및단백질약물과결합될수있는반응기를가진다. 상기비펩타이드성중합체의양말단반응기는반응알데히드그룹, 프로피온알테히드그룹, 부틸알테히드그룹, 말레이미드 (maleimide) 그룹및석시니미드 (succinimide) 유도체로이루어진군으로부터선택되는것이바람직하다. 상기에서, 석시니미드유도체로는석시니미딜프로피오네이트, 히드록시석시니미딜, 석시니미딜카르복시메틸또는석시니미딜카보네이트가이용될수있다. 특히, 상기비펩타이드성중합체가양말단에반응알데히드그룹의반응기를갖는경우, 비특이적반응을최소화하고, 비펩타이드성중합체의양말단에서생리활성폴리펩타이드및면역글로불린과각각결합하는데효과적이다. 알데히드결합에의한환원성알킬화로생성된최종산물은아미드결합으로연결된것보다훨씬안정적이다. 알데히드반응기는낮은 ph에서 N-말단에선택적으로반응하며, 높은 ph, 예를들어 ph 9.0 조건에서는라이신잔기와공유결합을형성할수있다. 상기비펩타이드성중합체의양말단반응기는서로같거나다를수있다. 예를들어, 한쪽말단에는말레이미드그룹을, 다른쪽말단에는알데히드그룹, 프로피온알데히드그룹, 또는부틸알데히드그룹을가질수있다. 양쪽말단에히드록시반응기를갖는폴리에틸렌글리콜을비펩타이드성중합체로이용하는경우에는공지의화학반응에의해상기히드록시기를상기다양한반응기로활성화하거나, 상업적으로입수가능한변형된반응기를갖는폴리에틸렌글리콜을이용하여본발명의단쇄인슐린아날로그결합체를제조할수있다. 이러한본발명의단쇄인슐린아날로그결합체는에너지대사및당대사와같은기존의인슐린의생체내활성이유지될뿐만아니라인슐린아날로그의혈중반감기및이로인한상기펩타이드의생체내효력지속효과가획기적으로증가하게하므로, 당뇨 (Diabetes) 의치료에유용하다. [0071] 또한, 본발명의또다른양태로서, 본발명은 (1) 양말단에알데히드, 말레이미드, 또는석시니미드유도체 반응기를갖는비펩타이드성중합체를사용하여프로인슐린아날로그의아민그룹또는티올그룹에공유결합으

12 로연결하는단계 ; (2) 상기 (1) 의반응혼합물로부터아미노말단이외의위치에비펩타이드성중합체가공유결합된단쇄인슐린아날로그를포함하는연결체를분리하는단계 ; 및 (3) 분리된연결체의비펩타이드성중합체의다른쪽말단에면역글로불린 Fc 영역을공유결합으로연결하여비펩타이드성중합체의양쪽말단이각각면역글로불린 Fc 영역및프로인슐린아날로그와결합된펩타이드결합체를생성하는단계를포함하는프로인슐린아날로그결합체의제조방법을제공한다. [0072] [0073] [0074] 본발명에서용어 " 연결체 " 란비펩타이드성중합체와단쇄인슐린아날로그만이공유결합으로연결된중간체로서, 이후이연결체에있는비펩타이드성중합체의단쇄인슐린아날로그가연결되지않은다른쪽말단에면역글로불린 Fc 영역을결합시키게된다. 또한, 바람직한일양태로서본발명은 (1) 양말단에알데히드반응기를갖는비펩타이드성중합체를프로인슐린아날로그의라이신잔기에공유결합으로연결시키는단계 ; (2) (1) 의반응혼합물로부터라이신잔기에비펩타이드성중합체가공유결합된프로인슐린아날로그를포함하는연결체를분리하는단계 ; 및 (3) 분리된연결체의비펩타이드성중합체의다른쪽말단에면역글로불린 Fc 영역을공유결합으로연결하여비펩타이드성중합체의양쪽말단이각각면역글로불린 Fc 영역및프로인슐린분비펩타이드와결합된단백질결합체를생성하는단계를포함하는제조방법을제공한다. 더욱바람직하게는 (1) 의비펩타이드성중합체및프로인슐린분비펩타이드의라이신잔기는 ph 7.5 이상에서연결된다. [0075] [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] [0081] 또한, 본발명의또다른양태로서, 본발명의프로인슐린아날로그결합체를포함하는당뇨병치료용약제학적조성물을제공한다. 본발명의결합체를포함한약제학적조성물은약제학적으로허용가능한담체를포함할수있다. 약제학적으로허용되는담체는경구투여시에는결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소및향료등을사용할수있으며, 주사제의경우에는완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제및안정화제등을혼합하여사용할수있으며, 국소투여용의경우에는기제, 부형제, 윤활제및보존제등을사용할수있다. 본발명의약제학적조성물의제형은상술한바와같은약제학적으로허용되는담체와혼합하여다양하게제조될수있다. 예를들어, 경구투여시에는정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽및웨이퍼등의형태로제조할수있으며, 주사제의경우에는단위투약앰플또는다수회투약형태로제조할수있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐및서방형제제등으로제형화할수있다. 한편, 제제화에적합한담체, 부형제및희석제의예로는락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트또는광물유등이사용될수있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료및방부제등을추가로포함할수있다. 본발명에따른결합체는당뇨치료에유용한바, 이를포함하는약제학적조성물을투여함으로써, 상기질환의치료를도모할수있다. 본발명에서 " 투여 " 는, 어떠한적절한방법으로환자에게소정의물질을도입하는것을의미하며, 상기결합체의투여경로는약물이목적조직에도달할수있는한어떠한일반적인경로를통하여투여될수있다. 복강내투여, 정맥내투여, 근육내투여, 피하투여, 피내투여, 경구투여, 국소투여, 비내투여, 폐내투여및직장내투여등이될수있으나, 이에제한되지는않는다. 그러나경구투여시, 펩타이드는소화가되기때문에경구용조성물은활성약제를코팅하거나위에서의분해로부터보호되도록제형화하는것이바람직하다. 바람직하게는주사제형태로투여될수있다. 또한, 약제학적조성물은활성물질이표적세포로이동할수있는임의의장치에의해투여될수있다. 또한, 본발명의약제학적조성물은치료할질환, 투여경로, 환자의연령, 성별및체중및질환의중등도등의여러관련인자와함께, 활성성분인약물의종류에따라결정된다. 본발명의약제학적조성물은생체내지속성및역가가우수하므로, 본발명의약제학적제제의투여횟수및빈도를현저하게감소시킬수있다

13 [0082] 발명의효과 본발명의단쇄인슐린아날로그결합체는생체내에서안정적인혈당강하효과를유지하고, 혈중반감기가현 저히증가하여인슐린의투여편의성및부작용을개선하는효과가있다. [0083] 도면의간단한설명 도 1 은프로인슐린아날로그유전자증폭모식도이다. 도 2는 A-C KR-B 프로인슐린-PEG-Fc를 RP HPLC로분석한결과이다. 도 3은 A-C KR-B 프로인슐린-PEG-Fc를 SE HPLC로분석한결과이다. 도 4는 A-C KR-B 프로인슐린-PEG-Fc를 12% SDS-PAGE로분석한결과이다. 도 5는 A-C KR-B 프로인슐린-PEG-Fc를 RP HPLC로분석한결과이다. 도 6는 A-C KR-B 프로인슐린-PEG-Fc를 SE HPLC로분석한결과이다. 도 7은 A-C KR-B 프로인슐린-PEG-Fc를 12% SDS-PAGE로분석한결과이다. 도 8은 A-C KR-B 프로인슐린-PEG-Fc의 STZ 랫트에서의효력결과이다. [0084] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하, 하기실시예에의하여본발명을보다상세하게설명한다. 단, 하기실시예는본발명을예시하기위한 것일뿐본발명의범위가이들로한정되는것은아니다. [0085] 실시예 1: 단쇄인슐린아날로그의발현벡터의제작 [0086] 1. 프로인슐린아날로그 (A-C-B 프로인슐린아날로그 ) 발현벡터의제작 [0087] 사람의인슐린아날로그, 프로인슐린아날로그를암호화하는발현벡터를제작하였다. 상기발현벡터는인슐린 A쇄의아미노말단을자유롭게하기위하여천연프로인슐린유전자의서열 (B쇄-C 펩타이드-A쇄, 서열번호 1, 2) 과다른프로인슐린아날로그 (A쇄-C 펩타이드-B쇄, 서열번호 3, 4) 을암호화하는유전자서열을포함하며, 다음과같이제조하였다. [0088] [0089] [0090] [0091] 86개의아미노산을암호화하는프로인슐린아날로그발현벡터의제작을위하여, 보고된프로인슐린유전자서열 (NM_ , from NCBI) 을바탕으로아래와같은 6개의올리고뉴클레오타이드를합성하고, 프로인슐린 cdna ( 입수처 : Origene) 를주형으로하여 A쇄및 C 펩타이드그리고 B쇄를 PCR 방법으로각각증폭한뒤, 3개의 PCR 증폭산물과올리고뉴클레오타이드를함께섞어 PCR 수행하여프로인슐린아날로그유전자를합성하였다. 먼저, 프로인슐린아날로그유전자의 A쇄합성을위하여, 순방향올리고뉴클레오타이드 ( 서열번호 : 7) 는개시 ATG 코돈및 NdeI 제한효소부위를포함하도록합성하고, 역방향올리고뉴클레오타이드 ( 서열번호 : 8) 는 A쇄의 3 말단부위서열과 C 펩타이드 5 부위서열을삽입하도록합성하였다. C 펩타이드를암호화하는유전자를합성하기위하여순방향올리고뉴클레오타이드 ( 서열번호 : 9) 는 A쇄의아미노말단서열및 C 펩타이드의서열을그리고역방향올리고뉴클레오타이드 ( 서열번호 : 10) 는 C 펩타이드 3 말단서열및 B쇄의 5 말단서열을포함하도록합성하였다. B쇄를암호화하는유전자를합성하기위하여순방향올리고뉴클레오타이드 ( 서열번호 : 11) 는 C 펩타이드의 3 말단서열과 B쇄의서열을그리고역방향올리고뉴클레오타이드 ( 서열번호 : 12) 는 B쇄의 5 말단서열과제한효소 BamH I 서열을포함하도록합성하였다. 상기의올리고뉴클레오타이드를이용하여각각의유전자를증폭한뒤, 각각의 PCR 증폭산물과서열번호 7로

14 기재되는올리고뉴클레오타이드와서열번호 12 로기재되는올리고뉴클레오타이드를함께섞어서최종 A 쇄 - C 펩타이드 -B 쇄의서열을가지는프로인슐린아날로그를합성하였다 ( 도 1). [0092] 상기의프로인슐린아날로그의증폭을위한 PCR 조건은어닐링온도 60 에서 20 초로하였으며, 연장은 68 에 서 20 초로진행하였다. [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] [0098] 5 GGAATTCCATATGGGCATTGTGGAACAATGCTGT 3 ( 서열번호 7) 5 CTGCCTCCCGGCGGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTG 3 ( 서열번호 8) 5 GAACTACTGCAACCGCCGGGAGGCAGAGGACCTG 3 ( 서열번호 9) 5 GTTGGTTCACAAAACGCTTCTGCAGGGACCCCTC 3 ( 서열번호 10) 5 CCTGCAGAAGCGTTTTGTGAACCAACACCTGTGC 3 ( 서열번호 11) 5 CGCGGATCCCTAGGTCTTGGGTGTGTAGAAGAAG 3 ( 서열번호 12) [0099] [0100] 상기에서얻어진프로인슐린아날로그단편 DNA(285bp) 을 pet22b 벡터 ( 입수처 : Novagen) 에클로닝하였다. 프로인슐린아날로그를세포내의봉입체의형태로발현시키기위하여 pet22b 벡터를제한효소 NdeI 및 BamHI로처리하여신호서열을제거하고, 프로인슐린아날로그 PCR 산물을동일한제한효소 Nde I과 BamHI으로처리하고분리된각각의 DNA를 T4 DNA 리가제를이용하여, pet22b 클로닝벡터에삽입하였다. 상기결과로얻어진발현벡터를 p22b-invpi 명명하였다. 상기 p22b-invpi 발현벡터는 T7 프로모터의조절하에서열번호 : 4의아미노산서열을암호화하며, 숙주세포내에서프로인슐린아날로그단백질을봉입체의형태로발현시켰다. [0101] 번라이신잔기와 56 번아르기닌잔기가제거된프로인슐린아날로그 (A-C KR-B 프로인슐린 ) 발현벡터 의제작 [0102] 55 번라이신잔기와 56 번아르기닌잔기를제거한프로인슐린아날로그 (A-C KR-B 프로인슐린 ; 서열번호 5, 6) 을제작하기위하여, 아래와같은 2 개의추가적인올리고뉴클레오타이드를합성하였다. [0103] [0104] 5 GGGGTCCCTGCAGTTTGTGAACCAACACCTGTGC 3 ( 서열번호 13) 5 GTTGGTTCACAAACTGCAGGGACCCCTCCAGGGC 3 ( 서열번호 14) [0105] [0106] 서열번호 13으로기재되는순방향올리고뉴클레오타이드및서열번호 14으로기재되는역방향올리고뉴클레오타이드는 C 펩타이드의 3 말단서열중라이신과아르기닌을암호화하는 AAG CGT 서열을제거하고합성하였다. B쇄 34번라이신잔기와 35번아르기닌잔기가제거된변이체의증폭및발현벡터의제작은상기실시예에기재된조건과동일한내용으로진행하였다. 상기의방법으로제작한프로인슐린아날로그발현벡터를 22b-InvPI KR 이라고명명하였다. 상기 p22b-invpi KR 발현벡터는 T7 프로모터의조절하에서열번호 : 6의아미노산서열을암호화하며, 숙주세포내에서프로인슐린아날로그단백질을봉입체의형태로발현시켰다. [0107] 실시예 2: 재조합융합펩타이드의발현 [0108] T7 프로모터조절하의재조합프로인슐린아날로그발현을수행하였다. 각각의재조합프로인슐린아날로그발

15 현벡터로 E.coli BL21DE3(E. coli B F-dcm ompt hsds(rb-mb-) gal λ(de3); 노바젠 ) 을형질전환하였다. 형질전환방법은노바젠사에서추천하는방법을이용하였다. 각재조합발현벡터가형질전환된각각의단일콜로니를취하여암피실린 (50ug/ml) 이포함된 2X 루리아브로스 (Luria Broth) 배지에접종하고, 37 에서 15시간배양하였다. 재조합균주배양액과 30% 글리세롤이포함된 2X LB 배지를 1:1(v/v) 의비율로혼합하여각 1ml씩 cryo-튜브에분주하고, -140 에보관하였다. 이를재조합융합단백질의생산을위한세포스톡 (cell stock) 으로사용하였다. [0109] 재조합프로인슐린아날로그들의발현을위하여, 각세포스톡 1 비알을녹여 500ml의 2X LB에접종하고 37 에서 14~16시간동안진탕배양하였다. OD.600nm의값이 5.0 이상을나타내면배양을종료하고, 이를종배양액으로사용하였다. 5L 발효기 (MDL-8C, B.E.MARUBISHI, 일본 ) 를이용하여종배양액을 1.7L의발효배지에접종하고초기배스발효를시작하였다. 배양조건은온도 37, 공기량 20 sl/ 분 (1vvm), 교반속도 500rpm 그리고 30% 암모니아수를사용하여 ph 6.70으로유지시켰다. 발효진행은배양액내의영양소가제한되었을때, 추가배지 (feeding solution) 을첨가하여유가배양을진행하였다. 균주의성장은 OD 값에의해모니터링하며, OD 값이 70 이상에서최종농도 100uM의 IPTG로도입하였다. 배양은도입후약 23~25시간까지더진행하며, 배양종료후, 원심분리기를사용하여재조합균주를수획하여사용시까지 -80 에보관하였다. [0110] 실시예 3: 재조합프로인슐린아날로그의회수및설폰화 (sulfonation) [0111] 상기실시예 2에서발현시킨재조합프로인슐린아날로그들을가용성형태로바꾸기위해세포를파쇄하고리폴딩하였다. 세포펠렛 200g(wet weight) 을 3L 용해완충액 (50mM Tris-HCl (ph9.0), 1mM EDTA(pH8.0), 0.2M NaCl 및 0.5% 트리톤 X-100) 에재부유하였다. 미세용액화 (Microfluidizer) 프로세서 M-110EH(AC Technology Corp. Model M1475C) 를이용하여 15,000psi 압력으로수행하여세포를파쇄하였다. 파쇄된세포용해물을 7,000rpm으로 4 에서 20분원심분리하여상층액을버리고, 3L 세척완충액 (0.25% 트리톤 X-100 및 20mM Tris-HCl (ph7.5), 1M NaCl) 에재부유하였다. 7,000rpm으로 4 에서 20분동안원심분리하여펠렛을 20mM 트리스- HCl(pH7.5) 또는증류수에재부유한후, 동일한방법으로원심분리하였다. 펠렛을취하여 2L 가용화완충액 (8M 우레아, 20mM 트리스-HCl (ph9.0, 1mM EDTA)) 에재부유하여상온에서 2시간동안교반하였다. 가용화된재조합프로인슐린아날로그의설폰화 (sulfonation) 를위하여 7,000rpm으로 4 에서 30분동안원심분리한후상층액을취하여, 여기에최종농도 0.3M의아황산나트륨 (sodium sulfite) 와 0.1M 사티온산나트륨 (sodium tetrathionate) 을넣어주고 3시간동안추가로교반하여프로인슐린아날로그의시스테인잔기들을설폰화시켰다. 20L의완충액 (10mM ammonium acetate, ph7.4) 을연동펌프 (peristaltic pump) 를이용하여 1000ml/hr의유속으로 20시간동안첨가한후, 6N HCl을첨가하여 ph를 3.6으로낮추어반응을정지시켰다. [0112] 실시예 4: 시아노겐브로마이드처리 [0113] [0114] 침전된프로인슐린아날로그을 1.8L의 70% 개미산 (formic acid) 으로용해시키고, 단백질양의 100몰비에해당하는시아노겐브로마이드 (CNBr) 을첨가하여 25 의암실에서 16시간이상반응하였다. 반응종료후, 감압증류장치 (Rotavapor R210) 를이용하여완전히건조시킨다음요소가포함된완충액 (7.5M urea, 20mM Bis-Tris, ph6.0) 으로용해시켰다. 프로인슐린아날로그의정제를위하여요소완충액으로용해시킨시료를 0.45um의크기를가진필터를통과시켜이물질을제거하였다. [0115] 실시예 5: 음이온크로마토그래피정제 [0116] 상기실시예 4 에서수득한시료에서시아노겐브로마이드로절단한프로인슐린아날로그 S- 설포네이트만을순수 분리하기위해음이온교환컬럼 (HiTrap Q HP; Amersham Bioscience AB) 으로정제하였다. 먼저, 완충용액 A(7.5M urea, 20mM Bis-Tris, ph6.0) 를약 5ml/min 의유속으로컬럼으로흘려평형을시킨뒤, 시아노겐브로

16 마이드절단시료를컬럼에흘려레진에결합시키고, 완충용액 B (7.5M urea, 20mM Bis-Tris, ph6.0, 0.5M NaCl) 를 0-100% 구배로 10 컬럼볼륨만큼흘려주어재조합프로인슐린아날로그를용출하였다. 용출구간은 ms/cm 이었다. [0117] 실시예 6: 프로인슐린아날로그의재접힘 (refolding) [0118] 디솔팅컬럼 (Desalting column) 으로용출된시료에서염을제거하고, 완충용액 (1M urea, 50mM Glycine, ph10.6) 으로교체하였다. 완충용액내의프로인슐린아날로그의농도는 1mg/ml이되도록정용여과법 (Diafiltration) 을이용하여조절하였다. 완충용액으로전환된프로인슐린아날로그 S-설포네이트시료의재접힘 (refolding) 을통한프로인슐린아날로그의전환을위하여, 시스테인또는시스테인염화수소 (Cystein- HCl) 를최종농도 1mM 되도록첨가한후, 4 에서 24시간동안교반하였다. 24시간후, 6N HCl을첨가하여 ph 를 3.0으로낮추어반응을종료한뒤, HPLC 및 SDS-PAGE로재접힘을분석하였다. [0119] 실시예 7: 소수성컬럼크로마토그래피정제 [0120] [0121] 디솔팅컬럼 (Desalting column) 으로용출된시료에서염을제거하고, 완충용액 (1M urea, 50mM Glycine, ph10.6) 으로교체하였다. 이시료를소수성성질을이용한페닐컬럼 (phenyl HP; Amersham Bioscience AB) 에적용하여프로인슐린아날로그을정제하였다. 완충용액 A(10mM Tris-Hcl, ph 7.5, 0.6M ammonium sulfate) 으로평형화된 Phenyl HP 컬럼에로딩하고완충용액 B(10mM Tris-Hcl ph 7.5) 을 100-0% 구배로 10 컬럼볼륨흘려주어단백질을용출하였다. 용출구간은 ms/cm 이었다. [0122] 실시예 8: 양이온결합크로마토그래피정제 [0123] 30 % 에탄올이포함된 20 mm 소디움사이트레이트 (ph2.0) 완충액으로평형화된 Source S (25 mm/20 cm, GE healthcare사 ) 컬럼에소수성컬럼에서용출된시료를 5 10배희석하여 6 ml/min 유속으로부하하여결합시킨후, 염화칼륨 0.5 M 과 30 % 에탄올이포함된 20 mm 소디움사이트레이트 (ph2.0) 완충액을사용하여농도가 0 % 에서 100 % 가되도록 10 컬럼용량의선형농도구배로써프로인슐린아날로그단백질을용출하였다. [0124] 실시예 9: 역상크로마토그래피정제 [0125] [0126] 10 % 아세토니트릴및 0.1 % 트리프루오로아세트산으로평형화된 C 컬럼 (10 mm /25 cm, 페노메넥스사 ) 컬럼에양이온결합크로마토그래피컬럼에서용출된시료를 2 ml/min 유속으로부하하여결합시킨후, 80 % 아세토니트릴및 0.1 % 트리프루오로아세트산까지 10 컬럼용량의선형농도구배를이용하여목적단백질을용출하였다. 상기역상크로마토그래피에따라최종정제된프로인슐린아날로그를 RP-HPLC, SE-HPLC, SDS PAGE 로분석하여각각도 1, 2, 3에나타내었다. [0127] 실시예 10: 프로인슐린아날로그페길화 (Pegylation) [0128] 상기실시예의공정으로고순도로정제된프로인슐린아날로그를 100 mm 포타슘포스페이트 (ph 6.0) 으로버퍼

17 교환후 5 mg/ml로농도를맞추고, 3.4 kda PropionylALD 2 PEG를프로인슐린아날로그의아미노말단에페길화시키기위하여인터페론과 PEG의몰비 1 : 10 이되도록 PEG를첨가한후완전히녹였다. 이후환원제인소디움시아노보로하이드라이드 (NaCNBH 3 ) 를 20mM이되도록넣어준후상온에서 70 분동안반응시켰다. 이후 30 % 에탄올이포함된 10 mm 소디움사이트레이트, ph 2.0 버퍼로 10 배희석한후 Source S 컬럼 (25 mm/ 20 cm, GE Healthcare사 ) 에주입하였다. Source S 컬럼은 30 % 에탄올이포함된 10 mm 소디움사이트레이트, ph 2.0 버퍼로평형이잡힌컬럼이며, 유속은 6 ml/min으로하였다. 하나의페길화인터페론을정제하기위해 30 % 에탄올이포함된 10 mm 소디움사이트레이트, ph 2.0, 0.5 M KCl 버퍼를 0에서 50 % 가되도록 10 컬럼부피를흘려주어하나페길화된프로인슐린아날로그를정제하였다. [0129] 실시예 11. 프로인슐린아날로그 - 면역글로블린 Fc 결합체제조 [0130] 실시예 5 의방법을이용하여얻은하나페길화된프로인슐린아날로그을면역글로블린 Fc 와커플링시켰다. 프 로인슐린아날로그과면역글로블린 Fc 몰비를 1:4 으로하였으며, 전체단백질농도를 50 mg/ml 로하여 4 에서 16 시간반응시켰다. 이때환원제로 20 mm 이되도록소디움시아노보로하이드라이드 (NaCNBH 3 ) 를넣어주었다. 이 후 20 mm Tris, ph 7.5 버퍼로 10 배희석한후 Source Q 컬럼 (70 mm/ 26 cm, GE Healthcare사 ) 에주입하였다. Source Q 컬럼은 20 mm Tris, ph 7.5 버퍼로평형이잡힌컬럼이며, 유속은 30 ml/min으로하였다. 커플링단백질을용출하기위해 20 mm Tris, ph 7.5, 0.5 M NaCl 버퍼를 0 % 에서 40 % 까지선형적으로 4 컬럼부피를흘려주어용출하였다. Source Q 컬럼으로미반응한면역글로블린 Fc를제거할수있었다. 상기 Source Q에서용출된커플링단백질용액에 1.5 M 암모늄설페이트를첨가하여 Source iso 컬럼 (35 mm/ 18 cm, GE Healthcare 사 ) 에주입하였다. Source iso 컬럼은 20 mm Tris-HCl, ph 7.5, 1.5 M 암모늄설페이트버퍼로평형이잡힌컬럼이며, 유속은 10 ml/min으로하였다. 프로인슐린아날로그-PEG-면역글로블린 Fc를정제하기위해 20 mm Tris-HCl, ph 7.5 버퍼를 0 % 에서 100 % 까지선형적으로 17 컬럼부피를흘려주었다. [0131] 상기 Source iso 컬럼에서최종정제된프로인슐린아날로그 - 면역글로블린 Fc 결합체를 RP-HPLC, SE-HPLC, SDS PAGE 로분석하여각각도 4, 5, 6 에나타내었다. [0132] 실시예 12: 지속형프로인슐린아날로그결합체의 in vivo PD 측정 [0133] [0134] 지속형프로인슐린아날로그결합체의효력을검증하기위하여당뇨모델랫드를이용하여효력을검증하였다. 당뇨모델은정상랫드에 Streptozotocin (STZ) 을투여하여췌장내의 beta cell을특이적으로파괴하여혈당을지속적으로증가시키는방법을이용하여만들어졌다. STZ 투여에따른혈당증가가발생한모델랫드에지속형프로인슐린아날로그결합체를투여용량을프로인슐린아날로그용량으로써 2-8 mg/kg으로증가시켜단회로피하경로를이용하여투여하였다. 투여전, 투여후매일동안혈당을측정하여지속형프로인슐린아날로그결합체의효력을측정하였다 (Figure 8). 투여결과지속형프로인슐린아날로그의투여용량에따른혈당강하현상이나타났다. 투여용량에효력지속기간이최고 10일까지도달하는결과를보였다

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