이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 2013R1A1A 부처명 교육과학기술부 연구관리전문기관 성균관대학교산학협력단 연구사업명 기본연구사업 연구과제명 생물진화중 Sialyl당지질당쇄체생합성을보이는동물군의추적과 VEGFR 조절당쇄체의 발굴연구 기여율 1/1

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태경 전
5 years ago
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 31/7032 ( ) A61P 35/00 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2014 년 07 월 22 일 심사청구일자 2016 년 03 월 31 일 (65) 공개번호 (43) 공개일자 2016 년 02 월 01 일 (56) 선행기술조사문헌 EP B1* O. V. Kozyreva, et al., Russian Chemical Bulletin. June 2014, Vol.63(6), pp ( )* EP B1* * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2017년06월14일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2017년06월07일 (73) 특허권자 성균관대학교산학협력단 경기도수원시장안구서부로 2066 ( 천천동, 성균관대학교내 ) (72) 발명자 김철호 서울특별시강남구남부순환로 2803 삼성래미안아파트 104 동 1501 호 (74) 대리인 손민 전체청구항수 : 총 2 항심사관 : 신창훈 (54) 발명의명칭강글리오사이드를포함하는병용항암치료제 (57) 요약 본발명은강글리오사이드또는그의당쇄체 ; 및활성산소종생성을유도하는세포독성약물을포함하는, 암예방또는치료용약학조성물에관한것으로, 강글리오사이드또는활성산소종생성을유도하는세포독성약물의단독처리에비해세포독성약물의부작용을최소화하면서상승된항암효과를나타낼수있으며, 기존에사용되는세포독성약물에내성을갖는암환자에효과적으로작용할수있다. 대표도 - 도 1a - 1 -

2 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 2013R1A1A 부처명 교육과학기술부 연구관리전문기관 성균관대학교산학협력단 연구사업명 기본연구사업 연구과제명 생물진화중 Sialyl당지질당쇄체생합성을보이는동물군의추적과 VEGFR 조절당쇄체의 발굴연구 기여율 1/1 주관기관 성균관대학교산학협력단 연구기간 ~

3 명세서청구범위청구항 1 강글리오사이드 GM3 (monosialodihexo sylganglioside) 또는 α2-3시알릴락토오스 (α2-3 sialyllactose), 및세포독성약물을포함하는, 암예방또는치료용약학조성물로서, 상기세포독성약물은시스플라틴 (cisplatin) 인것인, 조성물. 청구항 2 삭제청구항 3 삭제청구항 4 삭제청구항 5 제1항에있어서, 상기약학조성물은활성산소종생성또는축적을유도하는것인, 암예방또는치료용약학조성물. 발명의설명 [0001] 기술분야 본발명은강글리오사이드또는그의당쇄체, 및활성산소종생성을유도하는세포독성약물을포함하는, 암예 방또는치료용약학조성물에관한것이다. [0002] [0003] [0004] 배경기술시스플라틴 (Cisplatin; cis-diamminedichloroplatinum, 시스플라틴 ) 은여러고형암에효과적인일반적인항암제이다. DNA에결합하여 DNA 부가물 (adduct) 을생성하며 (Jamieson ER & Lippard SJ (1999) Chem Rev 99: ), 이온채널의활성, 수송단백질, 여러세포막효소를조절하고 (Aggarwal SK & Niroomand-Rad I (1983) J Histochem Cytochem 31: ; Grunicke H & Hofmann J (1992) Pharmacol Ther 55: 1-30), 활성산소 (ROS) 의생성을유도하여암세포를사멸시킨다 (Masuda H et al. (1994) Biochem Biophys Res Commun 203: ). 따라서시스플라틴은 DNA 수선, 전사저해, 세포주기정지, 세포사멸을조절한다 (Siddik ZH (2003) Oncogene 22: ). 한편, 시스플라틴에의해유도되는세포사멸은 ERK, JNK/SAPK, 및 MAPK를활성화시킨다 (Dent P & Grant S (2001) Clin Cancer Res 7: ; Wang X et al. (2000) J Biol Chem 275: ). 또한, 시스플라틴은사람상피세포에서 Fas/FasL-매개세포사멸을유도하며 (Razzaque MS et1999) Histochem Cell Biol 111: ), Bcl-2 패밀리의발현수준을조절하여미토콘드리아손상을유발한다. 또한, 시스플라틴의세포독성에영향을받아, 암세포에서세포사멸유발 Bax인 p53 매개의전사촉진 (transactivation), Bcl-2 발현의감소, Bid의분열로인하여미토콘드리아전위 (mitochondrial potential) 가감소하고, 미토콘드리아로부터사이토크롬 c가방출됨으로써캐스패이즈매개 PARP 분해가증가된다 (Kepp O et al. (2007) EMBO J 26: ; McNeish IA et al., (2003) Exp Cell Res 286: ; Wang P et al

4 (2006) Cell Signal 18: ; Thayyullathil F et al. (2008) Free Radic Biol Med 45: ). 상 기세포사멸현상은세포막의조성변화때문인것으로보인다 (d'azzo A et al. (2006) Cell Death Differ 13: ). [0005] [0006] 강글리오사이드 (ganglioside) 등일련의시알산 (sialic acid) 을포함하는글리코스핑고리피드 (glycosphingolipids, GSLs) 군들은모든포유동물세포막의미세도메인 (microdomain) 의구성성분으로, 세포간상호작용과신호전달등의다양한생물기능을수행하며 (Hakomori S (2000) Glycoconj J 17: ), GM3, GD3, GD1b과같은특이한강글리오사이드들이여러세포에세포사멸을유발한다는것이보고되었다 (Chahlavi A et al. (2005) Cancer Res 65: ; Garofalo T et al. (2005) Cell Death Differ 12: ). 또한, 미성숙한증식중인신경교세포 (glial cell) 및뉴런세포 (neuronal cell) 에강글리오사이드 GM3를처리하면세포증식이억제되고세포사멸이유발된다는것이보고되었다 (Nakatsuji Y et al. (2001) Exp Neurol 168: ; Noll EN et al. (2001) Exp Neurol 168: ). 그중 GM3는활성산소종의축적을유발하며, 신경세포안으로칼슘이온을유입시켜세포사멸을유발한다 (Fujimoto Y et al. (2005) J Neurooncol 71: ; Sohn H et al. (2006) FASEB J 20: ). 설치류의방광암에서 GM3의과발현은세포사멸을유발하고암세포의악성도를감소시킨다고보고된바있다 (Watanabe R et al. (2002) Cancer Res 62: ). [0007] 그러나, 상기종래항암치료제의항암효과는충분하지못하여, 보다항암효과가뛰어난화학치료제에대한필 요성이대두되고있다. [0008] 이러한배경하에, 본발명자들은보다항암효과가뛰어난치료제를개발하고자예의연구노력한결과, 강글리오사이드또는그의당쇄체를, 활성산소종 (ROS) 생성을증가시켜세포사멸을유발함으로써항암효과를나타내는약물과병용투여할경우두약물의협력작용으로인하여현저한항암효과가나타나는것을확인하고본발명을완성하였다. 발명의내용 [0009] 해결하려는과제 본발명의주된목적은강글리오사이드또는그의당쇄체, 및활성산소종생성을유도하는세포독성약물을포 함하는, 암예방또는치료용약학조성물을제공하는것이다. [0010] [0011] [0012] [0013] 과제의해결수단상기의목적을달성하기위한하나의양태로서, 본발명은강글리오사이드또는그의당쇄체, 및활성산소종생성을유도하는세포독성약물을포함하는, 암예방또는치료용약학조성물을제공한다. 상기강글리오사이드는시알산 (sialic acid) 을포함하는글리코스핑고리피드이다. 일예로상기강글리오사이드는 GM3, GD3, 또는 GD1b일수있다. 본발명자들은강글리오사이드또는활성산소종생성을유도하는세포독성약물을단독으로처리했을때에비하여, 두물질을같이처리했을때그협동작용으로인하여세포생존율이최대 6.5±0.3(%) 까지현저하게감소하여, 뛰어난항암효과가있음을확인하였다. 일예로상기강글리오사이드는 GM3일수있다. 본발명자들은여러강글리오사이드에대해병용투여효과를실험한결과 GM3(monosialodihexo sylganglioside) 가가장높은약리활성을가짐을확인하였다. 상기 GM3는 NANA-Gal-Glc-ceramide의구조로이루어지며, 구체적으로하기화학식 1로표시되는화합물이다

5 [0014] [ 화학식 1] [0015] [0016] [0017] 상기 NANA 는하기화학식 2 로표시되는 N- 아세틸 - 알파 - 뉴라미니데이트 (N-Acetyl--neuraminidate) 이다. [ 화학식 2] [0018] [0019] 상기강글리오사이드의당쇄체는강글리오사이드에당이첨가된화합물로, 일예로상기당쇄체는 3'-시아릴락토오스 (3'-Sialyllactose), 6'-시아릴락토오스 (6'-sialyllactose), α2-3시알릴락토오스 (α2-3sialyl lactos e) 일수있다. 본발명자들은상기당쇄체들이세포독성약물의협동작용으로인하여암세포생존이현저히억제됨을확인하였으며, 특히 α2-3시알릴락토오스와세포독성약물의협동작용으로인하여암세포생존이현저히억제됨을확인하였다. [0020] [0021] [0022] 세포독성약물 (cytotoxic drug) 은세포에독성을유발하는약물로, 세포의증식분화기능을저해하며, 세포분열을할때염색체복제이전단계에서염색체의활성을방해할수있다. 활성산소종생성을유도하는세포독성약물은활성산소종 (ROS) 생성을증가시켜세포사멸 (apoptosis) 을유발함으로써항암효과를나타내는약물을의미한다 (Gina Manda et al., Current Chemical Biology, 2009, 3, , Damian G. Deavall et al., Journal of Toxicology, 2012, 13, Giuseppina Barrera, Oncology, 2012). 상기활성산소 (ROS) 는인체대사활동에의해발생되는산소부산물로세포의성장과분화를돕고염증을억제하는유익한기능을하는한편세포손상을유발하여암, 당뇨등여러질병을일으키고, 노화를촉진시키는것으로알려져있다. 일예로, 활성산소종생성을유도하는세포독성약물은빈블라스틴 (vinblastine), 마이토마이신 (mitomycin), 시스플라틴 (cisplatin, cis-diamminedichloroplatinum), 독소루비신 (doxorubicin), 에토포시드 (etoposide), 타목시펜 (tamoxifen), 캠토테신 (camptothecin), 이노스타마이신 (inostamycin), 또는네오카르지노스타틴 (neocarzinostatin) 일수있다

6 [0023] [0024] [0025] [0026] 본발명자들은시스플라틴을강글리오사이드, 또는그의당쇄체와같이투여했을때, 협동작용으로인한우수한항암효과를확인하였다 ( 실시예 1). 또한, 상기병용투여효과는상기약물의활성산소종생성유도및이로인한암세포사멸유도에의한것임을확인하였다 ( 실시예 2). 따라서시스플라틴과같이활성산소종의생성을유도하는세포독성약물을강글리오사이드, 또는그의당쇄체와같이투여했을때동일한효과를나타낼수있다. 상기유효성분인강글리오사이드또는그의당쇄체, 및활성산소종생성을유도하는세포독성약물의함량은이에제한되지않으나활성산소종생성을유도하는세포독성약물은전체유효성분대비 내지 중량부로포함될수있다. 본발명에따른암예방또는치료용약학조성물은활성산소종생성또는축적을유도하는것일수있다. 본발명에따른약학조성물은부작용이있는세포독성약물을소량섭취하더라도강글리오사이드또는그의당쇄체와의협동작용으로인하여부작용을최소화하면서도암세포활성억제를극대화할수있다. [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] 또하나의양태로서, 본발명은상기약학조성물을개체에투여하는단계를포함하는암의예방또는치료방법을제공한다. 본발명에서사용되는용어, " 개체 " 란, 암이발병되었거나발병할가능성이있는인간을포함한모든동물을의미할수있다. 상기동물은인간뿐만아니라이와유사한증상의치료를필요로하는소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이등의포유동물일수있으나, 이에제한되지는않는다. 본발명의상기예방또는치료방법은구체적으로, 암이발병하였거나발병할위험이있는개체에상기조성물을약학적으로유효한양으로투여하는단계를포함할수있다. 본발명에서사용된용어, " 투여 " 는어떠한적절한방법으로환자에게본발명의약학적조성물을도입하는것을의미하며, 본발명의조성물의투여경로는목적조직에도달할수있는한경구또는비경구의다양한경로를통하여투여될수있다. 본발명에서용어, " 약학적으로유효한양 " 은의학적치료에적용가능한합리적인수혜 / 위험비율로질환을치료하기에충분한양을의미하며, 상기조성물의적합한총 1일사용량은올바른의학적판단범위내에서처치의에의해결정될수있으며, 일반적으로 내지 1000 mg/kg의양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의양을일일 1회내지수회로나누어투여할수있다. 그러나본발명의목적상, 특정환자에대한구체적인치료적유효량은달성하고자하는반응의종류와정도, 경우에따라다른제제가사용되는지의여부를비롯한구체적조성물, 환자의연령, 체중, 일반건강상태, 성별및식이, 투여시간, 투여경로및조성물의분비율, 치료기간, 구체적조성물과함께사용되거나동시사용되는약물을비롯한다양한인자와의약분야에잘알려진유사인자에따라다르게적용하는것이바람직하다. [0032] [0033] 발명의효과본발명에따른약학조성물은, 강글리오사이드또는활성산소종생성을유도하는세포독성약물의단독처리에비해세포독성약물의부작용을최소화하면서상승된항암효과를나타낼수있다. 특히, 시스플라틴, 독소루비신등기존에사용되는세포독성약물에내성을갖는암환자에효과적으로작용할수있다. [0034] 도면의간단한설명 도 1 은항암활성에대한시스플라틴과 GM3 당쇄체의협력효과를나타낸것으로, 도 1a 는시스플라틴및 GM3 를, 도 1b 는시스플라틴및 α2-3 시알릴락토오스를처리한결과를나타낸것이다. 도 2a 내지도 2f 는대장암세포 HCT116 에서시스플라틴처리에의한활성산소종생성유도및이로인한암세포 사멸유도를나타낸것이다

7 도 3a 내지도 3d 는대장암세포 HCT116 에서시스플라틴처리시 GM3 합성효소의발현및그생성물인 GM3 가증 가함을나타낸것이다. [0035] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하본발명을하기예에의해상세히설명한다. 다만, 하기예는본발명을예시하기위한것일뿐, 하기예 에의해본발명의범위가제한되는것은아니다. [0036] 실시예 1. 시스플라틴및 GM3 당쇄체의병용투여효과 : 대장암세포주 HCT116 의생존확인 [0037] [0038] [0039] [0040] 시스플라틴및 GM3 당쇄체의병용투여에의한항암효과를확인하기위하여, 하기와같이 XTT 증식어세이를이용하여암세포의생존율을측정하는실험을진행하였다. 인간대장암세포주 HCT116은 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, JBI, 대한민국대구 ) 배지에 10% FBS(fetal bovine serum), 100 units/ml 페니실린및 100 μg/ml 스트렙토마이신을첨가하여 37, 5% CO2에서배양하였다. 상업적으로판매되는증식키트 Ⅱ(XTT; Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) 를사용하여세포의증식을확인하였다. EGM-2 배지 (DMEM 및 10% FBS 배지 ) 100 μl에상기대장암세포주를웰당 1x10 3 세포농도로 96-웰배양플레이트분주하여배양하였다. 배양 24시간후, 96-웰플레이트내의배지를버리고 1% FBS를함유하는새로운 EBM-2 배지 100 μl로교체하였다. 상기새로운 EBM-2 배지에는다양한농도의시스플라틴 ( 동아제약, 서울, 대한민국 ) 과 GM3 또는 α2-3시알릴락토오스 (α2-3sialyllactose) 를첨가하였다. 이후상기플레이트를 5% CO2 조건의인큐베이터내에서 24시간동안 37 에서배양하였다. 그후, 5 ml의 XTT- 표지시약과 100 μl의전자결합시약 (electron coupling reagent) 을혼합하여제조한 50 μl의 XTT 시험시약을각웰에가했다. 5% CO2 조건의인큐베이터내에서 37 로 4시간배양한후, ELISA 리더 (Molecular Devices, USA) 를사용하여 490 nm에서흡광도를측정하였다. [0041] 상기시스플라틴및 GM3 당쇄체의병용투여에의한세포생존율을도 1a, 도 1b, 및하기표 1, 2 에나타내었 다. [0042] 시스플라틴 대비 %) 표 (μg/ml) GM3 (μm) 세포생존율 ±0.3 ( 대조군 ±10.4 ±50.5 ±3.7 ±4.4 ±3.5 ±3.6 ±2.3 [0043] 시스플라틴 (μg/ml) α2-3시알릴락토오스 (μm) 세포생존율 ( 대조군 대비 %) 표 ± ± ± ± ± ± ±

8 [0044] [0045] [0046] 도 1a, 도 1b에도시된것과같이, 시스플라틴을 10 μg/ml의농도로단독처리한경우, 대장암세포주는 77.3± 10.4 (%) 의세포생존율을나타내었으나, 여기에 GM3 10μM 을처리한결과 50.5±3.5(%) 의생존율을보여 2배이상생존율이감소하였으며, GM3 20μM 을처리한결과 28.6±3.6(%) 의생존율을보여 3배이상생존율이감소하였다. 따라서, 각각처리하였을때에비하여시스플라틴과 GM3을병용투여하였을때매우우수한항암효과가있음을확인하였다. 또한, 시스플라틴과 GM3의당쇄체인 α2-3시알릴락토오스를병용투여한결과, GM3에비하여세포생존율이더낮게나타났음을확인하였다. 따라서시스플라틴을소량섭취하더라도시스플라틴과 GM3 또는그의당쇄체의협동작용으로인하여우수한항암효과를얻을수있음을확인하였다. [0047] 실시예 2. 활성산소종생성유도및이로인한암세포사멸유도확인 [0048] (1) DNA 단편화유발효과 [0049] 시스플라틴이 HCT116 대장암세포에세포사를유도하는지확인하기위하여대장암세포에여러가지농도의시스 플라틴을 24 시간동안처리하였다. 시스플라틴 - 처리된 HCT116 세포로부터 DNA 를분리하여 2% 아가로오스젤전 기영동으로분석하였다. [0050] 도 2a 는상기 DNA 를 EtBr(ethidium bromide) 로염색하고 UV 하에서발색하여나타낸것이다. 시스플라틴 30 μg/ml 에서 DNA 단편화가관찰되었다. 이와같이시스플라틴은 DNA 의단편화를유발함을확인하였다. [0051] (2) 시스플라틴에의한세포내활성산소종 (ROS) 의생성여부확인 [0052] [0053] [0054] ROS생성이시스플라틴에의한세포사나세포독성의중요한원인이라는사실은알려져있다 (Benhar M et al. (2001) Mol Cell Biol 21: ). 이에, 시스플라틴의처리가대장암의세포내산화환원 (redox) 상태에대한미치는영향을확인하기위하여아래와같은실험을진행하였다. HCT116 대장암세포에 ROS 저해제로서항산화물질인 NAC (N-acetyl-L- cysteine, Molecular ProbesTM, Invitogen, 캐나다 ) 를 10 nm 전처리하고, 30μg/mL 시스플라틴을처리하였다. 이후 10μM 의 H2DCFDA (dichlorodi hydrofluorescein diacetate, Molecular Probes, Carlsbad, CA) 시약으로염색하였다. 이후세포를 DMEM-10% FBS로 2번세척하고, DMEM으로희석시킨 10μM H2DCFDA 시약을첨가하여 37 에서 20분동안배양하였다. 그후, PBS로세척하고트립신 (trypsin) 을처리하였다. 분리된세포들을차가운얼음에보관한 PBS로 2회세척하고, PBS로다시부유시켜유세포분석기 (flow cytometry; FACS Calibur, Becton-Dickinson, Mountain View, CA) 로형광강도를측정하였다. 시스플라틴을처리하지않은대조군을 1로한뒤이에대비하여증가한배수를결과로나타내었다. Data 는 3번실험측정치의 mean±sd이다 (***P < vs. 시스플라틴-처리실험군 ). [0055] [0056] 도 2b 내지도 2d는 ROS의생성비율 (%) 을나타낸것으로, Con은대조군 ( 무처리 ), CDPP는시스플라틴을의미한다. ROS의생성은시스플라틴을처리하지않은세포에비해서처리를한세포에서크게증가하였다. 또한, 시스플라틴을처리한상태에서 ROS 저해제로서항산화물질인 NAC를농도를높여가며처리하자세포안의 ROS 축적은점차감소하였다

9 [0057] (3) ROS 생성및축적에의한세포사멸유도확인 [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] 시스플라틴이미토콘드리아-의존성세포사를유발하는신호물질들에미치는영향, 및항암유전자로알려진 p53 유전자발현에어떤영향을미치는지확인하기위하여, 아래와같은실험을진행하였다. 상기 (2) 의 HCT116 대장암세포를 50 mm Tris-HCl (ph 8.0), 150 mm NaCl, 0.02% NaN3, 100 mg/ml PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride), 1 mg/ml 아프로티닌 (aprotinin), 및 1% Triton X-100를포함하는버퍼에서파쇄하였다. 그후단백질농도를바이오-라드단백질어세이 (Bio-Rad, Richmond, CA) 를통하여측정하였다. 30 mg의총세포파쇄물 (lysate) 을 SDS-PAGE로분획하여니트로셀룰로오스막 (nitrocellulose membrane) 에이동시켰다. 전기영동은 Hoefer electrotransfer system(amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) 을사용하였다. 항-PARP(poly (ADP-ribosyl) polymerase), 항-BCL-2, 항-Bax, 및항-p53 항체는산타크루즈바이오테크놀러지 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, 캐나다 ) 에서, 항-GAPDH (Anti-glyceraldehyde-3-phosphate -hydrogenase) 는케미콘 (Chemicon, Temecula, LA, 미국 ) 에서구입하였다. 목적단백질을확인하기위하여, 상기막에각항체를처리하고배양하였다. 그후서양고추냉이퍼록시다제 (horseradish peroxidase) 가부착된안티마우스및안티래빗 2차항체 (Santa Cruz), 및 ECL 화학발광시스템 (ECL chemiluminescence system; Amersham Biosciences) 을사용하여목적단백질을검출하였다. GAPDH는내부대조군으로사용하였다. [0063] [0064] 도 2e는대장암세포 HCT116에서전체단백질을분리한후각각의항체를이용하여 PARP, BCL-2, Bax, p53에대하여면역블로팅분석을실시한결과를나타낸것이다. HCT116 대장암세포에시스플라틴을처리하면 p53과 Bax발현이증가하지만 Bcl-2발현은감소하였다. 나아가시스플라틴을처리한결과세포안의 PARP분해가급격히증가하였는데, 이는미토콘드리아막의전위 (potential) 감소가원인으로알려진사이토크롬 (cytochrome) c 방출에의하여캐스페이즈 (caspase) 가활성화되었기때문이다. [0065] [0066] 한편, NAC 10 nm로전처리한뒤에시스플라틴 30 μg/ml를첨가한 HCT116세포에대하여상기 (3) 과동일한방법으로면역블로팅분석을진행하여그결과를도 2f에나타내었다. 도 2f와같이, 시스플라틴이세포사멸관련단백질인 Bax와 p53발현을촉진하고 PARP 절단을유발하며항세포사단백질인 Bcl-2발현을감소시킴을확인하였다. 이러한시스플라틴이사람대장암세포에미치는효과는 NAC에의해저해되었다. 즉, NAC가 ROS 생성을억제하는능력과비례하여, NAC가동시에시스플라틴존재하에서세포사와관련된신호들을억제하는활성을가짐을확인하였다. 따라서, 시스플라틴의항암활성은 ROS생성을유발하는것으로이것이 HCT116 세포의세포사의핵심임을확인하였다. [0067] (4) 시스플라틴의세포내 GM3 생성촉진효과확인 [0068] 강글리오사이드 GM3 합성효소와그생성물을대장암세포 HCT116에서과발현하였다. 구체적으로, GM3 합성효소발현플라스미드를구축하기위해, 인간 GM3 합성효소암호영역을함유하는 1.1kb DNA단편을 PCR증폭하였다. 사람태아뇌 cdna를주형으로사용하였으며, 하기표 3의프라이머를사용하였다. 프라이머에는 Hind III 와 Eco RI 제한효소절단부위가존재하도록제작하였다 ( 밑줄표시 )

10 표 3 [0069] 방향 서열 서열번호 센스 5'-CTAAGCTTATGAGAAGGCCCAGCTTGTTATTAAAAGACATC-3' 1 안티-센스 5'-ATGAATTCGTTCAAAATTCACGATCAATGCCTCCACTGAGATC-3' 2 [0070] [0071] [0072] [0073] 증폭단편은 Wizard SV Gel과 PCR Clean-Up System(Promega) 을이용하여 1% 아가로오스젤로부터분리하고제한효소로절단한후 T4 ligase (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) 로 pcdna3 벡터내에삽입시켜 pcdna-gm3을제작하였다. 그후제한지도를작성하고 DNA 시퀀싱을실시하여 GM3 합성효소유전자가삽입되었음을확인하였다. 6-웰플레이트에서웰당 10 5 세포의밀도로 HCT116 세포를배양하였다. WelFect-EXTM PLUS 방법 (JBI) 을이용하여 1 μg의 pcdna 또는 pcdna-gm3 플라스미드로세포를형질전환시켰다. 배양한후형질전환세포주들을 500 μ g/ml G418 (Life Technologies, Inc.) 를포함하는선택배지에서 21일배양한후, 각 G418-내성콜로니들을분리하였다. 그후, 상기대장암세포 HCT116에시스플라틴을 12시간동안처리한뒤, 트리졸시약 (Trizol reagent, Invitrogen) 으로총 RNA를분리하고, 분리된 RNA 1μg을올리고 (oligo) dt 프라이머및 AccuPower RT-PreMix (Bioneer Co., 대전, 대한민국 ) 시약을이용하여역전사 PCR을실시하였다. GM3 합성효소, GM2 합성효소, GalNAc-T(GM2/GD2 합성효소 ), β-액틴 (actin) 의 cdna를하기표 4의프라이머 EF-Taq 중합효소 (SolGent, 서울, 대한민국 ) 를이용하여 PCR로증폭하였다. 역전사 PCR의실행여부를확인하기위하여상기 -액틴을이용하여동량의 mrna에대하여역전사 PCR을실시하였다 ( 대조군 ). [0074] 목적유전자 방향 서열 서열번호 GM3 합성효소 센스프라이머 5'-CCCTGCCATTCTGGGTACGAC-3' 3 (413 bp) GD3 합성효소 (460 bp) GalNAc-T (230 bp) β-액틴 (247 bp) 표 4 안티-센스프라이머 5'-CACGATCAATGCCTCCACTGAGATC-3' 4 센스프라이머 5'-TGTGGTCCAGAAAGACATTTGTGGA-3' 5 안티-센스프라이머 5'-TGGAGTGAGGTATCTTCACATGGGT-3' 6 센스프라이머 5'-CCAACTCAACAGGCAACTAC-3' 7 안티-센스프라이머 5'-GATCATAACGGAGGAAGGTC-3' 8 센스프라이머 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3' 9 안티 - 센스프라이머 5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3' 10 [0075] PCR 산물은 0.5 x TAE (Tris-acetate-EDTA) 버퍼및 EtBr(ethidium bromide) 을포함하는 1.5% 아가로오스젤에 서전기영동을이용하여분리하였다. [0076] [0077] 막조성의변화로인하여세포사멸이유도될수있음이알려져있다 (dazzo A et al. (2006) Cell Death Differ 13: , Iwamori M & Iwamori Y (2005) Glycoconj J 22: ). 시스플라틴이 HCT116 대장암세포에서 GM2와 GD3 합성효소유전자들의발현을조절하고결과적으로 ganglioside GM2와 GD3가생성이조절되는지조사하였으나이들유전자와생성물의변화가보이지않았다 ( 도 3a). 한편, 도 3b에나타난것과같이, 시스플라틴은시스플라틴을처리한세포사유발조건에서대장암세포 HCT116의 GM3 합성효소발현을증대시킴을확인하였다. [0078] 또한, Choi HJ 등 (FEBS Lett 555: , 2003) 에기재된것과같이프로모터가없는발광효소벡터 pgl3- Basic(Promega) 의해당위치에 23 번의프로모터가상영역이존재하는 Sac I/Bgl II 단편들을삽입시켜리포터 플라스미드 (reporter plasmid) 인 pgl 을제작하였다

11 [0079] 세포를 6웰플레이트에서웰당 10 5 세포수의밀도로밤새배양하였다. 그후, 상기프로모터 (pgl3-1600) 또는그 CREB 변이프로모터 (pgl CREB Mu) 0.5 pmol 및베타-갈락토시다아제 (β-galactosidase) 플라스미드 0.5 mg을 WelFect-EXTM PLUS method (JBI) 를이용하여함께대장암세포 HCT116에도입하였다. 상기세포는 10% FBS 및시스플라틴을포함하는배지에서 12시간동안배양되었다. 발광효소와베타-갈락토시다아제의활성은발광효소와베타-갈락토시다아제효소어세이시스템 (Luciferase, β-galactosidase enzyme assay system, Promega) 으로측정하였다. 발광효소의활성은세포파쇄물에서의베타-갈락토시다아제활성에대하여표준화하였고, 결과는 3회실험에서각 3번씩측정수치의 means±sd로나타내었다 (***P < vs. 시스플라틴-처리실험군 ). [0080] 그결과, 도 3c 에도시된것과같이, GM3 합성효소유전자의프로모터를포함하는 pgl 을도입한대장암세 포 HCT116 에서시스플라틴처리후에 GM3 합성효소의발현이증대됨을확인하였다. [0081] [0082] 또한, 대장암세포 HCT116를 6 웰배양플래이트상의 12mm 직경의멸균된커버슬립에올려놓았다. 세포를 3.7% 포름알데히드 /PBS에고정시킨후, PBS로 3회세척하고 5분동안실온에서 0.5% 트윈-20/PBS로투과하였다. 1% 소혈청알부민 (BSA) 를포함하는 PBS로비특이적위치를 30분동안블로킹하였다. 그후, GM3 (M2590, Biotest Laboratories, 일본 ), GD3 또는 GM2-특이적항체를세포에잠기게두고밤새 4 에서배양하였다. 그후 PBS로세척하고, 세포를 FITC 결합된항-마우스 IgM과함께 30분동안실온에서배양하였다. 다시 PBS로세척하고, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 를포함하는항-페이드시약 (fade reagent, Molecular Probes) 을고정시켰다. 형광현미경 (Nikon, Japan) 을이용하여상기슬라이드를분석하였다. 2차항체만을미리-흡수시킨경우를음성대조군 (negative control) 으로사용하였다. [0083] 도 3d 에도시된것과같이, 시스플라틴을처리한대장암세포 HCT116 에서 GM3 의발현이증가하였음을 확인하였다. [0084] [0085] 따라서, 본발명에따른약학조성물은, 강글리오사이드또는활성산소종생성을유도하는세포독성약물의단 독처리에비해세포독성약물의부작용을최소화하면서상승된항암효과를나타낼수있다. 나아가, 기존에사용되는세포독성약물에내성을갖는암환자에효과적으로작용할수있다. [0086] 이상의설명으로부터, 본발명이속하는기술분야의당업자는본발명이그기술적사상이나필수적특징을변경하지않고서다른구체적인형태로실시될수있다는것을이해할수있을것이다. 이와관련하여, 이상에서기술한실시예들은모든면에서예시적인것이며한정적인것이아닌것으로서이해해야만한다. 본발명의범위는상기상세한설명보다는후술하는특허청구범위의의미및범위그리고그등가개념으로부터도출되는모든변경또는변형된형태가본발명의범위에포함되는것으로해석되어야한다

12 도면 도면 1a 도면 1b

13 도면 2a 도면 2b 도면 2c

14 도면 2d 도면 2e 도면 2f

15 도면 3a 도면 3b

16 도면 3c 도면 3d 서열목록 <110> RESEARCH & BUSINESS FOUNDATION SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Phamaceutical combination comprising ganglioside for the treatment of cancer <130> KPA KR <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211>

17 <220><223> primer(sense) <400> 1 ctaagcttat gagaaggccc agcttgttat taaaagacat c 41 <210> 2 <211> 43 <220><223> primer(anti-sense) <400> 2 atgaattcgt tcaaaattca cgatcaatgc ctccactgag atc 43 <210> 3 <211> 21 <220><223> primer(sense) for GM3 synthase <400> 3 ccctgccatt ctgggtacga c 21 <210> 4 <211> 25 <220><223> primer(anti-sense) for GM3 synthase <400> 4 cacgatcaat gcctccactg agatc 25 <210> 5 <211> 25 <220><223> primer(sense) for GD3 synthase <400> 5 tgtggtccag aaagacattt gtgga 25 <210>

18 <211> 25 <220><223> primer(anti-sense) for GD3 synthase <400> 6 tggagtgagg tatcttcaca tgggt 25 <210> 7 <211> 20 <220><223> primer(sense) for GalNAc-T <400> 7 ccaactcaac aggcaactac 20 <210> 8 <211> 20 <220><223> primer(anti-sense) for GalNAc-T <400> 8 gatcataacg gaggaaggtc 20 <210> 9 <211> 21 <220><223> primer(sense) for beta-actin <400> 9 caagagatgg ccacggctgc t 21 <210> 10 <211> 21 <220><223> primer(anti-sense) for beta-actin <400>

19 tccttctgca tcctgtcggc a

Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,