(72) 발명자 김경종 강원도춘천시후평 2 동주공 5 단지 502 동 508 호 박덕범 강원도춘천시석사동퇴계주공 4 단지 402 동 701 호 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 교육과학기술부 연구사업명 의료바이오신소재융복합연구사업단 /

Transcription

1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2013년05월10일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) G01N 33/573 ( ) G01N 33/68 ( ) G01N 33/551 ( ) C12Q 1/34 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2011 년 11 월 02 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 22 항 2011 년 11 월 02 일 (71) 출원인 강원대학교산학협력단 강원도춘천시강원대학길 1 ( 효자동 ) (72) 발명자 정두일 서울특별시노원구중계본동라이프아파트 108 동 1101 호 김영미 강원도춘천시퇴계동우성아파트 104 동 301 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 이종우 (54) 발명의명칭히스톤탈아세틸화효소 3 을표적으로하는알레르기치료제개발방법 (57) 요약 본발명은알레르기성질환의진단에필요한정보를제공하기위한방법및알레르기치료제를개발하는방법에관한것으로, 구체적으로알레르기성질환의진단에필요한정보를제공하기위하여포유동물의세포시료로부터히스톤탈아세틸화효소 -3 의발현수준을측정하는방법및히스톤탈아세틸화효소 -3 의발현을억제하거나히스톤탈아세틸화효소 -3 와 FcεRIβ 의교차결합을저해하는물질을선별하여알레르기치료제를개발하는방법에관한것이다. 본발명에따라히스톤탈아세틸화효소 -3, DNA 메틸전이효소 -1(DNA methyltransferase-1, DNMT-1) 또는단핵구화학주성단백질 -1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1) 의발현수준을측정하면효과인알레르기성질환의진단에필요한정보를제공할수있고, 히스톤탈아세틸화효소 -3 를타깃으로하면알레르기성질환의치료제를효과적으로개발할수있다. 대표도 - 도 1-1 -

2 (72) 발명자 김경종 강원도춘천시후평 2 동주공 5 단지 502 동 508 호 박덕범 강원도춘천시석사동퇴계주공 4 단지 402 동 701 호 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 교육과학기술부 연구사업명 의료바이오신소재융복합연구사업단 / 지역거점연구단육성사업 연구과제명 진단약물전달체신소재개발및응용 주관기관 강원대학교 연구기간 ~ 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 C 부처명 교육과학기술부 연구사업명 지역혁신인력양성지원사업 연구과제명 알레르기성질환의치료용시제품의개발및효능연구 주관기관 ( 주 ) 머슈빌 연구기간 ~

3 특허청구의범위청구항 1 알레르기성질환의진단에필요한정보를제공하기위하여포유동물의세포시료로부터히스톤탈아세틸화효소- 3(histone deacetylase-3, HDAC3) 의발현수준을측정하는방법. 청구항 2 제 1항에있어서, 알레르기성질환의진단에필요한정보를제공하기위하여포유동물의세포시료로부터 DNA 메틸전이효소-1(DNA methyltransferase-1, DNMT-1) 또는단핵구화학주성단백질-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1) 의발현수준을더측정하는방법. 청구항 3 제 1항에있어서, 상기알레르기성질환은아나필락시스쇼크, 기관지천식, 두드러기및화분증중에서선택된알레르기성질환인것을특징으로하는방법. 청구항 4 제 1항에있어서, 상기세포시료는조직, 혈청, 혈장및객당중에서선택된세포시료인것을특징으로하는방법. 청구항 5 제 1항에있어서, 상기히스톤탈아세틸화효소-3의발현수준을측정하기위하여히스톤탈아세틸화효소-3(histone deacetylase-3, HDAC3) 에특이적으로결합하는항체를사용하는것을특징으로하는방법. 청구항 6 제 2항에있어서, 상기 DNA 메틸전이효소-1의발현수준을측정하기위하여 DNA 메틸전이효소-1(DNA methyltransferase-1, DNMT-1) 에특이적으로결합하는항체를사용하고, 상기단핵구화학주성단백질-1의발현수준을측정하기위하여단핵구화학주성단백질-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1) 에특이적으로결합하는항체를사용하는것을특징으로하는방법. 청구항 7 제 5항또는제 6항에있어서, 상기측정은항체를이용한웨스턴블롯, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역확산법, 전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법, 보체고정분석법, FACS 및단백질칩분석법중에서선택된분석방법으로이루어지는것을특징으로하는방법. 청구항 8 제 1항에있어서, - 3 -

4 상기히스톤탈아세틸화효소-3(histone deacetylase-3, HDAC3) 의발현수준을측정하기위해, 표면에 HDAC3에대한앱타머 (aptamer) 가코팅된지지체를사용하는것을특징으로하는방법. 청구항 9 제 8항에있어서, 상기지지체는막, 슬라이드글라스및금속체중에서선택된것임을특징으로하는진단방법. 청구항 10 히스톤탈아세틸화효소 3을표적으로하여알레르기치료물질을선별하는방법. 청구항 11 제 10항에있어서, 상기알레르기는아나필락시스쇼크, 기관지천식, 두드러기및화분증중에서선택된알레르기성질환인것을특징으로하는방법. 청구항 12 제 10항에있어서, 상기치료물질은화합물또는생물학적분자인것을특징으로하는방법. 청구항 13 제 12항에있어서, 상기화합물은 HDAC3의발현수준을감소시키는화합물인것을특징으로하는방법. 청구항 14 제 12항에있어서, 상기생물학적분자는 HDAC3의발현수준을감소시키는핵산또는단백질인것을특징으로하는방법. 청구항 15 제 14항에있어서, 상기핵산은앱타머또는작은간섭 RNA인것을특징으로하는방법. 청구항 16 제 14항에있어서, 상기단백질은 HDAC3의프로모터서열에결합하여 HDAC3의발현수준을감소시키는전사인자인것을특징으로하는방법. 청구항 17 히스톤탈아세틸화효소-3(histone deacetylase-3, HDAC3) 의발현수준을측정하는마커를함유하는알레르기성질환진단용조성물. 청구항 18 제 17항에있어서, 상기조성물은 DNA 메틸전이효소-1(DNA methyltransferase-1, DNMT-1) 의발현수준을측정하는마커 ; 및단핵구화학주성단백질-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1) 의발현수준을측정하는마커 ; 중에서선택된마커를더포함하는것을특징으로하는조성물

5 청구항 19 제 17항에있어서, 상기히스톤탈아세틸화효소-3의발현수준을측정하는마커는히스톤탈아세틸화효소-3에특이적으로결합하는항체인것을특징으로하는조성물. 청구항 20 제 18항에있어서, 상기 DNA 메틸전이효소-1의발현수준을측정하는마커는 DNA 메틸전이효소-1에특이적으로결합하는항체인것을특징으로하는조성물. 청구항 21 제 18항에있어서, 상기단핵구화학주성단백질-1의발현수준을측정하는마커는단핵구화학주성단백질-1에특이적으로결합하는항체인것을특징으로하는조성물. 청구항 22 제 17항내지제 21항중어느한항의조성물을포함하는알레르기성질환진단용키트. 명세서 [0001] 기술분야본발명은알레르기성질환의진단에필요한정보를제공하기위한방법및알레르기치료제를개발하는방법에관한것으로, 구체적으로알레르기성질환의진단에필요한정보를제공하기위하여포유동물의세포시료로부터히스톤탈아세틸화효소-3의발현수준을측정하는방법및히스톤탈아세틸화효소-3의발현을억제하거나히스톤탈아세틸화효소-3와 FcεRIβ의교차결합을저해하는물질을선별하여알레르기치료제를개발하는방법에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] 배경기술급속한현대산업의발달과더불어천식, 알레르기성비염, 아토피성피부염과같은알레르기성질환이계속적인증가추세이며, 현재산업화된나라인구의 10 내지 40% 에영향을끼치고있다. 국내의경우 1980년대 1% 미만이었던알레르기성환자는 2000년대이르러 5% 이상으로급증하였으며, 잠재적인환자까지포함하면전체인구의 10% 가넘는것으로추정된다. 전체인구의 22% 이상이알레르기성비염을앓고있는미국의경우알레르기성질환의경제학상영향이초기 90년대에만 $6,400,000,000으로평가될만큼알레르기는개인삶의질에깊이영향을줄뿐아니라의학계, 경제활동에대한직접및간접비용이막대하다. 알레르기 (allergy) 란일반적으로외래물질인항원, 즉알레르기원 (allergen) 이면역학적기전을통해신체에해로운손상을유발하는현상을말한다. 즉알레르기원에대한과민반응으로이에대한질환으로는과민증 (anaphylaxis), 알레르기성비염 (allergic rhinitis), 천식 (asthma), 아토피성피부염 (atopic dermatitis), 곤충알레르기, 식품알레르기, 약품알레르기및두드러기 (urticaria) 등이있다 [Wuthrich B., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 90, 3-10]. 알레르기반응은비만세포를매개로일어나는데, 비만세포는피부, 호흡기, 위장관의점막, 임파관주위, 혈관주위, 뇌등전신의장기에널리분포하며, 알레르기반응의원인세포로서알려져있다. 알레르기반응은집먼지진드기, 꽃가루, 동물비듬, 곰팡이, 난알부민, 우유단백질, 땅콩등의알레르기원에대항하기위하여생성된 IgE가비만세포에작용함으로써야기된다 [Wills-Karp M., et al., 1998, Science, 282, , ; Grunig G., et al., 1998, Science, 282, ]. IgE는정상적으로는혈청중에아주낮은농도로존재하는일부류의항체이다. 특정항원에민감한알레르기환자의혈청내특정항원에대한결합특이성을갖는 IgE 생성농도는정상인의혈청과비교하였을때높은수준으로존재한다. 이렇게 IgE 생성에이르게하는항원에대한면역반응기작은하기와같다. 일단, 우리의몸이항원에노출되면, 항원은먼저항원제시세포 (Antigen presenting cells, APC) 에의해인지되 - 5 -

6 며, 이항원제시세포는 IL-4 존재하에서알레르기원제시를통해 Th0를 Th2 세포로분화시킨다. 이렇게분화된 Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-13와같은사이토카인을분비하는데, IL-4, IL-5 는골수에서호산성백혈구 (eosinophil) 의발달을촉진시켜염증발생조직으로호산성백혈구를유도할뿐만아니라, B세포에작용하여 IgE 생성을유도한다 [Wills-Karp M., et al., 1998, Science, 282, ]. [0007] [0008] [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] 상기작용기전으로생성된 IgE는 Fc 영역을통해고친화성 IgE 수용체 (FcεRI) 를매개로비반세포에강하게결합한다 [Ishisaka et al., 1970, Immunochemistry 7, ; Metzger et al., 1986, Ann. Rev. Immunol. 4, ; Kinet, 1999, Ann. Rev. Immunol. 17, ]. IgE에대한고친화성수용체 (FcεRI) 는즉각적알레르기증상에대한주요매개자이다. FcεRI은비반세포뿐만아니라호염기구, 혈소판을포함한많은다른세포유형및항원제시세포, 예를들어단핵구및수지상세포에서발견된다. 참고로 IgE에저친화성수용체 (FcεRII 또는 CD23) 는 B 림프구, 대식세포, 혈소판및많은다른세포유형, 예를들어기도평활근에서광범위하게발현된다. FcεRII는 IgE 발현의피드백조절및그결과로서 FcεRII 표면발현에역할을맡을수있다. IgE가 FcεRI를매개로비반세포에결합한이후동일한항원에재차노출되면항원이비반세포의 FcεRI와결합된 IgE에결합하여이들수용체간의교차결합을유도하고일련의신호전달반응이비반세포를활성화한다. 활성화된비만세포는히스타민 (histamine), 프로테오글리칸 (proteoglycan), 프로테아제 (protease), 류코트리엔 (leukotrien), 프로스타클라딘 (prostaglandin), 사이토카인 (cytokine), 활성산소 (ROS) 와같은자유라디칼 (free radical) 등을탈과립에의하여분비, 또는새로합성하여분비함으로써혈관확장, 장관내및기관지평활근수축, 점액분비및국소단백질분비등일련의알레르기반응을매개한다. 이처럼알레르기반응이비만세포의탈과립등비만세포의활성화에의해야기되므로, 비만세포의활성화를억제하는물질은알레르기성질환의치료제로활용될수있다 [J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem., 2005, 48, ]. IgE-매개염증반응은즉시형과민반응으로항원이 IgE 항체에결합한수분내에비반세포의탈과립화를유발하여히스타민과같은수행성매개자를방출한다. 이반응의최대강도는최초항원노출후 15분내에나타나며발진및소양증 ( 가려움증 ) 형태의홍반, 국소부종등이수반된다. 과립함유물은혈관투과를돕는혈관세포부착분자 (Vascular cell adhesion molecule, VCAM-1) 의국소적발현을유도하며, 백혈구및섬유아세포의주화성활성을갖는기타케모카인등은궁극적으로해당부위에염증을유발한다. IgE-매개즉시적염증반응을특별히제1형과민반응으로부른다. 이러한 IgE-매개염증반응에는아토피성알레르기 ( 예, 고초열, 천식및아토피성피부염 ), 전신성아나필락시스반응및알레르기성담마진 ( 두드러기 ) 이있으며, 이는상기한바와같이급속한혈관확장을일으키고, 순환하는가용성인자및세포의항원접촉부위로의진입을촉진시키기때문에일반적으로면역방어의제1선으로의역할을수행할수있다. 비반세포의초기매개반응후약 6 ~ 24시간이경과되면산성백혈과, 염기성백혈구및림프구의침윤이발행하며항원에노출된조직의만성적염증을유도한다. 이런후기상의면역반응을특별히제4형과민반응이라불리며이는감작 T임파구와항원이반응하여감작 T임파구에서유리되는여러가지활성인자에의해생긴다. 임상적특징으로는홍반, 경화 (induration), 온난 (warmth), 소양증, 및감염부위에서의작열감 (burning sensation) 을들수있다. 특정유전자의발현조절은 DNA에접근하는전사인자의능력에의해조절되는데이때 DNA와히스톤사이에결합이강할수록전사인자에의한접근을제한하고, 따라서유전자전사를억제한다 [Morrison et al, 2007, Cell Mol. Life Sci., 64, ]. 메틸기, 인산염기, 또는아세틸기공유부가등에의한히스톤또는 DNA의변형은그들의결합강도를변화시키고, 결과적으로 DNA 전사에영향을준다. DNA의메틸화 (methylation) 및히스톤의아세틸화 (acetylation) 현상은후생유전적조절의주된형태로서, 염색질 (chromatin) 구조의변형을통해유전자발현을억제하고 [Herman JG., 2003, N. Engl. J. Med., 349, ], 이러한후생유전적조절기작이종양발생및유전자질환에직접적인원인역할을한다는연구가보고되고있다. 특히 DNA 메틸화현상이전신성만성염증을일으키는자가면역질환인류마티스관절염의발병에중요한역할을하는것이밝혀졌으며, 류마티스관절염샘플로부터분리된 T 세포의게놈 DNA가저메틸화가되어있고, DNA 메틸전이효소 (DNMT) 의활성이감소되었다는내용이보고된바있으며 [Richardson B. et al., 1990, Arthritis Rheum., 33, ], 류마티스관절염이 DNA 메틸화와연관성이있다는내용이보고된바있다 [Kim YI. et al., J. Lab. Clin. Med., 1996,128, ]. DNA 메틸전이효소 (DNA methyltransferase, DNMT) 는 DNA 분자의특정뉴클레오티드염기에공유결합에의해메틸기를부가하는효소로포유류에서는 DNMT1, DNMT2, DNMT3A 및 DNMT3B 등 4가지의활성 DNA 메틸전이효소가동 - 6 -

7 정되었다. [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] DNMT1은가장흔한 DNA 메틸전이효소로서, 포유류에서중요한메틸전이효소로알려져있으며, 주로포유류게놈에서헤미메틸화된 CpG 디-뉴클레오티드를메틸화하고, 발생단계에서확립된메틸화패턴을유지시키는역할을담당한다. DNMT3는헤미-메틸화된 CpG 부위와메틸화되지않은 CpG 부분을동일한속도로메틸화할수있는유형의 DNA 메틸전이효소이며구조적으로 DNMT1과유사하다. 최근 DNMT3B 유전자의다형성과한국인에서의류마티스관절염발생위험도및관절파괴의진행속도와의상관관계가보고된바있으며, 이를바탕으로 DNMT3B 유전자다형성이류마티스관절염질병예후를진단하는유전적인자로제시된바있다 [KR 특허출원 ]. 또한, DNA 메틸전이효소와상호작용하는것으로공지된단백질들이많이알려져있는데이는 DNMT 효소가단독으로작용하기보다는, 공지된단백질들과큰복합체를이루어전사조절및염색질구조변형을유도하는구성성분효소의하나임을알수있다. 이러한사실들은질병에서의 DNA 메틸화의여러가지역할들을이해하고이러한결함을예방하거나회복시키는새로운치료법을개발하는데큰도움이될것이다. 히스톤의가역적아세틸화는 DNA에대한전사인자 (transcriptional factor) 의접근성을변화시키는유전자발현의주된제어인자이다. 정상세포에서, 히스톤디아세틸라제 (HDACs) 및히스톤아세틸트랜스퍼라제 (HATs) 는유전자발현의균형을유지하기위하여히스톤의아세틸화수준을함께조절한다. HATs가전사활성화인자인반면, HDACs는전사억제및유전자의사일런싱에대응된다 [Kouzarides, 1999, Curr. Opin. Genet. Dev., 9, 40-48; Johnstone RW, 2002, Nat. Rev. Drug Discov., 1, ]. 인간 HDACs는상동성 (homology) 에기초하여클래스 I, II, III로구분한다. 고전적 HDACs로간주되는클래스 I(HDAC1, 2, 3 및 8), II(HDAC4, 5, 6, 7, 9 및 10) 는트리코스타틴 A(TSA) 에의해그활성이공통적으로저해된다. 보편적으로발현되는클래스 I에비해클래스 II는조직제한적이며특히심장, 골격, 뇌에서발현수준이높다. 클래스 III HDACs는 TSA에의해영향을받지않는 NAD+ 의존적단백질부류이다. HDACs는그아세탈화수준을변형시키는것에의해비-히스톤단백질의활성을조절하는것으로알려져왔다. 이들은, 에스트로겐및안드로겐수용체와같은스테로이드수용체들 [Wang et al, 2001, J. Biol. Chem., 276, ; Gaughan et al, 2002, J. Biol. Chem., 277, ], p53, E2F와같은전사인자들 [Luo et al, 2000, Nature, 408, ; Ito et al, 2001, EMBO J., 19, ; Sartorelli et al, 1999, Mol. Cell, 4, ] 및 α-튜불린과같은세포질단백질들 [Hubbert et al, 2002, Nature, 417, ] 을포함한다. 상기와같은후생적조절의변형은암을포함한많은질환의징표이다. 그러므로이들질환의치료제로제공되는약물개발에있어서후생적조절의근본적인기전연구는집중적인관심분야이며후생적조절인자에대한탐색은약물발견을위한매우유망한분야가되고있다. 케모카인은분자량이낮으며 (8-10 kda), 유발성, 분비성, 전염증성, 화학유인사이토카인으로, 이는조직손상의부위에서백혈구의특정부분집단의혈관주위이동및축적에중추적역할을수행하는것으로보여진다. 단핵구화학주성단백질 MCP1(Monocyte Chemotactic Protein-1, 혹은 CCL2로칭함 ) 은모든공지된케모카인들중에서, 단핵구와대식세포에대해최고특이성을나타내는케모카인의 β 아과에속하는단백질로 T 림프구, 비만세포및호염기성백혈구에대해강력한화학주성작용을가진다 [Rollins B.J., 1997, Blood 90, ; M. Baggiolini M., 1998, Nature 392, ]. MCP1은케모카인수용체 CCR2를통하여결합하고신호를전달한다. CCR2는단핵구, T-세포, B-세포및호염구를포함하는많은세포들에서발현되며결과적으로여러염증성인자들 ( 활성산소, 아라키돈산및유도체, 사이토카인 / 케모카인 ) 을생산하고식균작용을증가시킨다. MCP1이염증성반응동안중요한역할을하며다양한병변들에서새로운표적으로입증되고있다. MCP1의상당한생리병리학적기여의증거는관절및신장염증성질환들 ( 류마티스관절염, 낭창성신염, 당뇨성신장병증및이식후거부반응 ) 을가진환자들의경우에서보고되고있다. 최근에, MCP1은 CNS( 다발성경화증, 알츠하이머병, HIV-관련치매 ) 의염증성이상및명백한염증성성분들을갖거나갖지않은, 아토피피부병, 대장염, 간질성폐이상, 재협착, 죽상경화증, 수술치료 ( 예를들어, 혈관형성, 동맥절제술, 이식, 기관및 / 또는조직교체, 보철임플란트 ), 암 ( 선종, 암종및전이 ) 및인슐린저항성과비만과같은신진대사질환들을포함하는다른이상및통증에관여하는인자들중에서지정되었다

8 [0025] [0026] 현재일반적으로상용되는대표적인알레르기치료제로는항히스타민, 스테로이드성또는비스테로이드성항염증용의약품등이있는데, 이들은주로증후성에치료효과가있고, 과도한체액성면역을완화하거나 IgE 생성을억제시키는알레르기의근본적인원인을치료하는효과는없는것으로나타났다. 한편, IgE 항체 (CGP ) 와재조합인간화단일클론항체의임상실험을통하여 IgE 생산억제가알레르기의증상을개선시킴이증명되었고 [Fahy JV. et al., Am. J. Respir. Crit. Care. Med., 1997, 155, ], IgE 합성및분비억제자로디아실벤지미다졸동족체 [US 특허 6,369,091호 ] 와세균성폴리사카라이드 [US 특허출원공개 호 ] 가밝혀졌다. 상기한바와같이알레르기치료에대한통상적인방법은항-히스타민제를사용한전신적인치료와환자의민감성을완화하는방법을포함하며, 이들연구는기초적인 IgE-비만세포 / 호염기성세포상호작용이나 FcRI 작용기작에근거하는것은아니다. [0027] 본발명자는종래에알려진 IgE-매개알레르기및피부아나필락시스유도기작을바탕으로 IgE 고친화성수용체 FcεRI에결합하는단백질복합체를연구한결과, 단백질의후생유전적조절자인 HDAC3이항원자극시 Fc εriβ에결합하여일련의신호전달을통해염증성반응을매개하는것을확인하였으며, DNMT1의반응을음성적으로조절하는등알레르기질환에깊이관여하고있는것을확인하였다. 이에따라상기 HDAC3를포함하여관련된인자들의발현수준등을확인하는방법으로알레르기질환을비교적손쉽고정확하게진단하기위한정보를제공할수있고, 이인자들의발현또는활성에영향을미치거나인자들간의결합에영향을미치는물질을선별하는방법을사용할경우, 효과적으로새로운알레르기치료제를개발할수있다. 발명의내용 [0028] [0029] 해결하려는과제따라서본발명의주된목적은알레르기성질환을효율적으로진단하기위한정보를제공하는방법을제공하는데있다. 본발명의다른목적은알레르기성질환의치료제를개발하기위한방법즉, 알레르기성질환치료제개발의새로운타깃을제공하는데있다. [0030] [0031] [0032] [0033] 과제의해결수단본발명의한양태에따르면, 본발명은알레르기성질환의진단에필요한정보를제공하기위하여포유동물의세포시료로부터히스톤탈아세틸화효소-3(histone deacetylase-3, HDAC3), DNA 메틸전이효소-1(DNA methyltransferase-1, DNMT-1) 또는단핵구화학주성단백질-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1) 의발현수준을측정하는방법을제공한다. 히스톤탈아세틸화효소-3는서열번호 1 또는서열번호 3의아미노산서열로이루어질수있다. 서열번호 1은생쥐 (Mus musculus) 의히스톤탈아세틸화효소-3의아미노산서열이며, 서열번호 3은인간 (Homo sapiens) 의히스톤탈아세틸화효소-3의아미노산서열이다. 또한히스톤탈아세틸화효소-3를코딩하는유전자는서열번호 2 또는서열번호 4의염기서열로이루어질수있다. 서열번호 2는생쥐 (Mus musculus) 의히스톤탈아세틸화효소- 3 유전자의염기서열이며, 서열번호 4는인간 (Homo sapiens) 의히스톤탈아세틸화효소-3 유전자의염기서열이다. DNA 메틸전이효소-1는서열번호 5 또는서열번호 7의아미노산서열로이루어질수있다. 서열번호 5는생쥐 (Mus musculus) 의 DNA 메틸전이효소-1의아미노산서열이며, 서열번호 7은인간 (Homo sapiens) 의 DNA 메틸전이효소-1의아미노산서열이다. 또한 DNA 메틸전이효소-1을코딩하는유전자는서열번호 6 또는서열번호 8의염기서열로이루어질수있다. 서열번호 6은생쥐 (Mus musculus) 의 DNA 메틸전이효소-1 유전자의염기서열이며, 서열번호 8은인간 (Homo sapiens) 의 DNA 메틸전이효소-1 유전자의염기서열이다. 단핵구화학주성단백질-1은서열번호 9 또는서열번호 11의아미노산서열로이루어질수있다. 서열번호 9는생쥐 (Mus musculus) 의단핵구화학주성단백질-1의아미노산서열이며, 서열번호 11은인간 (Homo sapiens) 의단 - 8 -

9 핵구화학주성단백질-1의아미노산서열이다. 또한단핵구화학주성단백질-1을코딩하는유전자는서열번호 10 또는서열번호 12의염기서열로이루어질수있다. 서열번호 10은생쥐 (Mus musculus) 의단핵구화학주성단백질 -1 유전자의염기서열이며, 서열번호 12는인간 (Homo sapiens) 의단핵구화학주성단백질-1 유전자의염기서열이다. [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] 본발명의방법에서, 알레르기성질환의진단에필요한정보를제공하기위한발현수준의측정대상으로상기히스톤탈아세틸화효소-3(histone deacetylase-3, HDAC3), DNA 메틸전이효소-1(DNA methyltransferase-1, DNMT-1) 또는단핵구화학주성단백질-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1) 의세가지효소 ( 단백질 ) 중하나를선택할수있으며, 보다정확한정보제공을위해서둘이상을선택하는것이바람직하고, 가장바람직하게는세가지모두를선택하는것이좋다. 본발명은피부아나필락시스모델을대상으로연구한결과에따른것이므로, 본발명의방법은알레르기성질환중에서도피부아나필락시스의예후진단에필요한정보를제공하기위해사용하는것이가장바람직하다. 아나필락시스쇼크를비롯해이와유사한기관지천식, 두드러기및화분증등의알레르기성질환의예후진단에필요한정보를제공하기위해서도사용할수있다. 본발명의방법에서, 상기세포시료는조직, 혈청, 혈장및객당중에서선택된세포시료인것이바람직하다. 본발명의방법에서, 발현수준을측정하기위해서는상기효소의발현여부를직접확인하거나, 상기효소의유전자에대한 mrna의발현여부를확인하는방법을사용할수있다. 효소의발현여부를직접확인하기위해서는효소에특이적으로결합하는항체를사용할수있는데, 본발명의방법에서는히스톤탈아세틸화효소-3에특이적으로결합하는항체, DNA 메틸전이효소-1에특이적으로결합하는항체, 단핵구화학주성단백질-1에특이적으로결합하는항체를사용할수있다. 효소의유전자에대한 mrna의발현여부를확인하기위해서는효소의유전자염기서열에특이적으로결합하는프라이머세트를사용할수있는데, 본발명의방법에서는히스톤탈아세틸화효소-3 유전자의염기서열에특이적으로결합하는프라이머세트, DNA 메틸전이효소-1 유전자의염기서열에특이적으로결합하는프라이머세트, 단핵구화학주성단백질-1 유전자의염기서열에특이적으로결합하는프라이머세트를사용할수있다. 발현수준을측정하기위해서는상기각항체를이용한웨스턴블롯, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역확산법, 전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법, 보체고정분석법, FACS 또는단백질칩분석법을사용할수있다. 또한, 상기히스톤탈아세틸화효소-3의발현수준을측정하기위해, 표면에 HDAC3에대한앱타머 (aptamer) 가코팅된지지체를사용할수있으며, 이때지지체로는막, 슬라이드글라스또는금속체를사용할수있다. 본발명의다른양태에따르면, 본발명은히스톤탈아세틸화효소 3을표적으로하여알레르기치료물질을선별하는방법을제공한다. 수많은질병또는질환에대한치료제를개발하기위한시도가이루어지고있지만, 마땅한원인을알수없어이러한시도조차할수없는경우가많다. 따라서치료제를개발하기위해서는우선그질병또는질환의원인을분석해야하며, 여기에관여하는인자들에대한연구가필요하다. 관련된인자를찾을경우, 이를대상으로하여새로운치료제를개발하기위한다양한시도가이루어질수있으므로, 질병또는질환의치료제를개발하는데있어서, 새로운타깃 (target) 인자를제공하는것은매우의미있는것이다. 본발명은지금까지알려지지않았던알레르기에관여하는새로운인자를제공하는것으로, 히스톤탈아세틸화효소 3을표적으로하여이의발현, 활성또는다른인자와의결합에영향을미치는물질을선별하기위한시도가이루어진다면효과적으로새로운알레르기치료제를개발할수있다. 특정단백질의발현을억제하거나증가시키는물질, 효소의활성을저해하거나활성화시키는물질또는단백질사이의결합이나단백질과 DNA, RNA와의결합을방해하는물질등을선별하는것은기존에다양한방법이알려져있으므로, 이들중선택하여치료제의개발에적용할수있다. 본발명은피부아나필락시스모델을대상으로연구한결과에따른것이므로, 알레르기성질환중에서도피부아나필락시스에대한치료물질을선별하기위해사용하는것이가장바람직하나이에한정되는것은아니다. 아나필락시스쇼크를비롯해이와유사한기관지천식, 두드러기및화분증등의알레르기성질환에대한치료물질을선별하기위해사용할수있고, 이외의다른알레르기성질환에대한치료물질을선별하는데에도사용할수있다

10 [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] 치료물질의선별을위해화합물또는생물학적분자를대상으로하는것이바람직하다. 상기생물학적분자는핵산또는단백질일수있고, 상기핵산은앱타머또는간섭 RNA일수있으며, 상기단백질은 HDAC3의프로모터서열에결합하여 HDAC3의발현수준을감소시키는전사인자일수있다. 치료물질을선별하기위한일례로, 화합물또는생물학적분자중에서 HDAC3의발현수준을감소시키는물질을선별하는방법을사용할수있다. 본발명의또다른양태에따르면, 본발명은히스톤탈아세틸화효소-3(histone deacetylase-3, HDAC3) 의발현수준을측정하는마커를함유하는알레르기성질환진단용조성물을제공한다. 본발명의진단용조성물은 DNA 메틸전이효소-1(DNA methyltransferase-1, DNMT-1) 의발현수준을측정하는마커 ; 및단핵구화학주성단백질-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1) 의발현수준을측정하는마커 ; 중에서선택된마커를더포함하는것이바람직하다. 상기각효소의발현수준을측정하는마커는각효소에특이적으로결합하는항체또는각효소유전자의염기서열에특이적으로결합하는프라이머세트일수있다. 본발명의진단용조성물에있어서, 상기히스톤탈아세틸화효소-3의발현수준을측정하는마커는히스톤탈아세틸화효소-3에특이적으로결합하는항체인것이바람직하고, 상기 DNA 메틸전이효소-1의발현수준을측정하는마커는 DNA 메틸전이효소-1에특이적으로결합하는항체인것이바람직하며, 상기단핵구화학주성단백질-1의발현수준을측정하는마커는단핵구화학주성단백질-1에특이적으로결합하는항체인것이바람직하다. 본발명의또다른양태에따르면, 본발명은상기조성물을포함하는알레르기성질환진단용키트를제공한다. 본발명의진단용키트는상기마커와효소또는 mrna의반응을위한완충용액이나각효소또는 mrna의발현수준을측정하기위한도구등을포함하여이루어질수있다. [0055] 발명의효과이상설명한바와같이, 본발명에따라히스톤탈아세틸화효소-3, DNA 메틸전이효소-1 또는단핵구화학주성단백질-1의발현수준을측정하면효과적인알레르기성질환의진단에필요한정보를제공할수있고, 히스톤탈아세틸화효소-3를타깃으로하면알레르기성질환의치료제를효과적으로개발할수있다. [0056] 도면의간단한설명 도 1 의 A 는 IgE 감작후항원 (DNFB) 자극에의해 TpCR(Triphasic passive cutaneous reaction; 아나필락시스 반응 ) 이유도되며그에따른시간대별귀두께의증가가일어난다는것을보여준다. 도 1의 B는도 1 A의귀조직에서시간대별 HDAC3, DNMT1의발현변화를보여준다. 도 1의 C는 IgE-DNFB 매개아나필락시스반응에서 HDAC3이음성적조절자임을보여준다. 도 1의 D는상기귀조직에서 HDAC3 발현에따른 DNMT1 발현의감소가일어나며 HDAC3이 FcεRIβ와복합체를이루는것을보여준다. 도 2는도 1 C의귀조직에서항원자극에의해 HDAC3 발현유도및 DNMT1의발현억제가유도되며비반세포의표지단백질인 c-kit과 Tryptase의발현증가가일어남을보여준다. 도 3의 A는 RBL2H3와 BMMCs 세포주에서항원 (DNP-HSA) 자극에의해 HDAC3이 FcεRIβ와복합체를이루는것을보여준다. 도 3의 B는 RBL2H3에서항원자극에의해 FcεRIβ-HDAC3 복합체형성을 IF(immunofluorescence) 로확인한결과이다. 도 3의 C는 IgE-DNFB 매개귀조직에서상기와동일한결과를보여준다. 도 4의 A 내지 E는항원자극에의해 HDAC3-Rac1 복합체가 DNMT1 티로신잔기의니트르화 (nitration) 을유발하

11 여프로테아좀의존적으로 DNMT1의발현을저해하는것을보여준다. 도 4의 F는 HDAC3의발현이 DNMT1에의해교차조절되는것을보여준다. 도 5의 A는 IgE-DNFB 매개아나필락시스에서케모카인 MCP1 분비가 HDAC3에의해조절되는것을보여준다. 도 5의 B는도 5 A의귀조직에서 MCP1의단백질발현이 HDAC3에의해조절되는것을보여준다. 도 5의 C는 IgE-DNFB 매개 TpCR이 MCP1에의해조절되는것을보여준다. 도 5의 D는비반세포주에서항원자극에의한탈과립화가 MCP1에의해조절되는것을보여준다. 도 6의 A 내지 C는 DNMT1에의해 MCP1이조절되는것을보여준다. 도 6의 D, E는재조합 MCP1 단백질에의해비반세포가탈과립화및활성화되는것을보여준다. 도 7의 A, B는비반세포주에서항원자극에의한 HDAC3, DNMT1, MCP1의발현이아스피린에의해조절되는것을보여준다. 도 7의 C 내지 E는 IgE-DNFB 매개 TpCR 반응에서상기와동일한결과를보여준다. 도 8의 A는 DNMT1 발현억제가귀두께를증가시키는결과를보여준다. 도 8의 B는상기귀조직에서 DNMT1에의해서 HDAC2, HDAC3와혈관형성관련단백질의발현이조절되는것을보여준다. 도 8의 C, D는 DNMT1에의해염증성면역반응이유도되어귀조직으로염증성세포들이이동및침윤된것을보여주며, 이때 DNMT1과 HDAC2의발현억제와 HDAC3의발현증가를보여준다. 도 8의 E는상기와동일한쥐폐조직에서 HDAC3과 FcεRIβ가복합체를이루는것을보여준다. 도 8의 F는상기와동일한폐조직에서 DNMT1에의해 HDAC3, MCP1, tryptase, c-kit의발현이조절되는것을보여준다. 도 9의 A는상기와동일한귀조직에서 DNMT1에발현억제가혈관투과성을증가시키는것을보여준다. 도 9의 B는항원자극에의한혈관투과성이 MCP1에의해조절되는것을보여준다. 도 9의 C는항원자극에의해귀조직에서 PECAM-1의발현이증가하는것을보여준다. 도 9의 D는 DNMT1의발현억제가귀조직에서 PECAM-1의발현을유도하는것을보여준다. 도 10의 A 내지 C는 DNMT1의발현이억제된비반세포주의적응용배지를처리한경우 RAEC가혈관형성력이증가하는것을보여준다. 도 10의 D, E는상기의혈관형성인자인 VEGF가 DNMT1에의해조절되는것을보여준다. [0057] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하, 실시예를통하여본발명을더욱상세히설명하기로한다. 이들실시예는단지본발명을예시하기위한 것이므로, 본발명의범위가이들실시예에의해제한되는것으로해석되지는않는다. [0058] [0059] [0060] [0061] 실시예 1. 피부아나필락시스에서 HDAC3의역할및조절기작본실시예에서는 Balb/C 종마우스의 IgE-DNFB 피부아나필락시스모델을이용하여 HDAC3의역할및조절기작을확인하였다. 피부아나필락시스반응은 anti-dnp IgE(10μg ) 를 Balb/C 마우스의꼬리정맥으로주입하여피부를감작시킨후 24시간후아세톤-올리브오일혼합액 (3:1) 에 0.15% 농도로 DNFB 항원이포함되어있는 DNFB 항원용액 25μl를쥐의양쪽귀에도포하였다. 도포 30분후부터도 1의 A에나타난시간간격대로귀두께를측정하고귀조직을분리하여웨스턴블롯을실시하였다. 도 1의 A 및 B에서볼수있듯이, 아나필락시스유발 60분후귀두께가초기의 IgE-매개에의한즉시형과민반응의결과로증가한후만성염증이진행되는것을확인하였으며, 이와동일한시간대에 HDAC3의발현이증가하

12 면서동시에 DNMT1 의발현이억제되는것을확인하였다. 이는피부아나필락시스에서 DNMT1 과 HDAC3 이서로음 성적조절자로서의역할이있다는것을나타낸다. [0062] [0063] [0064] 상기조건에서 HDAC3의역할을확인하기위해동일한모델에서 HDAC3 특이적 sirna를 IgE 감작하루전에꼬리정맥으로투여하였고, 투여후 24시간동안귀두께측정및웨스턴블롯을수행하였다. 도 1의 C 및 D에나타난바와같이, 항원자극 1시간후즉시형과민반응에의한귀두께증가및 DNMT1의발현감소가 sihdac3에의해저해되는것을확인하였다. 또한항원자극에의한 FcεRIβ의활성이 HDAC3에의해조절되며서로복합체를이루는것을확인하였다. 상기귀조직을파라핀포매후 4μm두께로절편을제작하여 HDAC3, DNMT1, c-kit, Tryptase에대한항체를이용하여조직면역염색법을수행하였다. 도 2에나타난바와같이, 도 1의 D와동일한패턴의결과를확인하였으며, 비반세포징표인 Tryptase의발현이 HDAC3에의해조절되는것을확인하였다. 상기와같이본실시예를통해 IgE-매개비반세포의존적아나필락시스반응에서 HDAC3이필수조절자임을확인하였다. [0065] [0066] [0067] 실시예 2. HDAC3은 FcεRIβ와복합체를이루어피부아나필락시스를매개한다. 도 1을통한 HDAC3과 FcεRIβ의복합체형성결과를바탕으로, RBL2H3와 BMMCs 비반세포주에서항원자극에의한복합체형성을면역형광염색과웨스턴블롯으로확인하였다. 비반세포주에 IgE 감작 24시간후 1 시간동안항원자극을실시하였고, 이후웨스턴블롯 ( 도 3의 A 참조 ) 과면역형광법 ( 도 3의 B 참조 ) 으로 HDAC3-FcεRIβ 복합체형성을확인하였으며, 도 1의피부아나필락시스모델귀조직에서도동일한결과를확인하였다 ( 도 3의 C 참조 ). 상기와같이본실시예를통해 HDAC3이 FcεRIβ와복합체를이루어 IgE-매개알레르기및피부아나필락시스를매개하는것을확인할수있었다. [0068] [0069] [0070] [0071] 실시예 3. HDAC3은 DNMT1과교차음성적조절자로서 MCP1의발현을유도한다. 항원자극에의한 DNMT1의발현조절기작을확인하기위해, 프로테아좀저해제인 MG132의 1μM 용액으로항원자극전 12시간동안전처리한비반세포주에항원자극 1시간후웨스턴블롯을수행하여 HDAC3, DNMT1, HDAC2의발현을확인하였다. 도 4의 A에나타난바와같이, 항원자극에의해 DNMT1, HDAC2는프로테아좀의존적으로분해되며이에따라 HDAC3 발현이조절되는것을확인하였다. HDCA3에의한 DNMT1 발현조절기작을확인하기위해항원자극후 GTP-Rac1 활성을확인한결과, 항원자극에의해 HDAC3-Rac1의결합이이루어졌으며 ( 도 4의 B, C), Rac1의 dominant negative 플라스미드로 Rac1의활성을억제한비반세포주에항원자극을실시한결과, HDAC3의발현이억제되고 DNMT1 발현억제가저해되는것을확인하였다 ( 도 4의 D). 또한항원자극에의한 DNMT1의발현억제는 HDAC3-Rac1 결합체에의한 Rac1의활성화가 DNMT1 Tyr 잔기의 nitration과같은후생유전적변형을유도하여유비퀴티네이션에의한프로테아좀의존적분해에의한것임을확인하였다 ( 도 4의 D). DNMT1 저해제인 5-aza-2-deoxycytidine을농도별로 24시간처리한비반세포주에서 DNMT1 저해에따른 HDCA3의발현이유도되었으며 ( 도 4의 F), si DNMT에의한저해역시동일한패턴의결과를보여주었다 ( 도 4의 G). 항원자극에의한 HDAC3의발현에서 DNMT1이음성적조절자임을 ChIP assay를통해다시한번확인할수있었다 ( 도 4의 F). 본실시예를통해 HDAC3과 DNMT1이서로음성적조절자역할을통해 MCP1의발현을조절하는것을확인하였다. [0072] [0073] 실시예 4. HDAC3과 DNMT1에의한 MCP1의발현기작및역할본실시예에서는 IgE-매개알레르기및피부아나필락시스에서 HDAC3/DNMT1에의해조절되는사이토카인및케모카인을확인하기위해실시예 1의피부아나필락시스모델쥐의혈청으로사이토카인어레이 (Profiler Mouse Cytokine Array Kit, R&D) 를실시하였다. 사이토카인항체혼합액과 1시간반응시킨혈청을 40여종의마우스사이토카인항체가집적된멤브레인에 4 에서 12시간동안배양후 HRP-conjugated streptavidin 2차항체와 1시간반응시켜서 ECL 웨스턴블롯용액으로사이토카인및케모카인발현을확인하였다. 도 5의 A 및 B에나타난

13 바와같이, 항원자극에의해케모카인 MCP1과혈관형성관련단백질 sicam의발현이유도되었으며이들은각각 HDAC3에의해조절되는것을확인하였다. 케모카인 MCP1이피부아나필락시스를조절하는지를확인하기위해 MCP1을중화시키는항 MCP1 중화항체 nmcp1을 IgE와함께꼬리정맥으로투여하고 24시간경과후 DNFB로자극하여실시예 1과같은방법으로귀두께의증가측정및웨스턴블롯을수행하였다. 도 5의 C와같이 MCP1이피부아나필락시스에서중요한조절자임을확인하였으며, 비반세포주에서도탈과립화반응을통하여동일한패턴의결과를얻을수있었다 ( 도 5의 D 참조 ). [0074] [0075] MCP1의발현기작을확인하기위하여 DNMT1을 sirna를이용하여발현억제시시킨비반세포주의적응용배지와동일한조건의피부아나필락시스를유발시킨쥐의혈청으로상기와같은사이토카인어레이를수행하였다. 도 6의 A 및 B에나타난바와같이, DNMT1의발현억제가 MCP1의발현을유도하는것을바탕으로 MCP1 프로모터로 ChIP assay를수행하였다. 항원자극한비반세포주에서 DNA를분리하여항 HDAC3 항체, 항 DNMT1 항체, 항 HDAC2 항체, 항 Ac-H3, -H4 항체로각각 IP를수행한후 MCP1 프로모터가포함된프라이머로 RT-PCR를수행하였다. MCP1 프로모터에전사억제조절자로결합되어있던 DNMT1, HDAC2가항원자극에의해 MCP1 프로모터에서떨어지면서 HDAC3이전사활성인자로작용하여히스톤의아세틸레이션이유도됨을확인하였다. 아세틸레이션과같은히스톤의후생유전적변형은히스톤과 DNA의결합력을변화시켜전사인자의활성을조절하는것으로알려져있다. 도 6의 C에나타난바와같이 HDCA3-DNMT1에의한 MCP1의발현조절에후생유전적변형이중요한역할을하는것을알수있다. 비반세포의활성화에 MCP1의영향을확인하기위해비반세포주에재조합 MCP1을처리한결과도 6의 D에나타난바와같이비반세포활성화의징표인탈과립이유도되었으며 MCP1의수용체인 CCR2의활성을 IP로확인하였다. 이로써본실시예에서는후생유전적조절인자인 HDAC3, DNMT1에의해 IgE-매개알레르기반응을매개하는 MCP1의발현및역할을확인하였다. [0076] [0077] [0078] [0079] 실시예 5. 항알레르기치료제개발연구에있어서 HDCA3, DNMT1, MCP1의타당성여부아스피린은염증반응매개체인프로스타글란딘합성효소 PGES의저해제로항류마티스제로사용되고있다. 또한항원자극비반세포주에서 PGES 발현증가에따른프로스타글란딘분비가이미보고되었기에본실시예에서는아스피린에의한 HDAC3과 DNMT1, MCP1의발현조절을확인함으로써항알레르기치료제개발에있어서세단백질들의표적으로서타당성여부를확인하고자하였다. 이를위해 0.1mM 아스피린을 30분동안전처리한비반세포주에서항원자극에의한탈과립과세단백질들의발현이아스피린에의해조절되는것을도 7의 A와 B에서확인하였다. 동일한조건하의피부아나필락시스동물모델에서도항원자극에의한귀두께증가가감소하였으며, 웨스턴블롯과조직면역염색을실시한결과상기와동일한패턴의결과를얻을수있었다. 이로써알레르기증상완화제및치료제개발에있어서세단백질들이중요한표적자가될수있다는것을확인하였다. [0080] [0081] [0082] [0083] 실시예 6. DNMT1은아나필락시스에의한혈관형성을조절한다. IgE-매개탈과립화된히스타민과같은과립함유물에의해세포부착단백질인 VCAM-1의발현및혈관투과력이증가하여 MCP1과같은화학주성케모카인에의한염증을유발한다는기존의연구결과를바탕으로, DNMT1의혈관투과력및혈관형성력의기능을조사하였다. 이를확인하기위해 100nM의 sidnmt를주기적으로꼬리정맥투여한쥐의귀두께를일정시간동안측정하였으며, 동일한귀조직으로조직염색과면역염색및웨스턴블롯을통해단백질들의발현및복합체형성을확인하였다. 도 8의 A에서 DNMT1 저해에따른귀두께의증가를확인하였으며, HDAC3, HDAC2 발현조절과함께세포부착및혈관형성관련단백질들의발현이조절되는것을확인하였다 ( 도 8의 B 및 D 참조 ). DNMT1의저해에따른귀두께의증가가염증성세포들의이동과침윤에의한것임을도 8의 C에서확인하였으며, 폐조직에서도동일한패턴의결과를얻을수있었다 ( 도 8의 E 및 F 참조 ). 본실시예에서는 DNMT1의발현억제가초기즉시형과민반응뿐아니라시간이진행됨에따라폐와같은다른장기로의염증세포들의이동및침윤에의한만성염증을유발하는것을확인하였다

14 [0084] [0085] 2% Evans blue 용액을꼬리정맥으로투여하여 DNMT1에의한혈관투과력이조절되는것을확인하였으며, 항원자극에의한혈관투과력증가가 MCP1에의해서조절되는것을도 9의 A 및 B에서확인하였다. 항원자극에의한혈관내피세포인자 PECAM-1의발현을항원자극된귀조직에서전조직고정염색법 (whole-mount) 으로확인하였으며 DNMT1의발현억제에의해서동일한패턴의결과를얻었다 ( 도 9의 C 및 D 참조 ). DNMT1에의한혈관형성을확인하기위해쥐의대동맥에서얻은혈관내피세포 RAEC에 DNMT1 발현을억제시킨 RBL2H3 비반세포주의적응용배지를처리하여내피세포관형성 (Endothelilal cell Tube formation) 과대동맥고리스프라우팅기법 (Aortic ring sprouting assay) 을수행하였다. 또한 Transwell을이용한인베이젼기법을통해항원자극에의한비반세포주와혈관내피세포주와의상호작용을확인하였다. 비반세포주 RBL2H3에 10nM의 sidnmt를트랜스팩션하고 48시간후에트립신처리한 2 x 10 4 개의비반세포주를 transwell의 upper chamber에서, RAEC 세포를 20% FBS가포함된 M199 배지로 lower chamber에넣어세포의이동및침윤정도를확인하였다. 14시간경과후침윤된세포를메탄올로고정한후 H&E 염색하여침윤정도를확인하였다. 도 10의 A 내지 C에나타난바와같이, DNMT1의발현이억제된비반세포주의적응용배지에의해쥐혈관내피세포의혈관형성력이증가하였으며, 침윤정도역시증가하였다. 이는 DNMT1 발현억제에의해분비되는케모카인또는사이토카인에의한것이며 MCP1이그역할을할것으로사료된다. DNMT1의억제에의한혈관형성력이 VEGF 생성및그수용체의활성화에의한것임을도 10의 D 및 E에서웨스턴블롯과 RT-PCR로확인하였다. [0086] 본실시예에서는 DNMT1 이알레르기및아나필락시스의음성적조절자임을확인하였다. 도면 도면

15 도면 2 도면

16 도면 4 도면

17 도면 6 도면

18 도면 8 도면

19 도면 10 서열목록 <110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> The development of allergy therapeutics targeting histone deacetylase 3 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 428 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Ala Lys Thr Val Ala Tyr Phe Tyr Asp Pro Asp Val Gly Asn Phe His Tyr Gly Ala Gly His Pro Met Lys Pro His Arg Leu Ala Leu Thr His Ser Leu Val Leu His Tyr Gly Leu Tyr Lys Lys Met Ile Val Phe Lys Pro Tyr Gln Ala Ser Gln His Asp Met Cys Arg Phe His Ser Glu

20 Asp Tyr Ile Asp Phe Leu Gln Arg Val Ser Pro Thr Asn Met Gln Gly Phe Thr Lys Ser Leu Asn Ala Phe Asn Val Gly Asp Asp Cys Pro Val Phe Pro Gly Leu Phe Glu Phe Cys Ser Arg Tyr Thr Gly Ala Ser Leu Gln Gly Ala Thr Gln Leu Asn Asn Lys Ile Cys Asp Ile Ala Ile Asn Trp Ala Gly Gly Leu His His Ala Lys Lys Phe Glu Ala Ser Gly Phe Cys Tyr Val Asn Asp Ile Val Ile Gly Ile Leu Glu Leu Leu Lys Tyr His Pro Arg Val Leu Tyr Ile Asp Ile Asp Ile His His Gly Asp Gly Val Gln Glu Ala Phe Tyr Leu Thr Asp Arg Val Met Thr Val Ser Phe His Lys Tyr Gly Asn Tyr Phe Phe Pro Gly Thr Gly Asp Met Tyr Glu Val Gly Ala Glu Ser Gly Arg Tyr Tyr Cys Leu Asn Val Pro Leu Arg Asp Gly Ile Asp Asp Gln Ser Tyr Lys His Leu Phe Gln Pro Val Ile Ser Gln Val Val Asp Phe Tyr Gln Pro Thr Cys Ile Val Leu Gln Cys Gly Ala Asp Ser Leu Gly Cys Asp Arg Leu Gly Cys Phe Asn Leu Ser Ile Arg Gly His Gly Glu Cys Val Glu Tyr Val Lys Ser Phe Asn Ile Pro Leu Leu Val Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Thr Val Arg Asn Val Ala Arg Cys Trp Thr Tyr Glu Thr Ser Leu Leu Val Glu Glu Ala Ile Ser

21 Glu Glu Leu Pro Tyr Ser Glu Tyr Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Asp Phe Thr Leu His Pro Asp Val Ser Thr Arg Ile Glu Asn Gln Asn Ser Arg Gln Tyr Leu Asp Gln Ile Arg Gln Thr Ile Phe Glu Asn Leu Lys Met Leu Asn His Ala Pro Ser Val Gln Ile His Asp Val Pro Ala Asp Leu Leu Thr Tyr Asp Arg Thr Asp Glu Ala Asp Ala Glu Glu Arg Gly Pro Glu Glu Asn Tyr Ser Arg Pro Glu Ala Pro Asn Glu Phe Tyr Asp Gly Asp His Asp Asn Asp Lys Glu Ser Asp Val Glu Ile <210> 2 <211> 1287 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 atggccaaga ccgtggcgta tttctacgac cccgatgtgg gcaacttcca ctatggagct 60 ggacacccaa tgaaacctca tcgcctggca ttgactcata gcctagtcct gcattatggt 120 ctctataaga agatgatcgt cttcaagcct taccaggcct cccagcatga catgtgccgc 180 ttccattctg aggactacat cgacttcctg cagagagtca gccccaccaa tatgcagggt 240 ttcaccaaga gccttaatgc cttcaacgtg ggtgatgact gcccagtgtt tccaggactt 300 ttcgagttct gctcccgtta cacaggcgca tctctgcaag gagcaacaca gctaaacaac 360 aagatctgtg atattgccat caactgggcc ggtggtctac atcatgccaa gaaatttgag 420 gcctctggct tctgctatgt caatgacata gtaattggta tcctggagct gcttaagtac 480 caccctcggg tgctctacat tgatatcgac atccaccatg gtgacggggt tcaggaagcc 540 ttctacctca ctgaccgggt catgactgtg tccttccaca aatacggaaa ttacttcttt 600 cctggaacag gtgacatgta tgaagttgga gcagagagtg gccgctacta ttgtctcaat

22 gtgcccttac gagatggcat tgatgaccag agttacaagc accttttcca gccagtcatc 720 agccaggtgg tggacttcta ccagccgacg tgcatcgtgc tccagtgtgg cgctgactcc 780 ctgggctgtg atcgattagg ctgcttcaat ctcagcattc gaggacatgg ggaatgtgtt 840 gaatatgtca agagtttcaa tatccctctc ctggtactgg gaggtggtgg ctacactgtc 900 cgaaatgttg cccggtgttg gacatatgaa acatctctgc tggtagaaga ggccattagt 960 gaggaacttc cctatagtga atacttcgag tactttgccc cagatttcac actccatcca 1020 gatgtcagca cccgcatcga gaatcagaac tcacgccagt atctggacca gatccgccag 1080 acaatctttg aaaacttgaa gatgctgaac catgcaccca gtgtccagat tcatgatgtc 1140 ccggcagacc tcctgacgta tgacaggact gacgaggccg acgctgaaga gagaggtccc 1200 gaggagaact acagcaggcc agaagcaccc aatgagttct atgatggcga ccatgacaac 1260 gacaaggaaa gtgatgtgga gatttag 1287 <210> 3 <211> 428 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Lys Thr Val Ala Tyr Phe Tyr Asp Pro Asp Val Gly Asn Phe His Tyr Gly Ala Gly His Pro Met Lys Pro His Arg Leu Ala Leu Thr His Ser Leu Val Leu His Tyr Gly Leu Tyr Lys Lys Met Ile Val Phe Lys Pro Tyr Gln Ala Ser Gln His Asp Met Cys Arg Phe His Ser Glu Asp Tyr Ile Asp Phe Leu Gln Arg Val Ser Pro Thr Asn Met Gln Gly Phe Thr Lys Ser Leu Asn Ala Phe Asn Val Gly Asp Asp Cys Pro Val Phe Pro Gly Leu Phe Glu Phe Cys Ser Arg Tyr Thr Gly Ala Ser Leu Gln Gly Ala Thr Gln Leu Asn Asn Lys Ile Cys Asp Ile Ala Ile Asn

23 Trp Ala Gly Gly Leu His His Ala Lys Lys Phe Glu Ala Ser Gly Phe Cys Tyr Val Asn Asp Ile Val Ile Gly Ile Leu Glu Leu Leu Lys Tyr His Pro Arg Val Leu Tyr Ile Asp Ile Asp Ile His His Gly Asp Gly Val Gln Glu Ala Phe Tyr Leu Thr Asp Arg Val Met Thr Val Ser Phe His Lys Tyr Gly Asn Tyr Phe Phe Pro Gly Thr Gly Asp Met Tyr Glu Val Gly Ala Glu Ser Gly Arg Tyr Tyr Cys Leu Asn Val Pro Leu Arg Asp Gly Ile Asp Asp Gln Ser Tyr Lys His Leu Phe Gln Pro Val Ile Asn Gln Val Val Asp Phe Tyr Gln Pro Thr Cys Ile Val Leu Gln Cys Gly Ala Asp Ser Leu Gly Cys Asp Arg Leu Gly Cys Phe Asn Leu Ser Ile Arg Gly His Gly Glu Cys Val Glu Tyr Val Lys Ser Phe Asn Ile Pro Leu Leu Val Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Thr Val Arg Asn Val Ala Arg Cys Trp Thr Tyr Glu Thr Ser Leu Leu Val Glu Glu Ala Ile Ser Glu Glu Leu Pro Tyr Ser Glu Tyr Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Asp Phe Thr Leu His Pro Asp Val Ser Thr Arg Ile Glu Asn Gln Asn Ser Arg Gln Tyr Leu Asp Gln Ile Arg Gln Thr Ile Phe Glu Asn Leu Lys Met Leu Asn His Ala Pro Ser Val Gln Ile His Asp Val Pro Ala Asp Leu

24 Leu Thr Tyr Asp Arg Thr Asp Glu Ala Asp Ala Glu Glu Arg Gly Pro Glu Glu Asn Tyr Ser Arg Pro Glu Ala Pro Asn Glu Phe Tyr Asp Gly Asp His Asp Asn Asp Lys Glu Ser Asp Val Glu Ile <210> 4 <211> 1287 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atggccaaga ccgtggccta tttctacgac cccgacgtgg gcaacttcca ctacggagct 60 ggacacccta tgaagcccca tcgcctggca ttgacccata gcctggtcct gcattacggt 120 ctctataaga agatgatcgt cttcaagcca taccaggcct cccaacatga catgtgccgc 180 ttccactccg aggactacat tgacttcctg cagagagtca gccccaccaa tatgcaaggc 240 ttcaccaaga gtcttaatgc cttcaacgta ggcgatgact gcccagtgtt tcccgggctc 300 tttgagttct gctcgcgtta cacaggcgca tctctgcaag gagcaaccca gctgaacaac 360 aagatctgtg atattgccat taactgggct ggtggtctgc accatgccaa gaagtttgag 420 gcctctggct tctgctatgt caacgacatt gtgattggca tcctggagct gctcaagtac 480 caccctcggg tgctctacat tgacattgac atccaccatg gtgacggggt tcaagaagct 540 ttctacctca ctgaccgggt catgacggtg tccttccaca aatacggaaa ttacttcttc 600 cctggcacag gtgacatgta tgaagtcggg gcagagagtg gccgctacta ctgtctgaac 660 gtgcccctgc gggatggcat tgatgaccag agttacaagc accttttcca gccggttatc 720 aaccaggtag tggacttcta ccaacccacg tgcattgtgc tccagtgtgg agctgactct 780 ctgggctgtg atcgattggg ctgctttaac ctcagcatcc gagggcatgg ggaatgcgtt 840 gaatatgtca agagcttcaa tatccctcta ctcgtgctgg gtggtggtgg ttatactgtc 900 cgaaatgttg cccgctgctg gacatatgag acatcgctgc tggtagaaga ggccattagt 960 gaggagcttc cctatagtga atacttcgag tactttgccc cagacttcac acttcatcca 1020 gatgtcagca cccgcatcga gaatcagaac tcacgccagt atctggacca gatccgccag 1080 acaatctttg aaaacctgaa gatgctgaac catgcaccta gtgtccagat tcatgacgtg

25 cctgcagacc tcctgaccta tgacaggact gatgaggctg atgcagagga gaggggtcct 1200 gaggagaact atagcaggcc agaggcaccc aatgagttct atgatggaga ccatgacaat 1260 gacaaggaaa gcgatgtgga gatttaa 1287 <210> 5 <211> 1502 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Met Ala Asp Ser Asn Arg Ser Pro Arg Ser Arg Pro Lys Pro Arg Gly Pro Arg Arg Ser Lys Ser Asp Ser Asp Thr Leu Ser Val Glu Thr Ser Pro Ser Ser Val Ala Thr Arg Arg Thr Thr Arg Gln Thr Thr Ile Thr Ala His Phe Thr Lys Gly Pro Thr Lys Arg Lys Pro Lys Glu Glu Ser Glu Glu Gly Asn Ser Ala Glu Ser Ala Ala Glu Glu Arg Asp Gln Asp Lys Lys Arg Arg Val Val Asp Thr Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ala Val Glu Lys Leu Glu Glu Val Thr Ala Gly Thr Gln Leu Gly Pro Glu Glu Pro Cys Glu Gln Glu Asp Asp Asn Arg Ser Leu Arg Arg His Thr Arg Glu Leu Ser Leu Arg Arg Lys Ser Lys Glu Asp Pro Asp Arg Glu Ala Arg Pro Glu Thr His Leu Asp Glu Asp Glu Asp Gly Lys Lys Asp Lys Arg Ser Ser Arg Pro Arg Ser Gln Pro Arg Asp Pro Ala Ala Lys Arg Arg Pro Lys Glu Ala Glu Pro Glu Gln Val Ala Pro Glu Thr Pro Glu

26 Asp Arg Asp Glu Asp Glu Arg Glu Glu Lys Arg Arg Lys Thr Thr Arg Lys Lys Leu Glu Ser His Thr Val Pro Val Gln Ser Arg Ser Glu Arg Lys Ala Ala Gln Ser Lys Ser Val Ile Pro Lys Ile Asn Ser Pro Lys Cys Pro Glu Cys Gly Gln His Leu Asp Asp Pro Asn Leu Lys Tyr Gln Gln His Pro Glu Asp Ala Val Asp Glu Pro Gln Met Leu Thr Ser Glu Lys Leu Ser Ile Tyr Asp Ser Thr Ser Thr Trp Phe Asp Thr Tyr Glu Asp Ser Pro Met His Arg Phe Thr Ser Phe Ser Val Tyr Cys Ser Arg Gly His Leu Cys Pro Val Asp Thr Gly Leu Ile Glu Lys Asn Val Glu Leu Tyr Phe Ser Gly Cys Ala Lys Ala Ile His Asp Glu Asn Pro Ser Met Glu Gly Gly Ile Asn Gly Lys Asn Leu Gly Pro Ile Asn Gln Trp Trp Leu Ser Gly Phe Asp Gly Gly Glu Lys Val Leu Ile Gly Phe Ser Thr Ala Phe Ala Glu Tyr Ile Leu Met Glu Pro Ser Lys Glu Tyr Glu Pro Ile Phe Gly Leu Met Gln Glu Lys Ile Tyr Ile Ser Lys Ile Val Val Glu Phe Leu Gln Asn Asn Pro Asp Ala Val Tyr Glu Asp Leu Ile Asn Lys Ile Glu Thr Thr Val Pro Pro Ser Thr Ile Asn Val Asn Arg Phe Thr Glu Asp Ser Leu Leu Arg His Ala Gln Phe Val Val Ser Gln

27 Val Glu Ser Tyr Asp Glu Ala Lys Asp Asp Asp Glu Thr Pro Ile Phe Leu Ser Pro Cys Met Arg Ala Leu Ile His Leu Ala Gly Val Ser Leu Gly Gln Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val Met Gly Ala Thr Lys Glu Lys Asp Lys Ala Pro Thr Lys Ala Thr Thr Thr Lys Leu Val Tyr Gln Ile Phe Asp Thr Phe Phe Ser Glu Gln Ile Glu Lys Tyr Asp Lys Glu Asp Lys Glu Asn Ala Met Lys Arg Arg Arg Cys Gly Val Cys Glu Val Cys Gln Gln Pro Glu Cys Gly Lys Cys Lys Ala Cys Lys Asp Met Val Lys Phe Gly Gly Thr Gly Arg Ser Lys Gln Ala Cys Leu Lys Arg Arg Cys Pro Asn Leu Ala Val Lys Glu Ala Asp Asp Asp Glu Glu Ala Asp Asp Asp Val Ser Glu Met Pro Ser Pro Lys Lys Leu His Gln Gly Lys Lys Lys Lys Gln Asn Lys Asp Arg Ile Ser Trp Leu Gly Gln Pro Met Lys Ile Glu Glu Asn Arg Thr Tyr Tyr Gln Lys Val Ser Ile Asp Glu Glu Met Leu Glu Val Gly Asp Cys Val Ser Val Ile Pro Asp Asp Ser Ser Lys Pro Leu Tyr Leu Ala Arg Val Thr Ala Leu Trp Glu Asp Lys Asn Gly Gln Met Met Phe His Ala His Trp Phe Cys Ala Gly Thr Asp Thr Val Leu Gly Ala Thr Ser Asp Pro Leu Glu Leu Phe Leu Val Gly Glu

28 Cys Glu Asn Met Gln Leu Ser Tyr Ile His Ser Lys Val Lys Val Ile Tyr Lys Ala Pro Ser Glu Asn Trp Ala Met Glu Gly Gly Thr Asp Pro Glu Thr Thr Leu Pro Gly Ala Glu Asp Gly Lys Thr Tyr Phe Phe Gln Leu Trp Tyr Asn Gln Glu Tyr Ala Arg Phe Glu Ser Pro Pro Lys Thr Gln Pro Thr Glu Asp Asn Lys His Lys Phe Cys Leu Ser Cys Ile Arg Leu Ala Glu Leu Arg Gln Lys Glu Met Pro Lys Val Leu Glu Gln Ile Glu Glu Val Asp Gly Arg Val Tyr Cys Ser Ser Ile Thr Lys Asn Gly Val Val Tyr Arg Leu Gly Asp Ser Val Tyr Leu Pro Pro Glu Ala Phe Thr Phe Asn Ile Lys Val Ala Ser Pro Val Lys Arg Pro Lys Lys Asp Pro Val Asn Glu Thr Leu Tyr Pro Glu His Tyr Arg Lys Tyr Ser Asp Tyr Ile Lys Gly Ser Asn Leu Asp Ala Pro Glu Pro Tyr Arg Ile Gly Arg Ile Lys Glu Ile His Cys Gly Lys Lys Lys Gly Lys Val Asn Glu Ala Asp Ile Lys Leu Arg Leu Tyr Lys Phe Tyr Arg Pro Glu Asn Thr His Arg Ser Tyr Asn Gly Ser Tyr His Thr Asp Ile Asn Met Leu Tyr Trp Ser Asp Glu Glu Ala Val Val Asn Phe Ser Asp Val Gln Gly Arg Cys Thr Val Glu Tyr Gly Glu Asp Leu Leu Glu Ser Ile Gln Asp Tyr

29 Ser Gln Gly Gly Pro Asp Arg Phe Tyr Phe Leu Glu Ala Tyr Asn Ser Lys Thr Lys Asn Phe Glu Asp Pro Pro Asn His Ala Arg Ser Pro Gly Asn Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys His Gln Val Ser Glu Pro Lys Glu Pro Glu Ala Ala Ile Lys Leu Pro Lys Leu Arg Thr Leu Asp Val Phe Ser Gly Cys Gly Gly Leu Ser Glu Gly Phe His Gln Ala Gly Ile Ser Glu Thr Leu Trp Ala Ile Glu Met Trp Asp Pro Ala Ala Gln Ala Phe Arg Leu Asn Asn Pro Gly Thr Thr Val Phe Thr Glu Asp Cys Asn Val Leu Leu Lys Leu Val Met Ala Gly Glu Val Thr Asn Ser Leu Gly Gln Arg Leu Pro Gln Lys Gly Asp Val Glu Met Leu Cys Gly Gly Pro Pro Cys Gln Gly Phe Ser Gly Met Asn Arg Phe Asn Ser Arg Thr Tyr Ser Lys Phe Lys Asn Ser Leu Val Val Ser Phe Leu Ser Tyr Cys Asp Tyr Tyr Arg Pro Arg Phe Phe Leu Leu Glu Asn Val Arg Asn Phe Val Ser Tyr Arg Arg Ser Met Val Leu Lys Leu Thr Leu Arg Cys Leu Val Arg Met Gly Tyr Gln Cys Thr Phe Gly Val Leu Gln Ala Gly Gln Tyr Gly Val Ala Gln Thr Arg Arg Arg Ala Ile Ile

30 Leu Ala Ala Ala Pro Gly Glu Lys Leu Pro Leu Phe Pro Glu Pro Leu His Val Phe Ala Pro Arg Ala Cys Gln Leu Ser Val Val Val Asp Asp Lys Lys Phe Val Ser Asn Ile Thr Arg Leu Ser Ser Gly Pro Phe Arg Thr Ile Thr Val Arg Asp Thr Met Ser Asp Leu Pro Glu Ile Gln Asn Gly Ala Ser Asn Ser Glu Ile Pro Tyr Asn Gly Glu Pro Leu Ser Trp Phe Gln Arg Gln Leu Arg Gly Ser His Tyr Gln Pro Ile Leu Arg Asp His Ile Cys Lys Asp Met Ser Pro Leu Val Ala Ala Arg Met Arg His Ile Pro Leu Phe Pro Gly Ser Asp Trp Arg Asp Leu Pro Asn Ile Gln Val Arg Leu Gly Asp Gly Val Ile Ala His Lys Leu Gln Tyr Thr Phe His Asp Val Lys Asn Gly Tyr Ser Ser Thr Gly Ala Leu Arg Gly Val Cys Ser Cys Ala Glu Gly Lys Ala Cys Asp Pro Glu Ser Arg Gln Phe Ser Thr Leu Ile Pro Trp Cys Leu Pro His Thr Gly Asn Arg His Asn His Trp Ala Gly Leu Tyr Gly Arg Leu Glu Trp Asp Gly Phe Phe Ser Thr Thr Val Thr Asn Pro Glu Pro Met Gly Lys Gln Gly Arg Val Leu His Pro Glu Gln His Arg Val Val Ser Val Arg Glu Cys Ala Arg Ser Gln Gly Phe Pro Asp Ser Tyr Arg Phe Phe Gly Asn Ile Leu Asp Arg

31 His Arg Gln Val Gly Asn Ala Val Pro Pro Pro Leu Ala Lys Ala Ile Gly Leu Glu Ile Lys Leu Cys Leu Leu Ser Ser Ala Arg Glu Ser Ala Ser Ala Ala Val Lys Ala Lys Glu Glu Ala Ala Thr Lys Asp <210> 6 <211> 4509 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 atggcagact caaatagatc cccaagatcc aggcccaagc ctcggggacc caggagaagc 60 aagtcggaca gtgacaccct ttcagttgaa acttcaccta gttccgtggc tacgaggaga 120 accaccaggc agaccaccat cacggctcac ttcacgaagg gccccactaa acggaaaccc 180 aaggaagagt cggaagaggg gaactcggct gagtcggctg cagaggagag agaccaggat 240 aagaaacgca gagttgtaga cacagagagt ggtgctgcag ctgctgtgga gaaactggaa 300 gaggtaacag cgggaaccca gctgggtccg gaagagccat gtgaacagga agatgacaac 360 aggagtcttc gacgtcacac cagagagcta tcattgaggc ggaaatcaaa ggaggatcca 420 gacagagaag caagaccgga aactcacttg gacgaggacg aggacggaaa aaaggataaa 480 agaagttcca gacccaggag ccagcccaga gatccagctg ccaaacggag acccaaggaa 540 gcagagccag agcaggtagc tccagagact cccgaggaca gagacgagga tgagagggag 600 gagaagagac gaaaaacgac acgtaaaaaa ctggagtcac acaccgttcc cgttcagagc 660 agatcggaga gaaaagccgc tcaaagcaaa agtgtgatcc cgaagatcaa ctcaccaaag 720 tgccccgagt gtggccagca cctagacgac cctaacctga agtaccagca gcaccctgag 780 gatgctgtgg atgaacccca gatgttgacc agtgagaaac tgtccatcta cgactccacc 840 tcgacctggt ttgatactta tgaagattct cccatgcata ggttcacttc cttcagtgtg 900 tactgcagtc gcgggcacct gtgtcctgtc gacaccggtc tcattgagaa gaatgtagag 960 ctctactttt ctgggtgtgc caaagcaatt catgacgaga atccatctat ggaaggtggt 1020 attaatggca aaaacctcgg gccaatcaat cagtggtggc tcagtggctt tgatggtggc 1080 gagaaggtgc tcattggctt ctccactgca tttgctgaat acattttgat ggagcccagc 1140 aaagagtatg agccaatatt tgggctgatg caggagaaaa tttacatcag caagattgtt

32 gttgagttcc tgcaaaacaa tcctgatgct gtatatgaag acctgatcaa taagattgag 1260 accactgttc ctccttctac cattaatgtg aaccggttca cagaggactc cctcttacgc 1320 cacgcccagt ttgtagtgag ccaggtagag agttacgacg aagccaagga cgatgatgag 1380 acccccatct tcttgtctcc ctgtatgaga gccctgatcc atttggctgg tgtctccctg 1440 ggacagaggc gagcaacaag gcgcgtcatg ggtgctacca aggagaagga caaagcaccc 1500 acgaaagcca ccaccaccaa gctggtctat cagatctttg acactttctt ctcagagcag 1560 attgagaagt atgataagga ggacaaggag aatgccatga agcgccgccg ctgtggtgtc 1620 tgtgaggtct gtcagcagcc tgagtgtggg aagtgcaagg cgtgcaaaga tatggtgaag 1680 tttggtggca ctggacggag taagcaggct tgcctcaaga ggaggtgtcc taacttggcg 1740 gtgaaggagg cagacgacga tgaagaggct gatgatgatg tgtcagagat gccatcaccc 1800 aaaaagctgc atcaggggaa gaagaagaag cagaacaagg accgcatctc ctggcttggg 1860 cagcctatga agattgaaga gaatagaact tactatcaga aggtgagcat cgatgaggag 1920 atgctagagg tgggcgactg cgtctcggtc attccagatg attcctccaa accactctat 1980 ctagccaggg tcacagctct gtgggaagac aaaaatggtc agatgatgtt ccatgcgcac 2040 tggttctgcg ctgggacaga cacagtcctg ggagccacct ccgaccccct ggaactgttc 2100 ctggtgggcg agtgcgaaaa catgcagctt tcctacatcc acagcaaggt caaggtcatc 2160 tacaaagccc cttctgaaaa ctgggccatg gagggaggca cagaccctga gaccacactg 2220 cctggggctg aggatggcaa gacttacttc ttccagctct ggtacaacca ggagtacgca 2280 aggtttgaat ccccacccaa gacccagccg accgaggaca acaagcacaa gttctgccta 2340 tcttgtatcc ggctggctga gctgagacaa aaagaaatgc ccaaggtcct ggaacaaatt 2400 gaggaggtgg atggccgggt ctactgcagt tccatcacca agaatggtgt tgtctaccga 2460 ctgggtgaca gtgtgtacct tcctcccgag gcctttactt tcaacatcaa agtggctagc 2520 cccgtgaaac gcccaaagaa ggatcctgtg aacgagaccc tgtaccctga gcactaccgc 2580 aagtattctg actacatcaa ggggagcaac ctggatgctc cagagcccta tcgcatcggt 2640 cggataaaag agatccactg tggcaagaag aaaggcaagg tcaacgaggc agacatcaag 2700 ctgaggctct acaagttcta caggcctgag aatacccaca ggtcctacaa cggatcctat 2760 cacactgaca tcaacatgct ttactggagc gacgaggaag ctgtggtgaa cttcagcgac 2820 gtgcagggcc gctgtaccgt ggagtacggg gaagacctac ttgagagcat ccaggattat 2880 tcacaagggg gccctgaccg cttctacttc ctcgaggcct acaattcaaa gaccaagaac 2940 tttgaagacc caccaaacca tgcccgcagc cctgggaaca aagggaaagg gaaggggaaa 3000 gggaagggga aggggaagca tcaggtgtca gagcccaaag agcctgaggc agccatcaaa

33 ctgcccaagc tccggaccct ggatgtgttt tccggctgtg gagggttatc ggaaggattc 3120 caccaagcag gcatctcgga aacgctgtgg gccatcgaga tgtgggaccc ggcagcccag 3180 gcatttcggc tgaacaaccc cggcaccaca gtgttcacag aggactgcaa cgtgcttctt 3240 aagctggtca tggctgggga ggtgaccaac tctctgggcc aaaggctgcc acagaagggc 3300 gatgtggaga tgctgtgtgg tgggccaccc tgccagggct tcagtggcat gaaccgcttc 3360 aactcccgca cttactccaa gttcaaaaac tccctagtgg tctccttcct cagctactgt 3420 gactactacc ggcctcggtt cttccttctg gagaacgtca ggaacttcgt gtcctacaga 3480 cgctccatgg tgctgaagct cacactgcgc tgcctggtcc gcatgggcta ccagtgcacc 3540 tttggtgtgc tccaggctgg acagtatggc gtggcccaga cacgaaggag ggccatcatc 3600 ttggctgcag ccccaggaga aaagctgcct ctgttcccag agcctctgca tgtgtttgcg 3660 ccccgtgcct gccagctgag cgttgtggtg gatgacaaga agtttgttag caacataacg 3720 aggctgagct cggggccctt ccgaaccatc accgtgcgag acaccatgtc tgacctcccc 3780 gagatccaga atggagcctc gaattctgag atcccctaca atggagagcc actgtcctgg 3840 ttccagaggc agctgcgagg atcacactac cagcccatcc tcagggacca tatctgcaag 3900 gacatgagcc cactggtggc tgcccgcatg cggcacatcc cactgttccc aggatcagat 3960 tggcgtgacc tgcccaacat acaggtgcgg ctgggagatg gcgtcatagc ccataagcta 4020 cagtacacct ttcatgatgt gaaaaatggc tacagcagca ccggtgccct gcgtggagtc 4080 tgttcctgtg cagaaggcaa ggcctgcgac cctgagtcca ggcaattcag caccctcatc 4140 ccctggtgcc tgccgcacac tgggaaccgg cacaaccact gggctggcct ctacgggcgt 4200 ctggagtggg atggcttctt cagcaccact gtcaccaacc ctgagcccat gggcaagcag 4260 ggtcgggtgc tccacccgga gcagcaccgg gtcgtgagtg ttcgggaatg tgcccgctcc 4320 cagggctttc cagatagcta ccggttcttc ggcaacatcc tggacagaca ccggcaggtg 4380 ggtaatgctg tgccaccacc cctggccaaa gccattggcc tggagattaa gctctgcctg 4440 ctgtccagtg ctcgggagag cgcatcagct gcagttaaag caaaagagga ggctgctacc 4500 aaggactag 4509 <210> 7 <211> 1632 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Pro Ala Arg Thr Ala Pro Ala Arg Val Pro Thr Leu Ala Val Pro

34 Ala Ile Ser Leu Pro Asp Asp Val Arg Arg Arg Leu Lys Asp Leu Glu Arg Asp Ser Leu Thr Glu Lys Glu Cys Val Lys Glu Lys Leu Asn Leu Leu His Glu Phe Leu Gln Thr Glu Ile Lys Asn Gln Leu Cys Asp Leu Glu Thr Lys Leu Arg Lys Glu Glu Leu Ser Glu Glu Gly Tyr Leu Ala Lys Val Lys Ser Leu Leu Asn Lys Asp Leu Ser Leu Glu Asn Gly Ala His Ala Tyr Asn Arg Glu Val Asn Gly Arg Leu Glu Asn Gly Asn Gln Ala Arg Ser Glu Ala Arg Arg Val Gly Met Ala Asp Ala Asn Ser Pro Pro Lys Pro Leu Ser Lys Pro Arg Thr Pro Arg Arg Ser Lys Ser Asp Gly Glu Ala Lys Arg Ser Arg Asp Pro Pro Ala Ser Ala Ser Gln Val Thr Gly Ile Arg Ala Glu Pro Ser Pro Ser Pro Arg Ile Thr Arg Lys Ser Thr Arg Gln Thr Thr Ile Thr Ser His Phe Ala Lys Gly Pro Ala Lys Arg Lys Pro Gln Glu Glu Ser Glu Arg Ala Lys Ser Asp Glu Ser Ile Lys Glu Glu Asp Lys Asp Gln Asp Glu Lys Arg Arg Arg Val Thr Ser Arg Glu Arg Val Ala Arg Pro Leu Pro Ala Glu Glu Pro Glu Arg Ala Lys Ser Gly Thr Arg Thr Glu Lys Glu Glu Glu Arg Asp Glu Lys

35 Glu Glu Lys Arg Leu Arg Ser Gln Thr Lys Glu Pro Thr Pro Lys Gln Lys Leu Lys Glu Glu Pro Asp Arg Glu Ala Arg Ala Gly Val Gln Ala Asp Glu Asp Glu Asp Gly Asp Glu Lys Asp Glu Lys Lys His Arg Ser Gln Pro Lys Asp Leu Ala Ala Lys Arg Arg Pro Glu Glu Lys Glu Pro Glu Lys Val Asn Pro Gln Ile Ser Asp Glu Lys Asp Glu Asp Glu Lys Glu Glu Lys Arg Arg Lys Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Glu Lys Lys Met Ala Arg Ala Lys Thr Val Met Asn Ser Lys Thr His Pro Pro Lys Cys Ile Gln Cys Gly Gln Tyr Leu Asp Asp Pro Asp Leu Lys Tyr Gly Gln His Pro Pro Asp Ala Val Asp Glu Pro Gln Met Leu Thr Asn Glu Lys Leu Ser Ile Phe Asp Ala Asn Glu Ser Gly Phe Glu Ser Tyr Glu Ala Leu Pro Gln His Lys Leu Thr Cys Phe Ser Val Tyr Cys Lys His Gly His Leu Cys Pro Ile Asp Thr Gly Leu Ile Glu Lys Asn Ile Glu Leu Phe Phe Ser Gly Ser Ala Lys Pro Ile Tyr Asp Asp Asp Pro Ser Leu Glu Gly Gly Val Asn Gly Lys Asn Leu Gly Pro Ile Asn Glu Trp Trp Ile Thr Gly Phe Asp Gly Gly Glu Lys Ala Leu Ile Gly Phe Ser Thr Ser Phe Ala Glu Tyr Ile Leu Met Asp Pro Ser Pro Glu Tyr Ala

36 Pro Ile Phe Gly Leu Met Gln Glu Lys Ile Tyr Ile Ser Lys Ile Val Val Glu Phe Leu Gln Ser Asn Ser Asp Ser Thr Tyr Glu Asp Leu Ile Asn Lys Ile Glu Thr Thr Val Pro Pro Ser Gly Leu Asn Leu Asn Arg Phe Thr Glu Asp Ser Leu Leu Arg His Ala Gln Phe Val Val Glu Gln Val Glu Ser Tyr Asp Glu Ala Gly Asp Ser Asp Glu Gln Pro Ile Phe Leu Thr Pro Cys Met Arg Asp Leu Ile Lys Leu Ala Gly Val Thr Leu Gly Gln Arg Arg Ala Gln Ala Arg Arg Gln Thr Ile Arg His Ser Thr Arg Glu Lys Asp Arg Gly Pro Thr Lys Ala Thr Thr Thr Lys Leu Val Tyr Gln Ile Phe Asp Thr Phe Phe Ala Glu Gln Ile Glu Lys Asp Asp Arg Glu Asp Lys Glu Asn Ala Phe Lys Arg Arg Arg Cys Gly Val Cys Glu Val Cys Gln Gln Pro Glu Cys Gly Lys Cys Lys Ala Cys Lys Asp Met Val Lys Phe Gly Gly Ser Gly Arg Ser Lys Gln Ala Cys Gln Glu Arg Arg Cys Pro Asn Met Ala Met Lys Glu Ala Asp Asp Asp Glu Glu Val Asp Asp Asn Ile Pro Glu Met Pro Ser Pro Lys Lys Met His Gln Gly Lys Lys Lys Lys Gln Asn Lys Asn Arg Ile Ser Trp Val Gly Glu Ala Val Lys Thr Asp Gly Lys Lys Ser Tyr Tyr Lys Lys Val Cys Ile

37 Asp Ala Glu Thr Leu Glu Val Gly Asp Cys Val Ser Val Ile Pro Asp Asp Ser Ser Lys Pro Leu Tyr Leu Ala Arg Val Thr Ala Leu Trp Glu Asp Ser Ser Asn Gly Gln Met Phe His Ala His Trp Phe Cys Ala Gly Thr Asp Thr Val Leu Gly Ala Thr Ser Asp Pro Leu Glu Leu Phe Leu Val Asp Glu Cys Glu Asp Met Gln Leu Ser Tyr Ile His Ser Lys Val Lys Val Ile Tyr Lys Ala Pro Ser Glu Asn Trp Ala Met Glu Gly Gly Met Asp Pro Glu Ser Leu Leu Glu Gly Asp Asp Gly Lys Thr Tyr Phe Tyr Gln Leu Trp Tyr Asp Gln Asp Tyr Ala Arg Phe Glu Ser Pro Pro Lys Thr Gln Pro Thr Glu Asp Asn Lys Phe Lys Phe Cys Val Ser Cys Ala Arg Leu Ala Glu Met Arg Gln Lys Glu Ile Pro Arg Val Leu Glu Gln Leu Glu Asp Leu Asp Ser Arg Val Leu Tyr Tyr Ser Ala Thr Lys Asn Gly Ile Leu Tyr Arg Val Gly Asp Gly Val Tyr Leu Pro Pro Glu Ala Phe Thr Phe Asn Ile Lys Leu Ser Ser Pro Val Lys Arg Pro Arg Lys Glu Pro Val Asp Glu Asp Leu Tyr Pro Glu His Tyr Arg Lys Tyr Ser Asp Tyr Ile Lys Gly Ser Asn Leu Asp Ala Pro Glu Pro Tyr Arg Ile Gly Arg Ile Lys Glu Ile Phe Cys Pro Lys Lys Ser Asn Gly Arg

38 Pro Asn Glu Thr Asp Ile Lys Ile Arg Val Asn Lys Phe Tyr Arg Pro Glu Asn Thr His Lys Ser Thr Pro Ala Ser Tyr His Ala Asp Ile Asn Leu Leu Tyr Trp Ser Asp Glu Glu Ala Val Val Asp Phe Lys Ala Val Gln Gly Arg Cys Thr Val Glu Tyr Gly Glu Asp Leu Pro Glu Cys Val Gln Val Tyr Ser Met Gly Gly Pro Asn Arg Phe Tyr Phe Leu Glu Ala Tyr Asn Ala Lys Ser Lys Ser Phe Glu Asp Pro Pro Asn His Ala Arg Ser Pro Gly Asn Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Pro Lys Ser Gln Ala Cys Glu Pro Ser Glu Pro Glu Ile Glu Ile Lys Leu Pro Lys Leu Arg Thr Leu Asp Val Phe Ser Gly Cys Gly Gly Leu Ser Glu Gly Phe His Gln Ala Gly Ile Ser Asp Thr Leu Trp Ala Ile Glu Met Trp Asp Pro Ala Ala Gln Ala Phe Arg Leu Asn Asn Pro Gly Ser Thr Val Phe Thr Glu Asp Cys Asn Ile Leu Leu Lys Leu Val Met Ala Gly Glu Thr Thr Asn Ser Arg Gly Gln Arg Leu Pro Gln Lys Gly Asp Val Glu Met Leu Cys Gly Gly Pro Pro Cys Gln Gly Phe Ser Gly Met Asn Arg Phe Asn Ser Arg Thr Tyr Ser Lys Phe Lys Asn Ser Leu Val

39 Val Ser Phe Leu Ser Tyr Cys Asp Tyr Tyr Arg Pro Arg Phe Phe Leu Leu Glu Asn Val Arg Asn Phe Val Ser Phe Lys Arg Ser Met Val Leu Lys Leu Thr Leu Arg Cys Leu Val Arg Met Gly Tyr Gln Cys Thr Phe Gly Val Leu Gln Ala Gly Gln Tyr Gly Val Ala Gln Thr Arg Arg Arg Ala Ile Ile Leu Ala Ala Ala Pro Gly Glu Lys Leu Pro Leu Phe Pro Glu Pro Leu His Val Phe Ala Pro Arg Ala Cys Gln Leu Ser Val Val Val Asp Asp Lys Lys Phe Val Ser Asn Ile Thr Arg Leu Ser Ser Gly Pro Phe Arg Thr Ile Thr Val Arg Asp Thr Met Ser Asp Leu Pro Glu Val Arg Asn Gly Ala Ser Ala Leu Glu Ile Ser Tyr Asn Gly Glu Pro Gln Ser Trp Phe Gln Arg Gln Leu Arg Gly Ala Gln Tyr Gln Pro Ile Leu Arg Asp His Ile Cys Lys Asp Met Ser Ala Leu Val Ala Ala Arg Met Arg His Ile Pro Leu Ala Pro Gly Ser Asp Trp Arg Asp Leu Pro Asn Ile Glu Val Arg Leu Ser Asp Gly Thr Met Ala Arg Lys Leu Arg Tyr Thr His His Asp Arg Lys Asn Gly Arg Ser Ser Ser Gly Ala Leu Arg Gly Val Cys Ser Cys Val Glu Ala Gly Lys Ala Cys Asp Pro Ala Ala Arg Gln Phe Asn Thr Leu Ile Pro Trp Cys Leu Pro His Thr Gly