(72) 발명자이누림전라남도신안군자은면유천길 이경순충청북도청주시흥덕구진재로47번길 9, 301호 김동석 충청북도청주시흥덕구무심서로 서원대학교외식산업학과 이상화 충청북도청주시흥덕구무심서로 서원대학교 RIC 이발명을지원한국가연구개발사업 과제

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동신 뇌
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2014년10월02일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2014년09월22일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 8/97 ( ) A61Q 19/00 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2013 년 08 월 07 일 심사청구일자 (56) 선행기술조사문헌 KR A KR A KR A KR A 2013 년 08 월 07 일 (73) 특허권자 서원대학교산학협력단 충청북도청주시흥덕구무심서로 ( 모충동, 서원대학교 ) 주식회사코씨드바이오팜 충청북도청원군강내면월곡길 38, 알동 103 호 ( 충청대학교 ) (72) 발명자 박성민 충청북도청원군오창읍각리중앙하이츠빌 103 동 601 호 최수연 대전광역시대덕구동춘당로 178 보람아파트 110 동 1402 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 특허법인태동전체청구항수 : 총 2 항심사관 : 박정민 (54) 발명의명칭홍삼에서배양된버섯균사체로부터수득된홍삼배양글루칸함유배양액을포함하는화장료조성물 (57) 요약 본발명은홍삼을버섯균사체로발효시켜수득된홍삼배양글루칸함유홍삼배양여과액을유효성분으로포함하는화장료조성물에관한것으로, 붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 균사체로홍삼을발효시켜글루칸을포함하는홍삼배양여과액을수득하고, 이를유효성분으로함유하여우수한피부노화방지, 염증완화, 피부재생및피부보습효과를발휘하는화장료조성물에관한것이다. 대표도 - 도 2

2 (72) 발명자이누림전라남도신안군자은면유천길 이경순충청북도청주시흥덕구진재로47번길 9, 301호 김동석 충청북도청주시흥덕구무심서로 서원대학교외식산업학과 이상화 충청북도청주시흥덕구무심서로 서원대학교 RIC 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 B 부처명 산업통상자원부 연구관리전문기관 한국산업기술진흥원 연구사업명 지역혁신센터사업 연구과제명 버섯균사체를이용한홍삼다당체 (sapoglucan) 개발및사업화 기여율 1/1 주관기관 서원대학교산학협력단 연구기간 ~

3 특허청구의범위청구항 1 홍삼을 500~1500 MPa로 12~24시간동안초고압추출하여홍삼추출액을수득하는단계 (a); 상기단계 (a) 에서수득된홍삼추출액에붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 의균사체를접종하여배양하는단계 (b); 상기배양후, 균사체를파쇄하기위해배양액을살균하는단계 (c); 및상기살균후, 파쇄된균사체잔사를제거하기위해배양액을여과하여, 베타글루칸을함유하는여과액을수득하는단계 (d); 를포함하여제조된홍삼배양붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 유래베타글루칸을함유하는여과액을유효성분으로포함하는것을특징으로하는화장료조성물. 청구항 2 제1항에있어서, 상기화장료조성물은, 피부노화방지용또는염증완화용또는피부재생용또는피부보습용인붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 홍삼배양여과액을유효성분으로포함하는것을특징으로하는화장료조성물. 명세서 [0001] 기술분야본발명은홍삼에서배양된버섯균사체로부터수득된홍삼배양글루칸함유배양액을포함하는화장료조성물에관한것으로, 더욱구체적으로는홍삼에서배양된붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 균사체로부터수득된글루칸을함유하는피부노화방지, 염증완화, 피부재생및피부보습효과가우수한화장료조성물에관한것이다. [0002] [0003] [0004] 배경기술노화는자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가들어감에따른프리라디칼의활성화등으로부터야기될수있으며, 이런상태가심화될경우, 생체내에존재하는항산화방어망이파괴되고, 세포및조직을손상되어성인병및노화가촉진된다. 보다구체적으로피부노화현상은피부의주요구성물질인지질, 단백질, 다당류및핵산등이산화되어피부세포및조직이파괴됨으로써발생하는것이다. 특히, 단백질의산화는피부의결합조직인콜라겐, 히아루론산, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 피브로넥틴등이절단되어심한과다염증반응과피부의탄력에지장을주게되고이것이더심해질경우, DNA의변이에의해돌연변이, 암의유발, 면역기능저하의사태에이르게된다. 그러므로신체의대사과정중발생하는프리라디칼이나자외선조사, 염증반응에의해매개되는프리라디칼을소거하여세포막을보호하고, 또이미손상받은세포는활발한신진대사에의해재생화시켜서세포를증식시켜야피부는빠르게회복되고건강한피부를유지할수있다. 이에따라깨끗한피부를유지하고피부노화를지연시키는기능성화장품에소비자의관심이집중되고있으며생활수준이향상되고노령화사회가되어감에따라기능성화장품시장은급속히증가하고, 고부가가치를창출할수있는첨단미래형산업으로발전하고있다. 한편, 인삼 (Panax ginseng) 은오갈피나무과 (Araliaceae) 에속하는다년생초본류로서, 한방에서는그뿌리를인삼 (Ginseng Radix) 이라하며, 강장 ( 强壯 ), 강정 ( 强精 ), 조혈 ( 造血 ), 보온 ( 保溫 ), 건위 ( 健胃 ), 피로회복, 정신안정, 진정작용등의효능이있는것으로알려져있다. 이러한인삼의주요유효성분으로는사포닌, 사

4 포게닌, 폴리아세틸렌, 피라진유도체, 말톨등이있으며, 인삼사포닌은화학구조의특성에따라프로토파낙사디올 (protopanaxadiol) 계, 프로토파낙사트리올 (protopanaxatriol) 계및올레아노난 (oleanonane) 계사포닌으로구분하는데, 현재까지각각 19종, 10종, 1종의화합물이분리정제되었으며, 디올계와트리올계는체내에서의약리작용이서로다른것으로알려져있다. [0005] [0006] [0007] [0008] 인삼사포닌은다른식물의사포닌과달리독성이없고 0.001% 이하에서는용혈작용을나타내지않는것으로알려져있으며, 중추신경억제작용, 단백질합성촉진작용, 부신피질호르몬분비촉진작용, 면역증강작용등이있는것으로보고되고있다. 한편, 홍삼은수삼을박피를하지않은상태에서증기로찌고건조시키는증숙의과정을반복하여만든가공된인삼을말한다. 홍삼은담황갈색혹은담적갈색을띠는시각적인차이뿐만아니라건조과정이수분이증발되어단위 g당생리활성물질의함량이매우높은특징이있다. 홍삼은증숙과정에서사포닌배당체가사포닌으로전환되어사포닌의농도가증가하고, 종류도 32종으로늘어나는것으로알려져있다. 한편, 담자균류의구멍장이버섯과에속하는붉은덕다리버섯 (Leatiporus sulphureus) 은우리나라의백두산, 월출산, 지리산, 발왕산등에자생하며, 세계적으로는일본, 아시아의열대지방전역에걸쳐분포한다. 봄부터여름까지침엽수의생목, 고목, 그루터기위에중생하는 1년생심재갈색부후성버섯이다. 붉은덕다리버섯은예로부터기능조절, 건강증진, 항질병에효과가있다고전해내려왔으나정확한약리효과에대해서는전혀알려진바가없다. 붉은덕다리버섯 (Leatiporus sulphureus) 자실체에는 N-메틸레이티드티라민유도체 (N-methylated tyramine derivatives)(lee et al. 1975; List 1958; Rapior et al.), 다당류, 많은라노스테인트리터페노이드류 (lanostane triterpenoids), 레티포릭산 (laetiporic acids) 및다른다양한혼합물들이포함되어있다 (Weber et al. 2004; Davoli et al. 2005). 선행기술문헌 [0009] 특허문헌 ( 특허문헌 0001) 대한민국공개특허제 호 ( 발명의명칭 : 발효홍삼추출물을함유하는피부세포사멸방지용화장료조성물 ) 에는홍삼추출물에유산균을접종하여발효시킨후, 아스페르길루스니가및트리코더마리세이를접종, 배양하여수득된발효홍삼추출물을유효성분으로함유하는피부세포사멸방지용화장료조성물에대해개시되어있다. 발명의내용 [0010] 해결하려는과제본발명은홍삼에서붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 균사체을배양하여균사체및배양액을회수하고, 이를살균및여과하여균사체내및균사체외에존재하는글루칸을함유하는여과액을수득한후, 이를이용하여피부노화방지, 염증완화, 피부재생및피부보습효과가우수한화장료조성물을제조하여제공하고자한다. [0011] 과제의해결수단본발명은홍삼을 500~1500 MPa로 12~24시간동안초고압추출하여홍삼추출액을수득하는단계 (a); 상기단계 (a) 에서수득된홍삼추출액에붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 의균사체를접종하여배양하는단계 (b); 상기배양후, 균사체를파쇄하기위해배양액을살균하는단계 (c); 및상기살균후, 파쇄된균사체잔사를제거하기위해배양액을여과하여, 베타글루칸을함유하는여과액을수득하는단계 (d); 를포함하여제조된홍삼배양붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 유래베타글루칸을함유하는여과액을유효성분으로포함하는것을특징으로하는화장료조성물을제공한다.

5 [0012] 또한, 본발명의붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 홍삼배양여과액을유효성분으로포함하는 화장료조성물은, 피부노화방지용또는염증완화용또는피부재생용또는피부보습용인것을특징으로한 다. [0013] 이하, 본발명의붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 홍삼배양여과액을유효성분으로포함하는 화장료조성물에대해각단계별로상세히설명하고자한다. [0014] [0015] [0016] [0017] 단계 (a): 초고압추출하여홍삼추출액을수득하는단계본단계는홍삼을 500~1500 MPa로 12~24시간동안초고압추출하여홍삼추출액을수득하는단계이다. 한편, 본발명에있어서, 추출의재료가되는홍삼은그대로사용할수있으나, 자연건조또는열풍건조하여건조시킨후, 분쇄하여사용하는것이좋다. 홍삼을분쇄하여사용하면추출을용이하게할수있다는이점이있기때문이다. 한편, 초고압추출법 (Ultra high pressure extract) 은비가열처리가공방법으로기존의가열처리에의한추출물의생리활성물질의활성유지및식품의조직감및풍미저하등을극복할수있는방법이다. 압력매체로물이나오일을이용해 100~1000 MPa의압력을순간적으로균일하게전달시키는파스칼의원리에근간한기술이다. 최신추출기법의하나로화장품소재개발에있어생리활성물질을추출하는방법이다. 다만, 열처리는화학변화가심하게일어남에비해압력처리는화학적으로큰변화를일으키지않는장점이있다. [0018] [0019] [0020] [0021] 단계 (b): 상기단계 (a) 에서수득된홍삼추출액에붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 의균사체를접종하여배양하는단계본단계는상기단계 (a) 에서수득된홍삼추출액에붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 의균사체를접종하여배양하는단계이다. 홍삼추출액에서붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 균사체를배양하면, 균사체내및배양액에는균사체로부터생산된베타글루칸이존재하는데, 베타글루칸은면역기능강화, 항암활성, 피부재생및보호, 활성산소억제, 항균활성의효과를가진다고알려져있다. [0022] [0023] 단계 (c): 상기배양후, 균사체를파쇄하기위해배양액을살균하는단계본단계는상기배양후, 균사체를파쇄하기위해배양액을살균하는단계이다. 살균을통해붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 균사체를파쇄함으로써균사체내베타글루칸을밖으로빼내어수득할수있다. 본단계를거치면균사체내베타글루칸과배양액으로배출되어존재하는베타글루칸이모두배양액중으로모이게된다. [0024] [0025] [0026] 단계 (d): 상기살균후, 파쇄된균사체잔사를제거하기위해배양액을여과하여, 베타글루칸을함유하는여과액을수득하는단계본단계는상기살균후, 파쇄된균사체잔사를제거하기위해배양액을여과하여, 베타글루칸을함유하는여과액을수득하는단계이다. 살균을하면파쇄된균사체잔사가존재하는데, 본단계를거침으로써균사체잔사를제거하고, 베타글루칸이함유된여과액을수득할수있다. 여과액중에는홍삼에서배양되어생산된것으로, 균체외로배출된베타글루칸및균체내존재한베타글루칸이모두존재한다. [0027] [0028] 한편, 상기본발명의화장료조성물은화장료로이용되는일반적인제형이면모두응용이가능하며, 특별히, 크림, 로션, 에센스, 폼, 화장수, 유연수, 젤, 수용성리퀴드, 파운데이션, 메이크업베이스, 비누, 액

6 체세정료, 수중유 (O/W) 형및유중수 (W/O) 형등의제형을가지는것이좋으며, 피부화장료조성물에배합되는 일반적인성분인유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 항산화제, 비타 민, 안료및향료등을적절히배합할수있다. [0029] 발명의효과본발명에의하면, 홍삼추출액에붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 균사체를배양함으로써생산된베타글루칸함유배양여과액을유효성분으로포함하는데, 피부노화방지, 피부염증완화, 피부재생및피부보습에우수한효과를발휘한다. [0030] 도면의간단한설명 도 1 은홍삼의추출방법에따른추출수율을측정한결과이다 ( 도 1 에서 'UHP' 는본발명의초고압추출법으로 추출된홍삼추출물이고, '60 ' 는 60 의온도에서일반열수추출법으로추출된홍삼추출물이다 ). 도 2는본발명의각단계를보여주는흐름도이다. 도 3은배양시간에따른붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 의균사체생성량과세포외다당체양을측정한결과이다. 도 4는배양시간에따른붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 의균사체생성량과베타글루코시다아제활성을측정한결과이다. 도 5는 ' 초고압추출법으로추출한홍삼추출물 ' 의배양전 후, 사포닌함량을측정한결과이다 ('F-After' 는배양후, 'F-Before' 은배양전 ). 도 6은 ' 초고압추출법으로추출한홍삼추출물 ' 을배양한후, 수득한배양액중베타글루칸과산성다당체 (Acid-pg) 성분함량을분석한결과이다. 도 7은 ' 초고압추출법으로추출한홍삼추출물 ' 의배양전 후, 세포독성을평가한결과이다 ('FRed-Before' 은배양전, 'Fred-After' 은배양후 ). 도 8은 ' 초고압추출법으로추출한홍삼추출물 ' 의배양전 후, 항산화효과 (DPPH assay) 를평가한결과이다 ('FRed-Before' 은배양전, 'Fred-After' 은배양후, 'EGCG' 는에피갈로카테킨갈레이트 ). 도 9는 ' 초고압추출법으로추출한홍삼추출물 ' 의배양전 후, 항산화효과 (NBT assay) 를평가한결과이다 ('FRed-Before' 은배양전, 'Fred-After' 은배양후, 'EGCG' 는에피갈로카테킨갈레이트 ). 도 10은 ' 초고압추출법으로추출한홍삼추출물 ' 의배양전 후, 항염효과 (5-LOX 저해효과 ) 를평가한결과이다 ('FRed-Before' 은배양전, 'Fred-After' 은배양후, 'NDGA' 는노르디히드로구아이아레트산 ). 도 11은 ' 초고압추출법으로추출한홍삼추출물 ' 의배양전 후, 피부재생효과를평가한결과이다 ('FRed- Before' 은배양전, 'Fred-After' 은배양후 ). 도 12는 ' 초고압추출법으로추출한홍삼추출물 ' 을배양한후수득한배양액의피부보습효과를평가한결과이다 ('20% BG' 는 20% 1,3-부틸렌글리콜이고, 'Sapo-Glucan' 은본발명에따라배양한후여과한배양액임 ). 도 13은 ' 초고압추출법으로추출한홍삼추출물 ' 을배양한후, 수득한배양액의경피수분손실억제효과를평가한결과이다 ('FRGG' 는본발명에따라배양한후여과한배양액이고, 'Glu' 는배양전홍삼추출액이며, 'control' 은대조군임 ). [0031] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하, 본발명에대해하기실시예에서더욱상세히설명하고자한다. 다만, 본발명의권리범위가하 기실시예에만한정되는것은아니고, 그와등가의기술적사상의변형까지를포함한다.

7 [0032] [0033] [0034] [0035] [ 제조예 1: 초고압추출법을이용하여홍삼추출액제조 ] 한국인삼공사로부터제공받은 6년근홍삼미분 ( 수분함량 5% 이하 ) 을총중량대비 10.0% 의함량으로수용액화하여 1,000 MPa로 12, 24시간동안각각초고압추출하여홍삼추출액을제조하였다. 또한, 초고압추출하여제조된홍삼추출액과일반홍삼추출액의홍삼베타글루칸의함량을비교하기위하여상기의홍삼미분 ( 수분함량 5% 이하 ) 을총중량대비 10.0% 의함량으로수용액화한후, 60 에서 12, 24 시간동안열수추출하여일반홍삼추출액을제조하였다. 비교결과, 열수추출하여제조된홍삼추출액보다초고압추출하여제조된홍삼추출액에고형성분이많이포함되어있음을확인할수있었다 ( 도 1). [0036] [0037] [0038] [ 실시예 1: 본발명에따른홍삼배양붉은덕다리버섯유래베타글루칸함유여과액의제조 ] 종균배양을위해 250 ml 플라스크배양조건에 working vol. 50 ml 기준으로글루코오스 (glucose) 3%, 효모추출물 (yeast extract) 0.6%, 폴리펩톤 (polypeptone) 0.2%, MgSO4 7H2O 0.05%, K2HPO4 0.05% 로조성된감자한천사면배지 (PDA, potato dextrose agar) 를조성한후, 붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 균사체 (KFCC 11494P, 참조특허출원번호 ) 를접종하고, 25 에서 150 rpm으로 7일동안배양하였다. 이후, 4 냉장보관을하며, 2개월간격으로계대배양하면서보관하였다. 한편, 상기제조예 1에서초고압추출하여제조된홍삼추출액에효모추출물 (yeast extract) 0.3% 와폴리펩톤 (polypeptone) 0.1% 를첨가한후, 상기에서준비한붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 균사체의종균배양액을 10%(v/v) 접종한다음 25 에서 150 rpm으로 8일간배양 ( 발효 ) 하였다. 발효후, 발효액을살균하여붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 균사체를파쇄하였다. 파쇄후, 붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 균사체파쇄물을여과하여제거한후, 여과액을수득하여본발명의붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 홍삼배양여과액을최종제조하였다. 제조과정은도 2에모식화하여나타냈다. [0039] [0040] [0041] [ 실험예 1: 붉은덕다리버섯의최적배양확립 ] 본실험예에서는 20 L 바이오리액터 (bioreactor) 교반기 (stirred tank) 를이용하여붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 의배양시간의경과에따라배양액내균사체, 세포외다당체및베타-글루코시다아제활성 (β-glucosidase activity) 을측정하고자하였다. 측정결과, 배양 8일째에균사체및세포외다당체양이가장많았고 ( 도 3), 베타-글루코시다아제활성 (β-glucosidase activity) 이가장활발해짐을확인할수있었다 ( 도 4). [0042] [0043] [0044] [ 실험예 2: 사포닌정량 ] 본실험예에서는식품공정에고시한홍삼의진세노사이드 (ginsenoside) 분석법에따라분석하여상기제조예 1에서제조된홍삼추출액과상기실시예 1에서제조된홍삼배양여과액의사포닌함량을측정하였다. 측정결과, 홍삼을붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 균사체 (KFCC 11494P) 로발효시킨홍삼배양여과액의진세노사이드의함량이발효하지않은홍삼추출액보다적게측정되었다. 이로부터붉은덕다리버섯 (Laetiporus sulphureus) 균사체로홍삼을발효시킬경우, 홍삼내진세노사이드가다른물질로변하는것으로추론할수있었다 ( 도 5). [0045] [0046] [ 실험예 3: 베타글루칸함량측정 ] 본실험예에서는상기실시예 1에서제조된홍삼배양여과액중베타글루칸함량을측정하고자하였다. 실험결과, 홍삼배양여과액중, 베타글루칸 (β-glucan) 0.9%, 산성다당체 0.09% 가함유되어있는것으로나타났다 ( 도 6).

8 [0047] [0048] [ 실험예 4: 세포독성평가 ] 사람정상피부세포를 PBS 로세척한후, 트립신을이용해배양접시에서떼어내었다. 이를헤마토싸이 토미터 (hematocytometer) 를이용하여카운팅하고 96 웰플레이트 (well plate) 에 cell/well로세포를분주하고 24시간동안안정화시켰다. 그후, 상기제조예 1에서제조한홍삼추출액과실시예 1에서제조된홍삼배양여과액을농도별로 (4.0, 16.0, 62.5, 250, 1000 μg /ml) 처리한후, 약 24시간동안 37 CO 2 배양기에서배양하였다. 그후, 배지를제거하고, 각웰 (well) 당 100 μl새배지, 50 μl MTT용액 (5 mg/ml) 을넣은후, 4시간동안 37 CO 2 배양기에서배양하였다. 그후, 배지를제거하고 DMSO 100 μl씩첨가하였다. 그다음 15분동안쉐이킹 (shaking) 하여세포를용해시키고마이크로플레이트리더 (microplate reader) 로 560 nm에서 O.D 560 값을측정하여 100% 세포생존률을나타내는시료의농도를측정하였다. [0049] 실험결과, 저농도 (~62.5 μg /ml) 까지는차이가나타나지않았으나, 고농도 (250 μg /ml) 에서는홍삼배양 여과액이홍삼추출액보다세포독성을덜일으키는것으로확인할수있었다 ( 도 7). [0050] [0051] [0052] [ 실험예 4: 항산화효과평가-DPPH] 본실험예에서는상기제조예 1에서제조된홍삼추출액과실시예 1에서제조된홍삼배양여과액의농도별 (31.5, 62.5, 125, 250, 500, 1000 μg /ml) 자유라디칼소거활성 (free radical scavenging acticity) 을평가하고자하였다. DPPH 측정법은억제제 (inhibitor) 가안정한라디칼 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl radical) 를소거하여탈색되는정도를 540 nm에서흡광도를측정하는방법이다. 사용한시료는하기표 1과같이시험하였고, 하기수학식 1을이용하여자유라디칼소거활성을측정하였다. 대조군은에피갈로카테킨갈레이트 (EGCG, Epigallocatechin gallate) 로하였다. [0053] 대조군 대조군의블랭크 실험군 실험군의블랭크 DPPH 용액 180 μl MeOH 180 μl DPPH 용액 180 μl MeOH 180 μl DMSO( 용매 ) 20 μl DMSO( 용매 ) 20 μl 시료 20 μl 시료 20 μl 표 1 [0054] [ 수학식 1] [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] A: 실험군의 Abs B: 실험군블랭크의 Abs C: 대조군의 Abs D: 대조군블랭크의 Abs [0060] [0061] 실험결과, 홍삼추출액, 홍삼배양여과액및대조군모두농도의존적으로항산화효과가증가함을확 인하였고, 다만홍삼추출액보다본발명홍삼배양여과액의항산화효과가더욱우수함을확인할수있었다 ( 도 8). [0062] [0063] [ 실험예 5: 항산화효과평가 -NBT] 본실험예에서는상기제조예 1 에서제조된홍삼추출액과실시예 1 에서제조된홍삼배양여과액의농 도별 (31.5, 62.5, 125, 250, 500, 1000 μg /ml) 슈퍼옥사이드라디칼소거활성 (superoxide radical scavenging

9 activity) 을평가하고자하였다. [0064] 일반적으로피부의주름생성방지등의노화를억제하기위한원료의평가방법으로 NBT 법을이용하여 항산화활성을측정한다. 이는잔틴옥시다아제 (xanthine oxidase) 가잔틴 (xanthine) 과반응하여우릭애씨드 (uric acid) 로전환되고이때생성되는 O 2 - 를소거하는활성을평가하는것으로, 억제제 (inhibitor) 가소거하지 못한활성산소를나이트로블루테트라졸륨 (nitroblue tetrazolium) 이반응하고, 디포마잔 (diformazan) 으로전 환되므로 540 nm 에서흡광도를측정함으로써원료의항산화활성을측정할수있다. [0065] 측정하였다. 사용한시료는하기표 2 와같이시험하였고, 상기수학식 1 에준해슈퍼옥사이드라디칼소거활성을 [0066] 대조군 대조군의블랭크 실험군 실험군의블랭크 Buffer solution 85 μl Buffer solution 115 μl Buffer solution 85 μl Buffer solution 115 μl DMSO( 용매 ) 20 μl DMSO( 용매 ) 20 μl 시료 20 μl 시료 20 μl Xanthine oxidase 30 μl - 시료 20 μl - Xanthine 20 μl Xanthine 20 μl Xanthine 20 μl Xanthine 20 μl Na 2 -EDTA 15 μl Na 2 -EDTA 15 μl Na 2 -EDTA 15 μl Na 2 -EDTA 15 μl 표 2 NBT 시약 30 μl NBT 시약 30 μl NBT 시약 30 μl NBT 시약 30 μl [0067] 실험결과, 홍삼추출액, 홍삼배양여과액및대조군모두농도의존적으로항산화효과가증가됨을확 인하였다. 다만홍삼추출액보다본발명홍삼배양여과액의항산화효과가더욱우수함을확인할수있었다 ( 도 9). [0068] [0069] [0070] [0071] [ 실험예 6: 염증완화효과평가 ] 리폭시게나아제 (lipoxygenase) 는아라키돈산 (arachidonic acid) 으로부터생체내염증반응이나알레르기반응등에관여하는다양한화학적인매개체역할을하는여러물질들을생성한다. 따라서리폭시게나아제 (lipoxygenase) 를저해하는물질은각종화학적매개체 (chemical mediators) 의생성을억제하는결과를가져오게되므로알레르기에유효할것이라고추정할수있다. 리폭시게나아제 (lipoxygenase) 의활성정도는기질과효소를이용하여과산화물생성정도로측정하는실험이다. 본실험예에서는상기제조예 1에서제조된홍삼추출액과실시예 1에서제조된홍삼배양여과액의농도별 (125, 250, 500 μg /ml) 5-리폭시게나아제 (5-Lipoxygenase) 저해활성시험을하여염증완화효과를평가하고자하였다. 대조군은노르디히드로구아이아레트산 (NDGA, Nordihydroguaiaretic acid) 으로하였다. 실험결과, 홍삼추출액보다본발명홍삼배양여과액의염증완화효과가더욱우수함을확인할수있었다 ( 도 10). [0072] [0073] [0074] [0075] [ 실험예 7: 피부재생효과평가 ] 본실험예에서는상기제조예 1에서제조된홍삼추출액과실시예 1에서제조된홍삼배양여과액의농도별 (6.25, 12.5, 25.0, 50.0 μg /ml) 피부세포재생촉진및활력강화효과를평가하고자하였다. 배양한섬유아세포에식물성플라보노이드를첨가하여일정시간동안배양하여세포의증식률을측정하는법을이용하였다. 사람피부섬유아세포 (Human dermal fibroblast, HDF) 를 96 웰플레이트 (well-plate) 에 cell/well씩접종하고 24시간동안안정화시켰다. 그후, FBS가 0.5% 함유된 DMEM배지 (growth 0.5% 배지 ) 에홍삼추출액과홍삼배양여과액을농도별 (6.25, 12.5, 25.0, 50.0 μg /ml) 로처리하여 48시간동안 37 CO 2 배양 기에서배양하였다. 그후, MTT 어세이 (assay) 를이용하여세포활성을측정하였다. [0076] 실험결과, 홍삼추출액, 홍삼배양여과액및대조군모두농도의존적으로세포활성이증가됨을확인

하였다. 다만, 홍삼추출액보다본발명홍삼배양여과액의세포활성효과가더욱우수함을확인할수있었다 ( 도 11). [0077] [0078] [0079] [0080] [ 실험예 8: 피부보습효과 ] 본실험예에서는상기실시예 1에서제조된홍삼배양여과액의피부보습효과를평가하고자하였다. 팔하박부안쪽의피부에상기홍삼배양여과액을도포하고피부보습효과를평가하였다.

10 하였다. 다만, 홍삼추출액보다본발명홍삼배양여과액의세포활성효과가더욱우수함을확인할수있었다 ( 도 11). [0077] [0078] [0079] [0080] [ 실험예 8: 피부보습효과 ] 본실험예에서는상기실시예 1에서제조된홍삼배양여과액의피부보습효과를평가하고자하였다. 팔하박부안쪽의피부에상기홍삼배양여과액을도포하고피부보습효과를평가하였다. 대조군으로는화장품에서일반적으로사용되고있는부틸렌글라이콜 (20% 1,3-butylene glycol) 을사용하였다. 실험결과, 대조군보다본발명홍삼배양여과액의피부보습효과가월등히우수함을확인할수있었다. 또한, 120분이후부터대조군은아무것도도포하지않은피부와동일하게피부보습지속력을나타냈으나, 본발명의홍삼배양여과액은도포후, 180분이후에도높은피부보습효과를나타냄을확인할수있었다 ( 도 12). [0081] [0082] [0083] [ 실험예 9: 경피수분손실억제효과평가 ] 본실험예에서는상기제조예 1에서제조된홍삼추출액과실시예 1에서제조된홍삼배양여과액의경피수분손실억제효과를평가하고자하였다. 경피수분손실량 (TEWL, Transepidermal Water Loss) 은피부의장벽기능이상실되었을때, 피부내부의수분이증발되는것을의미한다. 수분증발량의평가는시간당단위면 적에서증발하는 g/m 2 /h 으로표시된다. [0084] [0085] 테이프를이용하여팔하박부안쪽의피부를스트래핑방법으로피부의각질을인위적으로제거한후, 상기홍삼추출액과홍삼배양여과액을각각도포한후, 도포 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간후에경피수분손실량측정기 (Tewameter TM 210, Courage+Khazaka, Germany) 를이용하여피부의수분증발량을측정하였다. 또한, 아무처리하지않은피부를대조군으로하였다. 실험결과, 홍삼추출액과홍삼배양여과액모두경피수분손실억제효과가있음을확인할수있었다. 다만, 홍삼추출액보다본발명홍삼배양여과액이더욱우수한경피수분손실억제효과를나타냄을확인할수있었다 ( 도 13). 도면 도면 1

11 도면 2 도면 3

12 도면 4 도면 5 도면 6

13 도면 7 도면 8

14 도면 9 도면 10

15 도면 11 도면 12

16 도면 13 등록특허

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,