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정난 진
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1 동의생리병리학회지제 22 권 6 호 Korean J. Oriental Physiology & Pathology 22(6): , 2008 疎風湯이 Glutamate 에의한 C6 Glial Cell 의 Apoptosis 에미치는영향 정승원 1 최철원 2 김봉상 1 문병순 1,2 * 1: 원광대학교한의학전문대학원제 3 의학과, 2 : 원광대학교한의과대학내과학교실 Effect of Sopungtang on GlutamateInduced Apoptosis in C6 Glial Cells Seung Won Jeong 1, Chul Won Choi 2, Bong Sang Kim 1, Byung Soon Moon 1,2 * 1:Department of Third Medicine, Professional Graduate School of Oriental Medicine, Wonkwang University, 2:Department of Internal Medicine, School of Oriental Medicine, Wonkwang University The water extract of Sopungtang(SPT) has been traditionally used for treatment of psycologic disease and brain damage in oriental medicine. However, little is known about the mechanism by which the water extract of SPT rescues cells from these disease. Therefore, this study was designed to investigate the effect of SPT on the glutamateinduced toxicity of rat C6 glial cells. SPT have protective effects in glutamateinduced toxicity, which was revealed as apoptosis characterized by chromatic condensation and fragmentation and the loss of mitochondrial membrane potential in C6 glial cells. Also, SPT have inhibited the active form of caspase3 and PARP and significantly protected the apoptotic phenomena by glutamate toxicity in C6 glial cells. However, SPT significantly recovered the depletion of GSH and inhibited the generation of ROS by glutamate in C6 glial cells. In addition, both SPT and antioxidants such as GSH and NAC protected the glutamateinduced cytotoxicity in C6 glial cells, indicating that SPT possibly have antioxidative effect. Specially, SPT were showed transcriptional factor significantly increased the activation of NFκB using the analysis of NFκB luciferase reporter system in C6 glial cells. These NFκB activation protected cells from glutamateinduced toxicity to generate the heme oxygenase1(ho1). Taken together, we suggest that SPT have protective effects in glutamateinduced toxicity via a antioxidative mechanism. Key words : glutamate, apoptosis, glial cell, Sopungtang(SPT) 서론 疎風湯은明代龔廷賢의 萬病回春 에 治風中府手足不仁先宜解表後用愈風湯調理 1) 로최초로수록된이후 濟衆新編 에 治風中府, 手足不仁先宜解表 2), 診療要鑑 에 마땅히痰을疏割시키고, 火를寫해야되는것인데, 割痰에는疎風湯을쓴다 3), 東醫寶鑑 에 中腑手足不仁 4) 등여러醫書에인용되고中風初期의中腑證에활용되어온처방으로, 治風中在腑惡風寒拘急不仁先用此解表 라하여中風初期中腑證에활 * 교신저자 : 문병순, 전북익산시신용동 3442 원광대학교익산한방병원 mbs@wonkwang.ac.kr, Tel : 접수 : 2008/08/29 수정 : 2008/10/10 채택 : 2008/10/21 용되어왔다 5). 최근에는疎風湯이혈관이완효과와혈관확장에의한혈류량증가및혈압강하효과가있으므로심혈관계의혈액순환장애를개선시키고혈전증을예방하는데사용할수있으며 6), 고지혈증으로인한동맥경화증에유효하고 7), 또한초기뇌혈전증환자의반신불수, 언어장애, 의식장애등신경학적증상의악화를방지하는효과 8), 신경세포보호작용의효과 9), 허혈성뇌손상흰쥐의운동기능회복효과 10) 등주로심혈관계질환및뇌신경계질환에효과가있는것으로밝혀지고있다. 한편중추신경세포손상은세포막의파괴, 세포의팽창, 용해를동반하는괴사와 glutamate에의한흥분독성, 이온통로를통한칼슘의세포내유입, 산소자유기에의한산화적손상, acidosis 등의다양한생체내의생화학적기전이단독또는복합적으로작용하는 apoptosis에의하는것으로보고되고있다 11). 1423

2 정승원 최철원 김봉상 문병순 특히, glutamate는중추신경계의흥분성신경전달물질로서신경세포사이에서정보를전달하는역할을담당하지만신경독소로서도작용한다. 즉신경세포가허혈성손상을받게되면신경말단에서 glutamate를포함한신경전달물질이과다하게유리되고신경아교세포에의한재흡수가감소하여 glutamate가신경연접부위에축적되어신경세포의손상을초래하게된다 12,13). 이에저자는疎風湯이중추신경세포에서 glutamate에의한세포손상에미치는방어효과를실험적으로규명하고자과량의 glutamate에의해유도된생쥐의배양신경아교세포인 C6 glial 세포의손상에서 MTT assay, 유식세포분석, 형광현미경적조사, DAPI 및 Hoechst staining, Western blotting 등의방법으로疎風湯이세포생존율, 염색사의응축과핵분절, 미토콘드리아막전위변화, caspase3 활성, GSH 함량, ROS의생성, 전사조절인자인 NFκB의활성에미치는영향을관찰하여유의한결과를얻었기에보고하는바이다. 재료및방법 1. 재료 1) 세포주 C6 glial 세포는흰쥐신경아교세포로서한국세포주은행 (KNCC, 서울대학교 ) 에서분양받아계대배양하면서실험을실시하였다. 2) 약재 실험에사용한疎風湯의처방내용은 東醫寶鑑 4) 에의거하였으며, 약재는원광대학교익산한방병원에서구입한후정선하여사용하였고, 1 貼의내용과분량은다음과같다 (Table 1). Table 1. Prescription of Sopungtang(SPT) 韓藥名生藥名重量 (g) 羌活 Radix Osterici Koreani 2.6 防風 Radix Ledebouriellae 2.6 當歸 Radix Angenlicae gigantis 2.6 川芎 Rhizoma Cnidii 2.6 赤茯苓 Poria 2.6 陳皮 Pericarpium Citri Nobilis 2.6 半夏 Tuber Pinelliae 2.6 烏藥 Radix Linderae 2.6 白芷 Radix Angelicae Dahuricae 2.6 香附子 Rhizoma Cyperi 2.6 生薑 Rhizoma Zingiberis 2.6 桂枝 Ramulus Cinnamomi 1.1 細辛 Radix Asari 1.1 甘草 Radix Glycyrrhizae 1.1 Total amount ) 시약및기기 DMEM, glucosefree DMEM, FBS, 항생제및 trypsin 등의세포배양에필요한성분은 GIBCO BRL Co.(Grand Island, NY, USA) 로부터구입하였으며, 배양용기 (24 well plate와 10 cm dish) 는 Falcon 社 (Becton Cickinson, San Jose, CA, USA) 에서구입하여사용하였다. 세포및핵염색과관찰에이용한 slide chamber는 Nunc Co.(Germany) 로부터구입하여사용하였다. MTT, Hoechst 33258, NAC, SDS, DAPI, glutamate, GSH, DMSO, HRP는 Sigma(St. Louis, Missouri, USA) 로부터구입하였고, JC1, Rhodamine, Mito tracker은 Molecular probes(oregon, USA) 로부터구입하였다. 단백질정량을위한 Bradford assay kit는 BioRad에서구입하였고, HO1, PARP, caspase3, βactin, IκBα에대한항체는 Santa Cruz 社 (Santa Cruz, CA, USA) 로부터구입하였다. 2. 방법 1) 검액조제검액은疎風湯 4 貼분량인 g을 3,000 ml 환저플라스크에증류수 1,500 ml와함께넣은다음, 120 분간가열하여얻은전탕액을여과지에여과한후 5,000 rpm으로 30 분간원심분리하고, rotary vaccum evaporator에넣어減壓농축한다음동결건조기에완전히건조하여 25 g을얻었다. 시료는 eppendorf tube에 mg/ml를 DMSO로녹여냉장보관하면서사용시에는 DMEM에희석하여사용하였다. 2) C6 glial 세포의배양흰쥐신경아교세포인 C6 glial 세포는한국세포주은행 (KNCC, 서울대학교 ) 에서분양받아 10% FBS가포함된 DMEM 세포배양액으로 5% CO 2, 95% 대기공기및 37 세포배양기에서 10 cm 세포배양판에배양하였다. 24 시간간격으로 trypsin/edta를사용하여계대배양하였으며, 배양액을교체한후 log phase에있는세포를사용하였다. 3) 세포생존율측정세포생존율은 MTT assay 14) 를이용하였다. C6 glial 세포를 24 wells 세포배양액에 cells/ml씩분주하여 24 시간배양판에부착시키고, glutamate와검액및항산화제등을전처리한후 MTT(0.5 mg/ml) 와 3 시간반응시켰다. 살아있는세포에의해 MTT로부터생성된보라색불용성 formazan은 DMSO로용해하여 540 nm 파장에서분광광도계 (THERMO max, USA) 로흡광도를측정하였다. 측정한 formazan 생성정도는정상적인세포의값과비교하여백분율 (%) 로표시하였다. 4) 핵염색 (DAPI 및 Hoechst staining) 세포핵의형태를형광현미경을이용하여관찰하였다. 먼저 4% formaldehyde 용액으로세포를고정시킨다음, PBS로 2 번세척하고, Hoechst 또는 DAPI를 10 μμ로희석하여 10 분간염색한후다시 PBS로세척하여관찰하였으며, 역상광학현미경 (Nikon Eclipse TE 300, Japan) 을이용하여 10 10의배율로사진을촬영하였다. 5) 미토콘드리아막전위및분포양상미토콘드리아막전위의변화를관찰하고자 JC1 (1 μm/ ml ) 과 Rhodamine을이용하였고, 세포질내의분포양상을관찰하고자 MitoTracker를사용하여세포를염색하였다. 검액과 glutamate를처리한세포의배양액을버린후차가운 PBS로세척하였으며, C6 glial 세포에각각의염색시약을처리하고, 세포배양기에서 10 분간반응시킨다음, PBS로 3 번세척한후역상 1424

3 疎風湯이 Glutamate 에의한 C6 Glial Cell 의 Apoptosis 에미치는영향 형광현미경으로 10 40의배율로사진을촬영하였다. 또한 Rhodamine에의한미토콘드리아막전위의정량적인분석을위해유식세포분석기를이용하여분석하였다. 6) GSH 생성측정 Glutamate가세포내항산화제인 GSH 생성에미치는영향과이에대한疎風湯의효과를알아보기위하여 C6 glial 세포에 glutamate를처리하고세포내 GSH 함량을측정하였다. C6 glial 세포를 6 cm 세포배양판에 cells/ml씩분주하여세포배양기에서 24 시간배양하여안정화시킨후검액과 glutamate를처리하였다. 세포배양액을제거한후차가운 10% TCA를 400 μl씩분주하여 10 분동안반응시켰다. TCA에의해용출된분획을모아원심분리한후상등액은 3 M NaOH를사용하여중성 ph로조정하였다. 상등액 50 μl에 250 μl의 5,5 dithionitrobenzoic acid(0.1 M phosphate buffer, ph 7.4 및 5 mm EDTA 0.96 mg/ml) 와 250 μl의 NAPDH(0.59 mg/ml) 와 450 μl의 glutathione reductase(5 U/ml) 를첨가하고, 실온에서 10~15 분동안반응시킨다음, 분광광도계를이용하여 412 nm에서 GSH 함량을측정하였다. 7) 세포내 ROS 생성측정 C6 glial 세포에서 glutamate에의한세포내 ROS 생성을검출하기위하여 C6 glial 세포를 6 cm 세포배양판에 cells/ ml씩분주한다음 24 시간안정화시킨후실험에사용하였다. 안정화된 C6 glial 세포배양판에 glutamate와疎風湯단독및혼합처리후세포의배양액을제거하고, DCFDA(10 μm/ ml ) 가첨가된새로운배지로교환하여 1 시간배양한다음, trypsin을처리하고 PBS 용액에현탁시켜유식세포분석에사용하는 tube에모아서원심분리하여세포를침전시킨후상등액을제거하고, PBS 용액에 0.2% FBS, 0.1% BSA와 0.02% Sodium azide가첨가된분석용액에현탁시켜유식세포분석기 (FACSCalibur, BD Bioscience) 를이용하여측정하였다. 이를 CellQuestTM software (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 를이용하여분석하였다. 8) 유식세포분석 (Flow cytometric analysis) 실험에사용한 C6 glial 세포는시험관에원심분리하여모은후 propidium iodide (PI) (Propidium iodide 50 μg/ml, 0.1% sodium citrate, 0.03% Nonidet P40) 용액으로 1 분간염색하여유식세포분석기 (FACSCalibur, BD Bioscience) 를이용하여형광의세기를측정하였다. 이를 CellQuestTM software (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 를이용하여분석하였고, 세포자멸사를동반한세포생존율을측정하여백분율 (%) 로나타내었다. 9) Western blotting analysis Glutamate가 caspase family cysteine protease의효소활성에미치는영향과이에대한疎風湯의효과를알아보기위하여 C6 glial 세포에 glutamate를처리하고 caspase3의활성에따른발현을 Western blotting으로확인하였다. 배양된 C6 glial 세포에시료를처리한후세포를포집한다음, 파쇄용액 (50 mm HEPES, ph 7.4, 150 mm NaCl, 1% deoxycholate, 1 mm EDTA, 1 mm PMSF, 1 μg /ml aprotinin, 2 mm Na3VO4, μμ phenylarsine oxide) 으로 4 에서파쇄하여마찬가지로 BCA 용 액에의하여동량으로정량하여 2 배의 sample buffer(5 mm EDTA, 4% SDS, 20% glycerol, 200 mm Tris, ph 6.8, 0.06% bromophenol blue) 를섞어 에서 3 분동안끓여단백질변성을유도하고, 10% SDSPAGE를시행하였다. 전기영동이끝난 gel 의단백질을 nitrocellulose membrane으로 0.8 ma/cm 2 의전기를부하시키면서이동시킨후 blocking buffer(5% skim milk) 로상온에서 1시간반응시켜비특이적인항체반응을억제시켰다. IκBα에대한항체를 TBS에 1:1,000으로희석하여 nitrocellulose membrane 과상온에서 2 시간반응시켰다. 이후이차항체인 antirabbit IgG conjugated HRP(TBS로 1:3,000으로희석, Amersham, England) 와상온에서 1 시간반응시키고, ECL kit (Amersham, England) 를사용하여 ECL film에감광시켜현상하였다. 10) 전사인자의활성측정疎風湯이 glutamate에의한 C6 glial 세포자멸사에서전사인자인 NFκB의활성에미치는영향을알아보기위하여 NFκB luciferase reporter gene system을이용하여 NFκB의활성을측정하였다. C6 glial 세포에 reporter vector인 pnfκb luciferase 를 transfection하였다. 이를위해 C6 glial 세포를 2x10 4 cells/well을배양판에하루전에배양하고 luciferase 200 ng과표준보정을위한 50 ng의 pcdna3βgal을 TfxTM50 시약 (Promega, Madison, WI) 에잘혼합하여 transfection하였다. 형질전환후 24 시간에 glutamate와疎風湯을실험조건에따라처리하였고 24 시간후에세포를 PBS로 2 번세척하고, reporter lysis 용액 μl를첨가하여충분히 lysis한후 1.5 ml eppendorf tube에옮겨원심분리한다음, 상등액을모아서 luciferase 활성을 Promega에서제공하는방법에따라분석을수행하였다. 각 sample은 triplicate로평균을취하고 β galactosidase 활성을측정하여보정하였다. 11) 통계처리표시된결과는 3회이상의독립적인실험결과로서통계처리는 Student's ttest에준하여처리하였으며, pvalue가최대치 이하의경우를유의한것으로판정하였다. 결과 1. 疎風湯이세포자멸사에미치는영향 Glutamate에의해 47.05±2% 로감소되었던세포생존율이疎風湯을농도별로전처리한경우에는점차유의성있게증가하기시작하여 200 μg / ml, 400 μg / ml의농도에서는각각 82.36±0.57%, 91.92±1.75% 를나타내어농도의존적으로세포생존율이증가되었으며, 800 μg / ml의농도에서는다시감소하는것으로나타났다. 疎風湯단독의독성을확인하기위하여농도별로 C6 glial 세포에처리한결과 800 μg / ml의농도에서유의한독성을보이는것으로나타났다. 따라서이후모든실험은 400 μg / ml의농도에서수행하였다. Glutamate 15 mm의농도에서 24 시간배양한세포군과 400 μg / ml의疎風湯 1 시간전처리군과단독처리군의형태학적변화에서핵의응축및 DNA 분절을확인한결과에의거하여세포자멸사의전형적인특성인 DNA ladder를 agarose 1425

4 정승원 최철원 김봉상 문병순 gel을이용하여확인하였다. 그러나疎風湯전처리시 DNA 분절현상이억제되어대조군과동일하게나타났다 (Fig. 1). G lu 1 5 m M S P T μg / ml Fig. 1. SPT inhibited the formation of DNA ladder in the glutamatetreated C6 glial cells. 포의변화와이에대한疎風湯의효과를알아보기위하여 JC1, MitoTracker 등으로염색하여형광현미경으로관찰하였다.Glutamate에의한미토콘드리아막전위의변화와관련하여미토콘드리아의분포를확인하기위해미토콘드리아특이적인 MitoTracker를이용하여염색하였다. 정상대조군의미토콘드리아는핵주위에고르게분포하는 (Fig. 3A, B) 반면에 15 mm의 glutamate를처리한군에서는세포의응축과함께핵주위로응축되어나타났으며 (Fig. 3C, D), 疎風湯의전처리군 (Fig. 3E, F) 및단독처리군 (Fig. 3G, H) 에서는정상대조군과유사한현상을나타내었으나핵주위에밀집하여분포하는것으로나타났다. Light Phase Fluorescence Phase A) B) 2. 疎風湯이미토콘드리아막전위에미치는영향 C6 glial cell 정상대조군에서의미토콘드리아는핵및세포질에고르게분포되어약한형광을나타내고있으나, 15 mm의 glutamate를처리한군에서는미토콘드리아가핵방향으로많이이동하였으며, 강한형광을보이는것으로나타났다. 400 μg /ml 의疎風湯을 1 시간전처리하고, 15 mm의 glutamate를처리한군과疎風湯단독처리군에서는미토콘드리아의위치가정상대조군과유사하게나타나면서정상대조군보다더욱약한형광을나타내었다. 유식세포분석기를이용하여정량적인분석을한결과 glutamate 15 mm을처리한군의미토콘드리아막전위의변화량은疎風湯전처리군과단독처리군및정상대조군과비교하여약 27% 막전위의변화억제를나타내었다 (Fig. 2). C) D) E) F) G) H) (A) (B) Fig. 3. SPT promoted the accumulation of mitochondria around the nuclear membrane. SPT(400 μg /ml)was preincubated in C6 glial cells cultures for 1 hr and followed by the addition of 15 mm glutamate for 24 hrs and stained with mitochondria specific binding dye MitoTracker. Movement of mitochondria from the cells was observed under fluorescent microscope. A, B: Control cells, C, D: Glutamatetreated cells, E, F: SPTpretreated cells with glutamate, G, H: SPT treated cells. (C) (D) Fig. 2. SPT inhibited the mitochondrial membrane potential shift by glutamateinduced toxicity in C6 glial cells. SPT(400 μg /ml) was preincubated in C6 glial cells cultures for 1 hr and followed by the addition of 15 mm glutamate for 24 hrs. A: Control cells, B: Glutamatetreated cells, C: SPT pretreated cells with glutamate, D: SPT treated cells. 3. 疎風湯이미토콘드리아의분포에미치는영향 Glutamate에의해유도된 C6 glial 세포의미토콘드리아분 4. 疎風湯이 PARP 및 caspase3 활성에미치는영향 C6 glial 세포에다양한농도의疎風湯을 1 시간전처리하고 15 mm의 glutamate를 24 시간처리하여세포생존율을측정한결과 15 mm의 glutamate를처리한군에서는대조군에비하여 procaspase3의발현이현저하게감소하였다 (Fig. 4). 또한 caspase3의세포내표적단백질인 PARP의분절을조사한결과대조군에비하여 118kDa의 PARP 단백질이분해되어발현이감소하였고, 86kDa의분절된단백질의발현은증가되었다. 그러나소풍탕전처리시소풍탕의농도에의존적으로 procaspase3 및 PARP 단백질의분해가억제되었다 (Fig. 4). 5. 疎風湯이세포내 GSH 생성에미치는영향 Glutamate에의한 C6 glial 세포독성에서세포내 GSH 함량의변화를조사하였다. 그결과 15 mm의 glutamate 처리 3시간후부터세포내 GSH 함량이감소하기시작하여처리 12시간후 1426

疎風湯이 Glutamate 에의한 C6 Glial Cell 의 Apoptosis 에미치는영향 에는대조군에비하여 55±2.6%, 18시간후에는 32±3.1%, 그리고 24시간후에는 29.51% 로나타나시간의존적으로유의한감소를보였다 (Fig. 5). 그러나소풍탕을전처리후 15 mm의 glutamate (A) 55.58 44.42 (B) 12.46 87.

5 疎風湯이 Glutamate 에의한 C6 Glial Cell 의 Apoptosis 에미치는영향 에는대조군에비하여 55±2.6%, 18시간후에는 32±3.1%, 그리고 24시간후에는 29.51% 로나타나시간의존적으로유의한감소를보였다 (Fig. 5). 그러나소풍탕을전처리후 15 mm의 glutamate (A) (B) 를 24시간처리하였을경우 μg /ml 농도의疎風湯병용처 리시 41±2.2%, 200 μg /ml 농도의疎風湯처리시에는 60±3.2%, 그리고 400 μg /ml 의疎風湯을전처리시에는 83±1.9% 로세포내 GSH 함량이회복되었다. (C) (D) Fig. 4. SPT inhibited the activation of PARP and caspase3 protease from the glutamateinduced toxicity of C6 glial cells in a dosedependent manner. Cells were seeded for 24 hrs, pretreated with a various concentration of SPT for 1 hr and followed by the addition of 15 mm glutamate. Lysate from the cells was used to the activation of PARP and caspase3 protease using Western blotting. GSH Contents (% of Control) Glu 15 mm hrs GSH Contents (% of Control) * ** ** ** ** * ** (E) Control Glu 15mM SPT400 ug + Glu 15 mm SPT400 ug Color Black Green Red Blue Fig. 6. SPT inhibited the production of ROS by glutamate toxicity in C6 glial cells. A: Control group, B: Glutamate treated group, C: SPT pretreated group, D: SPT treated group, E: Combination of total group. 7. 疎風湯이전사인자 (NFκB) 활성과 HO1의발현에미치는영향 Glutamate 처리에의한 NFκB의전사인자활성을 luciferase assay로조사하였다. 15 mm의 glutamate를처리시대조군에비해 67.47% 로활성이감소하였으나疎風湯전처리군에서는농도의존적으로 NFκB 전사인자활성이각각 140%, 182.1%, 201.8% 로증가되었다. 이때, 단독처리군에서는 % 활성을보여대조군에비하여 2.5배증가되는양상이나타났다. 그러나항산화제인 GSH와 NAC 각각처리한후 15 mm의 glutamate를처리한군에서는 glutamate에의한 C6 glial 세포의세포생존율의감소를억제하였고, NFκB 전사인자활성은대조군에비하여감소된활성을보였으나통계적유의성은없었다 (Fig. 7) Glu 15 mm SPT μg / ml Fig. 5. SPT recovered the glutamateinduced reduction of GSH contents in a dosedependent manner. * p<0.05, ** p<0.001 by Student's ttest, compared with control group or glutamate treated group. 6. 疎風湯이 glutamate에의한 ROS생성에미치는영향 400 μg /ml의疎風湯을 1 시간전처리군및단독처리군과 15 mm의 glutamate를처리한군에서생성된 ROS의양을분석한결과 15 mm의 glutamate를처리한군에서는 87.54% 로정상대조군의 44.42% 에비교하여약 2 배정도증가하였다. 반면에疎風湯전처리군및단독처리군에서는정상대조군에비하여다소감소하여각각 31.32% 와 25.82% 로나타났다 (Fig. 6). Fig. 7. SPT protected the glutamate toxicity through NFκB activation in the C6 glial cells. Cells were transfected with NFκBluciferase reporter gene vector and were followed by the addition of 15 mm glutamate in the presence of SPT and antioxidant, GSH and NAC. Luciferase activity was measured. * p< 0.05, ** p<0.01 by oneway ANOVA, compared with control group(line) or glutamate treated group (dot line). 또한疎風湯에의한전사인자의활성과항산화효과를확인 1427

6 정승원 최철원 김봉상 문병순 하기위해세포내항산화단백질인 HO1의발현을 Western blotting으로확인하였다. 疎風湯의농도 (Fig. 8A) 와시간 (Fig. 8B) 에따라세포내항산화단백질은 HO1의발현이현저하게증가되는것으로확인되었다 (Fig. 8). (A) (B ) HO1 β actin Glu 15 m M SPT mm HO1 β actin Glu 15 mm SPT 400 mm hr Fig. 8. SPT inhibited the glutamate toxicity via HO1 activation in the C6 glial cells by a dose and timedependent manner. Cells were pretreated with a various concentrations of SPT for 1 hr and were followed by the addition of 15 mm glutamate. Lysate from the cells was separated on 10% SDSPAGE. HO1 on the nitrocellulose membrane was probed by antiho1 antibody(santa Cruz Co.) and the immunoreactive band was visualized by ECL kit. 고 찰 疎風湯은明代龔廷賢의 萬病回春 1) 에최초로수록되었으며, 東醫寶鑑 에서는 治風中府, 手足不仁... 中血脈而外有六經之形證, 則從小續命湯加減及疎風湯治之 라고하여風이침범하여손발이마비되어자유롭지못한것을치료한다고하였다 4). 이처방은麝香을제거한古防風湯에二陳湯을합하고當歸, 川芎, 烏藥, 香附子, 桂枝, 細辛을가한방제로볼수있다 5). 羌活防風白芷桂枝는解表發汗散寒去風藥하는君藥이고, 當歸川芎은活血하는臣藥이다. 茯苓半夏는滲濕利水化痰하고, 陳皮는茯笭과配伍되어順氣健脾燥濕化痰하고, 烏藥香附子는行氣止痛하며, 細辛은散寒止痛하는佐藥이고, 生薑은溫中去痰하는한편半夏의독성을완화하고, 甘草는모든약이조화를이루게하는使藥이다 15). 따라서疎風湯은疎風順氣活血祛痰등의治法을가진方劑로中風初期뇌혈전증환자의반신불수 언어장애 의식장애등신경학적증상의악화를방지하는데활용되고있다 6). 허혈성손상등의병리적외부자극에의해신경조직에산소및포도당의공급이줄어들면 ATP 관련이온채널의기능손실에의한 Ca 2+ 과같은양이온의세포내유입으로신경세포탈분극이발생하며, 신경말단에서 glutamate 등을포함하는신경전달물질의유리가증가하고신경교세포에의한 glutamate 재흡수가감소하여결과적으로흥분성신경전달물질인 glutamate가신경연접부위에축적된다 16). Glutamate의과도한축적은이온성수용체인 AMPA(αamino3hydroxy5methyl4isoxazolepropionic acid) 및 NMDA(NmethylDaspartate) 수용체등의활성을유도하며, 이로인하여신경세포의고사가초래된다 17,18). 또한활성산소종에의한산화적손상이신경독성및특정유전자의작용을유도하여세포자멸사를일으키는것으로밝혀지고있다 19,20). 최근 C6 glial 세포자멸사에대한한약재의보호효과를실험적으로연구한논문으로는김 21) 의 Nitric Oxide에의해유발된 C6 glial 세포독성에대한四物湯의방어효과, 나 22) 의炙甘草湯이 LPS와 PMA에의해損傷된 C6 glial 細胞에미치는影響, 김 23) 의攝生散이 C6 glial 세포의 NO생성에미치는영향, 이 24) 의 Zinc에의한세포자멸사로부터대보중탕에의한보호효과, 이 25) 의右歸飮이 Zinc에의한신경교세포의고사에미치는영향등이보고되고있으나疎風湯이 glutamate에의한뇌세포손상에미치는방어효과에대한연구는아직보고되지않았다. 이에저자는疎風湯이중추신경세포손상에미치는방어효과를실험적으로알아보기위하여생쥐의배양신경아교세포인 C6 glial 세포에과량의 glutamate에의해유도된신경세포손상에서疎風湯이세포생존율, 염색사의응축과핵분절, 미토콘드리아막전위의변화와분포, caspase3활성, GSH 함량, ROS의생성, 전사조절인자의활성에미치는영향과疎風湯의항산화효과를관찰하였다. 먼저 C6 glial 세포에대한 glutamate의직접적인세포독성을알아본결과 glutamate는 C6 glial 세포생존율을시간과농도의존적으로감소시킨반면疎風湯은 glutamate에의해감소된 C6 glial 세포생존율을농도의존적으로증가시켰다. 또한 glutamate는 C6 glial 세포에세포자멸사의형태학적특징의하나인염색사응축현상과핵분절현상을유발시킨반면疎風湯은 glutamate에의해유발된 C6 glial 세포의염색사응축및핵분절현상을억제시켰다. 그리고 glutamate의세포독성은미토콘드리아막전위의손상을유도하고미토콘드리아의핵부분응집현상을나타내었으며, 이러한독성에대하여疎風湯은방어효과를나타내었다. 이는 glutamate는시간과농도의존적으로 C6 glial 세포에독성을나타내며, 이러한세포독성이세포자멸사에의한것이고, 疎風湯은이에대한방어효과가있음을의미한다. 세포내에서 caspase family는염증반응이나세포자멸사기전에핵심적인역할을수행하는효소로서정상적으로는세포내에불활성상태로존재하다가세포자멸사가유도되면활성화되어세포자멸사의집행자로서역할을수행한다 26,27). 따라서본연구에서 Hoechst 및 DAPI 염색으로핵의응축및분절을확인하였고, 미토콘드리아막전위의변화를확인함으로써 C6 glial 세포에서 glutamate에의한세포독성이세포자멸사에의한것임을확인하였기에 glutamate에의한세포자멸사가 caspase 활성및 PARP의활성과관련이있음을확인하기위하여 Western blotting을수행하였다. 그결과 glutamate 처리군에서는 procaspase3 활성이절단되어감소된반면疎風湯을처리한군에서는이러한현상이현저하게억제되었다. 또한핵분절및 DNA ladder형성에관여하는 PARP의활성은 glutamate 처리군에서절단되어감소된반면疎風湯처리군에서는이러한현상이억제되어疎風湯이세포자멸사기전을효율적으로억제시키고있음을확인하였다. 신경세포자멸사에있어서산화적손상이 hydrogen peroxide 같은자유라디칼 (free radical) 생성에의한 GSH 함량의감소에기인하는것으로보여지며, 이러한자유라디칼에의한산 1428

7 疎風湯이 Glutamate 에의한 C6 Glial Cell 의 Apoptosis 에미치는영향 화적손상은일반적세포노화에관련된다. 따라서 glutamate에의해유도된 C6 glial 세포자멸사에서자멸사를억제하는疎風湯의작용기전을연구하고자 glutamate에의한세포내항산화제인 GSH 함량의변화와이에대한疎風湯의효과를관찰한결과 glutamate는 C6 glial 세포내 GSH 함량를감소시켰는데이는결국 glutamate로인한세포독성이산화적손상과관련한 GSH 함량의감소에기인하고있음을의미한다. 그러나疎風湯은 glutamate에의해유발된 C6 glial 세포내 GSH 함량의감소를회복시켰는데이러한결과는 glutamate에의한산화적손상에대하여疎風湯의방어작용은세포내 GSH 함량의감소를방어하는데기인하고있음을의미한다. 또한 glutamate에의한산화적손상이 ROS생성에기인하고있음을확인하기위하여 ROS에특이적으로반응하는 DCFDA 를유식세포분석기를이용하여분석한결과 glutamate 처리군은정상대조군에비하여약 2배의 ROS가생성됨을확인하였고, 疎風湯을처리한군에서는정상대조군에서발현되는 ROS양보다낮은수준으로유지하는것으로분석되었다. 이것은또한 glutamate에의한산화적손상에대하여疎風湯의방어작용이 ROS생성억제에도기인하고있음을의미한다. 疎風湯의항산화작용을통한세포자멸사억제작용을비교하기위해대표적인항산화제로알려져있는 GSH와 NAC에의한세포생존율과疎風湯에의한세포생존율을비교관찰한결과 GSH의경우정상세포수준보다높은 120~130% 세포생존율을나타내었으며, 疎風湯으로전처리하고 15 mm의 glutamate로처리한군에서는세포생존율이정상대조군의 97% 수준에이르는것으로관찰되었다. 이를통해 glutamate로인한세포자멸사가산화적손상과관련한 GSH 함량의감소와관련되어있고이러한산화적손상과정에疎風湯이 glutamate에의한 GSH 함량의감소를억제하여항산화제의역할을함으로써산화적손상을방어하고있음을알수있다. 최근 transcription factor인 NFκB의활성화가각기다른자극에의해발생하는세포자멸사에저항성을나타내는것으로보고되고있으나 28,29), 신경세포나 glial 세포에서는세포자멸사유도에직접적으로관련이있음이보고되고있다 30). 따라서본연구에서도 glutamate의세포독성으로인한 C6 glial 세포자멸사과정이전사활성인자 NFκB와어떤관련이있는지를알아보기위하여 NFκB luciferase reporter system을이용하여 NFκB의활성을측정한결과疎風湯처리군에서는농도에따라 NFκB luciferase 활성이현저히증가된반면 glutamate 처리군에서는정상대조군의 67% 정도로 luciferase 활성이감소되었다. 이는 glutamate의세포독성으로인한 C6 glial 세포자멸사과정이전사활성인자 NFκB의활성감소와관련이있는것을의미하며, 疎風湯은 NFκB의활성을증가시킴으로써세포자멸사를억제시키는것을의미한다. HO는항산화단백질로서최소두가지의 isozyme(ho1과 HO2) 이보고되고있는데 HO2는구성형효소이고, HO1은각종스트레스원에반응하여세포내에서유도발현되는효소로이효소의반응을조사하여항산화효과를확인하는데이용할수있다. 전사인자의활성의증가와관련하여항산화단백질인 HO1 의발현을 Western blotting을이용하여분석한결과 HO1의발현이疎風湯의처리농도에따라점차증가하는현상을보였으며, 400 ug/ml의농도에서시간의존적으로증가함을보였다. 이는疎風湯이항산화효과가있음을시사하고있다. 이상의실험결과를종합하면 glutamate는시간, 농도의존적으로 C6 glial 세포에독성을나타내었으며, 疎風湯은 glutamate 에의해감소된세포생존율을농도의존적으로증가시켰다. 이러한疎風湯의신경세포자멸사에대한방어효과로서疎風湯은염색사의응축현상, 미토콘드리아막전위의손상, GSH 함량의감소, ROS의생성등을억제시키고, 전사인자활성화및세포내항산화단백질의발현을증가시킴으로써산화적손상에대한방어효과를나타내는것으로사료된다. 결론 본연구는중추신경세포에서신경전달물질인 glutamate가세포자멸사기전에미치는영향에대하여疎風湯의방어효과를규명하고자신경아교세포인 C6 glial 세포를이용하여 MTT assay, 유식세포분석, 형광현미경적조사, DAPI 및 Hoechst staining, Western blotting, 염색사의응축과핵분절, 미토콘드리아막전위변화및분포, caspase3 및 PARP의활성, 세포내 GSH 함량, ROS 의생성및전사인자의활성과세포내항산화단백질의발현에미치는영향을관찰하여다음과같은결론을얻었다. 疎風湯은 glutamate에의해감소된세포생존율을농도의존적으로증가시켰다. 疎風湯은 glutamate에의해유발된염색사의응축및핵분절을억제시켰다. 疎風湯은 glutamate에의해유발된미토콘드리아막전위손상을억제시켰으며, 미토콘드리아를세포질내에서핵주위에고르게분포시켰다. 疎風湯은 caspase3 protease 활성및 PARP의활성을억제시켰다. 疎風湯은 glutamate에의한세포내 GSH 함량의감소를억제시켰다. 疎風湯은 glutamate에의한 ROS의생성을억제시켰다. 疎風湯은 glutamate에의한전사인자인 NFκB의활성을농도의존적으로증가시켰다. 疎風湯은세포내항산화단백질로작용하는 HO1의발현을농도와시간에의존적으로현저하게증가시켰다. 이상의결과로보아疎風湯은 glutamate로유발된중추신경세포의세포자멸사에대하여활성산소종의발생을억제하고, 세포내항산화제의감소를억제하며, 세포내항산화단백질의발현을증가시킴으로써 glutamate에의해유발된산화적손상을방어하는효과를나타내었다. 따라서뇌졸중, 치매등의뇌세포의산화적손상으로인한질환에유효하게활용할수있을것으로사료된다. 참고문헌 1. 龔廷賢. 萬病回春. 서울, 杏林書院, p 49, 康命吉. 濟衆新編. 서울, 驪江出版社, p 26, 김정제. 診療要鑑. 서울, 東洋醫學硏究院, p 453,

8 정승원 최철원 김봉상 문병순 4. 東醫寶鑑國譯硏究會. 東醫寶鑑許俊著. 서울, 法仁文化社, p 951, 尹用甲. 東醫方劑와處方解說. 서울, 醫聖堂, p 624, 崔錫珍. 疎風湯이고혈압과동맥경화에미치는영향. 세명대학교대학원, 權寧哲. 疎風湯및加味疎風湯이고지혈증에미치는영향. 경희대학교대학원, 鄭章均安日會. 疎風湯이腦血栓症初期患者에미치는영향. 원광한의학, 5(1):181195, 이민구. 소풍탕이 Glutamate에의한 C6 glial cell 세포손상에서항산화효소발현에미치는영향. 원광대학교대학원, 추민규. 허혈성뇌손상흰쥐에서인지및운동기능회복에미치는소풍탕의효과. 동신대학교대학원, Cho, Y., Bannai, S. Uptake of glutamate and cystein in C6 glioma cells and in cultured astrocytes, J. Neurochem, 55: , Weiss, J., Hartley, D., Koh, J., Choi, D. AMPA receptor activation potentiates zinc neurotoxicity, Neuron, 10: 4349, Kim, Y.M., Talanian, R.V., Billiar, T.R. Nitric oxide inhibits apoptosis by preventing increase in caspase3 like activity via distinct mechanism, J. Biol. Chem. 272: , Cole, S.P. Rapid chemosensitivity testing of human lung tumor cells using the MTT assay. Cancer Chemother Pharmacol. 17: , 裵秉哲. 標準臨床方劑學, 成輔社, p 401, Choi, DW. MaulucciGedde, MA., Kriegstein, AR. Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture, J. Neurosci. 7: , Peter, L. Ischemic Cell Death in Brain Neurons, Physiol. Review, 70: 1499, Weiss, J., Hartley, D., Koh, J., Choi, D. AMPA receptor activation potentiates zinc neurotoxicity, Neuron, 10: 4349, Buttke, T., and Sandstrom, P. Oxidative stress as a mediator of apoptosis, Immunol. Today, 15: 710, Behl, C., Dabis, J.B., Killer, F.G., Schubert, D. Amyloid beta peptide induces necrosis rather than apoptosis, Brain Res. 645: , 金都煥. Nitric Oxide에의해유발된 C6 glial 細胞毒性에대한四物湯의防禦效果. 서울, 대한한방내과학회지 21(4): , 나영훈. 炙甘草湯이 LPS와 PMA에의해損傷된 C6 glial 細胞에미치는影響. 원광대학교대학원, 金堯漢. 攝生散이 C6 glial 세포의 NO 生成에미치는影響. 원광대학교대학원, 이지현. Protective effects of Daebojungtang on zincinduced apoptosis in C6 glial cells. 원광대학교한의학전문대학원, 이영구, 문병순. 右歸飮이 Zinc에의한신경교세포의고사에미치는영향. 大韓韓醫學會誌 22(3):6373, Klaus, S.O., Davide, F. Apoptosis signal by death receptors, Eur. J. Biochem. 254: , Widmann, C., Gibson, S. Caspasedependent Cleavage of signaling proteins during apoptosis, J. Biol. Chem. 273(12): , Baeuerle, P.A., and Henkel, T. Function and activation of NFκB in the immune system, Ann. Rev. Immunol. Today, 12: , Siebenlist, U., Franzo, G. and Brown, K. Structure, regulation and function of NFκB, Ann Rev. Immunol. 12: , Lemos, F.B., Ijzermans, J.N., Zondervan, P.E., Peeters, A.M., Van Den Engel, S., Mol W.M., Weimar W., Baan C.C. Differential expression of heme oxygenase1 and vascular endothelial growth factor in cadaveric and living donor kidneys after ischemiareperfusion. J. Am. Soc. Nephrol. 14(12): ,

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α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를