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초희 홍
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1 대한한방내과학회지제 35 권 3 호 (2014 년 9 월 ) J. Int. Korean Med. 2014:35(3) 우찬, 유주연, 장철용, 김효린, 신용진, 문아지, 신선호원광대학교한의과대학내과학교실 Protective Effects of Sosokmyoung-tang Against Parkinson s Model in Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Chan Woo, Ju-yeon You, Chul-yong Jang, Hyo-rin Kim, Yong-jeen Shin, A-ji Moon, Sun-ho Shin Dept. of Internal Medicine, College of Oriental Medicine, Won-Kwang University ABSTRACT Objectives: In this study we made an effort to investigate the protective effect of SSMT on the N-methyl-4-phenyl-1,2,3,6 -tetrahydropyridine (MPTP) -induced cytotoxicity of SH-SY5Y cells. Methods: The cell viability was assessed by 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MMT) assay. The fluorescence intensity was measured by using a dye and then with propidium iodide (PI) DNA flow cytometry analysis of the effects on the cell cycle of the SH-SY5Y cells and were used to measure the fluorescence of intracellular reactive oxygen species generation by MPTP. Results: Pretreatment of SSMT significantly suppressed MPTP-induced cytotoxicity, which was revealed as apoptosis characterized by the reduction of cell viability, the increase of ROS production, and the loss of mitochondrial membrane potential in SH-SY5Y cells. Conclusions: These findings suggest that SSMT exerts neuroprotective effects on human neuroblastoma SH-SY5Y cells by MPTP-induced dopaminergic neurodegeneration. Key words: SH-SY5Y cell, neuroprotective effect, Sosokmyoung-tang (SSMT) Ⅰ. 서론 파킨슨병 (Parkinson's disease, PD) 은병인학적으로중뇌흑질부위의도파민성신경세포의사멸에의해발생되는가장흔한신경계퇴행성질환의한종류이다 1-3. 파킨슨병환자에대한사후연구는극히어렵기때문에이질병에대한여러연구모 교신저자 : 신선호전북전주시덕진구덕진동 2가 번지원광대학교전주한방병원심계내과학교실 TEL: FAX: shshin@wonkwang.ac.kr 델이개발되었는데, 그중 MPTP(N-methyl-4-phenyl -1,2,3,6-tetrahydropyridine) 라는물질을이용한모델이가장많이사용되고있다 4-6. 도파민과화학구조가유사한 MPTP 는도파민운반체를통해도파민성신경세포로유입되어이의선택적인사멸을일으킴으로써파킨슨병을유발시킨다. 小續命湯은唐代孫思邈의 千金要方 7 에 治卒中風, 人事不省, 喎斜, 癱瘓, 瘖瘂, 痲木, 眩暈 이라고최초로수록된이후여러醫書에인용된처방으로초기중풍의無汗表實證및一切風症을치료하는데활용되어왔다

2 우 찬 유주연 장철용 김효린 신용진 문아지 신선호 최근에는小續命湯이뇌출혈로인한부종을감소시키고뇌출혈주변부위에서염증반응을억제하여초기중풍환자에효과가있는것으로보고되는등뇌신경세포손상에효과가있는것으로알려져있다 이에주로허혈및염증으로인한뇌신경세포손상에효과가있다고보고되고있는小續命湯이도파민성뇌신경세포의손상에도효과가있을것으로생각되어본연구를시행하였다. 파킨슨병모델인 MPTP 에의해유도된 SH-SY5Y 세포주에서小續命湯을전처리한후세포생존율, 활성산소종생성, GSK3 활성화, 항산화효과, 세포내에너지원에미치는영향등을관찰하여유의한결과를얻었기에보고하는바이다. Ⅱ. 재료및방법 1. 재료 1) 약재본실험에사용된小續命湯의처방내용은 東醫寶鑑 8 에수록된약재의구성과용량을기준으로하였다. 약재는원광대학교전주한방병원에서구입하여정선한후사용하였으며, 4 貼의내용과분량은다음과같다 (Table 1). Table 1. Prescription of Sosokmyoung-tang Herbal Dosage name Scientific name (g) 防風 Ledebouriella seseloides 24 防己 Sinomenium acutum 16 肉桂 Cinnamomum loureirii 16 杏仁 Prunus sibirica L. 16 黃芩 Scutellaria baicalensis 16 白芍藥 Paeonia japonica 16 人蔘 Panax ginseng C.A.Meyer 16 川芎 Cnidium officinale Makino 16 麻黃 Ephedra sinica 16 甘草 Glycyrrhiza uralensis 16 附子 Aconitum carmichaeli Debeaux 8 生薑 Zingiber officinale 16 大棗 Zizyphus jujuba var. inermis 16 Total amount 208 2) 시약및기기 RPMI 1640, FBS(fetal bovine serum), 항생제및 trypsin 등의세포배양에필요한성분은 GIBCO BRL Co.(Grand Island, NY, USA) 로부터구입하였으며, 배양용기 (24 well plate 와 10 cm dish) 는 Falcon Co.(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 에서구입하여사용하였다. 세포및핵염색과관찰에이용한 slide chamber 는 Thermo scientific Nunclon Surface (Thermo scientific Nunc. Rochester, NY, USA) 로부터구입하여사용하였다. MTT(methylthizol-2-yl- 2,5-diphenyl, tetrazoliumbromide), MPTP(N-methyl- 4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine), SDS(sodium dodesyl sulfate), DMSO(dimethyl sulfoxide), PI (propidium iodide) 및 Ponceus S solution 은 Sigma Co.(St. Louis, USA) 로부터구입하였고, DCF-DA, DHE, Fluo-3 AM 및 JC-1은 Molecular probes (Invitrogen, Eugene, OR, USA) 로부터구입하였다. Nitrocellulose paper(hybond-c, RPN303C) 는 Amersham Biosciences Co.(Amersham, UK) 에서구입하였다. 실험에사용된일차항체중 β-actin, Caspase-3, Catalase, Cox 2, GSK3β, inos, Nrf2, PARP, PGC-1α, PMP70 은 Santa Cruz Co.(Santa Cruz, CA, USA) 에서구입하였고, β-catenin, phospho-β-catenin, phospho-gsk3 α/β(s-21/s-9), phospho-p53(s-15) 은 Cell Signaling (Cell Signaling Technology Inc, Beverly, MA, USA) 에서구입하였다. 2차항체는각각 Goat-IgG(Dako, P0449, Japan), Mouse-IgG(Bethyl, A90-116P, Montgomery, TX, USA) 및 Rabbit-IgG(Bethyl, A P, Montgomery, TX, USA) 에서구입하여사용하였다. 3) 세포주실험에사용한사람신경모세포종 SH-SY5Y 세포주는 ATCC(American Type Cell Culture, VA, USA) 에서구입하였고, 세포배양에필요한 10% FBS와 RPMI 1640 배지는 Gibco Co.(Gibco, NY, USA) 에서구입하여사용하였다. 299

3 2. 방법 1) 시료제조검액은小續命湯 4 貼분량인 208 g을 3,000 ml 환저플라스크에증류수 2,000 ml와함께넣은다음, 150분간가열하여얻은전탕액을여과지에여과한후 5,000 rpm으로 30분간원심분리하고감압농축기 (rotary vaccum evaporator) 에넣어감압농축한후동결건조기로완전히건조하여 g을얻었다. 시료는 15 ml 튜브에 100 mg/ml를 PBS용액에용해하여 2500 rpm으로 20분간원심분리후 25 μm filter로필터링하고 1.5 ml eppendorf tube에분주하여냉동보관하고사용시 RPMP 1640 배지와혼합하여사용하였다. 2) 세포배양사람신경모세포종 SH-SY5Y 세포는 ATCC (American Type Cell Culture, VA, USA) 에서구입하여 10% FBS가포함된 RPMI 1640 세포배양액으로세포배양기 (5% CO2 및 37 ) 에서 10 cm 세포배양판에배양하였다. 일주일에 2번간격으로 0.05% trypsin-edta를사용하여계대배양하였으며, 배양액을교체한후 log phase 에있는세포를사용하였다. 3) 세포생존율측정세포생존율은 MTT assay(mosmann. 1983) 를이용하였다. SH-SY5Y 세포를 24-wells 세포배양액에 cells/ml 씩분주하여 24시간배양판에부착시키고, MPTP 와小續命湯을농도및시간별로처리하고 MTT(0.25 mg/ml) 를첨가하고 37 에서 4시간반응시켰다. 상등액을주의깊게제거하고살아있는세포에의해생성된보라색불용성 formazan은 DMSO 로용해하여 570 nm 파장에서분광광도계 (THERMO max, USA) 로흡광도를측정하였다. 측정한 formazan 생성정도는정상적인세포의값과비교하여백분율 (%) 로표시하였다. 4) 세포주기분석 (Cell Cycle Analysis) MPTP 가 SH-SY5Y 세포의세포주기에미치는영향에대한분석은 propidium iodide(pi) 로 DNA 를염색한후 flow cytometry(facs Calibur, BD Biosciences, USA) 를이용하여형광의세기를측정하였다. SH-SY5Y 세포에 MPTP 와小續命湯을처리한다음, 24시간후에 trypsin-edta(0.05%/ml) 로처리하고 RPMI 1640 배지로교환한다음, 포집하여원심분리하고 PBS로 2번세척하였다. 세척된세포에 PBS 300 μl를넣고 PI용액 (0.1% Triton X-100, PI 20 μg/ml, RNase 200 μg/ml) 500 μl를첨가하고 20분간반응시킨후 세포를 flow cytometry를이용하여세포주기를분석하였다. 얻어진정보의분석은 Cell Quest Software(Becton Dickinson Biosciences, USA) 를이용하여분석하였다. 5) 세포내 ROS(Reactive Oxygen Species) 측정 MPTP 에의한세포내활성산소종의생성을측정하기위하여형광 probe 2',7'-dichlorofluorescein diacetate(dcf-da: Molecular probe) 와 dihydroethidium (DHE: Molecular probe) 을이용하였다. 비형광물질인 DCF-DA 는세포내 hydroxyl radical 및과산화수소등과반응하여형광을발하는 DCF로변환되어녹색의형광을나타낸다. 세포내활성산소종의양을측정하기위하여 SH-SY5Y 세포를배양하고 MPTP 와小續命湯을처리하고 24시간후세포를수확하기전에 5 μm DCF-DA를처리하고 37 에서 30분간배양후 PBS(pH 7.4) 로세척하고 0.05% trypsin-edta 용액으로처리하여세포를수확하고원심분리후 PBS 로세척하여 flow cytometry (FACS Calibur, BD Biosciences, USA) 를이용하여형광의세기를 Cell Quest Software(Becton Dickinson Biosciences, USA) 를이용하여정보를분석하였다. DHE 는세포내 superoxide anion에의해서 ethidium 으로전환되고세포내 DNA 에삽입되어형광 (488 nm exitation/ 510 nm emission) 을나타낸다 (Bindokas et al. 1996). 세포내순수한 superoxide anion을측정하기위하여 DHE를배양된 SH-SY5Y에 MPTP 와小續命湯을처리하고 24시간후배지를제거하고 PBS(pH 7.4) 용액으로세척한다음, DHE용액을 1 μg/ml 농도로처리하여세포배양기에서

4 우 찬 유주연 장철용 김효린 신용진 문아지 신선호 분간배양하였고 PBS로세척후형광현미경에서검경하였다. 6) 미토콘드리아막전위측정미토콘드리아의막전위변화를조사하기위하여 JC-1(10 μg/ml) 염색을수행하였다. 세포는차가운 PBS 로 2회세척하고 RMPI-1640 배지에희석한 JC-1 (10 μg/ml) 을처리하고 20분간세포배양기에서반응시킨후 PBS로세척하였다. Flow cytometry (FACS Calibur, BD Biosciences, USA) 를이용하여형광의세기를측정하였으며, Cell Quest Software (Becton Dickinson Biosciences, USA) 를이용하여정보를분석하였다. 7) 세포내유리칼슘농도측정 SH-SY5Y 세포를 6 cm 세포배양판에 cells/ml 씩분주한다음, 24시간안정화시킨후실험에사용하였다. MPTP 와小續命湯을처리하고 24시간배양한후세포내칼슘이온의축적을측정하기위하여형광 probe Fluo-3 AM(Molecular Probes, Eugene, OS) 을이용하였다. 처리된세포에 5 μm Fluo-3 AM을처리하고세포배양기에서 30분간배양후 PBS로세척하고 4% paraformaldehide 로상온에서 15분간고정하였다. 고정된세포에서세포내칼슘농도를 Flow cytometry(facs Calibur, BD Biosciences, USA) 를이용하여형광의세기를측정하였으며, Cell Quest Software(Becton Dickinson Biosciences, USA) 를이용하여정보를분석하였다. 8) 통계처리표시된결과는 3회이상의독립적인실험결과로서통계처리는 Student's t-test에준하여처리하였으며, p-value 가최대치 0.05 미만인경우를유의한것으로판정하였다. Ⅲ. 결과 1. MPTP 와小續命湯에의한 SH-SY5Y 세포생존율의변화파킨슨병을유발하는 MPTP 가 SH-SY5Y 세포 에미치는독성을알아보기위하여다양한농도의 MPTP를 24시간처리하여 MTT assay로세포생존율을측정하였다. MPTP 농도가증가할수록농도의존적으로유의하게 (p<0.05) 세포생존율이감소되었다. 특히 2.5 mm 이상의고농도에서는 41.9% 이하의세포생존율을보였다 (Fig. 1A). 마찬가지로小續命湯이단독으로투여되었을경우 SH-SY5Y 세포생존율에미치는영향을알아보고자같은방법으로세포생존율을측정하였다. 300 μg/ml 까지는 92.7% 이상의생존율을보였으나그이상의고농도에서는세포생존율이감소하였다 (Fig. 1B). Fig. 1. MPTP and SSMT-treatment increases cytotoxicity of SH-SY5Y cells in dose-dependent manner. Cells were treated with various concentrations of MPTP and SSMT for 24 hr. Cell viability was measured by MTT assay. Results represented as the mean (%)±S.D. of three independent expriments. * p<0.05 by student's t-test, compared to control group. 2. 小續命湯이세포생존율에미치는영향 MPTP 에의해유도된 SH-SY5Y 세포사멸에서 301

세포생존율에미치는小續命湯의효과를알아보기위해 SH-SY5Y 세포에다양한농도의小續命湯을 4시간전처리하고 2 mm 농도의 MPTP 를 24시간처리하여세포생존율을측정하였다. MPTP 에의해 71.6% 이하로감소되었던세포생존율이小續命湯을농도별로전처리한경우에 200 μg/ml의농도에서는약 92.8% 에가까운생존율을나타내었으나 300 μg/ml(86.

MPTP 처리후 24시간에 64.8%, 48시간에 39.9% 의세포생존율을나타내어향후 SH-SY5Y 세포에서 MPTP처리후 24시간을최적의조건으로선택하여이후의실험을진행하였다 (Fig. 2B). with concentration of SSMT in Human neuroblastoma SH-SY5Y cells.

5 세포생존율에미치는小續命湯의효과를알아보기위해 SH-SY5Y 세포에다양한농도의小續命湯을 4시간전처리하고 2 mm 농도의 MPTP 를 24시간처리하여세포생존율을측정하였다. MPTP 에의해 71.6% 이하로감소되었던세포생존율이小續命湯을농도별로전처리한경우에 200 μg/ml의농도에서는약 92.8% 에가까운생존율을나타내었으나 300 μg/ml(86.4%) 이상의농도에서는세포생존율이감소되어 500 μg/ml에서는 60.7% 로나타났다. 따라서본연구의최적조건으로小續命湯 150 μg/ml 을선택하여이후의실험을진행하였다 (Fig. 2A). 또한시간에따른세포생존율변화를알아보기위해 MPTP 를 24시간과 48시간으로나누어처리한후세포생존율을분석하였다. 그결과시간의존적으로세포생존율이감소하는것으로나타났다. MPTP 처리후 24시간에 64.8%, 48시간에 39.9% 의세포생존율을나타내어향후 SH-SY5Y 세포에서 MPTP처리후 24시간을최적의조건으로선택하여이후의실험을진행하였다 (Fig. 2B). with concentration of SSMT in Human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Low dose of SSMT protects MPTP-induced cytotoxicity of SH-SY5Y cells but not highconcentration treatment. Cells were treated with various concentrations of SSMT for 24 hr. Cell viability was measured by MTT assay. Results represented as the mean (%)±S.D. of three independent expriments. * p<0.05 by student's t-test, compared to control group and # p<0.05 by student's t-test, compared to MPTP-treated group. 3. 小續命湯이 MPTP 에의한세포주기에미치는영향파킨슨병을유발하는것으로알려진 MPTP에의한세포주기의변화를확인하고자 PI염색법을이용하여핵을염색하고 FACS 분석을통하여세포주기를분석하였다. 그결과 SH-SY5Y 세포에서 MPTP에의해 G1 arrest 가진행되는것으로나타났으며, 小續命湯을전처리한결과, G1 arrest 가다소감소하는것으로나타났다 (Fig. 3). Fig. 3. SSMT protects MPTP-induced G1 arrest in Human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Fig. 2. Action of different effects in accordance Cells were treated with 2mM MPTP and 150 μg/ml SSMT for 24 hr. Then, cells were stained with PI staining solution and analyzed by flow cytometry. 302

6 우 찬 유주연 장철용 김효린 신용진 문아지 신선호 4. 小續命湯이 MPTP 에의한 ROS 생성에미치는영향파킨슨병을유도한모델에이용되는 MPTP 는세포내 oxidative stress 를유발하는것으로알려져있다. oxidative stress 에대한小續命湯의보호효과를확인하기위하여 hydrogen peroxide 및 hydroxyl radical 계열을검출하는데이용되는 DCF-DA 를통해염색하고 FACS 장비를이용하여분석하였다. 그결과, MPTP 에의해증가된 ROS가小續命湯을전처리함으로써 72.65% 에서 54.72% 로현저히감소하는것으로나타났다 (Fig. 4). 또한세포내또다른 ROS인 superoxide anion (O2-) 에특이적으로반응하는 DHE를이용하여 MPTP 처리군과小續命湯전처리군에서세포내 superoxide anion을형광현미경을이용하여확인하였다. 그결과, superoxide anion이 MPTP 를처리한세포에서현저히증가된반면, 小續命湯을전처리한경우에감소하는것으로나타났다 (Fig. 5). MPTP는미토콘드리아에작용하여다량의 ROS 를생성하는것으로알려져있다. 따라서본연구에서는 MPTP를처리한경우와小續命湯을전처리한경우에서미토콘드리아의막전위변화에특이적인 JC-1 을이용하여미토콘드리아의막전위변화를 FACS 분석으로측정하였다. 그결과, 小續命湯전처리군에서의막전위변화가 MPTP 를처리한경우보다다소감소하는것으로측정되었다 (Fig. 6). 세포내 oxidative stress는 calcium reservoir로잘알려진세포내소기관인미토콘드리아및소포체 (endoplasmic reticulum) 로부터칼슘을방출한다. 이를확인하기위하여 Flu-3 AM을이용하여 intracellular free calcium을측정하였다. 형광현미경을이용하여검측한결과, MPTP 에의해세포내소기관으로부터칼슘방출이증가하였으나小續命湯전처리를한경우에는감소하는것으로나타났다 (Fig. 7). Fig. 4. SSMT suppresses MPTP-induced reactive oxygen species production in Human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Cells were treated with 2mM MPTP and 150 μg/ml SSMT for 24hr. After harvesting, cells were stained with DCF-DA staining solution for detection of various hydroxyl radicals and hydrogen peroxide and subjected on flow cytometric analysis to estimate intracellular specific reactive oxygen species. Fig. 5. SSMT reduces production of superoxide anion with MPTP treatment in Human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Cells were treated with 2 mm MPTP and 150 μg/ml SSMT for 24 hr. Cells were stained with DHE dye and estimated to the productive levels of intracellular specific superoxide anion under the fluorescence microscope. 303

7 Ⅳ. 고찰 Fig. 6. SSMT reduces MPTP-induced mitochondrial membrane potential shift (mψ) in Human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Cells were treated with 2 mm MPTP and 150 μg/ml SSMT for 24 hr. After harvesting, cells were stained with JC-1 staining solution and subjected on flow cytometric analysis to estimate the mitochondrial membrane potential shift (mψ). Fig. 7. SSMT reduces release of intracellular calcium with MPTP treatment in Human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Cells were treated with 2 mm MPTP and 150 μg/ml SSMT for 24 hr. Cells were stained with Flu-3 AM dye and analyzed to the productive levels of intracellular free calcium under the fluorescence microscope. 小續命湯은孫思邈이저술한 千金要方, 千金翼方 에기록되어있으며, 그후 醫學入門 등에수록되어사용된처방으로中風의人事不省, 神氣混亂, 半身不隨, 筋急拘攣, 口眼喎斜등의症을치료한다고알려져있다 7,9. 小續命湯은防風, 防己, 肉桂, 杏仁, 黃芩, 白芍藥, 人蔘, 川芎, 麻黃, 甘草, 附子, 生薑, 大棗로구성되어있다. 본방의麻黃, 防風, 防己, 杏仁, 甘草, 生薑등의약재는祛風通絡시킴으로써腠理를開하여治風한다. 邪氣가인체에침입하면正氣가반드시虛해지므로人蔘과附子, 肉桂등을이용하여益氣助陽시키며, 川芎과芍藥으로氣血을조화시키고正氣를회복시켜邪氣를祛하게한다. 또한風邪가外表로凝滯하고裏氣가不宣하면열을生하게하므로黃芩의苦寒한性을취하여表熱을祛하는佐藥으로하였다. 이와같이本方은辛溫發散하여發汗시킴으로써邪氣를밖으로배출시켜營衛를조화시키고, 氣血을통하게하며表氣를통하게하여裏氣역시조화롭게하는扶正祛邪의효과가있어 行血卽風自滅 하는원리를갖는처방으로卒中風초기와一切風症에사용된다고하였다 7,10. 靈樞海論篇 11 에 髓海有餘則輕勁多力自過其度髓海不足則腦轉耳嗚脛痠眩冒目無所見懶怠安臥 " 라고하여腦髓의충족여부가정신및신체활동의성쇠와관련되어있음을기술하고있으며, 腦髓의기능이실조되거나감퇴되면失眠, 知能低下, 癡呆, 頭痛, 眩暈, 耳鳴등의임상증상이나타난다고하였고 12,13, 그원인으로는心脾兩虛, 肝腎虛弱, 稟受不足, 痰瘀등이제시되고있다 14. 일반적으로세포가외부자극에의해심각한손상을입었을경우에는세포막의파괴, 세포의팽창, 용해를동반하는괴사를일으키지만파킨슨병, 허혈성뇌졸중등과같은뇌신경계질환에있어서는생체내의다양한생화학적기전들이작용하여신경세포와신경교세포의고사를초래하게되는것 304

8 우 찬 유주연 장철용 김효린 신용진 문아지 신선호 으로알려져있다 이러한대사성또는허혈성뇌질환에서신경세포손상에기여하는물질은여러가지가있으나그중대표적인것은아미노산계의흥분성신경전달물질인 MPTP 이다 20,21. 허혈성손상등의병리적외부자극에의해신경조직에산소및포도당의공급이줄어들면 ATP 관련이온채널의기능손실에의한 Ca 2+ 과같은양이온의세포내유입으로신경세포탈분극이발생하며, 신경말단에서 MPTP 등을포함하는신경전달물질의유리가증가하고신경교세포에의한 MPTP 재흡수가감소하여결과적으로흥분성신경전달물질인 MPTP 가신경연접부위에축적된다. MPTP 의과도한축적은이온성수용체인 AMPA(α-amino- 3-hydroxy-5-methyl-4-iso-xazolepropionic acid) 및 NMDA(N-methyl-D- aspartate) 수용체등의활성을유도하며, 이로인하여신경세포의고사가초래된다 22,23. 또한활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 에의한산화적손상이신경독성및특정유전자의작용을유도하여세포고사를일으키는것으로밝혀지고있다 세포고사 (apotosis) 는다세포생명체에서정상적인기관의발달과조직의항상성유지에필수적인생리현상의하나인계획된죽음 (programmed cell death) 을말하는것으로, 괴사 (necrosis) 와는다른독특한형태와생화학적인특징을동반하는생리 병리과정이다 이러한세포고사가과소하게발현되는경우에는암, 자가면역질환등이발생하고, 과다하게발현되면후천성면역결핍증, 중추신경계의퇴행성질환이발생하게된다 최근이러한고사의기전들이점차밝혀지고있으며중추신경계세포고사에서 MPTP 에의한흥분독성과산화성손상이중요한기전으로연구되고있다 근래생약을이용한신경세포보호효과에대하여보고된연구들이있다. 천연폴리페놀플라보노이드및인삼추출물을처리한신경세포에서의보호효과에대한연구와마우스의 striatal neuron 에 oxidized low density lipoprotein(oxldl) 에의한 세포독성을 epicatechin 을처리하여억제효과를보여준연구가있다 31. 최근까지이러한여러연구의결과항산화물질및천연폴리페놀추출물이파킨슨병모델을유발하는 MPTP 에의한세포독성을효율적으로억제또는보호한다는것이보고되었다. 이에본연구에서는아직 MPTP 에의한보호효과가보고되지않았으나허혈성뇌손상에주로사용되는小續命湯이마찬가지로 MPTP 에의한세포독성을억제할것이라판단하여실험을진행하였다. 본실험에서는 MPTP 로유도된인간신경모세포종인 SH-SY5Y 세포주에서小續命湯추출물에의한세포보호효과및기전을규명하고자하였으며, 이를유도하기위해 N-methyl-4-phenyl-1,2,3,6 -tetrahydropyridine(mptp) 를사용하였다. MPTP 가 SH-SY5Y 세포에미치는독성을확인하기위하여농도별 (0.5~2.5 mm) 로 MPTP 를 SH-SY5Y 세포에 24시간처리하여 MTT 방법으로세포생존율을조사하였다. 그결과, MPTP 에의해농도의존적으로유의하게세포생존율이감소하는것을확인할수있었으며, 특히 2.5 mm에서는 41.9% 이하의세포생존율을보였다 (Fig. 1A). 또한 MPTP 가처리된 SH-SY5Y 세포주에서小續命湯추출물에의한세포보호효과를조사하기위하여小續命湯을농도별 (50~500 μg/ml) 로처리한후세포생존율을조사한결과, 小續命湯 200 μg/ml 농도에서 92.8% 에가까운세포생존율을나타내었으며, 오히려 300 μg/ml 이상의농도에서는세포생존율이감소함을볼수있었다 (Fig. 2A). 이를토대로이후의실험에서는 150 μg/ml 농도의小續命湯을처리한연구를진행하였다. 세포주기는세포의생존과분열에있어서중요한개념이다. 체세포가분열을거듭함에따라세포주기를정지시킬수있는염색체의텔로미어가특정길이이하로짧아지면분열능을상실하고 G1 phase 에멈추게된다 (G1 arrest). 이러한기전은 DNA가손상되었을때 p53에의해매개되는세포주기정지 305

9 와비슷하다. 이상태를 mortality phase 1(M1) 이라고하며, 이시기의세포는불가역적인세포노화상태에빠지게된다. 이러한세포주기의변화를관찰하기위해핵을염색하고관찰한결과, MPTP 에의해 M1 시기가 70.59% 로증가된 SH-SY5Y 세포주의세포주기가小續命湯에의해 68.89% 로다소감소됨을확인할수있었다 (Fig. 3). 정상적인세포들은호흡과정동안다양한활성산소종 (O2-, H2O2, OH- 등 ) 을내지만이는세포자체가갖고있는항산화시스템 (GSH, SOD, catalase 등 ) 에의해조절된다. 그러나다양한자극에의해과량의활성산소종이발현되었을경우에는활성산소종이세포자체에해로운신호전달의시발점이되어결국세포사멸로이어지게되고, 분자생물학적변화와세포손상을일으킨다. 과량의활성산소종은세포막의인지질을자극하여지질과산화 (lipid peroxidation) 반응을유도하여세포막을파괴하는한편, DNA 손상을유도한다. 이것을 oxidative stress 라고하는데이에대한小續命湯의보호효과를확인하기위해활성산소종의하나인 hydrogen peroxide 및 hydroxyl radical 계열을검출하는데이용되는 DCF-DA 염색법을통해 MPTP 및小續命湯처리에의한 SH-SY5Y 세포를분석하였다. 그결과, 小續命湯을처리함으로써활성산소종비율이 MPTP 군에서측정된 72.65% 에서 54.72% 로현저히감소됨을확인할수있었다 (Fig. 4). 또한세포내또다른활성산소종인 superoxide anion(o 2- ) 에특이적으로반응하는 DHE 를이용한관찰에서는 MPTP 에의해증가된 superoxide anion 이小續命湯전처리에의해감소되었음을알수있었다 (Fig. 5). 활성산소종을확인하는또다른방법으로막전위변화와칼슘이온관찰이있다. MPTP 는미토콘드리아에작용하여다량의활성산소종을생성하는데이때막전위변화에특이적인 JC-1을이용하여그변화를분석및측정한결과, 小續命湯처리군에서다소감소됨을확인할수있었다 (Fig. 6). 또한세포내 oxidative stress 가발생하면미토콘드리 아및소포체로부터칼슘이온이방출되는데이를형광현미경을이용하여검측한결과, MPTP에의해방출되었던칼슘이온들이小續命湯을전처리한경우에는현저히감소되었다 (Fig. 7). 이상의결과들을보면, 小續命湯은 MPTP 로유도된파킨슨모델인인간신경모세포종 SH-SY5Y 세포주의사멸을억제하였으며, 활성산소종의생성을억제하여산화적손상에대해보호효과를나타내었다. 이러한小續命湯의세포보호효과는뇌졸중뿐만아니라파킨슨병과같은퇴행성뇌질환을치료하는데유용하게활용될수있을것으로사료된다. Ⅴ. 결론 MPTP 에의해파킨슨모델로유발된신경모세포종에대한小續命湯의보호효과를규명하고자세포주기조사, 형광현미경적조사, DCF-DA 염색등의방법으로小續命湯이세포생존율, 미토콘드리아의막전위변화, caspase 활성도, GSK3 의활성, ROS의활성에미치는영향을관찰하여다음과같은결론을얻었다. 1. 小續命湯은 MPTP 에의한 SH-SY5Y 세포생존율의감소를 200 μg/ml까지농도의존적으로유의하게억제시켰다. 2. 小續命湯은 MPTP 에의한 G1 arrest 의진행을억제시켰다. 3. 小續命湯은 MPTP에의한 ROS의생성을억제시켰다. 4. 小續命湯은 MPTP 에의한미토콘드리아의막전위변화를감소시켰으며, 세포내소기관으로부터칼슘방출증가를감소시켰다. 이상의결과로보아小續命湯은 MPTP 로유발된 SH-SY5Y 세포주의세포사멸에대하여활성산소종의생성을억제하고, 세포내항산화제의감소 306

10 우 찬 유주연 장철용 김효린 신용진 문아지 신선호 를억제함으로써산화적손상을방어하는효과를나타내었으며, 세포고사와관련된인자들을억제시켰다. 따라서小續命湯은파킨슨병등뇌신경세포손상으로인한질환에유효하게활용할수있을것으로사료된다. 감사의글본연구는 2014년도원광대학교교내학술연구비지원을받아수행하였음. 참고문헌 1. Ma J, Shaw Ve, Mitrofanis J. Does melatonin help save dopaminergic cells in MPTP-treated mice?. Parkinsonism & Relat Disord 2008;13: Blandini F, Nappi G, Tassorelli C, Martignoni E. Functional changes of the basal ganglia circuitry in Parkinson s disease. Prog Neurobiol 2000;62: Ferger B, Leng A, Mura A, Hengerer B, Feldon J. Genetic ablation of tumor necrosis factoralpha (TNF-alpha) and pharmacological inhibition of TNF-synthesis attenuates MPTP toxicity in mouse striatum. J Neurochem 2004;89: Choi DW, Maulucci-Gedde MA, Kriegstein AR. MPTP neurotoxicity in cortical cell culture. J Neurosci 1987;7: Cho Y, Bannai S. Uptake of MPTP and cystein in C6 glioma cells and in cultured astrocytes. J Neurochem 1990;55: Weiss J, Hartley D, Koh J, Choi D. AMPA receptor activation potentiates zinc neurotoxicity. Neuron 1993;10: 孫思邈. 備急千金要方. 서울 : 대성출판사 ; 1984, p 許浚. 新對譯東醫寶鑑. 서울 : 법인문화사 ; 2007, p 李梴. 國譯編註醫學入門. 서울 : 남산당 ; 2001, Vol. 6 p 최은정, 정승현, 신길조, 이원철. 千金方에記載된中風에관한考察. 대한한의학회지 1997;17(2) : 楊維傑. 內經靈樞譯解. 서울 : 대성문화사 ; 1990, p. 104, 李京燮. 東醫心系內科學 ( 上 ). 서울 : 서원당 ; 1995, p. 36-7, 黃義完. 東醫精神科學. 서울 : 현대의학서적사 ; 1987, p , 262-4, 266, , 金利和. 癡呆治療의最近硏究動向에關한考察. 대한침구학회지 1997;14(2): 서순규. 성인병 노인의학. 서울 : 고려의학 ; 1992, p. 10-5, 28-30, 지제근. 치매의병리. 대한신경과학회지 1985; 3(1): 최진호. 노화의메커니즘과연구방향. 생화학뉴스. 한국생화학회 1985;5(3): 고재영. 신경계질환에서의아폽토시스. 유전 1998;2: Kirino T, Tamura A, Sano K. Selective vulnerability of the hippocampus to ischemia reversible and irreverisible types of ischemic cell damage. Progress in Brain Res 1985;63: 서유헌. 신경전달물질. 서울 : 민음사 ; 1992, p Kurt J. Isselbacher. HARRISSON' 내과학. 서울 : 정담 ; 1997, p Simon R, Swan J, Griffiths T, Meldrum B. Blockade of N-methyl- D-aspartate receptors may protect against ischemic damage in the brain. Science 1984;226: Duga LL, Sensi SL, Canzoniero LMT, Choi DW. Mitochondria production of reactive oxygen species in cortical neurons following exposure 307

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,