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선자 묵
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1 대한내분비학회지 : 제 20 권제 3 호 2005 원저 갑상선유두암에서의 BRAF 변이와예후인자와의관계 충남대학교의과대학내과학교실 나소영 이준철 권기현 이효진 김군순 조영석 구본정 송민호 김영건 노흥규 The Relationship between the BRAF Mutations in Thyroid Papillary Carcinomas and the Prognostic Factors So-Young Rha, Jun-Chul Lee, Ki-Hyun Kwon, Hyo-Jin Lee, Koon-Soon Kim, Young-Suk Jo, Bon-Jeong Ku, Minho Shong, Young-Kun Kim, Heung-Kyu Ro Division of Endocrinology, Department of Internal Medicine, Chungnam National University College of Medicine, Daejeon, Korea ABSTRACT 3) Background: Thyroid cancers account for about 1% of all human malignancies, with papillary thyroid carcinomas being the most common istotype. Several investigators have recently identified the most common BRAF mutation, the T1796A transversion mutation, in 29~69% of papillary thyroid cancers. The BRAF mutation has been demonstrated as a novel prognostic biomarker for the prediction of poor clinicopathological outcomes, such as increased incidence of extrathyroid invasion and distant metastasis of the tumor. In this study, we investigated the prevalence of the BRAF mutation of thyroid tissues obtained by a thyroidectomy, and its correlation with the clinicopathological outcomes. Methods: We studied 36 thyroid tissues obtained from 24 women and 12 men by thyroidectomies, including 30 papillary carcinomas, 3 follicular carcinomas, 1 medullary carcinoma and 2 nodular hyperplasia. The mutation was sought in all specimens using DNA sequencing. Results: We studied the BRAF exon 15 T1796A in these 36 thyroid tissues. The mean age at surgery was 46.6, ranging from 18 to 72 years, with a median tumor size of 2.79, ranging from 1.5 to 4.5 cm. At the time of diagnosis, 27 of the 34 patients presented with some kind of extrathyroidal invasion of the tumor, and 16 had lymph node metastases. 16, 2 and 16 patients were in stages I, II and III, respectively. There was no distant metastasis. A missense mutation was found at T1796A in exon 15 in 21 of the 30 papillary carcinomas (70%). The other thyroid diseases, including the 3 follicular carcinomas, 1 medullary carcinoma and 2 nodular hyperplasia show no exon 15 T1759A transversion mutation. No statistically significant association was found between the BRAF mutations and clinicopathological characteristics of papillary carcinomas. Conclusion: The BRAF mutation is a important genetic alteration, with a high prevalence in papillary thyroid carcinomas. However, there was no significant association between the BRAF mutation and any of the clinicopathological factors. Further, large scale studies will be needed to evaluate the correlation between the BRAF mutation and the clinicopathological factors (J Kor Soc Endocrinol 20:224~229, 2005). ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Key Words: Thyroid cancer, BRAF 접수일자 : 2005년 1월 20일통과일자 : 2005년 3월 16일책임저자 : 조영석, 충남대학교병원내과

2 - 나소영외 9인 : 갑상선유두암에서의 BRAF 변이와예후인자와의관계 - 서 론 대상및방법 갑상선암은악성종양중약 1% 를차지한다. 조직학적으로갑상선상피세포에서기원하여다양한조직학적표현형을지닌유두암, 여포암그리고미분화암이있고칼시토닌을분비하는갑상선부여세포에서유래한갑상선수질암이있다. 이들은각각갑상선암에서약 80%, 15%, 2% 그리고 4% 를차지한다 [1,2]. 현재까지갑상선암의발생원인과관련하여다양한유전자에대한연구결과가발표되었다. 갑상선종양에서 DNA 메틸화이상은흔히관찰되지만선종양이나갑상선종에서는관찰되지않아갑상선종양발생의초기단계에서 DNA의메틸화이상이중요한역할을할것으로추정된다. 갑상선의양성및악성종양에서 ras 암유전자의돌연변이는비슷한빈도로나타나며보고자에따라차이가있지만약 30% 정도에서관찰되고있으며갑상선종양발생의초기단계에관여할것으로생각되고있다. 갑상선유두암에서는 RET/ PTC 돌연변이가약 11~40% 에서관찰되며 [3,4] met 암유전자의과다표출이 70% 에서보이고있다. 갑상선여포암에서는염색체 19q13의염색체전좌와염색체 3번단암의결손이관찰된다. 갑상선수질암에서는 RET 암유전자의돌연변이가가족형과산발형갑상선수질암에서관찰된다. 갑상선미분화암에서 p53 종양억제유전자점돌연변이의빈도가높은반면분화암에서의빈도는매우드물어서 p53 종양억제유전자의점돌연변이는갑상선분화암에서역형성암으로진행되는과정에관여할것으로생각된다. Raf kinase는세포의성장과분화그리고악성화에관여하는 Ras MEK MAP/ERK 신호경로의중요인자이다 [5]. Raf kinase 중 B type RAF는이신호경로에가장강력한활성화체이며이유전자는염색체 7번에위치한다. 최근에 BRAF gene의 exon 15의 1796 nucleotide가 thymine에서 adenine으로의 transversion 변이가밝혀졌으며 [6] 갑상선유두암에서 BRAF 변이는산발형갑상선유두암에서가장흔한유전적이상으로발견되고있다 [7~12]. 이변이는갑상선유두암에특이적인것으로보고되고있어갑상선유두암을진단하는데있어서상대적으로민감도가좋은분자표지자가될가능성이있다. 또한 BRAF 변이는갑상선외침윤과원격전이의빈도가높게나오는등나쁜임상조직학적결과를예측하는인자로써대두되고있다 [11,13]. 이에저자는충남대학교병원에서갑상선절제술로얻은갑상선조직에서추출한 DNA에서 BRAF 변이의빈도와예후인자와의상관관계에대해알아보고자하였다. 1. 대상 2003년 6월부터 2004년 6월까지충남대학교병원에서갑상선절제수술을받았던환자중에서조직이보관되어있는경우를대상으로하였다. 대상은모두 36명이었으며갑상선유두암 30명, 여포암 3명, 수질암 1명, 결절성과형성이 2명이었다. 2. 방법갑상선절제술로검체가보관된 36명의환자에서조직으로부터 DNA는 10 μm 두께로자른후 microdissection으로얻었다. Genomic DNA는 G-DEX (intron biotechnology co., Ltd, Korea) 를사용하여분리하였다. exon 15을증폭시키기위한 intron-based PCR primer는다음과같다. BRAF exon 15, 5'-ATGTTGCTCTGATAGGAAA, 3'-GATTT- TTGTGAATA CTGGGAA. PCR은표준 PCR 상태에서시행되었다 (95 5 min; sec, sec, sec, for 40 cycles; then min). 증폭된검체는 MinElute PCR Purification Kit (Qiagen, Chatworth, CA) 로정제하였고 BigDye terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) 을사용하는 ABI PRISM 3100 automated capillary DNA sequencer에의해 sequencing하였다. 환자의임상조직학적인자는후향적으로의무기록을검토하였으며병기는 AJCC (American Joint Committee on Cancer Recommendations) 기준에따랐다 [14]. 3. 통계분석통계처리는 SPSS 11.5 프로그램 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 를사용하였으며통계적유의수준은 0.05미만으로정의하였다. 결과갑상선암에서 BRAF 변이의확인은 DNA sequencing 을통하여 exon 15의 1796번염기에서 thymine이 adenine 으로의치환을확인할수있었다 (Fig. 1). 1. BRAF 변이의빈도 36명의환자를대상으로 BRAF 변이를보기위해 DNA seqencing을시행하였고유두암이 30명, 여포암이 3명, 수질암이 1명그리고결절성과형성이 2명이었다. 대상환자의연령은 18세에서 72세였고평균연령은 46.6세였다. 성별분포는여자 24명, 남자 12명으로여자에서 2:1로많았다. 암종의크기는평균 2.79 cm였고 1~4 cm인환자가 31명,

- 대한내분비학회지 : 제 20 권제 3 호 2005 - Fig. 1. T1796A in papillary thyroid carcinoma Table 1. BRAF Mutations According to Tumor Type Tumor type No.

cm 초과인환자가 3명이었다. 갑상선외침윤은양성이 27 명, 음성이 7명이었다. 림프절전이가양성인군은 16명음성인군은 18명이었다. 병기는 I기가 16명, II기가 2명, III 기가 16명이었고원격전이는없었다.

3 - 대한내분비학회지 : 제 20 권제 3 호 Fig. 1. T1796A in papillary thyroid carcinoma Table 1. BRAF Mutations According to Tumor Type Tumor type No. of cases Mutation of BRAF Positive (%) Negative (%) Follicular carcinoma 3 0 (0) 3 (100) Papillary carcinoma (70) 9 (30) Medullary carcinoma 1 0 (0) 1 (100) Nodular hyperplasisa 2 0 (0) 2 (100) cm 초과인환자가 3명이었다. 갑상선외침윤은양성이 27 명, 음성이 7명이었다. 림프절전이가양성인군은 16명음성인군은 18명이었다. 병기는 I기가 16명, II기가 2명, III 기가 16명이었고원격전이는없었다. 유두암에서는 BRAF 양성군이 30명중 21명으로 70% 에해당하였고여포암, 수질암그리고결절성과형성에서는 BRAF 변이를볼수없었다 (Table 1). 2. BRAF 변이와예후인자와의관계유두암에서 BRAF 양성군은 21명 (70%) 이었고 BRAF 양성군에서 45세미만인환자는 12명이었고 45세이상인환자는 9명이었으며성별은여성이 13명이었고남성이 8명이었다. 암종의크기는 1~4 cm인군이 19명이었고 4cm 초과인군이 2명이었으며갑상선외침윤이있는군이 17명이었고없는군이 4명이었다. 림프절전이가없는군이 11명이고림프절전이가있는군이 10명이었다. 병기는 I기가 12 명, II기가 1명, 그리고 III기가 8명이었다. BRAF 음성군에서 45세미만인환자는 3명이었고 45세이상인환자는 6 명이었으며성별은여성이 13명이었고남성이 2명이었다. 암종의크기는 1~4 cm이 9명이었으나 4cm 초과인군은없었다. 갑상선외침윤이있는군이 9명이었고없는군은 1명이었다. 림프절전이는없는군이 3명이었고있는군이 6명이었다. 병기는 I기가 3명이었고 III기는 6명이었다. 양군모두원격전이는없었다. 유두암에서환자의나이, 성별, 병기, 암종의크기, 갑상선외침윤, 림프절전이와 BRAF 사이에는통계학적인유의성이없었다 (Table 2). 고찰지난 20년간다양한갑상선암에서다수의유전적변이가증명되었다. 초기발견된발암성변화가운데 RET/PTC 재배열이갑상선유두암과관련이되어있다. RET/PTC 재배열은소아와 ionizing radiationinduced papillary thyroid carcinoma에서높은빈도로나타난다. 성인에서산발형유두암에서일부예외를제외하고는 RET/PTC 재배열은많은연구에서 30% 미만의빈도를보인다 [15~18]. RET/PTC에덧붙여 Ras 종양유전자의점돌연변이는성인에서산발형유두암에서 10~20% 의빈도로적은부분을차지한다 [24]. RET/ PTC 재배열과 ras 종양유전자가산발형갑상선유두암에서 30~40% 미만에서암의발생에관여하는유전적이상이다 [25]. 최근 BRAF 변이는여러종양에서발견되고있으며악성흑색종이 60% 이상의빈도로특기할만하며 [6] 대장암 [6,19], 난소암 [6,20], 폐암 [19,21] 그리고간담도암 [22] 에서는낮은수준에서나타난다. 또한 BRAF 변이는갑상선유두암에서높은빈도로보고되고있다. 알려진 BRAF mutation 에는 exon 11과 15에서변이가있으나갑상선유두암에서

4 - 나소영외 9인 : 갑상선유두암에서의 BRAF 변이와예후인자와의관계 - Table 2. BRAF Mutation (PTC) & Various Clinicopathological Parameters Mutation of BRAF Positive (%) Negative (%) P N % N % Ape < 45 yr yr Gender famale male Tumor size ~40 mm > 40 mm Extratthyroid invasion No Yes Nodal metastasis 0.29 No Yes Stage Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Distant metastasis No Yes 는 exon 11의변이는없는것으로보고되고있다. 또한여러보고에서 exon 15 T1796A 변이는갑상선여포암이나양성갑상선선종에서는발견되지않았다 [7~10]. BRAF 변이는산발형갑상선유두암에서가장흔히발견되는유전적이상소견이며갑상선유두암에서 29~69% 정도의빈도로보고되고있다 [7~10]. 본연구에서도갑상선유두암이었던 30명중 21명 (70%) 이 BRAF 변이가있었으며다른연구에서와마찬가지로여포암, 수질암그리고결절성과형성에서는 BRAF 변이가없었다. 갑상선유두암과 BRAF 변이사이에서관련이있는인자는 Nikiforva 등의연구에서는고령, 갑상선외침윤그리고진행된병기였고 [13] Namba 등의연구에서는 BRAF 변이와갑상선유두암에서관련이있는인자는병기와원격전이였다 [11]. 그러나 Puxeddu 등의연구에서는갑상선유두암에서나이, 성별, 암종의크기, 갑상선외침윤, 림프절전이그리고병기와 BRAF 변이사이에는관련이없는것으로나타났다 [23]. 본연구에서도 Puxeddu 등의연구에서처럼갑상선유두암에서 BRAF 변이와성별, 나이, 암종의크기, 림프절전이, 갑상선외침윤, 병기그리고원격전이가통계적유의성이없는것으로나타났다. 그러나본 논문에서대상이되었던환자군이 36명으로그수가적어서추후 BRAF 변이와임상조직예후인자의연관성에관한대규모연구가필요하다. 본연구에서는갑상선유두암에서 BRAF 변이가높은빈도를차지하고있다는것을확인하였다. 또한다른연구에서와마찬가지로유두암을제외한여포암, 수질암그리고결절성과형성에서는 BRAF 변이가관찰되지않았다. 유두암에서 BRAF 변이의높은빈도와유두암에서이변이의특이도는암의진단과예후에중요한표지자로써의가능성을제시하고있다. 요약연구배경 : 갑상선암은악성종양중약 1% 를차지하며이중가장흔한조직형은유두암이다. 최근갑상선암에서 BRAF 변이가산발적인갑상선유두암에서흔한유전적이상으로발견되고있으며이환율은보고자에따라 26~69% 에이른다. 지금까지유두암에서 BRAF 변이는 T1796A인것으로밝혀졌고이는갑상선외침윤과원격전이의빈도가높게나오는등나쁜임상조직학적결과를예측하는인자로써대

5 - 대한내분비학회지 : 제 20 권제 3 호 두되고있다. 이에저자는충남대학교병원에서갑상선조직의 BRAF 변이빈도와이에따른다른임상조직학적변수와의상관관계에대해알아보고자하였다. 방법 : 2003년 6월부터 2004년 6월까지충남대학교병원에서갑상선절제수술을받았던환자에서조직이보관되어검사가가능한 36명의갑상선조직에서추출한 DNA를표준 PCR방법을사용하여증폭후 DNA sequencing을하였으며다른임상적인자료는챠트를후향적으로조사하였다. 결과 : 36명의환자에서 BRAF exon 15 T1796A 유무를검사하였고유두암이 30명, 여포암이 3명, 수질암이 1명그리고결절성과형성이 2명이었다. 대상환자의연령은 18세에서 72세였고평균연령은 46.6세였다. 성별분포는여자가 24명이었고남자가 12명으로여자에서 2:1로많았다. 암종의크기는 1~4 cm인군이 31명이었고 4cm 초과인군이 3 명이었다. 갑상선외침윤은양성이 27명이었고음성이 7명이었다. 림프절전이가양성인군은 16명이었고음성인군은 18명이었다. 병기는 I기가 16명, II기가 2명, 그리고 III 기가 16명이었고원격전이는없었다. BRAF 양성인군은 21명이었고음성인군은 15명이었다. 갑상선여포암, 수질암, 그리고결절성과형성에서는 BRAF 변이는없었다. 유두암에서 BRAF 양성군은 21명 (70%) 이었고 BRAF 양성군에서 45세미만인환자는 12명이었고 45세이상인환자는 9명이었으며성별은여성이 13명이었고남성이 8명이었다. 암종의크기는 1~4 cm인군이 19명이었고 4cm 초과인군이 2명이었으며갑상선외침윤이있는군이 17명이었고없는군이 4명이었다. 림프절전이가없는군이 11명그리고있는군이 10명이었다. 병기는 I기가 12명, II기가 1명그리고 III기가 8명이었다. 환자의나이, 성별, 병기, 암종의크기, 갑상선외침윤, 그리고림프절전이와 BRAF 사이에는통계학적인유의성이없었다. 결론 : BRAF 변이는갑상선유두암에서높은빈도를보이는유전적변이이며갑상선유두암에특이적이다. BRAF 변이와임상조직예후인자의연관성에대해서는연구대상수를증가하여고찰이필요하다. 참고문헌 1. Hundal SA, Fleming ID, Fremgen AM, Menck HR: A National Cancer Data Base reprot on 53,856 cases of thyroid carcinoma treated in the U.S., Cancer 83: , Franceschi S, Boyle P, Maisonneuve P, La Vecchia C, Burt AD, Kerr DJ, MacFarlane GJ: The epidemiology of thyroid carcinoma. Crit Rev Oncog 4:25-52, Fusco A, Grieco M, Santoro M, Berlingieri MT, Pilotti S, Pierotti MA, Della Porta G, Vecchio G: A new oncogene in human thyroid papillary carcinomas and their lymph-nodal metastases. Nature 328: , Santoro M, Carlomagno F, Hay ID, Herrmann MA, Grieco M, Melillo R, Pierotti MA, Bongarzone I, DellaPorta G, Berger N, Peix JL, Paulin C, Fabien N, Vecchi G, Jenkins RB, Fusco A: RET oncogene activation in human thyroid neoplasm is restricted to the papillary cancer subtype. J Clin Invest 89: , Hilger RA, Scheulen ME, Strumberg D: The RasRaf- MEK-ERK pathway in the treatment of cancer. Onkologie 25: , Davies H, Bignell GR, Cox C, Stehens P, Edkins S, Clegg S: Mutations of the BRAF gene in human cancer Nature(Lond.) 417: , Kimura ET, Nikiforova MN, Zhu Z, Knauf JA, Nikiforv YE, Fagin JA: High prevalence of BRAF mutation in thyroid cancer:genetic evidence for constitutive activation of the RET/PTC-RAS-BRAF signaling pathway in papillary thyroid carcinoma. Cancer Res 63: , Cohen Y, Xing M, Mambo E, Guo Z, Wu Z, Trink B, Beller u, Westra WH, Ladenson PW, Sidransky D: BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma. J Natl Cancer Inst 95: , Soares P, Trovisco V, Rhosa AS, Lima J, Castro P, Preto A, Maximo V, Botelho T, Seruca R, Sobrinho-simoes M: BRAF mutations and RET/PTC rearrangements are alternative events in the etiopathogenesis of PTC. Oncogene 22: , Xu X, Quiros RM, Gattusso P, Ain KB: Prinz RA High prevalence of BRAF gene mutation in papillary thyroid carcinomas and thyroid tumor cell lines. Cancer Res 63: , Namba H, Nakashima M, Hayashi T, Maeda S, Rogounovitch TI, Ohtsuru A, Saeno VA, Kanematsu T, Yamashita S: Clinical implication of hot spot BRAF mutation, V599E, in papillary thyroid cancers, J Clin Endocrinol Metab 88: , Fuckshima T, Suzuki S, Mashiko M, Ohtake T, Endo Y, Takebayash Y, Sekikawa K, Hagiwara K, Takenoshita S: BRAF mutation in papillary carcinomas of the thyroid. Oncogene 22: , Nikiforova MN, Kimura ET, Gandhi M, Biddinger PW, Knauf JA, Basolo F, Zhu Z, Giannini R,

6 - 나소영외 9인 : 갑상선유두암에서의 BRAF 변이와예후인자와의관계 - Salvatore G, Fusco A, Santoro M, Fagin JA, Nikiforov YE: BRAF mutation in thyroid tumors are restricted to papillary carcinomas and anaplastic or poorly differentiated carcinomas arising from papillary carcinomas. J Clin Endocrinol Metab 88: , AJCC Cancer staging manual: 6th ed. New York, Springer-Verlag, Santoro M, Melillo RM, Carlomgno F, Fusco A, Vecchio G: Molecular mechanisms of RET activation in human cancer. Ann NY Acad Sci 963: , Vigilletto G, Chiappetta G, Martinez-Tello FJ, Fukunaga FH, Rallini G, Rigopoulou D, Visconti R, Mastro A, Santoro M, Fusco A: RET/PTC oncogenic activation is an early event in thyroid carcinogenesis. Oncogene 11: , Zou M, Shi Y, Farid NR: Low rate of ERt proto-oncogene activation (PTC/RET/PTC) in papillary thyroid carcinomas from Saudi Arabia. Cancer 73: , Puxddu E, Moretti S, Giannico A, Martinelli M, Marino C, Avenia N, Cristofani R, Farabi R, Reboldi G, Ribacchi R: Ret/PTC activation does not influence clinical and pathological features of adult papillary thyroid carcinomas. Eur J Endocrinol 148: , Brose MS, Volpe P, Feldman M, Kumar M, Rishi I, Gerrero R, Einhorn E: BRAF and RAS mutation in human lung cancer and melanoma. Cancer Res 62: , Singer G, Oldt 3rd R, Cohen Y, Wang BG, Sidransky D, Kurman RJ, ShihleM: Mutations in BRAF and KRAS characterize the development of low-grade ovarian setous carcinoma. J Natl Cancer Inst 95: , Naoki K, Chen TH, Richards WG, Sugarbaker DJ, Meyerson M: Missense mutation of the BRAF gene in human lung adenocarcinoma. Cancer Res 62: , Tannapfel A, Sommerer F, Benicke M, Katalinic A, Uhlmann D, Witzigmann H, Hauss J, Witterkind C: Mutations of the BRAF gene in cholangiocarcinoma but not in hepatocellular carcinoma. Gut 52: , Puxeddu E, Moretti S, Elisei R, Romei C, Pascucci R, Martinelli M, Marino C: BRAF(V599E) mutation is the leading genetic event in adult sporadic papillary thyroid carcinomas. J Clin Endocrinol Metab 89: , Namba H, Rubin Sa, Fagin JA: Point mutations of ras oncogenes are an early event in thyroid tumorigenesis. Mol Endocrinol 4: ,

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Jkbcs016(92-97).hwp Expression of bcl-2 and Apoptosis and Its Relationship to Clinicopathological Prognostic Factors in Breast Cancer - A Study with Long Term Follow-up correlated with the survival rate.(journal of Korean