127~142

Size: px

Start display at page:

Download "127~142"

유비 윤
5 years ago
Views:

1 調胃升淸湯의알코올및熱水추출물이지방세포대사에미치는영향 127 DOI: KPI 원저 調胃升淸湯의알코올및熱水추출물이지방세포대사에미치는영향 이재은ㆍ김병우 * ㆍ권기록 ** ㆍ임태진 *** ㆍ김동희 **** * 상지대학교한의과대학내과학교실 ** 상지대학교한의과대학침구학교실 *** 상지대학교응용동물과학부 **** 연세대학교원주의과대학환경의생물학교실 Effects of Chowiseungcheng-tang Extracts on the Preadipocytes Proliferation in 3T3-L1 cell line, Lipolysis of Adipocytes in rat, and Localized Fat Accumulation by extraction methods Jae-eun, Lee* Byoung Woo, Kim* Ki Rok, Kwon** Tae Jin, Rhim*** Dong Heui Kim**** * Department of Internal Medicine, Korean Medical College, Sangji University ** Department of Acup & Moxi, Korean Medical College, Sangji University *** Devision of Animal resourses and life science, Sangji University **** Department of Environmental Medical Biology, Wonju Medical College, Yonsei University ABSTRACT Objectives Methods Results Conclusions The purpose of this study is to investigate the effects of Chowiseungcheng-tang extracts on the preadipocytes proliferation in 3T3-L1 cell line, lipolysis of adipocytes in rat s epididymal adipocytes and localized fat accumulation of porcine by extraction methods(alcohol and water). Diminish preadipocytes proliferation and promote lipolysis of adipocytes do primary role to reduce obesity. So, we used 3T3-L1 mouse embryo fibroblasts(preadipocytes) and rat epididymal adipocytes from Sprague-Dawley rats to investigate the effects of Chowiseungcheng-tang extracts on the preadipocytes proliferation, lipolysis of adipocytes. They were treated with 0.01, 0.1, 1.0 Chowiseungcheng-tang alcohol and water extracts. And for the purpose of investigating the effects of Chowiseungcheng-tang alcohol and water extracts on the localized fat accumulation, we injected 0.1, 1.0, 10.0 Chowiseungcheng-tang extracts to porcine fat tissues and observed histological changes of them. Following results were obtained from the preadipocytes proliferation and lipolysis of adipocytes and histological investigation of fat tissues. 1. Chowiseungcheng-tang extracts suppressed preadipocytes proliferation on the high dosage(especially 1.0 ), and especially alcohol extracts had better effects. 2. The alcohol extracts of Chowiseungcheng-tang decreased the activity of glycerol-3-phosphate dehydrogenase(gpdh) on the concentrations of 0.1, 1.0. Alcohol extracts had better effects than water extracts. 3. Chowiseungcheng-tang extracts increased lipolysis of adipocytes on the concentrations of 0.1, 1.0, and especially on the concentration of 1.0 alcohol extract of Chowiseungcheng-tang had better effect. 4. The water extract of Chowiseungcheng-tang had significant activity to the destruction of porcine fat cell membranes only on the concentration of 10.0, but alcohol extracts of Chowiseungcheng-tang had it on all concentrations. The alcohol extracts of Chowiseungcheng-tang had much better effects on the preadipocytes proliferation, lipolysis of adipocytes and localized fat accumulation than water extracts key words Chowiseungcheng-tang,Alcohol extracts,waterextracts, Preadipocytes, Proliferation, Adipocytes, Lipolysis, Fat tissues. 교신저자 : 권기록, 강원도원주시우산동 283 상지대학교부속한방병원침구과 Tel : FAX : beevenom@paran.com

2 128 대한약침학회지제 11 권제 1 호 (2008 년 3 월 ) Ⅰ. 緖論 Ⅱ. 實驗材料및方法 비만이란대사장애로인해체내에지방이과잉축적된상태를말하는것으로, 칼로리섭취가신체활동과성장에필요한에너지보다초과되어중성지방의형태로지방조직에과잉축적된열량불균형으로일어난다 1). 비만은그자체만으로도용모손상 (Disfigurement), 불편감 (Discomfort), 비능률 (Disability) 을비롯하여질병 (Disease), 죽음 (Death) 등소위 5D 현상 을초래하며 2), 고혈압, 동맥경화, 심근경색등의심장혈관계질환, 신장장애, 당뇨병, 폐질환등의만성질환에대한빈도를증가시키고생리적기능을저하시킬뿐만아니라일상생활을위축시킨다는것은이미알려진사실이다 1). 이러한비만에대하여미국의경우국립보건원 (NIH) 이주축이되어 1998년비만의진단과치료에필요한지침을제정하는등과학적근거에의거한비만의정확한규명과효율적인치료전략을마련하기위해국가차원의노력을경주하고있고 3,4), 우리나라에서도 1990년대부터비만의치료에대한사회적관심이높아지고비만과관련된학회들이생겨나면서, 비만에관련된연구들이다양한주제로활발하게진행되고있다 5). 調胃升淸湯은太陰人의食後滿腿脚無力中消善飢者 6) 에사용되는처방이나그동안신등 7) 의調胃升淸湯및그加味方이비만마우스의체중과혈청함량변화에미치는영향및서등 8) 의비만환자에대한調胃升淸湯의효과및부작용에관한임상적관찰등의연구에서볼수있듯이비만치료에多用되었으며 東醫壽世保元, 9) 에太陰人의胃脘受寒表寒病중肺燥寒症에사용되는太陰調胃湯에 子의양을줄이고遠志, 天門冬, 酸棗仁, 眼肉등補心安神하는安神藥類가加味되어 7,10) 스트레스로인한폭식에유효한효과를거둘수있으며, 특히麻黃의加減으로적절한체중감소의효과를얻을수있는처방이다 8,10). 그러나그동안대부분熱水추출물의형태로실험에사용되었고, 추출방식에따른調胃升淸湯이지방세포대사에미치는영향에관한연구는아직까지이루어지지않았다. 이에저자는調胃升淸湯의알코올및熱水추출물이지방세포의분화와분해에미치는영향을비교연구하였고, 돼지복부지방층에추출액을주입하여국소지방세포에미치는영향을관찰하여국소비만치료의가능성및효과를알아보고자했다. 1. 材料 1) 調胃升淸湯추출물의조제실험에사용한調胃升淸湯의약재는한약재수급및유통관리규정 11) 에의거한규격품을사용하였고, 구성약재와용량은 Table 1과같다. 알코올추출물은 10 貼분량의調胃升淸湯 660g을둥근플라스크에넣고 90% 알코올 2,000ml에 24시간동안방치한후 rotary evaporator로감압농축하여 102.5g의 extract를얻어실험에사용하였다. 熱水추출물은同量의약재를환류냉각장치가설치된둥근플라스크에넣고 3차증류수 3,000ml를가하여 3 시간동안 100 로가열한후 rotary evaporator로감압농축하여 1.1g의 extract를얻어실험에사용하였다. (Table 1) The Contents of Chowiseungcheng-tang 韓藥名生藥名重量 (g)/10 貼基準薏苡仁乾 Semen Coicis Castaea Mollisima 子 Semen Raphani 60 麻黃桔梗麥門冬五味子石菖蒲遠志天門冬酸棗仁眼肉 Herba Ephedrae Radix Platycodi Radix Ophiopogonis Fructus Schisandrae Rhizoma Acori Graminei Radix Polygalae Radix Asparagi Semen Ziziphi Spinosae Arillus Longan 總量 660 2) 3T3-L1 지방세포및시약 3T3-L1 mouse embryo fibroblast( 이하 3T3라지칭함 ) 는 American Type Culture Collection에서구입하였고, Dulbecco s Modified Eagle Media(DMEM) 와 bovine calf serum(bcs) 은 GIBCO사 (U.S.A.) 로부터구입하였다. Fetal bovine serum(fbs), penicillin-streptomycin mixture 및 dimethy-l sulfoxide(dmso) 는 Cambrex 사 (U.S.A.) 로부터구입하였다.

3 調胃升淸湯의알코올및熱水추출물이지방세포대사에미치는영향 129 Insulin, isobutylmethylxanthine(ibmx), dexameth -asone, amphotericin B, collagenase, bovine serum albumin(bsa) 등세포배양에사용된기타시약들과생화학분석에사용된시약들은 Sigma사 (U.S.A.) 로부터구입하였다. 본연구에사용된모든화학물과용매들은세포배양또는분석급이상으로사용하였다. 3) 동물 ( 주 ) 오리엔트바이오로부터구입한 6주령수컷 Sprague -Dawley rat( g) 를실험동물로사용하였다. 본실험실에서사료와물은무제한공급하였고, 사육실온도는 를유지하였으며, 명암은 12시간주기로조절하였다. 4) 돼지의지방조직풍부한지방층을가지고있는돼지의복부조직을강원도원주시인근의도축장의협조를얻어도살직후잘라내어사용전최대 4시간까지냉장보관하여사용하였다. 2. 方法 분화 ( 지방합성 ) 에미치는영향을알아보기위해 Negrel 과 Dani의방법 13) 에따라 Oil Red O 염색을실시하였다. 즉, 실험종료시 (day 10) 에세포를 phosphate buffer - ed saline(pbs) 으로세척한다음 10% formaldehyde로 10분간고정시켰다. 증류수로세척하고 Oil Red O 염색용액으로 10-20분간배양하였으며, 증류수로세척한다음세포내지방축적을관찰하였다. (2) GPDH(glycerol-3-phosphate dehydrogenase) 활성지방세포의분화에대한탐침자로서 GPDH 활성을측정하였다. 3T3 세포들이 100% confluence에도달한 day 0에추출물이포함된분화배지로 3일간세포배양을하였고, day 10에 culture dish로부터세포를분리하여 sonication 시켰고원심분리하여상등액을수거하였다. 상등액내의 GPDH 활성은 Wise와 Green의방법 14) 에따라 spectrophotometer를사용하여 3nm에서의흡광도변화를측정하였다. GPDH 활성은 mu/min/ protein으로표시하며, 1mU 활성은분당 1nmol의 NADH 산화와동등한값을나타낸다 (Fig. 1). 단백질함량은 BSA을표준시약으로사용하여 Bradford 방법 15) 에따라측정하였다. 1) 지방세포의배양 3T3-L1 mouse embryo fibroblast는 Singh 등 12) 의방법에따라배양하였다. 즉, 3T3 세포들을 10% BCS을포함한 DMEM 배지를사용하여 cells/cm 2 가되도록 60-mm culture dish에분주한다음 37 CO 2 incubator에서배양하였다. 100% confluence에도달 (Day 0) 하면, 3T3 세포들을 10% FBS, 1.7μM insulin, 0.5mM IBMX, 1μM dexamethasone을포함한 DMEM 배지로교체하고 3일동안배양하여분화를유도하였다. 調胃升淸湯 alcohol 및熱水추출물이지방세포의분화에미치는영향을조사하기위해 1.0, 0.1, 그리고 0.01 농도의추출물이포함된분화유도배지로 3T3 세포들을배양하였다. 분화유도가끝난뒤실험종료시 (Day 10) 까지 10% FBS과 167nM insulin이포함된 DMEM 배지로배양하였다. 세포배양액은 2일간격으로교체하였다. 2) 지방세포의분화측정 (1) Oil Red O 염색調胃升淸湯추출물이전지방세포로부터지방세포로의 3) 지방세포의분해측정 Rat의성숙지방세포에알코올및熱水추출된調胃升淸湯추출물을분사하여분화된지방세포의지방분해에미치는영향을조사하였다. Rat 성숙지방세포의분리는 Rodbell 16) 방법을수정한 Zalatan 등 17) 의방법에따라실시하였다. 즉, 수컷 Sprague-Dawley rat의정소상체지방조직을떼어내어잘게절단한다음, collagenase(1/ ml ) 와 BSA(10 ) 가포함된 Krebs-Ringer 용액을이용하여 37 에서 1시간분해시켰다. 분해된조직액을 250 μm 여과메쉬를통해여과시키고 250xg에서 10분간원심분리하여전지방세포 (preadipocyte) 를침전시켰다. 상등액에위치한지방세포층을수거하여두차례세척을한다음, 지방세포수를측정하였다. 50-ml conical tube에 cells가되도록분주한다음 37 CO 2 incubator 에서 3시간동안배양하였다. 추출물이지방분해에미치는효과를조사하기위해처리시약과함께 3시간배양한다음, free glycerol을표준시약으로사용하여 McGowan 등 18) 의방법에따라배양액내 glycerol 함량을측정하였다. 방출된 glycerol은 ATP의존재하에서 glycerol kinase에의해 glycerol-1-phosphate로전환되며, 이는

4 130 대한약침학회지제 11 권제 1 호 (2008 년 3 월 ) glycerol phosphate oxidase에의해 dihydroxyact-one phosphate와 hydrogen peroxide(h 2 O 2 ) 로산화된다. 생성된 H 2 O 2 는 4-aminoantipyrine과 sodium N-ethyl- N-(3-sulfopropyl)m-anisidine존재하에서 peroxidase 에의해자주색을띠는 quinoneimine으로전환된다. 따라서생성된 quinoneimine에의한 5nm에서의흡광도의증가는배지내에서의 glycerol 농도의증가를나타낸다. 4) 돼지지방세포의용해측정도살직후채취한지방조직을 10% 포르말린용액에고정시킨것과 0.9% NaCl 용액에보관한지방조직을비교관찰하였다. GLYCEROL+ ATP GK G-1-P + ATP GPO G-1-P + O2 DHAP + H2O2 H2O2+ 4-AAP + ESPA P0D Quinoneimine dye + H2O 알코올추출과熱水추출된調胃升淸湯 extract를각각농도별로 10.0, 1.0, 그리고 0.1 로희석하여 1.0ml, 26gauge 주사기에준비한후돼지의지방층에주입하였다. 바늘깊이는표적조직의포화를목적으로돼지조직의가장자리에육안으로확인하면서주입하였다. 인산염완충액식염수로 37 에서한시간동안배양후, 생검검사물을주입한자리에서추출하였다. 실험은세번반복시행하였다. 조직을포름알데히드에고착시키고파라핀에고 Fig.1. The pathway for lipid biosynthesis. Lipid biosynthesis occurs through sequential binding of the fatty acids activated as acyl-coas to glycerol-3-phosphate. In the liver, glycerol-3-phosphate is generated from glycerol by the action of glycerol kinase. However, due to the absence of glycerol kinase in the adipose tissue and muscles, glycerol-3-phosphate is generated from glucose by the way of dihydroxyacetone phosphate.

지방세포의분화 (proliferation) 에미치는영향 1) 성숙지방세포의형성 3T3 미분화지방세포 (preadipocyte, Fig. 2 A) 를배양한결과배양 10일째에성숙된지방세포가형성됨을알수있었다 (Fig. 2 B).

5 調胃升淸湯의알코올및熱水추출물이지방세포대사에미치는영향 131 정시킨후 Hematoxylin-Eosin 염색 (H-E staining) 을실행하였다. 숙지방세포의형성이잘되었음을알수있었다 (Fig. 2 C&D). 5) 통계분석처리시약의농도별지방세포분화및지방세포분해에미치는효과는일원분산분석을사용하여조사하였으며, 평균값의차이는 Duncan s multiple range test 19) 를사용하여 p<0.05에서유의성을조사하였다. Ⅲ. 結果 1. 지방세포의분화 (proliferation) 에미치는영향 1) 성숙지방세포의형성 3T3 미분화지방세포 (preadipocyte, Fig. 2 A) 를배양한결과배양 10일째에성숙된지방세포가형성됨을알수있었다 (Fig. 2 B). 지방세포의형성을확인하기위하여세포질내에축적된중성지방 (triglyceride) 을염색하는시약인 Oil Red O를이용하여세포염색을시행한결과성 2) 농도별분화에미치는영향熱水추출물은대조군에비하여전농도에서차이를나타내지않고비교적광범위한지방세포의형성을나타내는것으로관찰되었다 (Fig. 3 C-E). 알코올추출물은대조군에비하여 1.0 에서는현저하게분화를억제하고있었고, 0.1 의농도에서는약간의억제를, 0.01 의농도에서는뚜렷한차이를나타내지못하는것을알수있었다 (Fig. 3 F-H). 그리고, Oil Red O로염색된세포를관찰한결과熱水추출물은 1.0 의농도에서, 알코올추출물은 1.0 / ml, 0.1 의농도에서대조군에비하여지방세포의분화를억제하고있음을알수있었다 (Fig. 4). 3) GPDH 활성에미치는영향지방합성은 dihydroxyacetone phosphate로부터조효소로써 nicotinamide adenine dinucleotide Fig. 2. Microscopic images of preadipocyte and adipocyte( 100) A: Undifferentiated cells B : Adipocytes induced to differentiation C : Undifferentiated cells stained with Oil Red O D: Differentiated cells stained with Oil Red O

6 132 대한약침학회지제 11 권제 1 호 (2008 년 3 월 ) Control WE - Cho AE - Cho mlmlmlmlmlml Fig. 3. The suppressed effects on the preadipocytes differentiation ( 100). A : Undifferentiated cells B : Control was treated with 0.9% NaCl Solution adipocytes induced to differentiation C : 0.01 / water extract of Chowiseungcheng-tang was treated with 3T3preadipocytes D : 0.1 / water extract of Chowiseungcheng-tang was treated E : 1.0 / water extract of Chowiseungcheng-tang was treated F : 0.01 / alcohol extract of Chowiseungcheng-tang was treated G : 0.1 / alcohol extract of Chowiseungcheng-tang was treated H : 1.0 / alcohol extract of Chowiseungcheng-tang was treated

調胃升淸湯의알코올및熱水추출물이지방세포대사에미치는영향 133 Control WE - Cho AE - Cho 0.01 0.1 1.0 mlmlmlmlmlml Fig. 4. The suppressed effects on the preadipocytes differentiation.

01 / water extract of Chowiseungcheng-tang was treated with 3T3 preadipocytes D : 0.1 / water extract of Chowiseungcheng-tang was treated E : 1.

7 調胃升淸湯의알코올및熱水추출물이지방세포대사에미치는영향 133 Control WE - Cho AE - Cho mlmlmlmlmlml Fig. 4. The suppressed effects on the preadipocytes differentiation. All cells are stained with Oil Red O ( 100). A : Undifferentiated cells B : Control was treated with 0.9% NaCl Solution C : 0.01 / water extract of Chowiseungcheng-tang was treated with 3T3 preadipocytes D : 0.1 / water extract of Chowiseungcheng-tang was treated E : 1.0 / water extract of Chowiseungcheng-tang was treated F : 0.01 / alcohol extract of Chowiseungcheng-tang was treated G : 0.1 / alcohol extract of Chowiseungcheng-tang was treated H : 1.0 / alcohol extract of Chowiseungcheng-tang was treated

8 134 대한약침학회지제 11 권제 1 호 (2008 년 3 월 ) hydrogen(nadh) 을사용하여 glycerol-3-phosphate 를생성하는효소인 glycerol-3-phosphate dehydroge nase(gpdh) 활성을측정함으로써조사하였다. 미분화 3T3 지방세포가성숙한분화지방세포로전환됨에따라 GPDH 효소활성은증가하게된다. 본실험에서는調胃升淸湯알코올추출물과熱水추출물이전지방세포로부터지방세포로의분화에미치는영향을알아보기위하여 GPDH 활성을측정하였다. 그결과추출물이포함되지않은분화배지로분화가유도된 3T3 지방세포 (Control) 에서 GPDH 활성은 81.8 mu/min/ protein으로나타났다. 調胃升淸湯熱水추출물의첨가농도에따른 GPDH 활성은 0.1 농도이외에는변화가관찰되지않았다. 즉, 熱水추출물은지방합성에영향을거의미치지못하였음을알수있었다. 반면, 알코올추출물은 0.01, 0.1 및 1.0 농도첨가에따라 GPDH 활성은각각 70.6, 43.0 및 22.5 mu/min/ protein으로감소하여 (Table 2) 농도의존적으로 GPDH 활성을감소시켰고, 특히 0.1 및 1.0 농도에서대조군보다유의한억제를나타내었다. 2. 지방세포의분해 (lipolysis) 에미치는영향 調胃升淸湯熱水추출물과알코올추출물이분화된지방세포의지방분해에미치는영향은 glycerol 함량을측정함으로써조사하였다. 처리시약과함께세포를배양한뒤, 배양액을채취하여 Free glycerol determination kit(sigma, U.S.A. Co.) 를사용하여측정하였다. 추출물이포함되지않은배지 (control) 에서성숙한분화세포를 3시간배양한결과방출된 glycerol 농도는 116.0μM/L이었다. 調胃升淸湯熱水추출물이지방분해에미치는효과는 0.01 농도에서는대조군에비해유의적인차이가관찰되지않았고, 0.1 및 1.0 농도에서는대조군에비하여유의적으로증가하였다. 0.1과 1.0 의 glycerol 농도는큰차이가없었다 (Table 3). 알코올추출물역시 0.01 농도에서는대조군에비해유의한차이가관찰되지않았다. 그러나, 0.1 및 1.0 / ml농도첨가에따라방출된 glycerol 농도는각각 과 212.5μM/L로유의적으로증가하여알코올추출물은농도의존적으로지방분해를촉진시킴을알수있었다 (Table 3). 알코올추출물과熱水추출물의지방분해효과를비교해보면, 저농도 (0.01 및 0.1 ) 에서는방출되는 (Table 2) The effects of Chowiseungcheng-tang extracts on glycerol-3-phosphate dehydrogenase(gpdh) activity in 3T3 adipocytes. Treatment Concentration GPDH activity 1,2 (mu/min/ protein) WE-Cho WE-Cho WE-Cho AE-Cho AE-Cho AE-Cho mlmlmlmlmlml Control 0.01 / 0.1 / 1.0 / 0.01 / 0.1 / 1.0 / 81.8±4.7 a,b 80.1±2.9 a,b,c 68.8±7.5 c 69.8±3.3 b,c 70.6±5.4 b 43.0±6.5 c 22.5±4.2 c 1 Values are means±sd(n=2) from two separate experiments. 2 Means in a column with different superscript differ, P<0.05. WE-Cho : Water extract of Chowiseungcheng-tang AE-Cho : 90% alcohol extract of Chowiseungcheng-tang Fig. 5. The effects of Chowiseungcheng-tang extracts on glycerol-3-phosphate dehydrogenase(gpdh) activity in 3T3 adipocytes. Cells were treated with 0.01, 0.1 and 1.0 concentration for 72hrs. Results are the mean±sd(n=2), and analyzed by Duncan s multiple range test(p<0.05).

調胃升淸湯의알코올및熱水추출물이지방세포대사에미치는영향 135 (Table 3) The effects of Chowiseungcheng-tang extracts on the glycerol release in rat epididymal adipocytes.

9 調胃升淸湯의알코올및熱水추출물이지방세포대사에미치는영향 135 (Table 3) The effects of Chowiseungcheng-tang extracts on the glycerol release in rat epididymal adipocytes. Treatment Concentration Glycerol 1,2 (μmole/l) WE-Cho WE-Cho WE-Cho AE-Cho AE-Cho AE-Cho mlmlmlmlmlml Control 0.01 / 0.1 / 1.0 / 0.01 / 0.1 / 1.0 / 116.0±6.3 a 132.3±4.2 a,b 145.7±10.5 b,c,d 154.6±14.7 d 127.9±2.1 a,b,c 150.1±16.8 c,d 212.5±8.4 e 1 Values are means±sd(n=2) from two separate experiments. 2 Means in a column with different superscript differ, P<0.05. WE-Cho : Water extract of Chowiseungcheng-tang AE-Cho : 90% alcohol extract of Chowiseungcheng-tang Fig.6. Lipolysis measured by glycerol release in epididymal adipocytes incubated with a range of concentrations of Chowiseungcheng-tang extracts. Results are the mean±sd(n=2), and analyzed by Duncan s multiple range test(p<0.05). glycerol 농도의차이가발견되지않았지만, 1.0 의농도에서는알코올추출물이熱水추출물에비해유의적으로높게관찰되어고농도에서알코올추출물의지방분해효과가더높은것으로관찰되었다 (Fig. 6). 3. 돼지지방세포의용해에미치는영향調胃升淸湯알코올및熱水추출물을각각 10.0, 1.0, 그리고 0.1 의농도로하고, 대조군으로는각각의 extract를희석하는데사용된 0.9% 생리식염수를처치하여돼지지방세포의용해에미치는영향을관찰하였다. 그결과생리식염수의처치도지방세포에약간의영향을주는것을관찰할수있었다. 調胃升淸湯熱水추출물은 0.1, 1.0 의농도에서는지방세포에큰손상을야기하지않는것으로관찰되었으나 10.0 의농도에서는광범위한손상을일으키는것이관찰되었다. 알코올추출물에서는전농도에서광범위한세포막의파괴를동반한세포사멸작용이일어나고있음을알수있었다. 따라서신선한지방세포에서알코올추출調胃升淸湯은熱水추출물에비하여지방세포파괴작용이더욱우수함을알수있었다 (Fig. 7). Ⅳ. 考察 비만은체지방이과잉축적된상태로남성의경우체지방량이체중의 25% 이상, 여성의경우 30% 이상인경우로정의된다 20,21). 비만은오늘날전세계인구의질병으로되었으며, 체중증가는당뇨병, 심장혈관계질환, 골관절염과일부암의증가와같은질병과의관련성을높여비만의치료에는직접또는간접으로높은비용이소요된다 22). 최근에는전향적연구를통해복부지방축적과사망률증가의인과관계가확인되고있어 23-25) 특히복부비만 ( 내장지방비만 ) 에주목을하고있다. Reaven은제 2형당뇨병과관상동맥질환의위험인자로알려진고혈압, 이상지질혈증 ( 혈중중성지방치상승, LDL 입자구성의변화, 혈중 HDL 콜레스테롤수치저하 ), 당불내성, PAI-1 상승, 비만 ( 특히상체비만 ) 등이함께발현하는것은인슐린저항성과관련이있다고주장하고이를 X 증후군 (Syndrome X) 이라고하였으며 26), 이후인슐린저항성증후군 27), 대사증후군 28) 등으로도불려왔다. 복부지방축적과인슐린저항성이밀접한연관성을보이는것은이후많은연구에서확인되었고, 이는복부비만과제 2형당뇨병및관상동맥질

10 136 대한약침학회지제 11 권제 1 호 (2008 년 3 월 ) Control WE-Cho AE-Cho mlmlmlmlmlml Fig.7. Microscopy images of porcine lipocytes treated with Chowiseungcheng-tang extracts depend on concentrations ( 100). A : Normal fat tissues of porcine B : Control treated with 0.9% Normal Saline C : Treated with 0.1 / water extract of Chowiseungcheng-tang D : Treated with 1.0 / water extract of Chowiseungcheng-tang E : Treated with 10.0 / water extract of Chowiseungcheng-tang F : Treated with 0.1 / alcohol extract of Chowiseungcheng-tang G : Treated with 1.0 / alcohol extract of Chowiseungcheng-tang H : Treated with 10.0 / alcohol extract of Chowiseungcheng-tang

調胃升淸湯의알코올및熱水추출물이지방세포대사에미치는영향 137 환을잇는중요한연결고리로이해되고있다 29). 비만에대하여한의학에서는 內經 30) 에서 肉堅皮 30) 30) 31) 滿者肥 로최초언급된이래肥, 肥人, 肥白人, 肥症 32) 32), 肥病등으로표현되고있으며, 기존연구에따르면비만인의대다수는太陰人인것으로나타나고있다 8,33).

11 調胃升淸湯의알코올및熱水추출물이지방세포대사에미치는영향 137 환을잇는중요한연결고리로이해되고있다 29). 비만에대하여한의학에서는 內經 30) 에서 肉堅皮 30) 30) 31) 滿者肥 로최초언급된이래肥, 肥人, 肥白人, 肥症 32) 32), 肥病등으로표현되고있으며, 기존연구에따르면비만인의대다수는太陰人인것으로나타나고있다 8,33). 비만의원인은內的要因과外的要因으로크게분류하는데, 內的要因은氣虛의虛證과濕, 痰, 熱등의實證및內傷七情등이고, 外的要因은活動減少, 外感濕邪, 膏粱飮食의過食등이다 1). 비만의치료에는虛證인경우에는健脾, 益氣, 補腎, 溫陽, 養陰하는治法을주로응용하고, 實證인경우에는祛濕 ( 化濕 ), 化痰 ( 祛痰 ), 水, 消導, 活血, 化瘀, 通腑하는治法이주로응용되며, 그외에疎肝膽, 升降三焦하는治法을사용하는데, 그중에서도虛證인경우에는健脾法, 實證인경우에는祛濕除痰法이주로사용되고있다 34). 현재까지비만의한의학적인치료와관련하여신등 35) 은비만의치료에관한임상적비교연구에서肥滿鍼의효과를피력했으며, 박등 36) 은耳鍼治療의체중감소효과에대한임상연구결과를보고했고, 정등 37) 은비만환자의電鍼治療임상례를보고했으며, 김등 38) 은비만치료및예방에대한한약의효능연구에서임상에서많이사용되는體減行血薏苡仁湯, 體減補血安神湯, 肥減丸의효과를입증했으며, 최근에는蒼朮, 薏苡仁, 麻黃, 蒼朮合薏苡仁, 麻黃合綠茶, 赤小豆, 熊膽, 牛黃, 山査, 子등의藥鍼이비만에미치는영향에대한연구등약침과비만과의관련성에대한연구가활발히이루어지고있다 39-43). 비만에있어藥鍼法은비만의가장대표적인병리인濕痰에직접적인주사요법을사용함으로써국소적인셀룰라이트 (cellulite : 피하에정체되어있는지방, 수분그리고신진대사배설물등복합적인물질로이루어져있으며, 한의학적병리에서의濕痰과비슷하다고볼수있다 44) ) 의제거및전신적인증상에대한내과적인치료를할수있는방법이다. 이는약리이론과경락이론의병행이라는장점을갖고있어일관된병리에따른치료지침을제공할수있을뿐아니라內服만으로치료해오던약물치료의단순함을극복하고또內服이어려운환자들에게까지응용할수있어서비만의한의학적치료방법을다양화시킬수있을것으로생각되고있다 44). 본연구에사용된調胃升淸湯은食後滿腿脚無力中消 6) 善飢者에사용되는처방으로 東醫壽世保元 9) 에太陰人의胃脘受寒表寒病중肺燥寒症에사용되는太陰調胃湯에 子의양을줄이고 (2 錢 1.5 錢 ) 遠志, 天門冬, 酸棗仁, 眼肉등安神藥類를加味한것이다 7,10). 天門冬은淸熱化痰潤燥한다고하는데이때의淸熱은虛熱을다스리는의미로생각된다. 酸棗仁, 遠志, 眼肉은安神시키는데, 遠志는祛痰하면서安神시키고, 酸棗仁은心臟을편안하게하면서安神시키고, 眼肉은心臟을補하면서安神시킨다. 그리고크게보면虛熱을제거하는것도安神시킨다고볼수있다 10). 즉, 이처방은이미비만의약물치료로널리응용되고있는太陰調胃湯에安神과發汗의효과를증강시킨처방이라고볼수있는데 7), 石菖蒲, 遠志, 酸棗仁, 眼肉등의補心安神하는약물구성으로스트레스로인한폭식에유효한효과를거둘수있으며, 특히麻黃의加減으로적절한체중감소의효과를얻을수있으리라사료된다 8,10). 麻黃은에페드라 (ephedra) 가함유된약용식물로한의학에서는강력한發汗藥으로理에서營衛氣血이운행하는것을發散하고全身經絡을通行하여發汗하고肺經壅 을宣通하니營衛가壅 하여無汗하기쉬운太陰人체질에쓰이는약물이다 8,45). 麻黃은특히음식섭취의감소를유발하고, 에너지소비를증가시켜체중을감소시키는부가적인효과가있다고보고되고있다 46). 이러한효과를가진調胃升淸湯과비만에관련하여신등 7) 은調胃升淸湯및그加味方이비만마우스의체중과혈청함량변화에미치는영향연구에서調胃升淸湯과調胃升淸湯加味方의체중감소효과및지질감소효과등을입증하였고, 서등 8) 은비만환자에대한調胃升淸湯의효과및부작용에관한임상적관찰보고에서특히太陰人에게調胃升淸湯을투여한경우효과적인체중감량이있었다는등의결과를보이는등현재까지연구보고는있어왔으나소수에그쳤으며, 더욱이대부분熱水추출물의형태로만실험에사용되었고알코올및熱水추출방식에따른調胃升淸湯이지방세포대사에미치는영향에관한비교연구는아직까지이루어지지않았다. 따라서저자는본연구에서調胃升淸湯의알코올및熱水추출물이지방세포의분화와분해에어떤영향을미치는지비교연구하여보다더효과적인치료를위한추출방식에대하여고찰해보고자했고, 추출액의돼지복부지방층주입으로국소지방세포에미치는영향을관찰하여실험에서시행한시술과비슷한방식이라사료되는약침요법의국소비만치료가능성및효과를알아보고자했다. 3T3 미분화지방세포 (preadipocyte, Fig. 2 A) 를배양한결과배양 10일째에성숙된지방세포가형성됨을알수

12 138 대한약침학회지제 11 권제 1 호 (2008 년 3 월 ) 있었다 (Fig. 2 B). 지방세포의형성을확인하기위하여세포질내에축적된중성지방 (triglyceride) 을염색하는시약인 Oil Red O를이용하여세포염색을시행한결과성숙지방세포의형성이잘되었음을알수있었다 (Fig. 2 C&D). 본실험에사용된전지방세포 (preadipocyte) 인 3T3- L1 세포는 3T3 세포로부터유래된細胞柱로서그생물학적특성이잘밝혀져있고, 적절한조건아래에서배양하면지방세포 (adipocyte) 로분화하는성질을갖고있어지방세포의대사과정은물론지방축적과지방세포의분화과정을연구하는데널리사용되고있다 47-50). 調胃升淸湯의알코올및熱水추출물이지방세포의분화에미치는영향에대하여알아보기위하여농도별분화에미치는영향과 GPDH 활성에미치는영향을관찰해보았다. 먼저알코올추출과熱水추출된調胃升淸湯 extract를각각 1.0, 0.1, 그리고 0.01 의농도로하여 3T3 지방전구세포의분화전단계에서배지에처리한후농도별로지방세포의분화에미치는영향을관찰한결과, 熱水추출물은대조군에비하여전농도에서차이를나타내지않고비교적광범위한지방세포의형성을나타내는것으로관찰되었다 (Fig. 3 C-E). 알코올추출물은대조군에비하여 1.0 에서는현저하게분화를억제하고있었고, 0.1 의농도에서는약간의억제를, 0.01 의농도에서는뚜렷한차이를나타내지못하는것을알수있었다 (Fig. 3 F-H). 그리고, Oil Red O를이용하여세포염색을시행한결과熱水추출물은 1.0 의농도에서, 알코올추출물은 1.0, 0.1 의농도에서대조군에비하여지방세포의분화를억제하고있음을알수있었다 (Fig. 4). 이상의결과를종합해보면調胃升淸湯추출물은고농도 ( 특히 1.0 ) 에서지방세포의분화기전에작용하며, 熱水추출물보다는알코올추출물의분화억제효과가더욱좋은것으로나타났다. 그리고, 調胃升淸湯알코올및熱水추출물이전지방세포로부터지방세포로의분화에미치는영향을알아보기위하여 GPDH 활성을측정하였다. GPDH는지방세포의형성에관여하는중요한효소로미분화 3T3 지방세포가성숙한분화지방세포로전환됨에따라 GPDH 효소활성은증가하게된다. 調胃升淸湯熱水추출물의첨가농도에따른 GPDH 활성은 0.1 농도이외에는변화가관찰되지않았다. 즉, 熱水추출물은지방합성에영향을거의미치지못하였음을알수있었다. 반면, 알코올추출물은 0.01, 0.1 및 1.0 농도첨가에따라 GPDH 활성은각각 70.6, 43.0 및 22.5 mu/min/ protein으로감소하여 (Table 2.) 농도의존적으로 GPDH 활성을감소시켰고, 특히 0.1 및 1.00 농도에서대조군보다유의한억제를나타내었다. 調胃升淸湯알코올및熱水추출물의지방합성억제효과를비교해보면, Fig. 5에서와같이, 0.1 및 1.0 의농도에서알코올추출물이熱水추출물에비해 GPDH 활성을각각현저히감소시켜알코올추출물이熱水추출물보다지방합성을현저히억제시킴을알수있었다. 調胃升淸湯알코올및熱水추출물이분화된지방세포의지방분해에미치는영향은 glycerol 함량을측정함으로써조사하였다. 지방은 glycerol과 fatty acid로분해되므로 glycerol의함량이많아지는것은지방세포의분해가증가되었음을의미한다. 그결과, 調胃升淸湯알코올및熱水추출물모두 0.1 및 1.0 농도에서방출된 glycerol 농도가유의적으로증가하여지방분해를촉진시켰음을알수있었다 (Table 3). 또한 1.0 의농도에서는알코올추출물이熱水추출물에비해 glycerol 농도가유의적으로높게관찰되어고농도에서알코올추출물의지방분해효과가더높은것으로관찰되었다 (Fig. 6). 調胃升淸湯알코올및熱水추출물이돼지지방세포의용해에미치는영향을알아보기위해알코올추출과熱水추출된調胃升淸湯 extract를각각농도별로 10.0, 1.0, 그리고 0.1 로희석하여 1.0ml, 26gauge 주사기에준비한후돼지의지방층에주입한결과調胃升淸湯熱水추출물은 10.0 의농도에서만지방세포에광범위한손상을일으켰으나, 調胃升淸湯알코올추출물은전농도에서광범위한세포막의파괴를동반한세포사멸작용을일으켰음을알수있었다. 따라서신선한지방세포에서調胃升淸湯알코올추출물은熱水추출물에비하여지방세포파괴작용이더욱우수함을알수있었다 (Fig. 7). 이상調胃升淸湯알코올및熱水추출물이지방세포의분화, 분해에미치는영향및돼지지방세포의용해에미치는영향을관찰해본결과특히調胃升淸湯알코올추출물이熱水추출물에비하여월등한효과를나타내어전반적으로비만치료에더큰효과를나타낼것으로보였다. 따라서비만치료제로서의한약복합제제의추출방식이치료효과에큰영향을미칠것이라생각되는바기존의熱

13 調胃升淸湯의알코올및熱水추출물이지방세포대사에미치는영향 139 水추출방식보다더효율적인추출방식의개발이필요하다고사료된다. 또한돼지지방세포의용해에미치는영향에관한결과에서약침치료가국소비만치료에도움이될수있을것이라미루어짐작할수있었으며앞으로보다더심도깊은연구가이루어져특히최근문제시되고있는대사증후군과관련된인슐린저항성발생의중요한요인인복부비만의치료에활용된다면임상적으로큰도움이될것이라생각된다. Ⅴ. 結論 지방세포에광범위한손상을일으켰으나, 調胃升淸湯알코올추출물은전농도에서광범위한세포막의파괴를동반한세포사멸작용을일으켰음을알수있었다. 따라서신선한지방세포에서調胃升淸湯알코올추출물은熱水추출물에비하여지방세포파괴작용이더욱우수함을알수있었다. 이상의결과로알코올추출물이熱水추출물에비하여전반적으로비만치료에더큰효과를나타낼것으로생각되며, 향후국소부위비만치료에유효하게이용될수있을것으로사료된다. 調胃升淸湯의추출방식에따른비만치료효과를알아보기위해 3T3-L1 세포 (preadipocytes) 와 rat의정소상체지방세포 (adipocytes) 를이용하여지방세포의분화와분해에미치는영향을관찰하였고, 생체지방세포에미치는영향을관찰하기위하여돼지의지방조직에처리한후조직학적관찰을시행한결과다음과같은결론을얻었다. 1. 농도별지방세포의분화에미치는영향을관찰해본결과調胃升淸湯추출물은고농도 ( 특히 1.0 ) 에서지방세포의분화기전에작용하며, 熱水추출물보다는알코올추출물의분화억제효과가더욱좋은것으로나타났다. 2. 調胃升淸湯알코올추출물과熱水추출물의지방합성억제효과를비교해보면, 0.1 및 1.0 의농도에서알코올추출물이熱水추출물에비해 GPDH 활성을각각현저히감소시켜알코올추출물이熱水추출물보다지방합성을현저히억제시킴을알수있었다. 3. 調胃升淸湯알코올추출물과熱水추출물모두 0.1 및 1.0 농도에서방출된 glycerol 농도가유의적으로증가하여지방분해를촉진시켰음을알수있었다. 또한 1.0 의농도에서는알코올추출물이熱水추출물에비해 glycerol 농도가유의적으로높게관찰되어고농도에서알코올추출물의지방분해효과가더높은것으로관찰되었다. 4. 調胃升淸湯추출물을돼지의지방층에주입한결과調胃升淸湯熱水추출물은 10.0 의농도에서만 Ⅵ. 參考文獻 1. 全國韓醫科大學再活醫學科學敎室. 東醫再活醫學科學. 서울 : 書苑堂 ; 1995, p Diehle HS, Darlynple W. Obesity and Digestive disorder and disease. Healthful living. New York: McGraw-Hill; 1973, p National Heart, Lung, and Blood Institute in cooperation with The National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases. Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Overweight and Obesity in Adults. The Evidence Report: National Institute of Health. 1998: Available from URL: /obesity/ob.home.htm 4. CDC(Centers for Disease Control and Prevention). Resource Guide for Nutrition and Physical Activity Interventions to Prevent Obesity and Other Chronic Diseases : Available from URL: cdc.gov/hccdphp/dnpa /sitemap.htm 5. 탁양주, 이영성, 이진석, 강재헌. 최근국내비만연구의경향 : 1984년부터 2002년까지. 대한비만학회지. 2004;13(1): 박인상. 東醫四象要訣. 서울 : 소나무 ; 1992, p 濟馬. 東醫壽世保元. 서울 : 행림출판사 ; 1986, p. 7, , 서동민, 이상훈, 이재동. 비만환자에대한調胃升淸

14 1 대한약침학회지제 11 권제 1 호 (2008 년 3 월 ) 湯의효과및부작용에관한임상적관찰. 대한침구학회지. 2005;22(3): 濟馬. 東醫壽世保元. 서울 : 행림출판사 ; 1986, p. 7, , 류주열. 東醫四象醫學講座. 경기 : 대성의학사 ; 2003, p 보건복지부. 한약재수급및유통관리규정제 2조 2 항보건복지부고시제 호 Singh R, Artaza JN, Taylor WE, Braga M, Yuan X, Gonzalez-Cadavid NF, Bhasin S. Testosterone inhibits adipogenic differentiation in 3T3-L1 cells: Nuclear translocation of androgen receptor complex with β-catenin and T-cell factor 4 may bypass canonical Wnt signaling to downregulate adipogenic transcription factors. Endocrinology. 2006;147: Negrel R, Dani C. Culture of adipose precursor cells and cells of clonal lines from animal white adipose tissue. In Adipose Tissue Protocols. G. Ailhaud(ed). Totowa, NJ: Human Press, Inc.; 2001, p 안영성, 성낙술, 함인혜, 최호영. 부평의면역및항암활성연구. 대한본초학회지. 2004;19(3): Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding. Anal. Biochem. 1976;72: Rodbell M. Metabolism of isolated fat cells. I. Effects of hormones on glucose metabolism and lipolysis. J. Biol. Chem. 1964;239: Zalatan F, Krause JA, Blask DE. Inhibition of isoproterenol-induced lipolysis in rat inguinal adipocytes in vitro by physiological melatonin via a receptor-mediated mechanism. Endocrinology. 2001;142: McGowan MW, Artiss JD, Strandbergh DR, Zak B. A peroxidase-coupled method for the colorimetric determination of serum triglycerides. Clin. Chem. 1983;29: Steel RGD, Torrie JH. Principles and Procedures of Statistics, 2nd ed. New York: McGraw-Hill; 1980, p 이광우. 비만증의진단과평가. 대한비만학회지 ;1(1): 대한비만학회. 임상비만학 ( 제2판 ). 서울 : 고려의학 ; 2001, p 김영설. 비만증의진단과평가. 대한비만학회지제 11권부록제 2호 ( 대한비만학회제 5회연수강좌 ). 2002: Fontbonne A, Thibult N, Eschwge E, Ducimetire P. Body fat distribution and coronary heart disease mortality in subjects with impaired glucose tolerance or diabetes mellitus: the Paris Prospective Study, 15-year follow up. Diabetologia. 1992;35: Folsom AR, Kaye SA, Sellers TA, Hong C-P, Cerhan JR, Potter JD, Prineas RJ. Body fat distribution and 5-year risk of death in older women. Journal of the Amerian Medical Association. 1993;269: Kalmijn S, Curb JD, Rodriguez BL, Yano K, Abbott RD. The association of body weight and anthropometry with mortality in elderly men: The Honolulu Heart Program International Journal of Obesity. 1999;23: Reaven GM. Role of insulin resistance in human disease. Diabetes. 1988;37: Haffner SM, Valdez RA, Hazuda HP, Mitchell BD, Morales PA, Stern MP. Prospective analysis of the insulin resistance syndrome (Syndrome X). Diabetes. 1992;41: Grundy SM. Hypertriglyceridemia, insulin resistance, and the metabolic syndrome. Am J Cardiol. 1999;83:25F-9F. 29. Kissebah AH, Krakower GR. Regional adiposity and morbidity. Physiological Reviews. 1994;74: 王. 黃帝內經樞. 臺北 : 臺灣中華書局 ; 1972, p. 155, 編註醫學入門. 서울 : 大星文化社 ; 1990, p.( 外

15 調胃升淸湯의알코올및熱水추출물이지방세포대사에미치는영향 141 集卷一 )278, p.( 外集卷二 ) 陳貴延. 實用中西醫結合診斷治療學. 北京 : 中國醫藥科學技術出版社 ; 1991, p 김달래, 백태현. 四象體質과肥滿의상관성에관한임상적연구. 사상의학회지. 1996;8(1): 조홍건, 김병덕. 肥滿症의原因과病機및治法에관한文獻的考察. 대전대학교한의학연구소논문집. 1992;1(2): 신현대, 김성수, 이응세. 肥滿의治療에關한臨床的比較硏究. 대한한의학회지. 1992;13(2): 박상용, 이병열. 肥滿治療에대한鍼灸및藥物治療의臨床的硏究. 大田大學校文集韓醫學編. 1994;2(2): 정선희, 남상수, 김용석, 이재동, 최도영, 고형균등. 肥滿患者의電鍼治療床例. 대한침구학회지. 1999;16(3): 김연섭, 변성희, 서부일, 김상찬, 국만, 조응행. 비만치료및예방에대한한약의효능연구 (Ⅱ). 대한본초학회지. 2000;15(1): 윤대환, 강자돈, 주준성, 채우석, 나창수. 高脂肪食餌로誘發된肥滿白鼠모델에서蒼朮, 薏苡仁, 麻黃, 蒼朮合薏苡仁, 麻黃合綠茶藥鍼이血淸脂質및肝機能에미치는影響. 제 3회대한약침학회학술대회논문집. 2004;7(1): 지준환, 이준무. 赤小豆蒸溜藥鍼이肥滿쥐의脂質構成, 肝臟機能, 抗酸化效果및分子生物學的特性에미치는影響. 대한약침학회지. 2005;8(2): 조희철, 이시형, 신조영, 김강산, 조남근, 권기록, 임태진. 熊膽과牛黃藥鍼이지방세포대사에미치는영향. 대한침구학회지. 2007;24(4) : 정영표, 윤여충, 윤대환. 胃兪의山査藥鍼이高脂肪食餌로誘發된肥滿白鼠에미치는影響. 대한침구학회지. 2007;24(4): 강수우, 위통순, 윤대환. 脾兪에대한羅蔔子藥鍼이고지방식이로유발된肥滿白鼠에미치는영향. 대한침구학회지. 2007;24(5): 주집성, 채우석, 신미숙, 나창수. 肥滿治療를위한經穴및藥物에관한考察. 대한경락경혈학회지. 2003;20(3): 김호철. 韓藥藥理學. 서울 : 集文堂 ; 2001, p Astrup A, Breum L, Toubro S, Hein P, Quaade F. Ephedrine and weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord Sep;16(9): Green H, Kehinde O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1974;1: Green H, Kehinde O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. Cell. 1974;3: Green H, Kehinde O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture Ⅱ. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 1975;5: Green H, Kehinde O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion. Cell. 1976;7:

α α α α α

α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를