The Korean Journal of Pathology 2005; 39: 자궁내발달지연과정상말기임신태반에서의 Telomerase 활성도와 MIB-1 및 Fas, Fas Ligand 발현차이에관한연구 전이경 홍성란 양문호 1 성균관대학교의과대학삼성제일병원병리

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1 The Korean Journal of Pathology 2005; 39: 자궁내발달지연과정상말기임신태반에서의 Telomerase 활성도와 MIB-1 및 Fas, Fas Ligand 발현차이에관한연구 전이경 홍성란 양문호 1 성균관대학교의과대학삼성제일병원병리과 1 경희대학교의과대학병리학교실 Telomerase activity and Expression of MIB-1, Fas and Fas Ligand in Placentas from Women with and without Intrauterine Growth Retardation Yi Kyeong Chun, Sung Ran Hong and Moon Ho Yang 1 Department of Pathology, Samsung Cheil Hospital, Sungkyunkwan University School of Medicine, Seoul; 1 Department of Pathology, Kyung Hee University, College of Medicine, Seoul, Korea 접수 : 2004년 11월 22일게재승인 : 2005년 1월 25일 책임저자 : 양문호우 서울시동대문구회기동 1 경희의료원병리과전화 : Fax: yang0604@khmc.or.kr * 본연구는 2001 년도삼성제일병원제일의료장학재단연구비지원으로수행되었음. Background : The placenta from a pregnancy that is complicated by intrauterine growth retardation (IUGR) tends to be smaller than that from a normal pregnancy. To investigate this difference, we analyzed the telomerase activity, the proliferative activity and the mrna levels of apoptosis mediators in placentas. Methods : In 20 placentas from normal third-trimester pregnancies and 22 placentas form pregnancies that were complicated by IUGR, the telomerase activity was detected by a telomeric repeat amplification protocol assay. The proliferative activity was assessed by immunohistochemical staining using the MIB-1 monoclonal antibody. The expression of the apoptosis mediator was evaluated by semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reactions for fas and fas ligand. Results : Telomerase activity was detected in 2 (10%) of 20 normal placentas, whereas it was not observed in all tested 13 placentas that were associated with IUGR. The proliferative activity was significantly low in the placentas that were associated with IUGR (7.44±2.96%), compared with the normal placentas (11.0±3.48%, p=0.002). There was no statistically significant difference in the mrna levels of fas or fas ligand between two groups. Conclusions : Low telomerase and proliferative activities in the placenta may play a role in the pathogenesis of IUGR. Key Words : Telomerase; MIB-1; Fas; Fas-ligand; Placenta 태반은태아와모체간의실질적인물질을교환하고내분비기능을통하여임신기간동안태아의생존에필요한항상성을유지시키는기능을담당한다. 그리고이러한과정은세포의증식과성숙, 사멸의상호균형으로이루어진다. 또한태반은임신중에만그기능을하고태아의출생과함께퇴화하기때문에, 세포의증식이나성숙, 사멸등의변화가현저하여세포의증식이나세포자멸사 (apoptosis) 를연구하기에적합한장기이다. 1 자궁내발달지연은주산기사망률과이환율을높이는가장중요한위험인자로자궁기형이나쌍태아및다태아임신, 산모의영양결핍, 자간전증이나자간증, 담배나약물남용등여러가지원인에의해발생한다. 자궁내발달지연태반은정상임신태반보다크기가작고, 정상보다적은수의세포를포함하게된다. 2 이와같은크기와세포수의감소는세포증식력의감소나세포자멸사의증가, 또는양자모두에의해발생하는것으로생각된 다. 그기전을밝히는일은자궁내발달지연의병리를이해하고나아가인간의노화나사망을연구하는데기여할수있을것이다. 최근세포의증식에중요한역할을하는것으로알려진 telomerase 에대한관심이높아지고있다. Telomerase는 telomeric DNA 를합성하여종말체의길이를연장시키는특수한역전사효소로서, 세포내에활성화된 telomerase가없으면세포분열을하는동안종말체의길이가짧아져노화또는사망에이르게된다. 인체내의대부분의세포는 telomerase를가지고있으나불활성상태로있기때문에세포가노화하거나죽지만, 조혈세포나생식세포, 종양세포등에서는 telomerase가활성화되어있어서계속분열하고증식하게된다. 현재까지의연구에의하면정상태반에서의 telomerase는임신후반보다임신초기에더많이활성화되어있는것으로알려졌다. 1,3,4 자궁내발달지연태반에서의세포증식은연구자에따라정상과차이가없거나감소하는 34

2 자궁내발달지연태반의 Telomerase 활성도와세포증식 35 등결론이나지않은상태이다. 3,5 1972년 Kerr 등 6 에의해처음기술된세포자멸사는 DNA 손상을받은세포가복구되지않을경우능동적으로세포사망에이르게하는경로이며, fas와 fas ligand, bcl-2, bax 등여러인자에의하여조절이되는복잡한과정이다. 사람의정상태반에서는임신기간이오래경과할수록세포자멸사가증가하는것으로알려졌다. 4,7,8 Fas와 fas ligand는 tumor necrosis factor (TNF) family에속하는세포막단백이다. Fas-fas ligand system은각막이나정소와같은 immune-privileged site에서세포자멸사를촉진하여염증세포를죽이는기능을한다. 9,10 Fas는다양한조직에서발현되지만 fas ligand는순환하는림프구, immune-privileged site 와태반의영양막세포에서만발현된다. 11 임신성고혈압이나자간전증에서의세포자멸사의증가에 fas와 fas ligand의발현의변화가관련된다고한다. 12,13 Smith 등 14 과 Kudo 등 4 은자궁내발달지연태반에서세포자멸사가증가하였다고보고하였다. 그러나자궁내발달지연태반에서세포자멸사를조절하는 fas와 fas ligand와같은각각의인자들에대하여는아직연구된바가없다. 본연구에서는자궁내발달지연태반에서세포수가줄어드는기전을밝히고, 세포증식에관련하여 telomerase 활성도와 MIB- 1 염색을통하여자궁내발달지연태반과정상임신태반과의차이를비교하고자하였다. 또한세포자멸사를조절하는인자인 fas 와 fas ligand의발현이자궁내발달지연태반에서의세포자멸사증가와관련이있는지를살펴보고자하였다. 재료와방법연구대상 말기임신태반조직은임신 38주부터 40주 ( 평균 38.3±0.6주 ) 사이에제왕절개로분만된것을사용하였고, 태반의무게는평균 510±95 gm, 태아는평균 3,227±366 gm이었다. 신선태반조직은정상말기임신태반 20예와자궁내발달지연태반 13예였고, 제왕절개분만후 30분이내에채취한신선한태반조직을 telomerase와 fas, fas ligand 발현을보기위하여액화질소에서급속냉동한후 -70 냉동고에동결보관하였다. 태반조직은융모조직만을얻기위하여변연부는피하였고육안상정상으로보이는부분에서채취하였다. 태반조직의일부는 H&E염색과 MIB-1 면역조직화학염색을위하여 10% 중성포르말린에고정하여파라핀블록으로보관하였다. 9예의자궁내발달지연태반은 MIB-1 면역조직화학염색을시행하기위하여보관되어있던파라핀블록중에서고정이잘되고조직상태가좋은증례로골랐다. Telomerase 활성도측정을위한 Telomerase Repeat Amplication Protocol (TRAP) assay 단백질추출절제한태반조직을액체질소가들어있는용기에넣어급속냉동시킨후실험을하기전까지 -70 냉동고에보관하였다. 액체질소하에서급속냉동된조직을분말상태가될때까지막자로분쇄한후분말을 1.5 ml 튜브로옮겼다. 냉각된 lysis 완충액 (10 mm tris-hcl (ph 7.5), 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 0.1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, 5 mm -mercaptoethanol, 0.5% CHAPS (Sigma, USA), 10% glycerol) 300 L를넣고용해시켰다. 얼음에서 30분간반응한후 4, 15,000 g에서 30분간원심분리하여얻은상층액을실험에사용하기전까지 -70 에서보관하였다. 추출물의단백질농도는 Bradford assay (Bio-Rad, USA) 로측정하였다. 자궁내발달지연태반조직 22예와대조군인정상말기임신 (third trimester) 태반조직 20예로구성된총 42예를연구대상으로하였다. 자궁내발달지연태반조직 22예는신선태반 13 예와파라핀블록 9예로이루어졌고, 정상말기임신태반조직 20예는모두신선태반이었다. 자궁내발달지연태반조직 22예중신선태반 13예는 2000년 4월부터 2001년 6월까지성균관의대삼성제일병원산부인과에서자궁내발달지연으로진단받고제왕절개한산모중에서태아의체중이 10 percentile 미만이었던예에서얻었다. 자궁내발달지연태반조직중파라핀블록 9 예는성균관의대삼성제일병원병리과에보관되어있던블록중 1998년에자궁내발달지연으로진단받고제왕절개로얻은태반가운데태아의체중이 10 percentile 미만이었던예에서골랐다. 자궁내발달지연태반조직은임신 30주에서 40주 ( 평균 36.6± 2.3주 ) 사이에분만한여성으로부터채취하였고, 태반의무게는평균 290±78 gm, 태아는평균 1,907±421 gm이었다. 정상 Polymerase Chain Reaction (PCR) 0.2 ml PCR용튜브에 15 pmol의 CX primer (5 -CCCTT- ACCCTTACCCTTACCCTAA-3 ) 를넣고 wax로차단하였다. 그리고 20 mm tris-hcl (ph 8.0), 1.5 mm MgCl2, 50 mm KCl, 0.005% Tween 20, 1 mm EGTA, 50 M dntps, 15 pmol의 TS primer (5 -AATCCGTCGAGCAGAGTT-3 ) 와추출한단백질 1 g과 2U의 Taq DNA polymerase를넣은후, 증류수로전체량이 50 L가되게하였다. 25 에서 30분간반응시키고, 94 에서 2분간가열하여 telomerase 의활성을억제시켰다. 94 에서 30초, 50 에서 30초, 72 에서 45초의반응을 35회실시하였다. PCR 산물은 12% polyacrylamide gel에서전기영동한다음, ethidium bromide로가시화하였다. Telomerase 활성도는추출한단백질 1 g을반응시켰을때 6 bp DNA ladder가보이는것을양성, 없는것을음성으로하였다. 양성대조군으로는암세포주인 C33A를사용하였고, 음성대조군은

3 36 전이경 홍성란 양문호 lysis 완충액와양성대조군인 C33A의 RNA에 RNase를처리하여사용하였다. 반정량적 RT-PCR (Semiquantitative Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction) 에의한 fas, fas ligand 의발현 Total RNA 획득동결된태반조직을분말상태로분쇄하여 1.5 ml 튜브에옮기고 Tri-reagent solution (MRC, USA) 1 ml를첨가하여용해하였다. Chloroform 용액 200 L를첨가하여혼합하고, 4 에서 10,000 rpm으로 10분간원심분리하였다. 상층액을새로운튜브로옮긴후동량의 isopropyl alcohol을첨가한다음혼합하여 10분간정치하였다. 그리고 4 에서 10,000 rpm으로 10분간원심분리하였다. 상층액을제거한다음 RNA pellet을 70% ethanol 로세척하였다. RNA pellet을적당량의 0.1% DEPC가처리된증류수에용해하였다. cdna 합성 0.2 ml PCR용튜브에 4 g의 total RNA, 5X RT buffer, 10mM dntps, 100 pmol Oligo dt (17), MMLV reverse transcriptase 200 units를넣은후증류수로전체량이 25 L가되게혼합하였다. 37 에서 1시간동안배양하여 cdna를합성하였다. PCR 0.2 ml PCR용튜브에 2-4 L의 total RNA, 10X PCR buffer, 10 mm dntps, 각각 10 pmol 씩의상류와하류 primer, Taq DNA polymerase 1 unit를넣은후증류수로전체량이 50 L가되게혼합하였다. Fas는 94 50초, 초, 72 30초의반응을 35회실시하였고, fas ligand는 94 50초, 64 30초, 72 30초의반응을 35회실시하였다. Fas와 fas ligand 그리고 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자의증폭을위하여사용한 primer의염기서열은 Table 1과같다. 증폭된산물은 2% agarose gel에서전기영동한다음 ethidium bromide로염색하여관찰하였다. Table 1. Sequences of fas, fas ligand and GAPDH primers Primers Sequences Product Fas forward reverse Fas ligand forward reverse GAPDH forward reverse 187 bp 5 -GGACCCAGAATACCAAGT-3 5 -GGCAAAAGAAGAAGACAAAG bp 5 -GGAATGGGAAGACACCTATGG-3 5 -GATGGAGGGGAAGATGATGA bp 5 -CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3 5 -AGCCTTCTCCATGGTGGTAAGAC-3 GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. 영상분석기 (Image analyzer) 를통한정량분석 Fas와 fas ligand 유전자의발현정도를영상분석기 (Vilber Lourmat, France) 를이용하여정량분석하였다. 분석방법으로는 fas와 fas ligand PCR 산물의밀도 (density) 를 house keeping 유전자인 GAPDH PCR 산물의밀도로나누어보정한후정량하는, 반정량적분석방법을사용하였다. MIB-1의면역조직화학염색 Avidin-biotin conjugate법을이용하여 MIB-1 항체에대한면역조직화학염색을하였다. 파라핀포매된태반조직은 4 m의두께로박절하여 poly L-lysin으로처리한슬라이드에붙인후신전기에서 2시간이상건조하고탈파라핀단계와함수단계를거쳤다 M sodium citrate 완충액 (ph 6.0) 에서 5분간 3회전자렌지를이용한가열처리후, Tris 완충액으로 3회세척하고 3% H2O2에서 10분간반응시켜서내인성과산화효소의작용을억제하였다. 그리고정상혈청으로 30분간반응하여비특이적결합을억제시킨후일차항체인 MIB-1 (Immunotech, France) 을4 에서 18시간동안반응시켰다. 다음이차항체 (biotinylated anti-mouse antibody) 를 25분간반응시키고 avidin-biotin peroxidase complex와 25분간반응시켰다. 이과정은 DAKO- LSAB kit를이용하여수행하였다. 발색제로 AEC (3-amino- 9-ethylcarbazole) 를사용하고 Mayer hematoxylin으로대조염색한후, 수용성봉입제로봉입하여현미경으로관찰하였다. MIB-1 항체에의해염색된검체는고배율 (400, Olympus BX40) 시야에서가장염색이잘된다섯군데를선택하여양성으로염색된세포의백분율을구하였다. 통계처리통계처리는 Statistical Product and Service Solution (SPSS) 프로그램을이용하여비교분석하였다. Telomerase 활성도는 Fisher's exact test로분석하였고, MIB-1 염색에의한세포증식능은 Mann-Whitney test로분석하였다. Fas와 fas ligand 유전자의발현은 t-test로분석하였다. 통계적검정의유의수준은 5% 미만으로하였다. 결과 TRAP assay에의한telomerase의발현 TRAP assay에의한 PCR 생성물을 12% acrylamide gel에서전기영동한결과, 6 bp의 DNA laddering을관찰하였다. 양성대조군으로사용한 C33A 암세포주에서는 ladder가관찰되었으나, 음성대조군으로사용한 RNase로처리한암세포주와 lysis

자궁내발달지연태반의 Telomerase 활성도와세포증식 37 완충액에서는 ladder가관찰되지않았다. 본연구에서대조군인정상말기임신태반에서는 20예중 2예 (10%) 에서 telomerase ladder가발현되었고, 자궁내발달지연태반 13예는모두발현되지않았다 (Fig. 1)(Table 2).

48%, 자궁내발달지연태반 22예는 7.44±2.96% 의증식지수를나타내어정상태반이자궁내발달지연태반보다유의하게높은증식능을보였다 (Mann-Whitney test, p=0.002)(table 2). Fas 정상말기임신태반과자궁내발달지연태반조직에서 RT-PCR 에의해 fas 발현을관찰할수있었다 (Fig. 3). 자궁내발달지연태반 13예중 10예 (76.

Summary of telomerase activity and expression of MIB-1 in placenta with intrauterine growth retardation and from normal term pregnancy Placenta with IUGR Term placenta Telomerase activity a 0/13 2/20

4 자궁내발달지연태반의 Telomerase 활성도와세포증식 37 완충액에서는 ladder가관찰되지않았다. 본연구에서대조군인정상말기임신태반에서는 20예중 2예 (10%) 에서 telomerase ladder가발현되었고, 자궁내발달지연태반 13예는모두발현되지않았다 (Fig. 1)(Table 2). 통계분석에서정상말기임신태반과자궁내발달지연태반간의 telomerase 발현정도는유의한차이를보이지않았다 (Fisher's exact test, p>0.05). MIB-1 항체 MIB-1 단클론성항체로면역조직화학염색을한결과주로영양막세포의핵에서갈색으로염색되었으나, 간질세포나혈관세포에서도간혹염색되었다 (Fig. 2). 정상말기임신태반 20예는 11.0±3.48%, 자궁내발달지연태반 22예는 7.44±2.96% 의증식지수를나타내어정상태반이자궁내발달지연태반보다유의하게높은증식능을보였다 (Mann-Whitney test, p=0.002)(table 2). Fas 정상말기임신태반과자궁내발달지연태반조직에서 RT-PCR 에의해 fas 발현을관찰할수있었다 (Fig. 3). 자궁내발달지연태반 13예중 10예 (76.9%) 와정상말기임신태반 20예중 19예 (95.0%) 에서 187 bp의 band를확인하였다. 이는정상태반에서자궁내발달지연태반보다다소높은발현양상을보인것이나, 그발현정도는통계학적으로유의한차이가없었다 (Table 3). Table 2. Summary of telomerase activity and expression of MIB-1 in placenta with intrauterine growth retardation and from normal term pregnancy Placenta with IUGR Term placenta Telomerase activity a 0/13 2/20 (10%) MIB-1 b 7.44±2.96 c % 11.0±3.48 c % a, Fisher s exact test, p>0.05; b, Mann-Whitney test, p=0.002; c, mean± standard deviation. IUGR: intrauterine growth retardation. 100 bp Fas 200 bp GAPDH fas (187 bp) M bp M C Fig. 1. Telomerase activity is detected in placenta from normal term pregnancy by TRAP assay. Telomerase positive samples produced a characteristic 6 bp DNA ladder. M: molecular weight, 100 bp DNA ladder; C: positive control (c33a); 1: negative sample; 2, 3: positive samples. 200 bp Fas ligand M GAPDH fas ligand (212 bp) Fig. 3. Human fas and fas ligand genes are expressed in human placental tissue using RT-PCR. M: molecular weight, 100 bp ladder; 1, 2: positive samples; 3: negative sample. A B Fig. 2. Immunohistochemical staining of MIB-1 monoclonal antibody shows lower proliferative activity in the placenta with intrauterine growth retardation (A) compared with the placenta from normal term pregnancy (B).

5 38 전이경 홍성란 양문호 Table 3. The mrna expression of fas and fas ligand in placenta with intrauterine growth retardation and from normal term pregnancy Placenta with IUGR Term placenta Expression rate a fas 10/13 (76.9%) 19/20 (95%) fas ligand 10/13 (76.9%) 16/20 (80%) Semiquantitation b fas 0.264±0.213 c 0.349±0.260 c fas ligand 0.260±0.250 c 0.234±0.183 c a, t test, p>0.05; b, t test, p>0.05; c, mean±standard deviation. Fas ligand 정상말기임신태반과자궁내발달지연태반조직에서 RT- PCR에의해 fas ligand의발현을관찰할수있었다 (Fig. 3). 자궁내발달지연태반 13예중 10예 (76.9%) 와정상말기임신태반 20예중 16예 (80.0%) 에서 212 bp의 band를확인하여발현율에차이를보이지않았고, 발현정도에대한분석에서도유의한차이가없었다 (Table 3). 고찰 자궁내발달지연은자궁기형이나염증, 쌍태아및다태아임신, 산모의영양결핍, 자간전증이나자간증, 담배나약물남용등여러가지원인에의해발생한다. 태아-태반간혈관병증 (fetoplacental vasculopathy), 태반경색이나혈종, 영양막세포의증식, 핵농축과융합영양막결절의증가, 염증, 혈관이없는융모가과다하게관찰되는등다양한병리소견이태반에서관찰된다. 15 공통적인소견으로는태반의크기가정상임신태반보다더작고더적은수의세포를포함한다는것이다. 2 태반세포수의감소는세포증식력의감소나세포자멸사의증가, 또는양자모두에의해발생할것이다. 자궁내발달지연태반에서세포자멸사가정상보다더증가한다고보고되고있으나, 세포증식능에서는이견을보이고있다. 3,4,8,14,16 본연구는세포수가줄어드는과정에서세포증식능의변화가동반되는지의여부를밝혀보고자, TRAP assay로 telomerase 활성도를보고 MIB-1 면역조직화학염색으로세포증식지수를구하였다. 최근 telomerase와종말체가세포의생명주기를조절하는인자로밝혀져많은연구가이루어지고있다. Telomere는 TTAG- GG의반복염기서열로구성되며염색체말단부위에존재한다. 17 염색체말단을안정화시키고변성이나말단융합, 재배열등의변화로부터염색체를보호하는기능이있다. Telomerase는 telomeric DNA를합성하여종말체의길이를연장시켜염색체말단을안정화시키는특수한역전사효소이며, 세포내에활성화된 telomerase가없으면세포분열을하는동안종말체의길이가짧아지게되어사멸한다. 사람의정상태반에서 telomerase 활성도 는초기임신에서는높지만말기임신에서는현저하게낮아진다고한다. 1,3,4,18,19 Izutsu 등 3 과 Kudo 등 4 은초기태반에서각각 93.3% 와 93.5% 의높은활성도를보였으나, 임신중기와말기에서는 64.3% 와 62.5% 로낮아졌다고하였다. 조등 1 은초기임신태반에서 81.3%, 말기임신태반 (37-41주, 평균 39.3주 ) 에서 9.5% 의활성도를보였다고하였다. Cheung 등 18 은초기태반에서 36.7%, 말기태반에서 20% 였다고하였고, Kyo 등 19 은융모막에서 telomerase 활성도를연구하였는데초기태반에서 76%, 말기태반에서 4% 였다고하였다. 본연구에서는말기임신태반 (38-40주, 평균 38.3주 ) 20예중 2예인 10% 에서 telomerase 발현을보였다. 자궁내발달지연이있는태반에서의 telomerase 활성도는없거나, 있어도정상보다약하다고한다. 3,4 Kudo 등 4 은정상태반의특징적인 6 bp의 DNA ladder와비교하여자궁내발달지연태반에서는밀도가약한 band가관찰되어 telomerase 활성도가약하다고하였다. Izutsu 등 3,20 은자궁내발달지연태반에서 telomerase 활성도가관찰되지않았다고하였다. 본연구에서 telomerase 활성도는정상말기임신태반에서 10%, 자궁내발달지연태반에서는관찰되지않았고, 두군간에통계학적으로유의한차이는없었다. 그러나본연구에사용된태반의연령이자궁내발달지연임신이평균 36.6주이고정상말기임신이평균 38.3주로, 자궁내발달지연태반이정상태반보다조금이르며, 사람의정상말기태반에서의 telomerase 활성도가 4-20% 1,18,19 로낮은점을고려한다면, 본연구결과로는정상태반보다자궁내발달지연태반에서 telomerase 활성도가낮은것으로생각할수있다. Ki-67 은세포의증식능을평가할때흔히쓰이는핵내단백으로, G0와초기G1기를제외한모든세포주기에서발현되는항원이다. Ki-67항원의재조합체에대해만들어진 MIB-1 항체는파라핀포매된조직에서세포증식능을평가할수있다. 21 정상태반에서의 MIB-1 증식지수도 telomerase 활성도와마찬가지로초기임신일수록높고말기로갈수록낮아진다. 1,3,5 Izutsu 등 3 은 MIB-1 증식지수가정상초기태반에서 28.1± 1.7%, 정상말기태반에서 7.0±2.9%, 자궁내발달지연태반에서1.9±0.6% 로, 자궁내발달지연태반에서정상임신태반보다세포증식능이감소한것으로보고하였다. 그러나 Smith 등 5 은정상초기태반에서 11.8%, 중기태반에서 9.88%, 말기태반에서 3.15% 로, 임신이진행될수록세포증식능이감소하는소견을보이지만, 말기의자궁내발달지연태반에서는 3.7% 로정상말기임신과의미있는차이를보이지않았다고하였다. 본연구에서는 MIB-1 증식지수는정상말기태반에서 11.0±3.48%, 자궁내발달지연태반은 7.44±2.96% 로정상태반이자궁내발달지연태반보다유의하게높았다. 본연구에사용된태반은자궁내발달지연태반이정상태반보다조금더이른시기에얻어졌는데, 세포증식능은오히려더낮은것으로나타났다. 이와같은증식능의감소는자궁내발달지연임신에서정상임신보다태아와태반이작고태반의세포수가감소하는데직접적으로기여

6 자궁내발달지연태반의 Telomerase 활성도와세포증식 39 할것으로생각된다. 태반에서의세포자멸사는초기태반에서는영양막세포에서주로보이고말기에는융합세포영양막에서보이며임신이진행될수록증가하며, 자궁내발달지연태반에서정상보다더증가한다고보고되고있다. 4,8,14,16,22 Kudo 등 4 은 terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick endlabelling (TUNEL) 염색으로세포자멸사지수를구하였는데, 임신 26주와 39주사이의자궁내발달지연태반에서는 9.7±7.4% 인데반하여정상초기임신태반에서는 1.1±1.9%, 정상중기와말기임신에서는 2.9±3.7% 로자궁내발달지연태반에서의미있게세포자멸사가증가하였다고하였다. Smith 등 14 은말기자궁내발달지연태반에서는 0.24%, 정상임신의말기태반에서는 0.14% 로유의한차이를보였다고하면서, 세포자멸사는시작에서종료까지 1-2시간밖에걸리지않는빠른과정이기때문에미세한변화라도전체세포수의증감에서는큰차이를나타낸다고하였다. Axt 등 8 도말기자궁내발달지연태반에서 4.2± 2.96%, 정상말기임신에서 0.93±0.12% 로의미있는차이가있다고하였으나, 세포자멸사의증가가자궁발달지연의원인인지결과인지분명하지않다고하였다. 이와같이자궁발달지연태반에서세포자멸사의증가가있기때문에저자들은세포자멸사를유도하거나억제하는물질에대한비교연구가필요하다고생각하였다. Fas ligand (APO-1L 또는 CD95L) 는 TNF family에속하는세포막단백으로그수용체인 fas보다제한된조직에서발현된다. 11 태반에서는융합세포영양막이나 extravillous trophoblast 에서만들어진 fas ligand가융모사이나태반기저부에서세포를용해시킬수있는 fas-bearing maternal lymphocyte의공격으로부터태아를보호하여, 태반을 immune-privileged site로유지시킨다. 23 Koenig 등 12 은임신성고혈압에서양막과탈락막에서 fas와 fas ligand의발현이대조군보다높다는것을면역조직화학염색으로밝히고세포자멸사의증가와관련이있을것이라고하였다. Allaire 등 13 도자간전증에서면역조직화학염색과 TUNEL 염색으로 fas와 fas ligand의발현과세포자멸사를관찰하였다. 대조군과비교하여 fas ligand의발현은낮고 fas는높으며세포자멸사는증가한것으로나타났고, 이러한세포자멸사와 fas, fas ligand 발현의변화가자간전증의발병기전에영향을미칠것이라고하였다. 저자들은자궁내발달지연태반에서세포자멸사가증가하기때문에자간전증과같은 fas와 fas ligand의발현의변화가동반될수있을것이라고생각하였다. 그러나 RT- PCR 방법으로 fas와 fas ligand의발현을보고반정량한결과, 자궁내발달지연태반과정상말기임신태반간에통계학적으로유의한차이를관찰하지못하였다. 이상의결과를요약하면 telomerase 활성도와 MIB-1 염색을통한세포증식력비교에서자궁내발달지연태반은정상말기임신태반보다더낮은증식력을보였다. 따라서자궁내발달지연 임신태반에서정상말기임신태반보다세포증식력이감소하기때문에태반의크기가작아지고세포수가감소하는것으로생각된다. 세포자멸사에관여하는인자인 fas와 fas ligand 발현은자궁내발달지연태반과정상말기임신태반사이에뚜렷한차이가관찰되지않았다. 세포자멸사는여러인자가복합적으로작용하는과정이며아마도자궁내발달지연태반에서의세포자멸사의증가에는 fas와 fas ligand 이외에다른인자가더관여하리라고생각된다. 정상태반의세포자멸사에서 bcl-2와 bax 비의변화와 TNF- 가중요한역할을한다는보고가있다. 16 앞으로는이와같은인자에대한활발한연구가자궁내발달지연태반에서이루어질것으로예상된다. 참고문헌 1. Cho JS, Kang YS, Moon IG, et al. Telomerase activity and expression of MIB-1 and bcl-2 in human chorionic villi from early and term normal pregnancy. Korean J Pathol 2000; 34: Teasdale F. Idiopathic intrauterine growth retardation: histomorphometry of the human placenta. Placenta 1984; 5: Izutsu T, Kudo T, Sato T, Nishiya I, Ohyashiki K, Nakagawara K. Telomerase and proliferative activity in placenta from women with and without fetal growth restriction. Obstet Gynecol 1999; 93: Kudo T, Izutsu T, Sato T. Telomerase activity and apoptosis as indicators of aging in placenta with and without intrauterine growth retardation. Placenta 2000; 21: Smith SC, Price E, Hewitt MJ, Symonds EM, Baker PN. Cellular proliferation in the placenta in normal human pregnancy and pregnancy complicated by intrauterine growth restriction. J Soc Gynecol Investig 1998; 5: Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972; 26: Smith SC, Baker PN, Symonds EM. Placental apoptosis in normal human pregnancy. Am J Obstet Gynecol 1997; 177: Axt R, Kordina AC, Meyberg R, Reitnauer K, Mink D, Schmidt W. Immunohistochemical evaluation of apoptosis in placentae from normal and intrauterine growth-restricted pregnancies. Clin Exp Obstet Gynecol 1999; 26: Griffith TS, Brunner T, Fletcher SM, Green DR, Ferguson TA. Fas ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilege. Science 1995; 270: Bellgrau D, Gold D, Selawry H, Moore J, Franzusoff A, Duke RC. A role for CD 95 ligand in preventing graft rejection. Nature 1995; 377: Bamberger AM, Schulte HM, Thuneke I, Erdmann I, Bamberger

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Jkbcs016(92-97).hwp Expression of bcl-2 and Apoptosis and Its Relationship to Clinicopathological Prognostic Factors in Breast Cancer - A Study with Long Term Follow-up correlated with the survival rate.(journal of Korean