RESEARCH ARTICLE Kor. J. Aesthet. Cosmetol., Vol. 13 No. 2, , April 2015 화장품소재로서아로니아추출물의생리활성연구 신동화 1, 최태부 2 * 1 건국대학교일반대학원생물공학과, 2 건국대학교생물공학과 S

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세빈 독고
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1 RESEARCH ARTICLE 화장품소재로서아로니아추출물의생리활성연구 신동화 1, 최태부 2 * 1 건국대학교일반대학원생물공학과, 2 건국대학교생물공학과 Study on the Bioactive Characteristics of Aronia Extract as a Cosmatic Raw Material Donghwa Shin 1, Taeboo Choe 2 * 1 Department of Bioengineering, Graduate School of Konkuk University 2 Department of Biological Engineering, Konkuk University Abstract Recently, Korea s domestic cosmetics market is as large as over KRW 6 trillion, the export of cosmetic products has reached US million dollars. Even though antiaging cosmetics market has grown to more than KRW 3 billion industry, the supply of cosmetic materials has been hugely dependent on import (%). As consumers seek more naturefriendly and organic products, world s natural and organic cosmetics market has reached a value of approximately KRW 1 trillion. Under these circumstances, it is urgent to develop raw materials for natural cosmetics. Therefore, this study attempted to investigate aronia which has lately drawn a great attention. Aronia is a berry plant in the family Rosaceae, which grows in the northeastern part of North America. It was first introduced to the Republic of Korea in 7. The Russian botanist Ivan Michurin started to reveal the diverse values of the shrub. It s been known that the perennial plant has abundant anthocyanin in its flesh and skin. According to comparison between aronia and berries, the deciduous shrub is 4 times higher than blueberry in terms of anthocyanin contents. In other words, it is the best natural substance in getting anthocyanin among existing berries. Recently, there have been a lot of studies on aronia in food industry. In cosmetic industry, however, it s still very new. Therefore, this study examined if the native American fruit would be available as a cosmetic material. In an NR assay on the aronia extract in RAW264.7, HDF and B16F1, % or higher cell survival rates were confirmed in all concentrations. According to an NO assay on RAW264.7, for example, NO production was cut to less than %. With αmsh treatment on B16F1, melanin, the production of melanin was induced. With the addition of aronia extract in different concentration levels, melanin synthesisinhibiting effects occurred in a concentrationdependent manner, which inhibits tyrosinase expression. Therefore, it appears that it would be available as a material for whitening cosmetics. When UV rays were applied to HDF, MMP1 expression declined more than 5% until the aronia extract reach up to 5 μg /ml. In other words, the inhibition of MMP1 expression was confirmed after ERK and JNK activities were slowed down. In sum, this study confirmed the efficacy of aronia as a natural cosmetic material by proving the effects of inhibiting NO, melanin synthesis and MMP1 production. It is likely that this natural substance would be available as a cosmetic material and academic data in cosmetics and skin beauty sectors. Keywords: Aronia, Anthocyanins, Antiaging, Anitmelanogenesis, JNK, ERK, MMP1 *Corresponding author: Taeboo Choe, Department of Biological Engineering, Konkuk University, Hwayangdong 1, Gwangiingu, Seoul, 14371,Republic of Korea Tel.: , Fax: tbchoe@konkuk.ac.kr Received April 7, 15; Revised April 22, 15; Accepted April 24, 15; Published April 3, 15 현대사회는국민소득증가와지속적인경제발전과함께고령화사회로접어들면서삶의질에대한관심이증가되어육체적건강뿐만아니라아름답게늙어갈수있는안티에이징 (antiaging) 제품의효과및효능이뛰어난기능성원료가필요 275

2 한시점이되었다 ( 윤강희, 9). 식품의약품안전처에의하면 1년국내화장품생산실적은약 6조원이상으로전년대비 16.4% 가상승하였으며, 수출액은 6억달러규모로전년대비 43.5% 상승하였고항노화화장품의규모는 3천억원이상의규모임에비해화장품원료는 % 이상이수입에의존하고있는안타까운현실이다. 특히소비자들은화학제품에대한소극적선택과환경의변화에따라친환경, 웰빙, 신소재등으로구매욕구가변화하고있다. 11년세계천연, 유기농화장품시장규모는약 1조원에달하고, 국내천연, 유기농화장품시장은약 89억원이며, 기능성화장품수요는종류별로적게는 2배에서많게는 1배까지상승하였음으로기능성화장품시장도빠른속도로확대되고있기때문에소비자의구매욕구를만족시킬수있는천연화장품원료개발이시급한시점으로사료되어최근주목받고있는천연식물성소재인아로니아를연구하고자한다. 아로니아 (Aronia melanocarpa) 는 7년에국내에최초로도입되었고, 장미과에속하는베리류로북아메리카 ( 미국, 캐나다 ) 동북부지역에서자생한다 (Tanaka et al., 1). 학명에따라 Black chokeberry (Aronia melanocarpa), Red chokeberry (Aronia arbutifolia) 및 Puple chokeberry (Aronia prunifolia) 로나누지만일반적으로아로니아 (Aronia melanocarpa) 에모두포함시킨다 (Kokotkiewicz et al., 1). 193년대초러시아식물학자인이반 (IVAN) 미츄린교수가아로니아과즙을이용하여다양한가치를밝혀내기시작했다 (Kask, 1987). 아로니아열매는검은적자색을띄고, 과육부위의색상은껍질보다는약하지만진한적자색으로수분 84.36%, 탄수화물 14.37%, 지질.14%, 단백질.7%, 회분.44% 를함유하고있다 (Tsuneo et al., 1). 아로니아의과육과껍질에는생리활성능과강력한항산화기능이있는페놀성식물화합물인안토시아닌함량이 g당 14mg, 프로안토시아니딘 (Proanthocyanidin) 함량은 g 당 664 mg, chlorogenic acid, neochlorogenic acid 등을함유하고있으며, 안토시아닌중 % 시아닌계열은 cyanidin3 arabinoside, cyanidin3galactoside가다량함유되어 (Strigl et al., 1995) 식품과의약품으로도널리활용되고있으며 (Oszmianski et al., 1988), 아로니아에함유된폴리페놀성분에대한라디칼의소거활성, 항산화효과로암, 심장혈관계질환등을예방 지연시킴으로노화방지에중요한역할을한다 (Ferreres et al., 9). 과일과채소등식물계에분포되어있는아스코르브산, 카로티노이드, 토코페롤등은지질의산화를억제하는작용을하기때문에산소독성의방어기구를형성한다. 세포내에는 Fe 3 은 O 2 에의해 Fe 2 로환원되며환원된 Fe 2 와 H 2 O 2 가반응하면 OH가생성 (Fenton reaction) 된다. 철이온킬레이터는이러한 Fe 2 와 H 2 O 2 가반응을억제하 여 OH 생성을감소시키는 ( 중촌양등, 1998; 곽재욱, 1998; 김영곤, 4) 항산화제역할을하며, 특히폴리페놀계화합물 (flavonone, flavone, anthocyanin, isoflavone, catechine 등 ) 은 radical 소거능을바탕으로강력한항산화능과생리활성을갖는다고알려져있다 (Guo et al., 7). 허브, 과일야채, 등에자유라디칼을제거하는성분인안토시아닌의항산화능력이평균 277 μm Trolox Equivalent (Eq) 인데반해아로니아는 g 당 16,62 μm Trolox (Eq) 로높은수치를나타내었다 (Nutrient, 7). 아로니아는카로틴류와루테인같은크산토필류를다량함유하고있으며 5, mg / Kg의시아닌, 녹차보다 1배이상인 15, mg /Kg의카테킨과탄닌, 필수불포화지방산들과풍부한천연비타민류, 무기질이있어다양한신체대사와기능에중요한역할을한다고조사되었고 (Atringl et al., 1995; Wu et al., 4), 원예과학자인 Strigl (1995) 의논문에서아로니아와베리류의안토시아닌함량을비교한결과, 항산화효과가우수하다고알려진블루베리보다 4배나많다고보고되었으며, 아로니아니는현존하는베리류중안토시아닌을얻을수있는최고의소재로보고되었다. 아로니아에관한연구로는설탕대체당류를첨가하여제조한야로니아잼의품질특성및항산화활성 ( 황은선등, 14), 아로니아분말첨가가머핀의품질및항산화능에미치는영향 ( 박효정등, 14), 아로니아첨가에따른화이트초콜릿가나류의산패억제효과 ( 박혜란, 14), 발효공정을통한아로니아추출물의항염증효능증진 ( 김남영등, 14), 추출방법에따른아로니아추출물의주름개선효능비교 ( 감남영등, 14), 추출물의항산화및항알레르기효능 ( 정종문, 8) 등의연구가발표되어졌으나화장품원료보다는주로식품등에많은연구가진행되었다. 그러므로피부미용분야에서의항산화 항균 항염 항멜라닌 항노화작용에관한생리활성의특성연구가필요하다고사료된다. 또한주원료인안토시아닌에대해서도많은연구가진행되고있지만아직까지화장품의원료로는실험한연구가미비한상태임으로화장품적용시다양한효과가기대됨에따라본연구에서는아로니아추출물의생리활성특성을알아보는데목적을두고화장품소재로서의가능성여부와천연화장품소재개발을위한기초자료로활용하고자한다. 1. 실험재료본연구에사용한아로니아 (Aronia melanocarpa, 13년산 ) 는전북고창에서재배, 수확된것을구입하였으며, 이물질은제거하고세척하여아로니아열매의 1배무게의 95% 에탄올을넣은후실온에 72 h 두었다가원심분리기에서 9, 276

3 아로니아추출물을이용한생리활성연구 rpm으로 15 min 간원심분리한후 Whatman No. 2 여과지로상층액을여과하고, 에탄올을증발시키기위하여감압농축기 (EYELA, Japan) 로에탄올을제거한후 3일동안동결건조를실시하여분말형태의추출물을사용하였다. 2. 시약및기기본연구에사용된시약은 1,1diphenyl2picrylhydrazyl (DPPH), butylat ed hydroxy toluene (BHT), 3,5dinitrosalocylic acid (DNS), glucose, caffeic acid, quercetin, arbutin, pyrogallol, griess reagent, trishcl buffer (tris[hydroxymethyl] aminomethaneedta), aluminium nirate, potassium acetate, sodium phosphate buffer를사용하고 (Sigma), Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM, Hyclone, USA), αmelanocyte stimulating hormone (αmsh) 와 fetal bovine serum, penicillin, streptomysin, formaldehyde, arbutin, phosphate buffered saline solution (PBS), easy blue, chloroform, isopropanol (Sigma) 를구입하여사용하였다 (Kim, 13). pjnk, perk (Cell signaling, USA), 그외의기타시약은특급시약을사용하였다. 3. 세포배양실험에사용한세포주는 HDF human dermal fibroblast, B16F1 melanoma, RAW macrophage는한국세포주은행에서분양하여사용하였고, 배양시에는 High glucose Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM, Hyclone, USA) 에사용하였으며, 1% fetal bovine serum (FBS, sigma) 과 1% penicillin/ streptomycin ( IU/5 μg /ml) 이첨가하여 37 로유지되는 5% CO 2 습윤배양기에서배양하였다. HDF 세포를이용하여 MMP1 생성억제능실험을수행하였고, B16F1 melanoma 세포를이용하여세포내멜라닌생성억제실험을수행하였다. RAW264.7 세포를이용하여세포내 NO 생성억제량을측정하였다. 4. 사용기기사용된기기는흡광도를측정하기위해 microplate reader 를사용하였고 (SynergyHT, BIOTEK Instruments, USA), 세포를배양하기위하여 CO 2 incubator (MCO 175, Sanyo Electric Co., Japan) 를이용하였고, Thermo Elctron (USA) 의 Optizen Pop UV/Vis spectrophotometer (Orion, 5A USA), 냉동건조기등을이용하여측정하였다. 5. Neutral Red assay를이용한세포독성측정실험에서사용된시료의독성농도범위는 Neutral Red (NR) assay 를이용하여결정하였다 (Borenfreund & Puemer, 1985). 세포주는 RAW264.7, B16F1, Human Dermal Fibroblast 세포를사용하였으며, 96 wll plate 에 well 당 3 1⁴ cells/well 의농도로분주하고아로니아를각각농도가되 도록첨가한후 48 h 동안 37 에서 CO 2 배양기에서배양하 였다. 세포부착확인후시료를농도별로무혈청배지에희석 하여처리한후 48 h 배양하였다. 배양한세포는배양액을 NR solution 이 1% 포함된무혈청배지로교환하여 3 h 배양한다 음현미경하에서 neutral red 의결정화유무를확인하였다. 세 포고정액으로 formaldehyde 용액 1% 가첨가된 phosphate buffered saline (PBS) 을각 well 에 µl 로 min 처리하 여고정하였다. NR desorb solution (1% glacial acetic acid, 49% ethanol, 5% distilled water) 을각 well 에 µl 씩분 주하여세포내의 neutral red 를추출하고 microplate reader 를 이용하여 5 nm 에서흡광도를측정하였고, 세포생존율은다 음의식에따라계산하였다 (Kim, 13). 세포생존율 (%) = 6. Nitric oxide 생성능측정 시료첨가군의 O.D. at 5 nm 시료무첨가군의 O.D. at 5 nm Green et al. (1982) 방법에따라 NO 생성저해능을측정하 기위하여세포배양액내 NO 양을 nitrite (NO2) 와 nitrate (NO3) 의형태로측정하였다. RAW 세포를 96 well plate 에 well 당 5 1⁴ cells/well 의농도로분주하고 24 h 동안 배양한다. 배양후배지를제거하고 LPS (lipopolysaccharide) 1 µl/ml 이처리된배지에아로니아를 5, 1, 25, 5, µl/ ml 의농도별로가하여 48 h 동안배양하였다. New plate 에 배양된세포상층액 µl 와 griess reagent µl 을가하 여차광된상태에서 1 min 간반응시키고 5 nm 에서흡광 도를측정하였고, LPS 처리군과비교하여백분율로표시하였 다. NO 생성억제능 (%) = 7. Melanin 생성저해능측정 시료첨가군의 O.D. at 5 nm 시료무첨가군의 O.D. at 5 nm B16F1 melanoma 세포를이용하여아로니아의멜라닌생 성억제능을측정하였다. 96 well plate 에 B16F1 세포를 2 1³ cells/well 의농도로분주하고, 세포가바닥에부착할수있 도록 24 h 동안배양하였다. 세포부착확인후멜라닌생성을 촉진하기위하여혈청 5% 와 αmsh 1 μm 이포함된배지로 갈아준후, 시료를 5, 1,, 5, µl/ml 의농도별로처리 하였다. 분비된멜라닌의양은 Microplate reader 를이용하여 277

4 5 nm에서측정하였고멜라닌생성량을 αmsh 무처치군과비교하여백분율로표시하였다 (Kim, 13). 시료첨가군의 O.D. at 5 nm Melanin 생성억제율 (%) = 시료무첨가군의 O.D. at 5 nm 8. MMP1 발현억제능측정 MMP1 발현에미치는영향을측정하기위해 HDF 세포를 96 well plate에 cell/well 농도로분주하여세포가바닥에부착할수있도록 24 h 동안배양하고, well plate 상층액을제거한후시료를농도별로처리하고 UVB를 mj/cm 2 로 min 간조사한후 24 h 배양한후상층액 ml를 96 well에옮긴후 coating buffer ml를넣은후 overnight 시키고, 배양상층액을제거후 PBST (PBS,.5% Tween) ml로 3회 washing을하고 blocking buffer (PBS,.1% BSA) ml씩처리후 37 C에서 1 h 동안정치하였다. Blocking 후 PBST ml로 3회 washing을하고 blocking solution으로 배희석한 primary antibody (antimmp1 mouse antibody) 를 5 ml씩처리후 37 C에서 1 h 동안정치하였다. PBST ml로 3회 washing 후 alkaline phosphatase가접합된 secondary antibody (antimouse IgG antibody) 를 blocking solution으로 배희석을한후각 well에 5 ml씩처리후 37 C에서 1 h 동안정치하였다. 그후 PBST ml로 3회 washing하고 substrate 인 pnitrophenyl phosphate (in 9.7% diethanolamine buffer,.5 mm MgCl 2, ph 9.8) 를각 well에 ml씩첨가한후 plate를 aluminium foil로감싼뒤 37 C에서 1 h 동안반응시키고 5 nm로흡광도를측정하였다. 시료첨가군의 O.D. at 5 nm MMP1 발현억제율 (%) = 시료무첨가군의 O.D. at 5 nm 9. Western blot 아로니아가멜라닌생성에필요한단백질인 MITF (Microphthalmiaassociated transcription factor) 와 tyrosinase의발현에미치는영향과, MMP1 생성에중요하게작용하는 kinase인 ERK (extracellular signalregulated kinases) 와 JNK (cjun Nterminal kinases) 의세포내활성화에미치는영향을확인하기위해 western blotting을실시하였다. 아로니아 1 μm을 HDF와 B16F1 세포에 24 h 처리하여배양한세포를수확하여 PBS로세척후 RIPA buffer (5 mm TrisCl (ph 7.5), 5 mm NaCl, 1% NP,.5% sodium deoxycholate,.1% SDS, proteaseinhibitor cocktail (Roche, Switzerland)) 를가첨하고얼음에서 3 Relative cell viability (% of control) control LPS min 간정치하여세포를용해하였고, 용해된세포는 4 에 서 12, rpm 으로 3 min 간원심분리하여상등액을회수 하여, SDS sample buffer ( mm Tris (ph 6.8), 14.4 mm 2mercaptoethanol, 25% glycerol, 2% SDS,.1% bromophenol blue) 를첨가하고 5 min 간 에서끓여단백질 을 denatu ration 시킨후단백질을 SDSPAGE 로분자량 별로분리하였다. 분리된단백질은 V 의조건에서 1 h 동 안 nitrocellulose membrane (W hatman, UK) 으로 transfer 하였다. 단백질이옮겨진 membrane 은.1% BSA 용액에 blocking 하고, 그후 membrane 을 primary antibody 용액 에담가 4 에서 18 h 교반하였다. Primary antibody 가처리 된 membrane 은 TBST (1 mm TrisCl (ph 7.5), 15 mm NaCl,.2% Tween ) 로교반기에서 5 min 씩 3 회세척하였 다. 세척된 membrane 을화학적형광을낼수있는 horseradish peroxidase (HRP) 가결합되어있는 secondary antibody 용액에담가상온에서 2 h 처리후다시 TBST 로 5 min 씩 3 회세척하였다. Secondary antibody 가처리된 membrane 은 supersignal west pico solution (Pierce, USA) 을처리하고암 실에서실험용필름 (Konica, Japan) 으로덮어필름에감광을 유도한후자동현상기 (QX13II, Konica) 를이용하여현상 하였다. 현상된필름상에있는단백질 band 는 densitometer program 인 ImageJ (NIH, USA) 를이용하여 band 크기의변 화를측정하였다. Antibody 는 βactin primary antibody (Sigma), pjnk, perk, antibody (Cell signalihg) 를사용 하였다 (Yoon, 12) 아로니아추출물의항염증효과 1) RAW 세포에대한세포독성 5 Concentration of Aronia melanocarpa(µg/ml) Figure 1. Effect of Aronia melanocarpa extract on the cell viability of RAW cell. 세포의증식과생존율을확인하기위하여 NR assay 를실시 278

5 아로니아추출물을이용한생리활성연구 Relative concentration of NO(%) Relative cell viability(%) controll PS 51 5 LPS() Concentration(µg/ml) control α MSH 51 5 Concentration of Aronia melanocarpa(µg/ml) Figure 2. Inhibition of nitric oxide production in RAW cell using Aronia Melanocarpa extract. Figure 3. Effect of Aronia melanocarpa extract on the cell viability of B16F1 melanoma cell. 하였다. Figure 1은아로니아추출물의 RAW 세포에대한 5, 1,, 5, μg /ml 농도별로세포독성을나타낸것이다. 아로니아추출물농도에관계없이모두 % 이상의세포생존율이나타났다. 따라서아로니아추출물은세포의증식과생존율에별다른문제없이실험이가능한것으로나타났다. 2) 아로니아추출물의 RAW 세포에대한 Nitric oxide 생성능억제 NO는대식세포와같은면역세포에의해생성되며, 병리및생리적과정에관여하는새로운유형의염증매개물질로주목받고있으며, NOS 및 NO 활성을억제함으로서염증성질환의진행을억제할수있는것으로알려져있다 (FariasEisner et al., 1994). NO는대부분의포유류동물의세포내에서생성되고신경계에서는화학적신호전달물질로서, 혈관계에서는혈압조절과혈소판의응집및호중성구의집합작용을, 골격근에서는대사와근수축조절등생리학적으로중요한역할을한다 (Marletta, 1993; Nathan, 1992). 일반적인 NO의형성은박테리아를죽이거나종양을제거시키는중요한역할을하지만, 염증상태에서 inos에의해과잉생성된 NO는혈관투과성, 부종등의염증반응을촉진시킬뿐만아니라염증매개체의생합성을촉진하여염증을심화시키는것으로알려져있다 (Korhonen et al., 5). 과량의 NO 생성이염증반응을일으키고, 조직의파괴및면역체계의이상을일으킨다고보고됨에따라 (Liang, 1999) NO 생성량을측정하는연구가이루어지고있다. 아로니아추출물은 COX1과 COX2의저해비율비교를통해 COX2를선택적으로저해하고있음을확인하였고 ( 정종문, 8), 김남영 (14) 의논문에서는발효시킨아로니아추출물로 NO assay를실험한결과 NO 생성에대한억제능이증진되었다고보고하였다. Figure 2는아로니아추출물이 LPS (lipopolysaccharide) 로자극받은 RAW 세포에서아로니아추출물 5, 1,, 5, μg /ml로처리하였을때 NO 생성을 ~% 정도로억제하는것으로나타났다. 이것은앞서설 명한아로니아추출물이 NO 생성억제에관한효과연구에서세포독성없이 NO 생성을억제하는결과와일치함을알수있다. 2. 아로니아추출물의항멜라닌효과 1) 아로니아추출물의 B16F1 세포에대한세포독성미백생리활성결과에앞서 Figure 3은세포증식과생존율을확인하기위하여아로니아추출물이멜라닌세포인 B16F1 melanoma 세포에대한세포독성을나타낸것이다. 아로니아추출물 5, 1,, 5, μg /ml까지첨가했을때농도에관계없이세포생존도 % 이상을유지하여문제없이실험이가능한것으로보인다. 선행연구의 B16F1에아로니아에서분리한안토시아닌을농도별로처리하여 48 h 동안배양한후 MTT assay 세포생육활성을이용한세포독성을측정한결과모든시료구에서 75% 이상의세포생육활성을나타내어세포독성이낮음을확인하였다 ( 박혜미, 14). 선행연구의아로니아추출물의농도범위가 μg /ml와 25 μg /ml로농도차이가큰점을고려할때본연구에서는좀더세부적인독성실험결과를바탕으로아로니아추출물농도 μg /ml 까지실험을진행할수있었다. 2) 아로니아추출물의 B16F1 세포에대한멜라닌생성억제능측정결과멜라닌세포는기저층에존재하며, 아미노산의일종인티로신 (tyrosin) 을전구물질로하여 tyrosine DOPA DOPA quinone indole5,6dihydroquinone으로변화하고, indole5,6dihydroquinone의중합체가멜라닌이다. 멜라닌생성의주요기전은멜라닌세포의증식과티로시나아제 (tyrosinease) 효소활성도의증가이다 (Kang et al., 6). 이효소에의해 tyrosine이 3,4dihydroxyphenylalanine (DOPA), DOPA quinone으로변환되어 eumelanin 과 phomelanin이합성된다 (Lopezet et al, 1992). 멜라닌생합성에관여하는주요인자로는 tyrosinease, vitamin 279

6 D3, dopachrome conversion factor, interferon (IFN), prostaglandin (PG), melanocyte stimulating hormone (MSH), histamine 등이있다 (Imokawa & Mishima, 1982). 따라서이러한멜라닌생합성저해제가개발되어식품, 의약품, 피부질환치료제, 피부미백제, 화장품등에활용되고있다. 미용분야에서는자외선을차단하는화장품에첨가하는방법과멜라닌합성시중요한역할을하는 tyrosinease의활성을저해하는물질을개발하는방향으로연구가집중되어있다 (Kang et al., 6). 하이드로퀴논, 코직산, 알부틴등은 tyrosinease 억제제로알려진성분으로피부자극및접촉성피부염등과같은부작용을일으킨다 (Ortonne & Passeron, 5) 는보고가있어피부친화적이고안전한식물의천연추출물을이용한미백제의연구가활발히이루어지고있다 (Choi et al., 11). 본실험에서는아로니아추출물의멜라닌생성억제효과를확인하기위하여 B16F1 세포에 αmsh 1 nm을처리하여멜라닌생성을유도하고동시에아로니아추출물 5, 1,, 5, µg/ml의농도로처리한후멜라닌세포가생산하는멜라닌생성량을비교하였다. 그결과 αmsh만처리한경우에는멜라닌함량이대조군에비하여뚜렷하게증가하는것을확인할수있었으며, 아로니아추출물을처리한경우에는 α MSH만단독처리한경우에비해멜라닌생성이현저하게억제되는것을확인할수있었다 (Figure 4). 박혜미 (14) 에의하면아로니아추출물은 tyrosinase 활성을저해시키는효과가있고, 이는아로니아주요안토시아닌중에서도함량이높은 cyanidin3arabinoside chloride 및 cyanidin3 galactoside chloride가피부미백활성기능성에활성이높아다양한화장품소재로활용가능성을제시하였다. 따라서본실험결과아로니아추출물이미백에효과가나타나미백기능성화장품원료로서가능성이있다고사료된다. 3) MITF, tyrosinase protein 발현억제효과아로니아추출물이멜라닌합성에관여하는 MITF, tyrosinase protein 발현에미치는영향을알아보기위해 Relative melania contents(%) Relative cell viability(%) controlα MSH arbutin arbutin 5 arbutin α MSH Concentration(µg/ml) control Concentration of Aronia melanocarpa(µg/ml) Figure 4. Effect of Aronia melanocarpa extract on the melanin production in B16F1 cell. Figure 6. Effect of Aronia melanocarpa extract on the cell viability of HDF (human dermal fibroblast). MSH ( nm) MITF Tyrosinase 5 25 아로니아 ( μg /ml) MITF Tyrosinase Rekatuve MITF, Tyrosinase band intensities(% of control) actin control α _MSH 52 5 α MSH() Concentration of Aronia melanocarpe (µg/ml) Figure 5. Inhibitory effect of Aronia melanocarpa extract on the MITF and tyrosinase in expression B16F1 cells. 2

아로니아추출물을이용한생리활성연구 Western blotting 으로확인한결과 Figure 5 에서와같이 α MSH 로증가된 tyrosinase protein 발현량이아로니아추출 물 5 μg /ml 에서는 tyrosinase 의억제능이미비하였으나, 아로 니아추출물 25 μg /ml 에서는 tyrosinase 의발현량이현저하게 억제된것을확인할수있었다.

7 아로니아추출물을이용한생리활성연구 Western blotting 으로확인한결과 Figure 5 에서와같이 α MSH 로증가된 tyrosinase protein 발현량이아로니아추출 물 5 μg /ml 에서는 tyrosinase 의억제능이미비하였으나, 아로 니아추출물 25 μg /ml 에서는 tyrosinase 의발현량이현저하게 억제된것을확인할수있었다. 이는아로니아추출물이멜라닌 생성억제효과가있음으로미백기능성화장품의원료로서사 용가능하다고사료된다. 3. 아로니아추출물의항노화효과 1) 아로니아추출물의 HDF 세포에세포독성 아로니아추출물의생성능을보기위해먼저 HDF 세포의농 도별로처리하여 NR 실험을통해세포생존율을조사하였다 (Figure 6). 아로니아추출물 5, 1,, 5, μg /ml 까지의 세포생존율을나타내고있다. 아로니아추출물농도에관계없 이세포생존도 9% 이상을유지하여문제없이실험이가능한 것으로판단하였다. Relative MMP1 concentration(%) No UV UVB UVB() Concentration of Aronia melanocarpa(µg/ml) Figure 7. Effect of Aronia melanocarpa extract on the MMP1 production of UVBirradiated HDF. 2) 아로니아추출물의 MMP1 발현에미치는영향피부의구조는표피, 진피, 피하조직이며, 이중진피는기질성분과섬유성분으로구성되어있고콜라겐은진피층의 9% 를차지하는섬유성분으로존재하는주요단백질이다 (Kim et al., 7). 진피층에는 type Ⅰ,Ⅲ콜라겐이주요한성분이며 type Ⅰ은총콜라겐의 % 를, type Ⅲ는 15% 를차지하고있다 (Talwar et al., 1995). type Ⅰ 교원질생성촉진에는 TGFβ/Smad 신호전달체계가관여하는데, TGFβ1이섬유아세포표면의 TGFβ1 수용체에결합하면 Smad family라고불리는세포내단백질이활성화되고, 이러한 Smad 단백질들이교원질생합성을조절하는데관여한다 (Verrecchia et al., 6). 김남영 (14) 의추출방법에따른아로니아추출물의주름개선효능비교에의하면주름개선에우수한효능이있다고보고되었다. 따라서본실험은 HDF 세포에대한아로니아추출물에대한 MMP1 생성능변화를알아보기위하여아로니아추출물을 HDF 세포에 48 h 동안처리한후배양상층액을취하여 ELISA (EnzymeLinked Immunosornent Assay) 방법으로 MMP1 측정을수행하였으며그결과 Figure 7과같다. 아로니아추출물을 5, 1,, 5, µg/ml을처리하였을때아로니아추출물의농도에따라 MMP1 발현이억제되는것을알수있다. 따라서아로니아추출물은콜라겐생성에영향을미치는것으로확인되었다. 3) 아로니아추출물이 kinase 활성화에미치는영향 HDF 세포에 UVB가조사되면 DNA가손상되고, 광노화현상이발생하며, HDF 세포의광노화는성장과 MMP의발현을촉진시켜진피층의콜라겐분해를촉진시킨다 (Kim et al., 11; Yoon, 12). MMP의발현은 UVB로인해서활성화되 5 UV ( mj/cm 2 ) 25 아로니아 ( μg /ml) perk pjnk Rekatuve MITF, Tyrosinase band intensities(% of control) perk pjnk actin controlu luvb UVB() Concentration of Aronia melanocarpe(µg/ml) Figure 8. Effect of Aronia melanocarpa extract on the hsphorylation of kinase ERK & JNK in the culture of HDF cell. 281

8 는전사인자인 NFκB에의하여촉진된다. HDF 세포에조사된 UVB는 ROS를증가시켜염증성전사인자 NFκB를활성화시키고, NFκB는핵내로이동하여 MMP의발현을촉진하게된다. 본연구에서는 UVB에의한 MMP1 유전자발현에관련있다고알려진 ERK와 JNK의인산화정도를 Western blotting을이용하여측정하였다. 아로니아추출물 5, 25 µg/ ml 농도로각각처리한후 UVB lamp를이용하여 mj/ cm 2 의강도로조사하였다. 실험결과 Figure 8에서볼수있듯이 UVB 조사후 ERK와 JNK의인산화가증가된것을확인할수있었고, 고농도인아로니아추출물 25 µg/ml의처리시 ERK와 JNK의인산화가억제되는것으로보아 MMP1 유전자의발현을억제시킨다는것을유추할수있었다. 이것으로아로니아추출물이 HDF 세포에서 UVB에의해유도된 ERK와 JNK의인산화를억제함으로써 MMP1 유전자의발현이억제되는것을확인하였다. 본연구는천연식물성화장품소재로서아로니아추출물이적합한지에대한생리활성연구를진행한내용으로아로니아를 7% ethanol로추출하여세포독성, 항염효과, 멜라닌생성억제능, MMP1 발현변화를측정하였고, 실험결과는다음과같다. 첫째, 항염효과를보기위해 NO 생성억제능을실험한결과아로니아추출물을 5, 1,, 5, μg /ml 로처리하였을때 NO 생성을 ~% 가량억제하는것으로나타났다. 둘째, 멜라닌생성억제능을실험한결과, 아로니아추출물로처리한경우에는 αmsh 만단독으로처리한경우에비해멜라닌생성이현저하게억제되는것을확인할수있었다. 알부틴저농도일때 18% 의억제효과대비아로니아추출물저농도일때 38% 로아로니아추출물을알부틴과비교해볼때약 % 정도멜라닌억제효과가나타났음을알수있었다. 또한멜라닌생합성에직접적으로관여하는효소인 tyrosinase의단백질발현을확인한결과 αmsh로증가된 tyrosinase 발현량이아로니아추출물을처리한경우 tyrosinase의발현량이현저하게억제된것을확인할수있었음으로아로니아추출물이멜라닌생성억제효과가있음을확인하였다. 셋째, UVB가조사된 HDF 세포에서아로니아추출물이 MMP1 발현에미치는영향을실험한결과, 아로니아추출물이 5 μg /ml에달할때 5% 이상의 MMP1 발현이감소하였다. 이와같은결과로 MMP1 발현에관련있다고알려진 ERK와 JNK 활성정도를측정하였으며, UVB 조사시 ERK와 JNK는활성화된것을확인할수있었고, 아로니아추출물 25 μg /ml에서 ERK와 JNK 활성이억제되어 MMP1 발현이억제되었다. 이러한연구결과로보아아로니아추출물은향후기능성화장품소재로서의사용가능하다고사료된다. 곽재욱. 메가비타민入門. 도서출판신일상사, 김남영, 김정환, 최근표, 이현용. 추출방법에따른아로니아추출물의주름개선효능비교. 한국메디컬학회지, 22: , 14. 김영곤. Antioxidants ( 항산화제 ). 여문각, 4. 박혜미. 아로니아 (Aronia melanocapa) 로부터분리한안토시아닌의생리활성. 대구카톨릭대학교석사학위논문, 14. 박혜란. 아로니아첨가에따른화이트초콜릿가나슈의산패억제효과. 세종대학교석사학위논문, 14. 윤강희. 복합기능성화장품개발폭발적증가세. 장업신문, 서울, 9. 중촌양, 최동성, 고하영. 식품기능화학. 지구문화사, Atringl AW, Leitner E, Pfannhauser W. Die schwarze apfelbeers(aronia melan ocarps) alsnatuerliche Farbstoffe. Deutscha Lebensmittel Rundschau, 91: Borenfreund E, Puerner JA. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters, 24: , Choi SY, Kim YC, Chang BS. Inhibitory efficacy of black tea water extract on melanogenesis in melana cells and its action mechaniss. Kor. J. Microscopy, 41: FariasEisner R, Sherman P, Aeberhard E, Chaudhuri G. Nitric oxide is an important mediator for tumoricidal activity in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci., 91: , Ferreres FD, Gomes P, Valentao R, Goncalves R. Pio EA, Chagas RM, Seabra PB. Improved loquat (Eriobotrya japonica Lindl.) cultivars: Variation of phenolics and antioxidative potential. Food Chem., 114: , 9. Jeong JM. Antioxidative and Antiallergic Effects of Aronia (Aronia melanocarpa) Extract. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr., 37: , 8. Hwang ES, Thi ND. Antioxidant Contents and Antioxidant 282

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,