Life Science & Biotechnology 22 실험강좌 RNA interference를 이용한 발생유전자 해석

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태훈 안
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1 Life Science & Biotechnology 22 실험강좌 RNA interference 를이용한발생유전자해석 Hideshi Inoue 동경약과대학생명과학부 장치와숙련된기술을요구하는 microinje 적인변이유발과 transposon을이용한기 1. RNAi는 주입장소에영향을받지않는다 는것은전용 어떤 유전자의염기서열에해당하는 double 법이외에도가능한방법이있다는것을시사하는 strand RNA(dsRNA) 를선충 Caenorhabditis 것이다. 실제로성충을 dsrna 용액에담구거 elegans의체내에넣으면, 그에대응하는 ( 침투성 mrna ), dsrna를발현하고있는대장균을 가 특이적으로분해되어유전자의기능을상실한식하여도 RNAi는일어난다 ( 섭식법. ) 섭식 다. 또한투여하는 dsrna는분해될 mrna dsrna 에비는소화관세포에서다른체세포와 ge 하여 극히소량이어도가능하다. 세포주변에 line 적은에서나타난다. 수의 dsrna라도발현량이많은 mrna에대해 유효하다. 본실험결과 (RNA interference, 어떤방법이라도 dsrna에의한 RNAi 활성 RNAi) 는 1998년 2 월에 Nature 보고되었으 일동안지속되고또생식세포를거쳐다음세대 며, 그현상의특이성과역유전자적인유전자기도계승되나, RNAi의효과는어디까지나일시 능 파괴법으로인하여급속하게전파되어많이이며이세대를계속하면소실된다. 용되고있다. C. elegans의전체게놈염기서열 이 1998년 12월에발표되었으며, 포스트게놈 3. 어떤유전자도효과가있을까? 염기서열의 high throughput한기능해석에유용 하다. C. elegans는다섯 개의상염색체와 RNAi는 X염색상당히강한영향이나타나특히생식 체를 가지며, RNAi를사용하여 제 1염색체와포와초기발생제유전자가억제되기쉽지만, 신경세 3염색체의전체적인기능검색결과가 2000포에서는년 11 강한영향을나타내기어렵다. 이와같 월에 보고되었다 3), 4). 이 RNAi는모든유전자에유효하지는않고, RNAi는선충에만해당되는것이아니고, knock 전생물 out 방법과는상이하므로, 경우에 계에 응용할수있다. 식물에서는 post-나누transcriptional 사용하는편이좋다. gene silencing, 곰팡이에서의 quelling 현상이 RNAi와동일한현상으로마우 스 배아초기에도 RNAi가일어난다. 초파리에서 는 dsrna 의존적표적 RNA 분해를실험관내에 서 재현하였다. 이초파리의 in vitro 실험은 RNAi의메커니즘을이해하는데크게공헌하였 다. 일반적인실험실에서사용되는배양동물세포 (1 / 2) 오후 4:11:51

2 로 RNAi가가능하다면그유용성은상당히광범위해졌을것이나, dsrna에의한염기서열특이적장해효과는쉽게발생하지않는다. 5) Elbashir 는 21염기의짧은 dsrna(sirna) 를사용하여배양동물세포에서 RNAi가일어남을밝혔으며, RNAi의이용성확대에기여하였다. 2. 선충 C. elegans 에서 RNAi 의방법 C. elegans에 dsrna 투여방법은세가지가있다. 1) Micro injection법 2) 침투법 3) 섭식법처음보고된것은 microinjection에의한 RNAi이다. dsrna가일으키는간섭은세포의경계를넘어전달된다. 예를들어체내에주입한 dsrna는그성충의유충에도장해효과를나타낸다. 또체내와생식소에주입한 dsrna는그성충체조직그림 1 dsrna 발현용 vector L444 에도영향을준다. 즉 dsrna의주입장소는상관 7, 8) 없다. 4. dsrna 디자인 전화면 찾아보기 ( 목차 ) RNAi에이용하는 dsrna는 mrna의염기만을포함하고있으면된다. 즉유전자의 int 과 promoter 영역서열은효과가없지만, 은 non translation region 서다. 특이적인서열의길이는 200~300 염기이필요하다. RNAi는특이성은높지만보존높은유전자에대하여 cross하여영향을나타다. 또 polycistronic한유전자는 (2 / 2) 오후 4:11:52

3 Life Science & Biotechnology 22 실험강좌 RNA interference 를이용한발생유전자해석 Hideshi Inoue 동경약과대학생명과학부 그중하나의유전자에대해서 RNAi를하면요한다른시간이다. 또 mrna가분해되어도이미유전자도억제되므로주의해야한다. 성된단백질수준에서의장해는나타나지않는다 5. 섭식법 RNAi 복수의유전자에대해서동시에 RNAi를하는도가능하다. dsrna 발현대장균을발현하지자세한자료는 Kamath 8) 의을논문참조하기바란은대장균과섞어섭식시키면 RNAi의효과는다. RNAi의방법중섭식법의최대장점은하하지만간단하, 단독으로 RNAi를하여도저해가면서도비용이적게든다는점이다. 표현형의나지관찰않는 2종류의유전자를 dsrna 발현대까지필요한기술은기본적인 DNA 재조합과조작으섞어섭식하면처음의영향이나타날수있로초보자라도쉽게할수있다. 선충배양이시두개의필요유전자산물은하나의기능에공동으로한기구와배지등은다른 9) 을문헌참조한다. 관여하고있는것이다. Protease 서열을코딩하는유전자는 C. 전체유전자의약 1.7% 로 300개가넘지만학적인실험에서기능분석이이미보고되어있는것은겨우 10개정도에불과하다. 필자는 protease 유전자반수이상에대해서 R RNAi를위해서우선 dsrna 발현 plasmid 6. RNAi 를의만실험예 든다. 필자는 Fire 연구실에서제공받은 plasmid L4440(pPD129.36) 과대장균 HT115(DE3) 필자의연구실에서를 RNAi를사용한실험예를 사용하였다. L4440은한쌍의 ( 두개의서로개하겠다잘. 맞필자는단백질의활성화와분해를지 는 ) T7 promotor와그사이에 multicloning 는 protease를 site 중요한표적으로연구하고 가 디자인되어있다 ( 그림 1). 이것에표적이프로테오리시스는되생명현상에서중요하게작용하 는 유전자의 mrna와일치하는염기서열을며가지, 생물에는다종다양한 protease와 는 DNA를조합하면되고, DNA는 cdna 시스유래나시스템이존재한다. 생물은몇종류의 게놈 DNA 유래모두상관이없다. cdna protease 를를가지며, 그중생명활동에 template로하여 PCR로증폭한후, 것은 500 어느염기정도일까이? 상의 DNA 단편을제한효소로절단하여 L4440 에 재조합한다. 먼저이소박한질문에대한해답을얻기위해 elegans를이용한 RNAi 실험을하였 (1 / 3) 오후 4:12:05

4 였으며, 이는 EST 가존재하는유전자의대부을포함하는것이다. 그결과 10 개의 pro protease 유사유전자산물에대해서 10 그에가까운배아치사율을볼수있어, 이들자는배아발생에필수적이라고여겨진다. 이외약한배아치사성과불임, 형태이상, 생식소등을관찰할수있었다. 필자는 proteasome의각 subunit RNAi실험을하였지만거의대부분 subun 하여 L4기에 dsrna 발현대장균을섭식시그선충이태어난알은배아치사하므로, 이는아발생과정에필수적이라고여겨진다. dsr 그림 2 섭식법 RNAi의모식도를섭식시키지않은성충을 dsrna 발현대장 L4로 dsdna 발현대장균을을섭식시키면섭식시켜, 성충몇개의 subunit에대해이나다음세대에영향을미친다든알이. 부화하고 L2까지성장한후에모두한다. 이는배아발생후에도그 subunit cdna는 BLAST로 EST database 인자임을를검색하여알수있다. L1에서 dsrna를 clone의번호를조사한다. 재조합 plasmid 는데도불구하고를영향이거의없었고 L2에있 DH5 등의대장균에클로닝하여제한효소지도를서영향이관찰되었으나이같은 RNAi의효과작성하고 DNA sequencing으로확인한투여한후시기보다늦게나타난것은이경우에만 HT115(DE3) 에도입한다. HT115(DE3) 특이하게는발생하는것이아니라일반적인것이다 double strand RNA에특이적인 RNase III가결손되어 IPTG 유도시 T7 RNA polymerase 또한 proteasome 가발의 subunit 중현되는대장균이다. 발현 plasmid를가진 Rpn12 HT115 각각을별도로 RNAi 로해석하여 (DE3) 은 ampicillin을포함한 LB 상은 plate 보이지않았다에서. 선택그러나각각의 dsrna 할수있다. 선택한 clone을 ampicillin 대장균을섞어을첨가한선충에게섭식시켰을때 100% LB 액체배지에서 8~18시간배양한후, 사하였으며 IPTG와, 이두개의 subunit은상호 ampicillin을포함하는 nematode 작용하는 growth 것을알수있었다. medium(ngm) plate에도말하여실온에서하룻밤동안 dsrna를유도한다. 이 plate에선충을두필자가 RNAi를하던중 L4기유충에서 d 면 RNAi가작용한다. Plate에도말하는선충과유의섭식을개시하고다음세대 (F1) 에서는영도후의 plate는오래두면 RNAi의출현이저하되이관찰되지않았으나, 그다음세대 (F2) 에므로신선한것을사용해야한다. 100% 치사되는경우가있었다. 이런경우이전의유충에게 dsrna를섭식시키면 F1은이와같이준비한 plate에선충을옮기면아 RNAi 단계에서실치사한다. 다른가능성도충분히험이시작된다. 예를들어 L4 초기자웅동체유충지만, L4기이전생식소에서합성된단백질을선택하여 dsrna 발현대장균상에둔다아발생에 ( 그림작용하고있다고여겨진다. 2). 20 에서배양하면다음날성충이되어산란을시작한다. 표적이되는유전자에따라불임등 7. 인터넷으로 RNAi 결과검색의영향이관찰된다. 배아발생에관련하는유전자인경우수정란을관찰한다. 부화한벌레를지속적 C. elegans의 RNAi에의한유전자으로관찰하면배아발생후의영향을볼수있다. 몇개의그룹에서대규모로배아발생후의영향만을보고자하는경우 L1기이후유충에섭식시킨다. dsrna를섭식시키지않 (2 / 3) 오후 4:12:05

5 은성충에서 dsrna 발현대장균상에서산란시켜도된다. 다만 RNAi의효과가나타나기위해서는섭식개시후시간이필요하며, 이는소화관에서채취한 dsrna가생식소와다른조직으로이동하는데필 전화면 찾아보기 ( 목차 ) (3 / 3) 오후 4:12:05

6 Life Science & Biotechnology 22 실험강좌 RNA interference 를이용한발생유전자해석 Hideshi Inoue 동경약과대학생명과학부 행해지고있다. 이결과는 Wormbase ( 참고문헌 등인터넷을통하여검색할수있다. 검색화면에서 RNAi experiment 1)Fire, 를 A., Xu, S., Montg 선택하고예를들어 C47B2.4라는유전자번호를 Kostas, S.A., Driver, S 넣고검색을하면 RNAi에의한표현형화면을 (1998) 얻 Nature 391, 806- 을수있다. 또는검색화면에서 sequence(any) 2)The C. elegans Sequenci 를선택하여유전자번호를넣어도된다. 이경우 (1998) Science 282, 201 3) Fraser, A.G., Kamath, R 는 RNAi의결과뿐아니라여러가지정보를얻을 P., Martinez- Campos, M 수있다. RNAi의결과는유전자에의한배아발생 M., & Ahringer, J.(2000 과정을동영상으로볼수있다 ) Gonczy, P., Echeverri, 8. 동물세포의 RNAi Coulson, A., Jones, S.J Duperon, J., Oegema, J. RNAi의작용기작은아직해명되지않았으나초파 Cassin, E., Hannak, E., 리추출액을사용한 in vitro 실험으로 RNAi Pichler, 과정 S., Flohrs, K. 에서생겨난 21 혹은 22염기의짧은 RNA(si Leodel, S., Alleaume, A RNA) 가중요하게작용한다는것을 10). Ozlu, N., Bork, P., & H 밝혔다그 (2000) Nature 408, 331- 리고이발견은척추동물유래의배양세포에 5)Elbasir, S.M., Harborth RNAi의응용을가능하게하였다. 즉 HeLa W., 와 Yalcin, A., Weber, COS-7 등실험실에서자주사용되는배양세포(2001) Nature 411, 494- 에 21염기의 sirna를투여하면 RNAi6)Tabara, 가일어난 H., Grishok, A. 다고보고되었다 5). 지금까지 long strand (1998) Science 282, 430 dsrna를포유류세포에투여하였을경우 7)Timmons, RNAi L. & Fire, A. 가일어나지않고비특이적인장해를나타내었는 395, 854 데, 이는 dsrna 의존적단백질인산화로단백질 (Science를 Nature로정정합니다합성계가저해받기때문이다. sirna가포유류의 8)Kamath, R.S., Martinez. 세포에서도 RNAi를일으킨다는발견은역유전학 Zipperlen, P., Fraser, 적연구방법으로 RNAi의유용성을많이확대했다 (2000) Genome Biol. 2, 9) 桂勳, 石原健 (1998) 실험의학, 고말할수있다. 현재선충을사용하지않은많은 77 연구실에서도 RNAi는자주사용하는방법으로, (1 / 2) 오후 4:12:16

7 앞으로기초연구뿐아니라의료등분야에 10) 응용Elbashir, S.M., Lendeck 이기대된다. T. (2001) Genes Dev. 15 전화면 찾아보기 ( 목차 ) (2 / 2) 오후 4:12:16

Chapter 14 유전정보 (Genetic Information) A + G = C + T 일정 ( 샤가프룰 ] - Watson & Crick(1953년 ) : double helix model of DNA( 이중나선구조 ) 제시 1. 유전정보의전달경로 DNA 상의정

Chapter 14 유전정보 (Genetic Information) A + G = C + T 일정 ( 샤가프룰 ] - Watson & Crick(1953년 ) : double helix model of DNA( 이중나선구조 ) 제시 1. 유전정보의전달경로 DNA 상의정보를 RNA로옮겨주는과정 ex) retrovirus 2. DNA Replication ( 유전자복제