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보령 진
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1 Journal of Life Science 2010 Vol. 20. No ~613 cjls / ISSN Effect of Pine (Pinus densiflora) Needle Extracts on Synthesis of Collagen in Osteoblastic MC3T3-E1 Cells Min Hee Jeon, Young Kyoung Kim, Yong Soo Park, Hyun Jung Hwang, Sung Gu Kim 1, Sang-Hyeon Lee 2, In Soon Choi 3 and Mihyang Kim* Department Food and Nutrition, Silla University, Busan , Korea 1 Bioport Korea Co., Busan , Korea 2 Department of Bioscience and Biotechnology, Silla University, Busan , Korea 3 Department of Biological Science, Silla University, Busan , Korea Received March 26, 2010 /Accepted April 8, 2010 Osteoporosis is a disease involving a decrease in bone mineral density and an increased risk of fractures. The MC3T3-E1 pre-osteoblastic cell line is a well-accepted model of osteogenesis in vitro. Pine needles have long been used as a traditional health-promoting medicinal food in Korea. In this study, MTT assay, the alkaline phosphatase (ALP) activity and collagen synthesis of osteoblast cells were investigated to determine the effects of pine needle extracts on cell proliferation and differentiation. Pine needle extracts were prepared using hexane, ethanol and water. The effects of the pine needle extracts were examined by comparing the results with those of commercial agents, such as proanthocyanidin. The MC3T3-E1 cells exposed to proanthocyanidin showed increased proliferation in a concentration-dependent manner. The cells exposed to the hexane extract showed a similar increase in proliferation to that observed with proanthocyanidin. The hexane extract showed the highest ALP activity. Moreover, a supplement of pine needle extracts induced collagen synthesis in MC3T3-E1 cells. The pine needle extract produced the highest level of collagen synthesis at concentrations of 10~50 μ g/ml. These results indicate that pine needle extracts have an anabolic effect on bone by promoting osteoblastic differentiation, and may be used in the treatment of common metabolic bone diseases. Key words : Pine (Pinus densiflora) needle, MC3T3-E1 cell, MTT assay, alkaline phosphatase, collagen synthesis 서 뼈는파골세포에의한골흡수와그에따른조골세포에의한새로운골기질형성, 그리고무기질화과정이끊임없이반복적으로일어나는활발한대사기관이다. 그러나일반적으로폐경후에스트로겐이감소하면서파골세포에의한골흡수가폐경전에비해많아져빠른뼈손실이일어나고폐경이후 10년사이에약 20% 의골무기질이감소하는등 [33] 골대사질환을가진다. 대표적인골대사질환중고령화사회에서큰문제로대두되고있는골다공증은뼈밀도가낮아지고뼈의조직의구조가악화된것으로골절을유발할수있는질병으로골형성과골흡수의불균형으로부터야기되는퇴행적인골대사질환이다. 골다공증의치료는여성호르몬대체요법, 선택적에스트로겐수용체조절제 (SERM), 비스포스포네이트, 부갑상선호르몬, 칼시토닌투여등으로알려져있다 [12]. 현재골다공증의예방과치료에가장많이이용되고있는방법은에스트로겐이나천연에존재하면서약한에스트로 론 *Corresponding author *Tel: , Fax: * mihkim@silla.ac.kr 겐활성을나타내는식물유래의 phytoestrogen이폐경후골다공증예방에매우유용하게처방되고있다 [1]. 조골세포는골표면에근접해있으며세포질내에과립형질내세망이발달해있으며, 세포막에는당단백효소인 alkaline phosphatase (ALP) 가존재하고있다 [31]. 이효소는기질특이성과염기성 ph에서최적의활성을나타내고세포의외막과석회화조직의기질소포에서높은농도로발견되어석회화과정동안무기인산의운반, 세포분열이나분화의조절자로서역할을하여 [24], 골세포분화의표지인자로알려져있다 [9]. 또한활성화된조골세포는골기질을생성하는데콜라겐, osteocalcin, osteopontin, bone sialoprotein과같은물질을합성하여석회화과정에중요한역할을한다 [20]. 콜라겐은진피, 인대, 건, 연골, 뼈, 근막, 혈관등의결합조직에광범위하게분포되어있으며체단백질의약 30% 를차지하는중요한경섬유단백질이다 [23]. 콜라겐은 estrogen에의해생성량이증가한다는연구보고도있으며 [18], 골다공증및연골조직의노화에의한골관절염병인에연골조직의 collagen이손상되고, 구조가비정상적으로변한다고도보고되고있다 [22]. 한편, 소나무는표고 1000 m 이하의국내어느지형에서나자라고있는사철푸른나무로우리나라이외에도중국, 일본등아시아지역의

2 608 생명과학회지 2010, Vol. 20. No. 4 임야에서널리자생하고있다 [28]. 솔잎은예로부터약용식품으로널리이용되어왔으며동의보감에따르면중풍, 동맥경화, 고혈압과같은심혈관계질환, 위장질환, 비뇨기질환, 피부질환, 간장질환, 당뇨, 탈모, 불면증, 신경쇠약등에유용한효능을보인다 [19]. 솔잎에대한선행연구로는혈행및지질개선의효과 [15], 항산화효과 [10], 항돌연변이활성 [17,22], 항균효과및항암활성 [5,8,27], 항노화 [7] 에대한보고가있다. 솔잎의주요성분은 querecetin, kaempferol 등의 flavonoid 류, α- oinene, β-pinene, camphene 등의정유성분및수지, 당류, carotene, vitamin C 등이있다 [21]. 또한솔잎중의 flavonoid 류중 proanthocyanidin은항산화력이우수한것 [10] 으로알려져있다. 조골세포의배양법은골의대사, 골세포의생성및분화등의연구와각종호르몬이나성장인자, cytokines가골대사에미치는효과그리고식품유래천연물질의골대사조절물질을검색하는데비교적간편하면서유용한방법으로알려져있다 [4,30]. 골조직유래확립된여러가지세포주중태생기의마우스를이용한 MMBI, MC3T3-E1 골아세포주의태생기의 rat을이용한 RCB, RCJ 세포주가널리이용된다. 본연구에사용한 mouse calvaria 유래의 MC3T3-E1 osteoblastic cell 은 in vivo 골형성과정에서나타나는세포의증식, 분화, 석회화등골아세포와유사한대사적특징을가지고있으므로, 골세포의세포활성과관련된연구에서유용하게이용되어왔다 [13,16]. 따라서본연구에서는 MC3T3-E1 세포를이용하여적송잎추출물이조골세포의증식에미치는영향, 조골세포의활성과분화인자인 ALP 활성및조골세포의골형성을위한필수인자인콜라겐합성에미치는영향을검토하였다. 재료및방법세포배양경희대학교의과대학내분비연구실에서분양받은 mouse calvaria osteoblast cell 인 MC3T3-E1 세포는 α-mem 배지 (Gibco BRL, Grand islane, N. Y., USA) 에 10% FBS (Gibco) 와 1% antibiotics (Gibco) 를첨가하면서 37 o C, 5% 의 CO 2 incubator에서 2~3일마다배지를교환하면서실험에사용하였다. 분화유도를위해 5mM β-glycerol phosphate (Sigma Chem. Co., St. Louis. Mo., USA) 와 50 mg/ml의 vitamin C (Sigma) 를첨가하여분화유도배지로사용하였으며, 3일마다배지를교환하였다. 추출물의제조본실험에사용한적송잎은 2008년지리산에서채취하여 60 o C에서열풍건조한후믹서로분말화시켜열수추출, 에탄올추출과헥산추출을행하였다. 열수추출은 700 g에물 4,500 ml을첨가하여 121 o C에서 15분간추출한후여과한액을 동결건조하여제조하였다. 에탄올및헥산추출은분말 200 g에각각 95% 에탄올및헥산 1,500 ml을첨가하여상온에서 24시간침지하여추출한후여과한액을동결건조하여제조하였다. 동결건조하여얻은적송잎추출물분말각각 1, 10, 50, 100 μg/ml를에탄올로용해한후, 0.2 μl membrane filter 로여과한후사용하였다. 세포증식유도 시료의농도별처리에따른조골세포의세포증식은 Green 등의방법에따라 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, sigma) 시약의환원정도를측정하는 MTT assay 방법을사용하여측정하였다. MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석은탈수소효소작용에의해노란색의수용성기질인 MTT tetrazolium을청자색의 formazan (3-(4,5-dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 으로환원시키는미토콘드리아의능력을이용하는검사법으로이검사법은세포의증식과성장을알아보는대표적인실험방법중하나로살아있는세포수에비례해서흡광도를나타낸다. 배양한 MC3T3-E1 세포를 0.4% trypan blue 염색법을이용하여세포수를 cell/ml로조정하여 96 well plate에 platting 한후, 농도별로준비된적송잎추출물을 20 μl씩첨가하여 37 o C, 5% 의 CO 2 incubator에서 48시간배양하였다. 이때대조군으로는적송잎추출물대신에탄올을 20 μl 를첨가하여동일하게배양하였다. 48시간배양후 MTT (5 mg/ml) 시약을 10 μl 씩각각의 well에첨가하고 37 o C, 5% 의 CO 2 incubator에서 4시간더배양하였다. 배양후배지를제거하고 DMSO (dimethyl sulfoxide) 를 100 μl씩첨가하여생성된불용성의 formazan 결정을용해시킨뒤 ELASA reader로 550 nm에서흡광도를측정하였으며, 세포증식률은적송잎의흡광도를대조군의흡광도에대한백분율로나타내었다. Alkaline phosphatase (ALP) 활성 배양된 MC3T3-E1 세포를 cell/ml로조정하여 96 well plate에 platting 한후, 농도별로준비된적송잎추출물을 20 μl씩첨가한후 37 o C, 5% 의 CO 2 incubator 에서 48시간배양하였다. 48시간배양후 PBS로 3회세척하고 0.1% Triton X-100을 20 μl씩넣은다음 37 o C, 5% 의 CO 2 incubator에서 30분간 lysis 하였다. Lysis 된 cell의상등액 5 μl는단백질정량에사용하였고, 나머지상등액에 20 μl의 0.1 N glycine 과 100 μl의 100 mm p-nitrophenylphosphate (p-npp) 를첨가한후 37 o C, 5% 의 CO 2 incubator에서 30분간반응시켰다. 반응후 0.1 N NaOH로반응을정지하고 200 μl 를취해 405 nm에서흡광도를측정하여 ALP 효소에의해 p-nitrophenol로전환된양을산출하였다. 세포수의차이가 ALP 활성도에영향을미칠수있으므로총단백질양을측정하여나누어줌으로써

3 Journal of Life Science 2010, Vol. 20. No 단위세포수에대한 ALP 활성도를계산하였다. 결과및고찰 콜라겐측정방법배양한 MC3T3-E1 세포를 cell/ml로조정하여 plate 에배양한후 PBS로 2회세척하고세포층은 cell scraper를이용하여모은후이를 0.05 M Tris-HCl buffer로한번더현탁시킨후 ultrasonicator로 sonication 시켰다. 이후 5% TCA를첨가한후원심분리하여상등액을제거한뒤침전물에 5% TCA를첨가한후이과정을 2회반복하였다. 상등액제거후침전물에 6N HCl을가하여 20 시간동안 110 o C에서가수분해하고, 가수분해물을여과농축하여 ph를중성으로조절한후실험에사용하였다. 시료용액중의 hydroxyproline의측정은 woessner [36] 법을이용하였고, 얻어진 hydroxyproline량으로부터콜라겐량을환산하였다. 콜라겐중에 hydroxyproline 이약 10% 포함되어있으므로, hydroxyproline (mg/100 ml)x100/11= 콜라겐으로산출하였다. 통계처리연구결과얻어진자료를 SPSS 통계프로그램을사용하여하위그룹각각의기술통계치 (mean, SD) 를산출하였다. 사후검증은 Tukey를적용하였고 p<0.05수준에서유의수준을검증하였다. 조골세포에대한증식유도효과인체의뼈는파골세포와조골세포에의해서지속적인생성이일어난다 [32]. 골세포군의조골세포 [35] 는연골세포, 지방세포와같이간엽줄기세포에서유래하며, 조골전구세포로부터분화되어콜라겐섬유등의골기질단백질을합성 분비하고, 자신의주위로합성방출한유골속에묻혀이유골에석회화가일어나골이형성되면그속에묻혀골세포가된다. 조골세포는다양한성장인자를생성하며 alkaline phosphatase, parathyroid hormone (PHT), 1,25(OH) 2D 3 그리고 estrogen 수용체들을함유하고있다 [29]. 적송잎추출물의농도 (1, 10, 50, 100 μg/ml) 에따른조골세포성장에미치는영향을 MTT assay로분석한결과는 Fig. 1과같다. 적송잎에함유되어있으면서항산화능을가진것으로알려져있는 proanthocyanidin 의조골세포성장에미치는영향을검토한결과, 농도 10 μg/ml 까지는증식률에별다른변화가나타나지않았으나 50 μg/ml 이상첨가한군에서대조군보다급격한증식률을나타내었다 (p<0.001). 적송잎헥산추출물처리군에있어서는 10 μg/ml 농도이상에서증식률의증가가나타났다. 이에반해에탄올추출물을첨가하였을때첨가농도증가에의한증식증가는나타났으나유의적인차 (a) Proanthocyanidin (b) Hexane extracts (c) Ethanol extracts (d) Hot water extracts Fig. 1. Effect of pine needle extracts on the proliferation of the MC3T3-E1 osteoblastic cells by the MTT assay. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared with control

4 610 생명과학회지 2010, Vol. 20. No. 4 (a) proanthocyanidin (b) Hexane extracts (c) Ethanol extracts (d) Hot water extracts Fig. 2. Effect of pine needle extracts on the alkaline phosphatase activities of the MC3T3-E1 osteoblastic cells during the differentiation. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared with control 이가보이지않은반면, 열수추출물의경우 50 μg/ml 첨가하였을때, 120% 이상의증식률을나타내유의적인증식향상이유도되었다. 대두에탄올추출물을실험한최 [6] 의결과에서는 50~100 μg/ml 의농도로조골세포주에처리한결과대조군에비해최고 117% 의증식률을나타내었으나, 본실험결과적송잎의 100 μg/ml 헥산및 50 μg/ml 열수추출물첨가시 120% 이상의증식유도효과가나타나더높은조골세포증식유도결과임을확인할수있었다. Alkaline phosphatase (ALP) 활성에미치는영향염기성인산분해효소 (Alkaline phosphatase; ALP) 는거의모든조직에존재하며특히골조직에존재하는 ALP는골성장이활발히일어날때그활성이증가한다 [14]. 따라서조골세포활성을나타내는 biomarker [11] 로서 MC3T3-E1 조골세포에서의 ALP 활성을측정하여적송잎추출물이조골세포의골성장활성에미치는영향을검토하였다. 적송잎추출물이 ALP 활성에미치는영향을조사한결과는 Fig. 2에나타내었다. 조골세포의 ALP 활성은 proanthocyanidin 을첨가한경우 1 μg/ml 이상의농도에서증가하였고 100 μg/ml 농도에서는대조군과비교하여유의성있는결과를나타내었으나, 오히려 50 μg/ml 농도보다감소하는경향이나타 났다. 헥산추출물을첨가한경우, 1 μg/ml 이상의농도에서유의성있는 ALP 활성을나타내었고, proanthocyanidin을첨가했을때와비슷한경향을나타냈다. 한편, 에탄올추출물의경우 10 μg/ml 농도에서그활성이증가하였으나, 그이상의농도에서는오히려감소하는경향을나타내었고, 열수추출물에있어서도비슷한결과를나타내었다. 주로세포막에결합되어존재하는염기성인산분해효소는기질특이성과염기성 ph에서최적의활성을나타내는효소로써골세포분화의표지인자로알려져있다 [34]. 따라서이상의결과는적송잎추출물이조골세포의 ALP 의발현을증가시켜조골세포의분화에영향을줄가능성을제시하고있다. 또한적송잎의열수및에탄올추출물보다헥산추출물에서조골세포의 ALP 활성이증가하여적송잎의 ALP 활성에영향을주는성분은수용성성분보다지용성성분인것으로추측되었다. 조골세포의콜라겐합성에미치는영향골형성이이루어지는과정은 Ⅰ형콜라겐의합성과세포내의과정그리고세포외로분비, 섬유질의형성및콜라겐기질의성숙과 hydroxyapatite 형성등의단계를밟는다 [37]. 조골세포에서합성되는 Ⅰ형콜라겐은전체골단백질의 85~90% 를차지하며, 조골세포는여러가지호르몬 [2-3,25] 국소인자

5 Journal of Life Science 2010, Vol. 20. No (a) Proanthocyanidin (b) Hexane extracts (c) Ethanol extracts (d) Hot water extracts Fig. 3. Effect of pine needle extracts on collagen content in bone of the MC3T3-E1 osteoblastic cells. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared with control 에의해조절되고있다. 대표적으로부갑상선호르몬, 갑상선호르몬, 1,25(OH) 2D 3, 성호르몬, 인슐린등이있고국소인자로는프로스타글란딘과여러종류의 cytokine 이이에해당된다 [2]. 뼈는주로콜라겐과칼슘으로구성되어있으며, 계속성장하며살아있는조직이다. 콜라겐은뼈에서부드러운골격을형성하는단백질이고인산칼슘이라는미네랄이뼈의골격을강하고단단하게만들어준다. 또한콜라겐은골조직의유기물의대부분을차지하며, 콜라겐이적절하게생성되지못하는조건에서는골조직의석회화가일어나지않을뿐만아니라 ALP 활성저하및 osteocalcin의생성또한매우감소하는것으로알려져있다 [26]. Fig. 3은적송잎추출물이조골세포의콜라겐합성에미치는영향을나타낸것이다. Proanthocyanidin 처리군의경우농도 1~50 μg/ml에서는대조군과비교하여농도의존적으로콜라겐합성을촉진하였고, 농도 100 μg/ml 첨가군에서는오히려감소하는결과가나타났다. 헥산추출물처리군은농도 10 μg/ml 보다높을경우감소하는경향을나타내었으나, 에탄올및열수추출물의경우 proanthocyanidin 처리군과비슷한결과를나타내었다. 특히열수추출물을 50 μg/ml 첨가하였을때대조군에비해약 10배에해당하는콜라겐합성결과가나타났다. 앞선선행연구 [21] 에서도적송잎추출물중 proanthocyanidin 함량은열수추출물의경우 4.5 mg/g으로 가장높은함량을나타내었다. 따라서, 이상의실험결과에서헥산추출물뿐만아니라열수추출물에서높은콜라겐합성능력을나타낸것으로미루어볼때, 상이한화학적특성을지닌 proanthocyanidin과같은단일성분또는복합적성분들의상승작용에의해조골세포의콜라겐합성을촉진시킨것으로추측할수있다. 적송잎추출물이콜라겐합성을촉진하여골생성에영향을줄수있는것이확인되었으며, 그에대한구체적인기작연구를위하여 in vivo 및 in vivo 실험을통한구체적인연구가수행되어야할것으로사료된다. 감사의글 본연구는교육과학기술부와한국산업기술진흥원의지역혁신인력양성사업으로수행된연구결과이며이에감사드립니다. References 1. Aldercreutz, H. and W. Mazur Phyto-estrogens in relation to cancer and other humam health risks. Proc. Nutr. Soc., 55, Canalis, E The hormonal and local regulation of bone formation. Endocr Rev. 4,

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,