[ 별지 19] 최종보고서 발간등록번호 Zinc finger nucleases를이용한소광우병발현유전자가제거된배아생산및유전자제거검증 (Generation of PRNP knockout embryos using zinc finger n

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1 [ 별지 19] 최종보고서 발간등록번호 Zinc finger nucleases를이용한소광우병발현유전자가제거된배아생산및유전자제거검증 (Generation of PRNP knockout embryos using zinc finger nucleases and verification of its knockout) 충남대학교 농림축산식품부

2 제출문 농림축산식품부장관귀하 이보고서를 Zinc finger nucleases 를이용한소광우병발현유전자가제거된배아생산 및유전자제거검증에관한연구 과제의보고서로제출합니다. 년월일 주관연구기관명 : 충남대학교 주관연구책임자 : 조종기 세부연구책임자 : 조종기 연 구 원 : 이두수 연 구 원 : 조상철 연 구 원 : 김강용 협동연구기관명 : 서울대학교 협동연구책임자 : 장 구 협동연구기관명 : 툴젠 협동연구책임자 : 김석중 - 2 -

3 요약문 Ⅰ. 제목 - Zinc finger nucleases를이용한소광우병발현유전자가제거된배아생산및유전자제거검증 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성제1절. 연구개발의필요성 최근조류독감 (AI; avian influenza), 구제역 (FMD; foot and mouth disease), 광우병 (BSE; bovine spongiform encephalopathy) 등가축전염병으로인하여전세계적으로막대한피해가발생하고있으며현재우리나라역시이로인하여많은피해가발생하고있다. 최근구제역으로인한국가피해액은 2조원을넘었다는보고가있다. 그리고 2008년광우병의발생국가 ( 미국 ) 로부터소고기수입협상에대한결과는우리나라에사회적으로큰파장을야기하였다. 그이유는광우병소고기섭취로인해인간에게발생할수있는치명적인질병, variants Creutzfeldt-Jakob disease (vcjd) 때문이다. 오른쪽표 1은국가별로 2007년까지보고된소해면상뇌증 (BSE) 및 vcjd 발병에대한통계이다 ( 영국을포함한유럽일부국가에서광우병에걸린소에서유래한변형된 prion 감염으로 variants vcjd라는질병으로인해죽는환자가발생하여, 인수공통전염성질병의무서움을다시한번경고하였다. 하지만현재까지국내에서 PrP-BSE 및 PrP-vCJD에대한발생보고는없었다. 광우병의원인이되는 prion은단백질성감염성입자 (Proteinaceous Infectious Protein) 로서, 정상 cellular prion protein (PrPc) 이 amyloid folding을해서비정상적인단백질구조인 pathogenic한 scrapie isoform의 prion protein(pcpsc) 으로변형되면서뇌와같은신경조직에침착되어동물에서 transmissible spongiform encephalopathy를야기한다 1. 광우병에대한연구는현재까지는마우스에서 rodent models for prion diseases를이용하여많은연구가이루어지고있다. 초기 년대에는마우스와햄스터에서 scrapie에걸린양의뇌물질을직접넣어해면상뇌증을유도하는 conventional 방식으로진행되다가 1982년 2 광우병의원인이 prion으로밝혀진이후로 3가지형태의형질전환마우스질환모델을이용한연구가시작되었다. 첫번째로 PrPc 발현유전자인 PRNP(PRioN Protein) gene을 knockout(prnp-ko) 한마우스를이용한연구가시작되었다 3-7. 현재까지 4가지종류의 PrP-KO mouse가보고되었으며 8 이모든연구에서 PrPc가포유류의세포의발육과기능에는필요하지않지만 prion의 replication과해면상뇌증을야기한다는것을증명하였다. 두번째로 mutant PrP expression model 마우스를이용한많은연구가있었으며특히 prion 단백질에대해서많은정보를얻게되었다 9. 세번째는매우낮은종간 prion의전파율을극복하기위해다른종의 prion이숙주동물에서발현될수있는형질전환마우스가생산되어이용 - 3 -

4 되었다 10,11. 이세가지종류의광우병질환모델마우스는 homologous recombination된마우스 embryonic stem cells을이용한 blastocyst injection 방법과전핵내주입법 (pronuclear microinjection) 으로생산되었다. 이렇게실험동물인마우스에서광우병질환모델마우스를이용한많은연구가진행되고있지만, 실제동물의고기를섭취시사람에게전파될수있어소를이용한연구는광우병에걸린소의임상학적검사분야에서는많은결과가발표되었지만그발병기전에대해서연구할수있는질환모델소생산연구는현재매우제한적이다. 현재까지광우병질환모델소생산은미국과일본그룹의협동으로 2007년 Richt 등 12 에의해 homologous recombination 방법에의한 PRNP knockout (PRNP -/- ) 방법으로 prion lacking 소생산이보고되었다. 그연구결과에따르면, prion이없는소들은 20개월까지성장하면서임상학적, 생리학적, 조직학적, 면역학적, 번식학적으로분석한결과그모든측면에서정상임이보고되었다. 그리고 adeno-associated virus vectors 13 또는 small interfering RNA (sirna) 14 을이용하여 PRNP 유전자발현이억제된소체세포생산까지보고되었다. 그러나최초의광우병질환모델소의경우 Fig. 1에서와같이이를생산하기위해 embryonic stem cell이수립되지못한종특성상 biallelic targeted gene knockout을위해체세포에서 gene targeting과또이를이용한복제된태아의 fibroblast에서 sequential gene targeting이이루어졌기때문에그방법이매우복잡하며, 경비및시간이많이소요되고무엇보다도체세포에서 homologous recombination율이너무낮다는단점이있다. 그래서이를극복할수있는다른 gene targeting 방법이요구된다. 최종적으로광우병질환모델동물생산은인간에게문제를일으킬수있고최근국내에서사회적으로큰문제가되었던동물종인소에서이루어져야하며특히그생산효율을획기적으로높일수있는방법이필요한실정이다. 제 2 절연구개발의목적 - ZFNs 시스템을이용하여광우병의 prion 발현유전자인 PRNP knockout 소배아를 생산하고, 생산된배아에서유전자의발현이제거되었음을검증 - 4 -

5 Ⅲ. 연구개발의내용및범위 1. 주관연구기관 ( 제1세부 ) (PRNP KO 세포를이용한복제배아생산 ) 가. PRNP knockout 복제배아생산 (1) 우수형질의소복제배아생산 ( 가 ) 우수형질의한우및젖소세포주확립 ( 나 ) 체세포핵이식에의한복제배아생산 ( 다 ) 복제배아생산효율을높이기위한최적의배양조건확립 ( 라 ) 대조군으로체외수정배반포생산 (2) PRNP-KO 복제배아생산 ( 가 ) 제2세부연구기관에서 PRNP-KO 세포를공여받아체세포핵이식실시 ( 나 ) 배반포생산효율을높이기위한최적의배양조건확립나. 수정란에서 PRNP 유전자발현검증 (1) 일반배반포에서유전자분석체계확립 ( 가 ) 복제및체외수정 ( 대조군 ) 배반포에서 genomic DNA 및 RNA 추출 ( 나 ) 배반포단계에서복제및체외수정배반포에서 PRNP 유전자발현비교 (2) 배반포에서 PRNP-KO 확인 ( 가 ) 체외수정란과 PRNP-KO 복제배반포에서 genomic DNA 및 RNA 추출 ( 나 ) 배반포단계에서복제및체외수정배반포에서 PRNP KO 검증다. PRNP-KO 복제배아대량생산체계확립 (1) PRNP-KO 복제배아대량생산체계확립 ( 가 ) PRNP-KO 복제배아생산을위한최적의체세포핵이식조건확립 ( 나 ) 생산효율을높이기위한최적의배양조건확립 ( 다 ) 향상된생산효율로 PRNP-KO 복제배아대량생산체계확립 2. 세부연구기관 ( 제2세부 ) (ZFNs을이용한 PRNP-KO 세포주수립및 ZFNs의난자내주입법확립 ) 가. PRNP Knockout을위한우수세포주생산 (1) 한우세포주확립 ( 가 ) 혈통이확보된한우태아세포주를확립 ( 나 ) 유전자검사를통하여성별판정및세포 proliferation assay 나. PRNP KO 세포주개발 (1) 3세부연구팀과협동으로 PRNP KO 세포주생산다. PRNP KO 배아생산을위한 ZFNs injection 방법확립 (1) ZFNs의 injection 방법확립 ( 가 ) 활성화자극이전에미세주입과활성화자극이후미세주입비교 - 5 -

6 ( 나 ) 농도에따른 ZFNs 의미세주입후배아발육평가 라. 한개의배반포에서 PRNP KO 을검증하기위한세포배양 (1) 한개의배반포에서효율적으로 genomic DNA 와 RNA 추출하기위한배양기법확립 3. 세부연구기관 ( 제3세부 ) (ZFNs을이용한 knockout 시스템개발및검증 ) 가. PRNP Knockout을위한다양한쌍의 ZFNs 생산 (1) PRNP knockout genomic analysis ( 가 ) 실험에적용된체세포의 genomic DNA를추출하여 PRNP에대한 ZFNs 평가 ( 나 ) 선별된 ZFNs의생산및검증 ( 다 ) PRNP KO 검증시스템확립나. 체세포에서 ZFNs의검증 (1) 제2세부과제와협동으로체세포에 ZFNs을이용한 PRNP KO검증 ( 가 ) 유전자도입후 genomic DNA 수준의평가 ( 나 ) KO을효율개선방법개발 ( 다 ) KO 세포분리기술개발다. PRNP knockout 세포주완성및 Knockin 세포주수립 (1) 제 2세부과제와협동으로 PRNP knockout 및 knockin 세포주완성 ( 가 ) KO 후 Knock-in시스템개발 ( 나 ) 효과적 Knock-in 후제 2세부과제와협동으로세포주완성 ( 다 ) 완성된세포주를 2세부과제와협동으로분석 - 6 -

7 Ⅳ. 연구개발결과 1. PRNP 제거세포를위한 PRNP 시퀀싱세포확립가. 한우세포확보및 PRNP발현조사및분석 (1) 한우의태아세포는임신된자궁에서분리하였고, 성체세포는홍천한우클러스터사업단에서검증된 한우퀸 귀조직의생검을통하여분리하였다. 그이외에도화성목장과장수군한우목장의도움을받아서 10여두의한우세포를분리배양하였다. (2) 한우세포에서 PRPN발현조사및분석 ( 가 ) 한우의세포에서 mrna를추출하여 cdna를만들어서유전자발현을비교분석하였다. 한우의 primary 세포의경우 PRNP 발현이개체에따라다를수있다는점을규명하였다. 나. PRNP제거를위한불멸화세포개발 - 체세포를불멸화상태로만들기위하여 BMI유전자또는 TERT유전자를발현시키는아래그림과같은 DNA vector를제작하였으며, 이들 DNA를체세포도입하여한우의불멸화를유도하였다. - BMI 또는 BMI와 TERT유전자의발현을통해만들어진불멸화세포는 passage를거치면서 senescency를거치지않고지속적인 doubling time을가지고장기간성장하였으며또한 Single 세포콜로니의형성및성장속도가크게향상된것으로보여불멸화가성공적으로수행되었음을확인하였다. 2. PRNP 제거된수정란생산을위한최적의미세주입법및체세포핵이식조건수립가. 미세주입확립 - PRPN KO 영양막세포배양을위한초기실험으로서, reporter DNA를 microinjection ( 미세주입 ) 을수행하였다. 미세주입을조건을위하여 pcdna3.1-mcherry-stopsv40p-neomycinr-stop유전자를이용하였으며미세주입을실시한후배아는단위발생을화학적조건을이용하여유도하여배양을하고유전자발현을검토하였다. 배양후 7일째형광현미경하에서관찰한결과아래와같이 RFP 유전자가잘발현되는것을관찰하였다. 나. 불멸화세포를이용한복제배반포생산효율비교 - 대조군세포와 2개의불멸화세포주 (RAP, TERT) 를이용한체세포핵이식란의발육율을비교한결과분할율에서는각군간유의적차이는없었으며배반포발육율에서는 TERT 군에서유의적으로높은배반포로의발육율 (22.1, 22.0 vs. 28.4) 을보였다. 다. 공여핵원용불멸화세포주종류에따른소핵이식란의발육속도비교 - 7 -

8 - 불멸화세포주종류에따른체세포핵이식란의발육속도를비교한결과 TERT 세포주를 이용한군에서빠른배반포발육율속도를보였다. 라. 공여핵원용불멸화세포주종류에따른소핵이식란의내부세포괴비율비교 - 체세포핵이식란의질적평가를위한지표로서내부세포괴수 / 영양막세포수를비교한결과 TERT 불멸화세포를이용한배반포에서상대적으로좋은지표를보였다. 마. PRNP 제거가된불멸화세포를이용한복제배반포생산및효율비교 - 불멸화세포에서 PRNP 가제거된세포라인을확립하고확립된세포별로체세포복제실 험을한결과는아래와같다. 3. Genome editing 기술을이용한 PRNP 유전자제거가. ZFN제작및준비 (1) Cow PRNP ZFN 개발 - 확보된 ZFN/TALEN의활성을소세포내에서검증하기위해 Primer3 ( 를이용하여 primer를고안하고한우세포의 genomic DNA에서 PRNP target site의 PCR 과정을확립하였다. Gradient PCR을통해최적화된 PCR melting temperature를결정하였다. (2) ZFN 검증및개선 - ZFN 활성검증은리포터시스템을이용하여이루어졌다. 툴젠의리포터시스템은유전자가위의활성에따라정량적으로세포에서형광단백질을발현하여유전자가위의활성을조사하는중요한도구로특히리포터에서관찰되는활성은세포내의원하는유전자부위를자르는실제의활성과높은상관관계를보여유전자가위의대량생산을위해유용하게사용되고있다. 먼저합성된각 ZFN의목적서열을포함하는활성리포터를제작하고 293T 세포내로도입하여형광단백질의발현을측정하여 1차로활성이관찰되는 ZFN을찾아내었다. 이후 ZFN의 FokI 부분을활성및특이성이개선된형태의 nuclease variant (DAS/RR, RR/DAS) 로교체하여다시한번활성조사를진행하여 ZFN에따라더높은활성을갖는 ZFN 구조를확인하였다. 이를통해 2 pair의 Cow PRNP ZFN을확보하였다. 나. TALEN 제작및준비 (1) Cow PRNP TALEN 제작 년새롭게발견된맞춤형염기결합도메인구조인 TAL effector 염기결합도메인의모듈을이용한유전자가위인 TAL effector nucleases (TALEN) 이최근크게각광을받고있다. 툴젠은독립적연구를통해자체의 TALEN 구조및생산시스템을구축하였으며이를이용한 PRNP TALEN 개발을진행하였으 ZFN과같은과정으로고안및합 - 8 -

9 성을진행한후유전자가위활성리포터를이용하여활성을조사하였으며이를통해 4 pair의고활성 TALEN을확보하였다. (2) TALEN 리포터제작및검증 - 세포내에서활성확인된 PRNP TALEN의인식서열을합성하여 MACS reporter에 cloning하여 PRNP TALEN MACS reporter를제작하고 sequencing으로서열검증하였다. (3) TALEN 실험결과 - 총 12쌍의 TALEN pairs를 Immortalization 세포에 prnp talen유전자 nucleofection을실시한후제 2협동연구팀에서 mutation assay를실시하여 prnp ko할수있는쌍을선별하였으며이중가장활성이좋았던 TALEN을선정하여추후 KO 실험에사용하였다. - 유전자 KO 효과가있는 pair에대해서 enrichment 실험을위하여 reporter를제 2협동연구팀에서제작하였고, 이렇게완성된 talen DNA를 maxi-prep을통해서많은양의 DNA를확보하였다. - 확보된 DNA를가지고한우태아섬유아세포에 nucleofection을실시하여, RFP/GFP발현을확인하고, MACS sorting을하여유전자변형세포을일차적으로 enrichment를하였다. - Enrichment 괸세포의 PRNP locus를 T7E1 assay를이용하여분석한결과 mutation의도입이관찰되었으며특히 MACS를이용한 enrichment를통해돌연변이도입세포가농축된것을확인할수있었다. 또한해당세포 pool의 PRNP locus에대한돌연변이서열분석을통해실제로 KO를일으킬수있는 frameshift 돌연변이가들어간것을보았다. - KO clone을얻기위해 Enriched cell population에서총 6개의싱글세포콜로니를확보하고돌연변이분석을진행한결과2개의콜로니에서 mutation이관찰되었다. 이세포를제 2협동연구팀에서 mutation assay를한결과 prnp유전자에 mutation이관찰이되었고, mutation된결과를시퀀싱한결과 2개의콜로니에서 mutant형태가관찰되었다. - mutation assay를한후남은세포를싱글세포콜로니로키워서싱글콜로니유래의세포를확보하기위하여실험을하였다. 총 6개의콜로니를확보하였고, 그중에서 2 개의콜로니를얻었고, 얻어진콜로니중 2개의콜로니에서 mutation이관찰되었다. - 같은과정으로 PRNP KO 세포주를소체세포및불멸화체세포에서제작하여그효율을분석한결과불멸화체세포가 DNA전달효율및성장성이좋은이유로전체 KO cell line 구축과정에서의효율이소체세포에비해높았다. 4. 불멸화세포와기본세포에서 PRNP 유전자제거효율비교테이블 - 9 -

10 가. PRNP-KO 확인 - 확보된 PRNP gene knockout 소불멸화체세포의 genotype을확인하여각 clone들이가지고있는 framefshift 돌연변이의모양을확인하였다. 나. 복제배아에서 PRNP-KO확인 - 또한확보된 PRNP KO 불멸화세포주의복재배반포를제작후확보된배반포의 PRNP locus 서열을분석하였을때공여세포가가지고있는 PRNP 돌연변이가그대로관찰되어 PRNP 유전자녹아웃복제배반포가성공적으로생산되었음을확인하였다. 다. mrna 단계에서복제배아 PRNP-KO 확인 - PRNP KO 복재배반포에서 PRNP 유전자의 mrna 발현을 RT-PCR로조사한결과몇몇돌연변이 type에따라서는 PRNP mrna의발현이현저히줄거나사라진것을관찰할수있었다

11 Ⅴ. 연구개발결과의활용계획제1절. 추가연구의필요성 1. 본연구의결과로유전자가위를이용하여특정유전자인프리온단백질발현유전자인 PRNP 유전자가제거된세포주를수립하였고이를공여핵원으로하여체세포핵이식을하여생산된복제배아에서 PRNP 유전자가제거된것을확인되어본연구는목표인 PRNP 유전자제거된복제배아를생산하였음 2. 본연구과제의성공적인수행으로복제배아를생산하였으나복제배아단계에서는그활용가치가높지않으며단지소에서유전자가위효용성검증했다는데의의를둘수가있음가. 유전자가위가소의체세포에서적용되어그효용가능성이입증됨나. 그리고이세포를복제하였을경우복제배아에서도그유전자가제거되었음 3. 대리모에이식하여 PRNP 유전자가제거된복제송아지가태어날경우가. 국민들에게광우병내성소생산가능성에대해홍보가능나. 광우병예방에대한획기적기반을마련가능다. 국내에서최신기법으로광우병의원인이되는 prion knockout소를개발하면, 이에대한안전성연구에과학적인성과를거둘수있음라. 관련기술이아직진입단계이므로다양한대동물을이용한다양한모델동물을생산할수있는기술및특허를취득하여경제산업적으로도움가능함 4. 이에추가적으로본연구로성공적으로생산된복제배아에서연구가멈추는게아니라이를대리모에이식하여광우병내성소생산연구가필수적으로수행되어야함가. 소에서대리모이식은실험실에서하는연구보다그비용이훨씬많이들어가며소의경우현실적으로대리모를구입할수없기때문에학교농장또는일반축산농가에게대리모대여를하여함나. 대리모에대량생산된광우병내성복제배아를이식하였을경우임신기간 277일을거친후광우병내성소생산이가능하게됨 제 2 절. 다른연구에의응용 1. 본연구결과가성공하면, 생산된형질전환소의세포또는개체를이용하여 prion의안전성을과학적으로검증할수있으며, 이세포주또는개체가완성되면, prion의질병의발병및치료에대한기초자료가될수있는샘플을확보하여, 다양한기관들에게샘플을제공하여, 이분야에활발한연구를할수있을것이다. 2. 기대성과

12 가. 기술적측면현재많은부분에서유전자변형, 특히 knockout에대한기술이 HR을이용하여적용되고있지만, 소와같은대형동물에서는그연구의한계로제한적이었다. ZFNs을이용한본연구의성공은대형동물에서목적에맞는유전자변형동물을좀더효과적으로생산할수있다는장점이있다. 나아가다른유전자및동물에도 ZFNs을적용할수있으므로대형동물형질전환동물을통한새로운장을열수있다. 나. 경제-산업적측면본연구의성공은광우병예방에대한획기적기반을마련할수있다. PRNP-KO 세포주및배반포가수립되면이를이용하여핵이식을실시 PRNP-KO 소를생산하고자한다. 일단국내에서최신기법으로광우병의원인이되는 prion knockout소를개발하면, 이에대한안전성연구에과학적인성과를거둘수있다. 나아가관련기술이아직진입단계이므로다양한대동물을이용한다양한모델동물을생산할수있는기술및특허를취득하여경제산업적으로도움이될수있다. 제 3 절. 기업화추진방안 1. 유전자가위를이용한넉아웃동물생산기업수립가. 현재소와돼지에서유전자가위를이용한넉아웃및넉인이된형질전환동물생산보고가미국및일본등생명공학선진국에서많이이루어지고있으며특히그동안이분야후진국으로분류되었던중국에서천문학전인연구비와인적자원투여로그생산보고가우리나라보다훨씬빠르게이루어지고있음나. 본연구가성공적으로이루어져산업동물에서유전자가위의적용가능성을보았으며생산된복제배아를대리모에이식하여광우병내성소가태어났을경우기업화를추진하여소나돼지에서원하는유전자가제거된동물을생산한다. 2. 기술이전가. 기업화가어려울경우본유전자가위기술을유수생명공학회사에전수하여그산업적가치를창출하고자함

13 5. 영문요약서 SUMMARY Due to the decline in the livestock industry in Korea, a research was financed by a grant from the Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Generation of PRNP knockout embryos using zinc finger nucleases and verification of its knockout. The mission was to This research was performed to generate the PRNP knockout embryos using zinc finger nucleases and verify the its knockout. within a project duration date of 3 years. 1. Establishment of the of HanWoo cell lines for PRNP sequencing to remove the PRNP gene 1) Significant differences in the expression of PRNP gene was confirmed after comparing of transcripts in the RT-PCR of PRNP. 2) Establishment of bovine immortalized cell lines for PRNP-KO. 2. Intracytoplasmic injection and somatic cell nuclear transfer to produce the bovine PRNP-KO embryos. 1) Establishment of optimal methods for intracytoplasmic injection of PRNP genetic scissor. 2) Investigation of the most efficient immortalized cell lines in bovine somatic cell nuclear transfer 3. Removal of PRNP gene using genome editing 1) Development of efficient ZFNs systems for PRNP-KO 2) Development of efficient TALENs systems for PRNP-KO 4. Verification of PRNP-KO in the cloned bovine embryos 1) Production of cloned embryos using PRNP-KO cells 2) Confirmation of PRNP-KO in the cloned bovine embryos We performed this Our research findings show possibility of production of PRNP-KO cows by genetic scissors (ZFNs and TALENs) and somatic cell nuclear transfer and its application into development of the livestock industry is possible. Our research can be applied to other biotechnology and medical field including with production of cloned pig for xenotransplantation

14 6. 영문목차 CONTENTS Chapter I- Overview of Research projects Cahpter II Current research activities in domestic or foreign countries Chapter III Research activities and Results Chapter IV - Achievements and Contribution to related era Chapter V Research outcomes and applications Chapter VI Scientific informations in the middle of research projects Chapter VII Current state of research facilities and equipments Chapter VIII References

15 7. 목차 목차 제 1 장연구개발과제의개요 제 2 장국내외기술개발현황 제 3 장연구개발수행내용및결과 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 제 5 장연구개발결과의활용계획 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 제 7 장연구시설 장비현황 제 8 장참고문헌

16 목 차 제 1 장연구개발과제의개요 제 1 절연구개발의필요성 최근조류독감 (AI; avian influenza), 구제역 (FMD; foot and mouth disease), 광우병 (BSE; bovine spongiform encephalopathy) 등가축전염병으로인하여전세계적으로막대한피해가발생하고있으며현재우리나라역시이로인하여많은피해가발생하고있다. 최근구제역으로인한국가피해액은 2조원을넘었다는보고가있다. 그리고 2008년광우병의발생국가 ( 미국 ) 로부터소고기수입협상에대한결과는우리나라에사회적으로큰파장을야기하였다. 그이유는광우병소고기섭취로인해인간에게발생할수있는치명적인질병, variants Creutzfeldt-Jakob disease (vcjd) 때문이다. 오른쪽표 1은국가별로 2007년까지보고된소해면상뇌증 (BSE) 및 vcjd 발병에대한통계이다 ( 영국을포함한유럽일부국가에서광우병에걸린소에서유래한변형된 prion 감염으로 variants vcjd라는질병으로인해죽는환자가발생하여, 인수공통전염성질병의무서움을다시한번경고하였다. 하지만현재까지국내에서 PrP-BSE 및 PrP-vCJD에대한발생보고는없었다. 광우병의원인이되는 prion은단백질성감염성입자 (Proteinaceous Infectious Protein) 로서, 정상 cellular prion protein (PrPc) 이 amyloid folding을해서비정상적인단백질구조인 pathogenic한 scrapie isoform의 prion protein(pcpsc) 으로변형되면서뇌와같은신경조직에침착되어동물에서 transmissible spongiform encephalopathy를야기한다 1. 광우병에대한연구는현재까지는마우스에서 rodent models for prion diseases를이용하여많은연구가이루어지고있다. 초기 년대에는마우스와햄스터에서 scrapie에걸린양의뇌물질을직접넣어해면상뇌증을유도하는 conventional 방식으로진행되다가 1982년 2 광우병의원인이 prion으로밝혀진이후로 3가지형태의형질전환마우스질환모델을이용한연구가시작되었다. 첫번째로 PrPc 발현유전자인 PRNP(PRioN Protein) gene을 knockout(prnp-ko) 한마우스를이용한연구가시작되었다 3-7. 현재까지 4가지종류의 PrP-KO mouse가보고되었으며 8 이모든연구에서 PrPc가포유류의세포의발육과기능에는필요하지않지만 prion의 replication과해면상뇌증을야기한다는것을증명하였다. 두번째로 mutant PrP expression model 마우스를이용한많은연구가있었으며특히 prion 단백질에대해서많은정보를얻게되었다 9. 세번째는매우낮은종간 prion의전파율을극복하기위해다른종의 prion이숙주동물에서발현될수있는형질전환마우스가생산되어이용되었다 10,11. 이세가지종류의광우병질환모델마우스는 homologous recombination된마우스 embryonic stem cells을이용한 blastocyst injection 방법과전핵내주입법 (pronuclear microinjection) 으로생산되었다. 이렇게실험동물인마우스에서광우병질환모델마우스를이용한많은연구가진행되고있지

17 만, 실제동물의고기를섭취시사람에게전파될수있어소를이용한연구는광우병에걸린소의임상학적검사분야에서는많은결과가발표되었지만그발병기전에대해서연구할수있는질환모델소생산연구는현재매우제한적이다. 현재까지광우병질환모델소생산은미국과일본그룹의협동으로 2007년 Richt 등 12 에의해 homologous recombination 방법에의한 PRNP knockout (PRNP -/- ) 방법으로 prion lacking 소생산이보고되었다. 그연구결과에따르면, prion이없는소들은 20개월까지성장하면서임상학적, 생리학적, 조직학적, 면역학적, 번식학적으로분석한결과그모든측면에서정상임이보고되었다. 그리고 adeno-associated virus vectors 13 또는 small interfering RNA (sirna) 14 을이용하여 PRNP 유전자발현이억제된소체세포생산까지보고되었다. 그러나최초의광우병질환모델소의경우 Fig. 1에서와같이이를생산하기위해 embryonic stem cell이수립되지못한종특성상 biallelic targeted gene knockout을위해체세포에서 gene targeting과또이를이용한복제된태아의 fibroblast 에서 sequential gene targeting이이루어졌기때문에그방법이매우복잡하며, 경비및시간이많이소요되고무엇보다도체세포에서 homologous recombination율이너무낮다는단점이있다. 그래서이를극복할수있는다른 gene targeting 방법이요구된다. 최종적으로광우병질환모델동물생산은인간에게문제를일으킬수있고최근국내에서사회적으로큰문제가되었던동물종인소에서이루어져야하며특히그생산효율을획기적으로높일수있는방법이필요한실정이다. 제 2 절연구개발의최종목표 ZFNs 시스템을이용하여광우병의 prion 발현유전자인 PRNP knockout 소배아를생산하고, 생산된배아에서유전자의발현이제거되었음을검증 제 3 절연구개발의범위 신청하고자하는본연구개발의주내용은기존의광우병내성소생산을위하여수행된 gene targeting방법의많은단점을극복할수있는최신유전자절단기술인 zinc finger nucleases(zfns) 을이용하여인간에게전염되어치명적인뇌질환을야기할수있는 prion 발현유전자인 PNRP를넉아웃하는최신연구방법의응용및적용이라고할수있다. 최근생명공학분야에서새로운 gene targeting 방법으로이용되고있는 ZFNs는특정염기서열을갖는 DNA에특이적으로결합하는 zinc finger array 부분과 DNA의절단을일으킬수있는 nuclease 부분을결합하여만들어지는인공제한효소이다 (Fig 2). ZFNs은유전체의정해진목표 locus를절단하도록고안될수있어서지금까지는자유로운유전체 engineering이불가능하였던다양한동물모델시스템에서효율적으로유전자를 knockin 및 knockout을가능하게해주는획기적인기술로최근크게각광을받고있다 25. 원하는유전

18 자를인식하도록고안된 ZFNs이세포에서발현되면매우특이적으로 target 유전자의 DNA를절단하여이중가닥손상 (Double strand break) 을유발한다. 세포에서이중가닥손상이발생하면세포는자체적으로가지고있는수리기작을이용하여손상된부위를고치게된다 (Fig 2). 이때손상된부분과유사한 DNA 서열을가진 DNA(donor DNA) 를세포내에도입해주면세포는이를주형으로사용하여손상된염색체부분을수리하는 homologous recombination방법을이용한다. 동시에 donor DNA에우리가원하는염기서열을넣어주면유전체상의특정부위에원하는대로조작이가능하게되며 donor DNA가없을경우에도세포는 non-homologous end joining(nhej) 방식으로손상된부위를고치게된다. NHEJ는끊어진 DNA 가닥을바로접합시켜서원상태로수리할수도있지만, 끊어진 DNA 가닥말단에서작은 insertion이나 deletion (indel) 이일어나는 error-prone한방향으로수리가진행될수도있다. 따라서 ZFNs을이용하여특정유전자의염기서열부분에이중가닥손상을일으켜 NHEJ를유도하면원하는유전자에돌연변이를일으키고 knockout 세포주를수립할수있다. 그림 1 Zinc finger nucleases homodimer binding to DNA 27 and Potential genome manipulation using zinc finger nucleases 25 특히 NHEJ를이용하는유전자 knockout의방식은다양한세포및동물배아에서 1%~20% 의높은효율로 ZFNs target site에 indel을유도하기때문에 drug selection marker등을이용한추가적인과정이필요없이 knockout cell을빠르게분리하는것이가능하다는장점이있다. ZFNs을개발하는데있어서가장핵심적인기술은 zinc finger domain을조합하여원하는염기서열을특이적으로인식할수있게하는 zinc finger engineering 기술이다. 제3세부연구팀인툴젠은 2003년에인간유전체에서다양한염기서열을인식하는 zinc finger들을확보하고이를조합하여원하는염기서열에결합하는 designed zinc finger DNA binding domain을구축하는기술을개발하여발표하였다 28,28. 그리고 zinc finger engineering 기술을 ZFNs 제작에사용할수있는제반시스템을구축하고이를이용해 AIDS 치료를위해중요하게연구되고있는인간 CCR5 유전자를 targeting하는 ZFNs을개발하여발표한바있다 30,31. 특히최근에는 ZFNs의대량생산및검증시스템을완성하고 32 이를이용하여세계연구자들에게 ZFNs 개발서비스를시작해지난 10개월간세계 6개국 30여연구실에 ZFNs을공급해왔다

19 ZFNs을이용해목적유전자넉아웃동물을생산하기위한접근법으로는크게두가지가있다. 첫번째는인공수정란에직접 ZFNs을주입하는방법인데이때 ZFNs은 mrna의형태로전달하는경우가많다. ZFNs인주입된인공수정란에서태어나는개체는높은확률로목적유전자에돌연변이를가지고있다 (Table 1). 특히각개체에서높은효율의 mosaicism ( 목적유전자의 wild-type과 mutant의비율 ) 을보이기때문에추가적인교배를통해쉽게목적유전자넉아웃을얻을수있다. 안공수정란의 ZFNs 주입은 zebrafish, drosophila, mouse 그리고 rat등의다양한실험동물에서효율적으로사용된다. 그림 2 ZFNs-mediated Thmpd3 disruption in mouse embryos. 두번째로는체세포에서 ZFNs을이용하여목적유전자의넉아웃을유도하고이를핵이식에이용하여유전자넉아웃동물을생산하는것이다. 배양세포에 ZFNs을발현시키면짧은시간 ( 보통 2~3일 ) 내에높은효율로목적유전자에돌연변이가일어나게된다. 이때돌연변이는 NHEJ에의해자연적으로생산되는 small indel이고그효율은 ZFNs에따라 1%~20% 로다양하게나타난다 (Fig 3). 중요한것은목적유전자의한 allell에서돌연변이가발생하였을경우다른 allele에도돌연변이가일어나서 homozygous mutation이일어날확률이상대적으로높기때문에많은경우목적유전자에돌연변이가일어난세포중 10~30% 는 homozygous 넉아웃상태인것으로관찰되고있다. 이에본연구는광우병내성소를생산하기위해 Fig 4에서와같이소체세포에서 ZFNs을이용하여광우병의원인이되는 prion 발현유전자인 PRNP이 knockout된체세포주를수립하고이를이용하여체세포핵이식을실시배반포단계에서 PRNP 유전자가 knockout 됐음을증명하고자한다. 본신청연구가성공적으로수행되어 PRNP-KO 체세포핵이식란생산체계가확립되면이를수란우에이식하여최종적으로광우병내성소를생산연구에적용하고자한다

20 그림 3 Targeted mutagenesis using ZFNs in cultured cells. Genomic DNA isolated from cultured cells transfected with ZFNs expression plasmids were analyzed for target gene mutation using a mismatch-sensitive nuclease assay. If the DNA amplicons contain both wild-type and mutated DNA sequences, heteroduplexes would be formed. T7E1 recognizes and cleaves heteroduplexes, but not homoduplexes. 그림 4 Production of PRNP-KO bovine blastocysts by SCNT and pronulcear microinjection

21 제2장국내외기술개발현황제1절국내연구개발의필요성 1. 국내관련연구현황가. 서울대연구팀에서 1996년부터 2004년까지최초로광우병감염우역학조사실시하여 8,677 samples에서광우병음성으로판정됨 15 나. 정등에의해한국소에서 PRNP 유전자의 genotype 분포연구가이루어짐 16 다. 2004년 mutant prion을발현하는광우병소생산 2. 국내연구개발의필요성가. 우리나라국민정서에는예로부터먹을거리, 특히축산식품에대한안정성을중요시하였으며, 광우병이라는치명적질병에대해서사회적으로불안한잠재요소로작용하고있으며, 그예로, 최근미국산소고기수입할때많은국민들이촛불시위에참여할정도로전염성질병에관심이크며광우병을극복하기힘든질병으로인식하고있다. 이에광우병내성소를생산하여광우병은인간이극복할수있으며국민들에게도소고기에대한막연한불안감을해소시킬필요가있다. 나. PRNP 유전자가넉아웃된광우병내성소를생산하기위해서는수정란유래줄기세포가없는동물종인소의특성상체세포에직접 gene targeting을실시하여이를핵이제거된난자에이식하는체세포핵이식방법을이용해야한다. 그러나앞서언급한바와같이기존의연구에서소체세포에서 gene targeting 방법은극히낮은효율과소요되는시간및경비측면에서많은단점들이있어이를극복할수있는다른방법이요구된다. 다. 이에본신청자는현재국외에서많이적용되고있는 Zinc Finger Nucleases(ZFNs) 기술을응용하여기존의유전자제거방법보다좀더효과적으로소체세포에서 PRNP 유전자를제거하고자한다. 이기술은현재까지많은부분에서응용되고있으며최근생명공학분야에적용되어형질전환동물생산보고가국외에서많이이루어지고있다. 실험동물인 rat와마우스에서 ZFNs을이용한 knockout 동물생산이보고되었으며 산업동물에서는 2010년돼지에서외인성유전자인 GFP가 knockout 된세포주 20 와올해 2011년에는이를이용한복제돼지 21 가생산보고되었다. 그리고줄기세포에서도적용되어인간의수정란유래 및유도만능 22,24 줄기세포에적용되어생명공학분야에서 ZFNs의효용성은점점높아지고있다. ZFNs의가장큰장점은 1) 수정란유래줄기세포뿐만아니라체세포에적용가능하며 2) 높은 gene targeting

22 효율이다. 보통마우스에서 knockout 마우스를만들기위해수정란유래줄기세포에 gene targeting을하였을경우 10-6 ~ 10-9 의효율로 homologous recombination이일어난다고알려져있지만 25 Santiago 등 26 의연구에서는줄기세포가아닌체세포인 Chinese hamster ovary (CHO) cells에서 1% 이상의 biallelic gene disruption이보고되었다. 이 ZFNs 기술을광우병내성소생산에적용시 Fig. 1과표2에서와같이기존의방법에서는매우낮은확률의 2번의 homologous recombination과 2번의복제과정을거쳐서광우병내성소를생산하였지만이기술로는아주쉽게 1% 이상의확률로 PRNP-KO 세포주를수립할수있고이를이용하여광우병내성소를생산할수있다. 이는수정란유래줄기세포가수립되지않고번식주기가상대적으로긴동물종인소에서질환모델동물생산을위한매우획기적인방법이라할수있다. 그림 5 Comparison of conventional and ZFNs-mediated methods to produce BSE-resistant cow 표 2. 광우병내성소생산방법비교 ( 기존의방법 vs. ZFNs 를이용한방법 ) 기존의생산방법 12 ZFNs 이용한생산방법 Homozygous PRNP KO 필요횟수 : 2회필요횟수 : 1회확률 : 매우낮음확률 : 상대적으로높음 (>1%) 필요한복제과정횟수 2회 1회 외부유전자도입여부 2개의항생제내성유전자 없음 연구수행경비및시간 많은시간과경비요구 시간과경비단축가능

23 라. 국외에서앞서언급한바와같이 ZFNs이생명공학분야에적용되어많은연구보고가있지만국내에서는아직까지는연구초기단계라고할수있다. 국내에서 ZFNs의적용은서울대학교김진수교수팀과본연구신청의제 3세부연구팀인 ToolGen 등몇몇연구기관에서인간세포수준에서그연구를수행하고있으며 ZFNs을이용한형질전환동물생산보고는없는실정이며세포수준에서벗어나동물및사람의적용연구에해당하는 in vivo 관련연구는늦은상태이다. 마. 본연구신청의제1세부연구팀인충남대학교수의과대학은그동안수행된 bioreactor로서형질전환소생산연구경험으로 ZFNs에의한 PRNP-KO 세포주를이용하여체세포핵이식을실시하여그생산효율을높일수있으며제2세부연구팀인서울대학교수의과대학은오랜기간동안동물의전염병과관련하여, 전염병학, 병리학, 미생물학, 면역학등관련전문가들이연구를수행해왔으며, 특히기존의생명공학분야에서정부지원다른연구과제를수행하고있어형질전환동물생산에대한연구인프라가충분히확보된상태이다. 바. 형질전환가축생산기반을위한기술로 ZFNs을적용하면 PNRP 유전자를 knockout 하여좀더효과적으로 prion 발현을억제할수있으며이를이용한 knockout 동물생산및이생산된동물을이용하여사람의 CJD의연구에기초가될수있으리라사료된다. 생산된형질전환동물의안전성등을추가적으로확인하여식품안전성에크게기여할수있는모델이될수있을것이다

24 제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절연구기관별연구개발내용 1. 주관연구기관 ( 제1세부 ) (PRNP KO 세포를이용한복제배아생산 ) 가. PRNP knockout 복제배아생산 (1) 우수형질의소복제배아생산 ( 가 ) 우수형질의한우및젖소세포주확립 ( 나 ) 체세포핵이식에의한복제배아생산 ( 다 ) 복제배아생산효율을높이기위한최적의배양조건확립 ( 라 ) 대조군으로체외수정배반포생산 (2) PRNP-KO 복제배아생산 ( 가 ) 제2세부연구기관에서 PRNP-KO 세포를공여받아체세포핵이식실시 ( 나 ) 배반포생산효율을높이기위한최적의배양조건확립나. 수정란에서 PRNP 유전자발현검증 (1) 일반배반포에서유전자분석체계확립 ( 가 ) 복제및체외수정 ( 대조군 ) 배반포에서 genomic DNA 및 RNA 추출 ( 나 ) 배반포단계에서복제및체외수정배반포에서 PRNP 유전자발현비교 (2) 배반포에서 PRNP-KO 확인 ( 가 ) 체외수정란과 PRNP-KO 복제배반포에서 genomic DNA 및 RNA 추출 ( 나 ) 배반포단계에서복제및체외수정배반포에서 PRNP KO 검증다. PRNP-KO 복제배아대량생산체계확립 (1) PRNP-KO 복제배아대량생산체계확립 ( 가 ) PRNP-KO 복제배아생산을위한최적의체세포핵이식조건확립 ( 나 ) 생산효율을높이기위한최적의배양조건확립 ( 다 ) 향상된생산효율로 PRNP-KO 복제배아대량생산체계확립 2. 세부연구기관 ( 제2세부 ) (ZFNs을이용한 PRNP-KO 세포주수립및 ZFNs의난자내주입법확립 ) 가. PRNP Knockout을위한우수세포주생산 (1) 한우세포주확립 ( 가 ) 혈통이확보된한우태아세포주를확립 ( 나 ) 유전자검사를통하여성별판정및세포 proliferation assay 나. PRNP KO 세포주개발 (1) 3세부연구팀과협동으로 PRNP KO 세포주생산다. PRNP KO 배아생산을위한 ZFNs injection 방법확립

25 (1) ZFNs의 injection 방법확립 ( 가 ) 활성화자극이전에미세주입과활성화자극이후미세주입비교 ( 나 ) 농도에따른 ZFNs의미세주입후배아발육평가라. 한개의배반포에서 PRNP KO을검증하기위한세포배양 (1) 한개의배반포에서효율적으로 genomic DNA 와 RNA 추출하기위한배양기법확립 3. 세부연구기관 ( 제3세부 ) (ZFNs을이용한 knockout 시스템개발및검증 ) 가. PRNP Knockout을위한다양한쌍의 ZFNs 생산 (1) PRNP knockout genomic analysis ( 가 ) 실험에적용된체세포의 genomic DNA를추출하여 PRNP에대한 ZFNs 평가 ( 나 ) 선별된 ZFNs의생산및검증 ( 다 ) PRNP KO 검증시스템확립나. 체세포에서 ZFNs의검증 (1) 제2세부과제와협동으로체세포에 ZFNs을이용한 PRNP KO검증 ( 가 ) 유전자도입후 genomic DNA 수준의평가 ( 나 ) KO을효율개선방법개발 ( 다 ) KO 세포분리기술개발다. PRNP knockout 세포주완성및 Knockin 세포주수립 (1) 제 2세부과제와협동으로 PRNP knockout 및 knockin 세포주완성 ( 가 ) KO 후 Knock-in시스템개발 ( 나 ) 효과적 Knock-in 후제 2세부과제와협동으로세포주완성 ( 다 ) 완성된세포주를 2세부과제와협동으로분석 제 2 절실험적접근방법및내용 연구범위한우세포분리소불멸화세 연구수행방법 ( 이론적 실험적접근방법 ) 프라이머리세포 분리 1.Primary culture 불멸화세포주수립 1. 불멸화세포제작 구체적인내용 1) PRNP 제거를위해서한우의세포분리를위하여 한우목장에방문하여혈통등록이되어있는한우조 직을무균적으로생검기구를이용하여분리하였다. 2) 분리한조직을멸균된수술용칼을이용하여잘게 자르고단백질분해효소에서 15 시간이상배양을하 고, 배양된조직을배양접시에넣고약일주일간배양 을하고자라게된세포는액체질소에보관하였다

26 포주수립 1) 체세포에유전자 transposon-bmi-2a-rfp유전자가들어가있는 DNA 1ug을 nucleofection을통하여 transfection을실시한후 RFP를발현하는세포를 mechanically분리한다. 이렇게분리된 BMI-RFP세포에 htert-neomycin 유전자를재 transfection을실시하였다. 이후 neomycin이선별을하여살아남은세포를분리하여동결하였다. 2) 불멸화세포분열능력 BMI-2A-RFP세포와 BMI/hTERT 세포를 1X10^5로 seeding을한후매 24시간마다세포수를측정하여세포수가 doubling 되는시간을측정하였다. 불멸화 세포주공여핵원용불멸화세 1. 체세포핵이식 1) 수핵난자준비 - 도축장유래난소를실험실에운반주사기로난포를흡입하여난자를선별 - 선별된난자를체외배양기에 18시간배양하여체외성숙유도 - Hyaluronidase로난구세포제거한후제1극체가돌출되어있은성숙난자선별하여체세포핵이식에공여 2) 공여핵원용세포준비 종류에따른핵포주종류에따른소 - 서울우유협동조합의고능력젖소의귀섬유아세포 이식란의 발육핵이식란의발육율비 를대조군으로하고이에 RAP 유전자와 TERT 유 율비교 교 전자가도입된불멸화세포주를공여핵원으로함 - 실험 2일전에계대배양한후 trypsin으로 cell suspension을유도하여체세포핵이식에공여 3) 체세포핵이식 - Hoechst 염색을한후 UV light하에서핵의위치를확인한후제1극체와함께제거하여탈핵을실시 - 기수립된대조군및 2개의불멸화세포주를탈핵된난자의주란강내에도입 - 각세포군당 30개씩총 90개의난자에서실시

27 - 전기적충격 (1.75kV/cm) 으로세포와난자의융합유도 - 4시간동안체외배양하여 reprogramming을유도 - Ionomycin으로 activation 유도 - 6-DMAP으로 4시간동안 post-activation 유도 - 체외배양기에서 8일동안배양 4) 분할율과배반포로의발육율비교 - 체세포핵이식실시 2일후실체현미경하에서분할율비교 - 체세포핵이식실시 8일후각군간배반포로의발육율비교 공여핵원용불멸화세포주종류에따른소핵이식란의발육속도비교공여핵원용불멸화세포주종류에따른소핵이식란의내부세포괴비율비교 1) 핵이식란의발육속도비교 - 앞서수행된실험에서배반포로의발육속도를비교하기위해 3가지세포군에서발율 6일, 7일, 8일에배반포발육비교함 1) 핵이식배반포의질적평가를위한내부세포괴 / 영양막세포비율비교 PRNP-KO 용 TALENs mrna 직접주입 PRNP-KO mrna 제작 - 확보된 TALEN 발현 vector를 PvuII를이용하여 linearize 후 T7 polymerase를이용하여 mrna를합성 (mmessage mmachine T7 Kit, Lifetechnologies) - 합성된 Capped mrna에 polya tailing을통해세포내 mrna 형태와유사한형태로구성 TALENs PRNP-KO TALENs - 합성된 PRNP-KO 용 TALENs mrna 를 20ng/ul 군과

28 mrna 농도에따른주입 ng/ul 군으로나누어서소체외수정란에주입하여 PRNP-KO 을유도 PRNP-KO TALENs - 합성된 PRNP-KO용 TALENs mrna를수정후 16시 mrna 주입시기에따른 KO 비교 간, 20시간및 24시간후로구분하여체외수정란에주입 PRNP sequence 에서 TALEN target site 를찾아 TALEN 합성을준비하였다. TALEN target site 는 T 로시작하여 A 로끝나는 48~52 base pair 로이루어진다. - PRNP KO 세포주개발 도출된 TALEN 후보들을 golden gate TALEN 합성소 PRNP TALEN 의고 system을이용하여제작하였다. 안및합성 그림 8 Golden Gate TALEN assembly 방법. - Primer List - PRNP KO 세포주개발 PCR 조건확립 - PCR condition

29 - Genomic DNA preparation (G-DEX genomic DNA kit, Intronbio) - PCR of PRNP locus - Induction of heteroduplex formation - T7E1 assay - PRNP KO 세포주개발 TALEN 활성검증 그림 13 유전자가위에의한유전체상목적위치돌 연변이도입효율검증실험범 PRNP knockout cell line 제작 PRNP knockout cell clone 확인법 1. PRNP TALEN을소세포및불별화소세포에 electroporation (neon, Lifetech) 을통해전달 2. 3일후 10cm dish에적절한양의세포를분주. 3. 2~4주간지켜보면서하나의세포에서증폭된세포 colony를확인하고분리하여독립적인세포주로배양

30 4. 각 colony에서유래된세포주들의 genomic DNA를분리후 T7E1 assay를통해 mutant cell clone을확보 5. mutant clone의 genomic DNA에서증폭된 PRNP target locus를 TA-cloning 및 Sanger sequencing을통해서열분석하여 mutation의모양을확인하고 frameshift 돌연변이를동정 제 3 절연구결과 1. PRNP 가제거및 Sequencing 을위한한우세포주수립 가. 한우세포확보및 PRNP발현조사및분석 (1) 한우의태아세포는임신된자궁에서분리하였고, 성체세포는홍천한우클러스터사업단에서검증된 한우퀸 귀조직의생검을통하여분리하였다. 그이외에도화성목장과장수군한우목장의도움을받아서 10여두의한우세포를분리배양하였다. 그림은홍천한우퀸의생검모습이다. 그림 14 한우생검사진아래그림은생검된한우조직으로부터분리되어자라고있는한우세포의사진이다. 세포의성별판정을위하여 Colcemid를이용하여배양중인세포를 metaphase로유도하였고, 유도된세포를 hypotonic KCL solution을이용하여세포를팽창시킨후고정액으로세번의세정을통하여세포내염색체를고정시킨후약 100cm위에서세포를슬라이드글라스에떨어뜨려염색체를조사하였다

31 그림 15 조직으로부터자라나오는한우세포와세포의성별을위한 Karyotyping 사진 (XX) (2) 한우세포에서 PRPN 발현조사및분석 그림 16 PRPN 유전자의 Exons 기발표된연구결과에의하면소의 fibroblasts에서 mrna가발현된다는보고가있어 (Wang et al., Mol Biol Rep, 2009), 한우의세포에서 mrna를추출하여 cdna를만들어서유전자발현을비교분석하였다. 위의그림처럼 Forward primer는 exon2에 reverse primer exon3번에의하여 PCR을아래와같은조건으로수행하였다. 그림 17 Prion expression detection 을위한 PCR 조건및 gel picture 위의그림처럼 3 가지의다른개체유래의한우세포에서추출한 mrna 를 cdna 로합성한결 과, 1 번한우에서는 PRNP 유전자가발현되지않았지만 2/3 번에서는서로다른수준으로발현

32 이관찰되었다. 2/3번의한우 Sample에서 RT-PCR을통해관찰된 DNA band가 PRNP임을확인하기위해 PCR product의서열을분석하였으며이를통해알려진소의 PRNP유전자와일치함을확인하였다. 이는한우의 primary 세포의경우 PRNP 발현이개체에따라다를수있다는점을보여준다. 그림 18 RT-PCR 을통해증폭된 PRNP 유전자부위의 sequencing 결과 나. PRNP 제거를위한불멸화세포개발 체세포를불멸화상태로만들기위하여 BMI 유전자또는 TERT 유전자를발현시키는아래그림 과같은 DNA vector 를제작하였으며, 이들 DNA 를체세포도입하여한우의불멸화를유도하였

33 다. 그림 19 불멸화세포에이용한유전자모식도. (A)BMI1을발현하는 DNA, (B) htert를발현하는 DNA BMI 또는 BMI와 TERT유전자의발현을통해만들어진불멸화세포는 passage를거치면서 senescency를거치지않고지속적인 doubling time을가지고장기간성장하였으며또한 Single 세포콜로니의형성및성장속도가크게향상된것으로보여불멸화가성공적으로수행되었음을확인하였다. 그림 20 세포불멸화세포들의불멸화사진 (A, a: 대조군, b:bmi, c: BMI-TERT), 불멸화세포의성장곡서 (B), 불멸화세포들간의성장곡선 (C). 2. PRNP 제거된수정란생산을위한최적의미세주입법및체세포핵이식조건수립

34 그림 21 BMI/hTERT 을이용하여세포불멸화의싱글세포유래의콜로니생성능력염색사진. 왼쪽 ( 대조군세포 ), 중간 (BMI), 오른쪽 (BMI/TERT) 가. 난자세포질내최적의미세주입법확립 PRPN KO 영양막세포배양을위한초기실험으로서, reporter DNA 를 microinjection ( 미세주입 ) 을수행하였다. 미세주입을조건을위하여 pcdna3.1-mcherry-stop- sv40p-neomycinr-stop 유 전자를이용하였다. 그림 22 미세주입조건을위해사용된 pcdna3.1-mcherry vector map 아래그림은미세주입을실시하고있는사진이다

35 그림 23 소수정란에미세주입하고있는모습 미세주입을실시한후배아는단위발생을화학적조건을이용하여유도하여배양을하고유 전자발현을검토하였다. 배양후 7 일째형광현미경하에서관찰한결과아래와같이 RFP 유 전자가잘발현되는것을관찰하였다. 그림 24 형광 DNA 를미세주입후발현하는배아사진. 왼쪽 ( 형광 ), 오른쪽 (brightness) 나. 불멸화세포를이용한복제배반포생산효율비교

36 - 대조군세포와 2 개의불멸화세포주 (RAP, TERT) 를이용한체세포핵이식란의발육율을비교 한결과분할율에서는각군간유의적차이는없었으며배반포발육율에서는 TERT 군에서유 의적으로높은배반포로의발육율 (22.1, 22.0 vs. 28.4) 을보였다. 그림 25 소체세포및불멸화체세포의복제수정란발달효율비교 Table1. Comparison of development rates of bovine somatic cell nuclear transfer embryos using immortalized cells No. of embryos Reconstructed Cleaved (%) Devleop. to Bl (%) Control (66.8) 50 (22.1) a BMI (61.9) 48 (22.0) a TERT (62.5) 59 (28.4) b 다. 공여핵원용불멸화세포주종류에따른소핵이식란의발육속도비교

37 - 불멸화세포주종류에따른체세포핵이식란의발육속도를비교한결과 TERT 세포주를이용한군에서빠 른배반포발육율속도를보였다. Table 2. Comparison of time to develop to the blastocyst according to donor cell types in the bovine somatic cell nuclear transfer embryos No. of blastocysts Total Day 6 Day 7 Day 8 Control 50 0 (0) 31 (62.0) 19 (38.0) BMI 48 0 (0) 32 (66.7) 16 (33.3) TERT 59 0 (0) 42 (71.2) 17 (28.8) 라. 공여핵원용불멸화세포주종류에따른소핵이식란의내부세포괴비율비교 - 체세포핵이식란의질적평가를위한지표로서내부세포괴수 / 영양막세포수를비교한결과 TERT 불멸화세포를이용한배반포에서상대적으로좋은지표를보였다. Table 3. Comparison of inner cell mass/trophectoderm according to donor cell types after immortalization Inner cell mass/trophectoderm Day 7 blastocysts Day 8 blastocysts Control 0.74 ± ± 0.07 BMI 0.34 ± ± 0.02 TERT 0.51 ± ± 0.19 마. PRNP 제거가된불멸화세포를이용한복제배반포생산및효율비교 불멸화세포에서 PRNP 가제거된세포라인을확립하고확립된세포별로체세포복제실험을 한결과는아래와같다

38 Cell line Total No. Fusion Cleavage Blastocysts % % % % % % % % % % % % Summary % % % 그림 26 PRNP 제거를통해서얻어진세포주를이용한배반포

39 3. Genome editing 기술을이용한 PRNP 유전자제거 가. 최적의 ZFNs 제작및준비 (1) Cow PRNP ZFN 개발 그림 27 Cow PRNP ZFN/TALEN 의검증을위한 Primer test 및 PCR 조건확립 확보된 ZFN/TALEN 의활성을소세포내에서검증하기위해 Primer3 ( 를 이용하여 primer 를고안하고한우세포의 genomic DNA 에서 PRNP target site 의 PCR 과정을 확립하였다. Gradient PCR 을통해최적화된 PCR melting temperature 를결정하였다. (2) ZFN 검증및개선 ZFN 활성검증은리포터시스템을이용하여이루어졌다. 툴젠의리포터시스템은유전자가위의활성에따라정량적으로세포에서형광단백질을발현하여유전자가위의활성을조사하는중요한도구로특히리포터에서관찰되는활성은세포내의원하는유전자부위를자르는실제의활성과높은상관관계를보여유전자가위의대량생산을위해유용하게사용되고있다. 먼저합성된각 ZFN의목적서열을포함하는활성리포터를제작하고 293T 세포내로도입하여형광단백질의발현을측정하여 1차로활성이관찰되는 ZFN을찾아내었다. 이후 ZFN의 FokI 부분을활성및특이성이개선된형태의 nuclease variant (DAS/RR, RR/DAS) 로교체하여다시한번활성조사를진행하여 ZFN에따라더높은활성을갖는 ZFN 구조를확인하였다. 이를통해 2 pair의 Cow PRNP ZFN을확보하였다

40 그림 28 Cow PRNP ZFN 처리후세포활성조사 그림 29 확보된 PRNP ZFN 의 PRNP 유전자상위치 나. TALEN 제작및준비 (1) Cow PRNP TALEN 제작 2009년새롭게발견된맞춤형염기결합도메인구조인 TAL effector 염기결합도메인의모듈을이용한유전자가위인 TAL effector nucleases (TALEN) 이최근크게각광을받고있다. 툴젠은독립적연구를통해자체의 TALEN 구조및생산시스템을구축하였으며이를이용한

41 PRNP TALEN 개발을진행하였다. ZFN 과같은과정으로고안및합성을진행한후유전자가위활성리포터를이용하여활성을 조사하였으며이를통해 4 pair 의고활성 TALEN 을확보하였다. 그림 30 Cow PRNP TALEN 활성검증 그림 31 확보된 PRNP 의 TALEN site 정리 (2) TALEN 리포터제작및검증 세포내에서활성확인된 PRNP TALEN 의인식서열을합성하여 MACS reporter 에 cloning 하여 PRNP TALEN MACS reporter 를제작하고 sequencing 으로서열검증하였다

42 그림 32 그림 32 MACS Reporter 구조및 KO cell enrichment 실험과정 또한제작된리포터와 TALEN 발현벡터를함께세포에도입하였을때 TALEN 에의한 Reporter 유전자의발현이관찰되어기능성이검증되었다. 그림 33 TALEN reporter 검증. 293T 세포에 TALEN reporter 및 TALEN 발현벡터를전달하 고 RFP/GFP 발현을 flow cytometer 로관찰 (3) TALEN 실험결과총 12쌍의 TALEN pairs를 Immortalization 세포에 prnp talen유전자 nucleofection을실시한후제 2협동연구팀에서 mutation assay를실시하여 prnp ko할수있는쌍을선별하였다. 이중가장활성이좋았던 TALEN을선정하여추후 KO 실험에사용하였다. 유전자 KO 효과가있는 pair에대해서 enrichment 실험을위하여 reporter를제 2협동연구팀에서제작하였고, 이렇게완성된 talen DNA를 maxi-prep을통해서많은양의 DNA를확보하였다. 확보된 DNA를가지고한우태아섬유아세포에 nucleofection을실시하여, RFP/GFP발현을확인

43 하고, MACS sorting 을하여유전자변형세포을일차적으로 enrichment 를하였다. 그림 34 DNA maxi-prep 결과 그림 35 TALEN 을이용한 PRNP 적중위치모식도 Enrichment 괸세포의 PRNP locus를 T7E1 assay를이용하여분석한결과 mutation의도입이관찰되었으며특히 MACS를이용한 enrichment를통해돌연변이도입세포가농축된것을확인할수있었다. 또한해당세포 pool의 PRNP locus에대한돌연변이서열분석을통해실제로 KO를일으킬수있는 frameshift 돌연변이가들어간것을보았다

44 그림 36 TALEN 활성리포터를이용한 KO 세포 enrichment 과정의검증. RFP 는 reporter 에서 constant 하게발현되는단백질. GFP 는 TALEN 에의해유도되는단백질임. 농축을 통해골라진세포에서 RFP,GFP 발현빈도가향상됨. 그림 37 TALEN 활성검증의예. 2/3/4/5 번 TALEN 발현 vector 의 electroporation 실행 2 일후 genomic DNA 를준비하여 T7E1 assay 로돌연변이도입을관찰. * T7E1 에의한돌 연변이위치절단시나타날것으로예상되는 DNA band 위치

45 그림 38 Enriched KO cell pool 에서관찰된 PRNP mutant allele sequence KO clone 을얻기위해 Enrichmed cell population 에서총 6 개의싱글세포콜로니를확보하고 돌연변이분석을진행한결과 2 개의콜로니에서 mutation 이관찰되었다. 그림 39 Enriched Mutant cell pool에서 monoclonal cell colony를분리및배양하여 mutation 을관찰같은과정으로 PRNP KO 세포주를소체세포및불멸화체세포에서제작하여그효율을분석한결과불멸화체세포가 DNA전달효율및성장성이좋은이유로전체 KO cell line 구축과정에서의효율이소체세포에비해높았다

46 4. 복제배아에서 PRNP 유전자제거확인가. 세포에서 PRNP-KO 확인 - 확보된 PRNP gene knockout 소불멸화체세포의 genotype을확인하여각 clone들이가지고있는 framefshift 돌연변이의모양을확인하였다. 그림 40 불멸화세포에서 PRNP 가제거된싱글세포유래의콜로니세포주분석결과 나. 복제배아에서 PRNP-KO 확인 - 또한확보된 PRNP KO 불멸화세포주의복재배반포를제작후확보된배반포의 PRNP locus 서열을분석하였을때공여세포가가지고있는 PRNP 돌연변이가그대로관찰되어 PRNP 유전자녹아웃복제배반포가성공적으로생산되었음을확인하였다. 그림 42 PRNP 가제거된세포를이용한체세포복제배반포생산후생산된배반포의 PRNP 시 퀀싱결과

47 그림 43 불멸화세포 (1-4), PRNP 제거세포 (5), 배반포 (6-8), PRNP 제거배반포 (9-10) 에서 PRNP 발 현검사결과 다. mrna 단계에서복제배아 PRNP-KO 확인 - PRNP KO 복재배반포에서 PRNP 유전자의 mrna 발현을 RT-PCR로조사한결과몇몇돌연변이 type에따라서는 PRNP mrna의발현이현저히줄거나사라진것을관찰할수있었다. 5. PRNP rgens 개발새로운유전자가위 platform인 RNA-guided Engineered Nucleases (rgens) 을소 PRNP knockout에적용하기위해 PRNP coding sequence 중간에 rgens이 targeting 할수있는 motif에대해 rgens 발현벡터를제작하였다. 그림 44 PRNP Knockout rgens target sequence 및 PRNP 유전자상위치. PRNP rgens 의발현벡터를불멸화체세포에전달하였을때효율적으로돌연변이가도입되 는것을 T7E1 assay 를통해확인하였다. 특히반복적인 rgens 발현벡터의전달을통해돌 연변이축적비율이향상되는것을확인하였다

48 그림 45 PRNP 녹아웃 rgens 의돌연변이도입효율 6. rgens 을이용한돌연변이확인방법확립 rgens은효소형태로제작되어 in vitro에서도표적 sequence를절단할수있다. 이런특징을이용하여 TALEN 또는 rgens등유전체교정에의하여유도된돌연변이 allele을분석하기위한실험방식을개발할수있다. 특히기존에사용되는 T7E1 assay의경우에는세포가가지고있는 allele중돌연변이가들어간수를 (hetero / homo) 알수없는반면 rgens-rflp의경우 WT allele이남아있는지를알수있어좀더손쉽게 KO cell을찾는방식으로사용될수있다. 그림 46 rgens 을이용한돌연변이세포유전자분석방법 이를 test 하기위해 DNA vector 형태의 rgens 으로돌연변이가유도되고 single clone 으로분 리된인간암세포 population 에대해 T7E1 과 rgens-rflp 분석을진행하였다. 실제로 T7E1 분석을통해발견된돌연변이 colony 세포중 rgens-rflp 를통해 WT allele 이남아있지

49 않은전체 allele 에돌연변이가도입된세포를차별적으로발견할수있었다. 그림 47 유전자돌연변이세포 clone 의 T7E1 및 rgens-rflp 분석 앞으로이런방식을이용해 PRNP 유전자에돌연변이가도입된세포 clone 의동정이손쉽게 진행될수있을것으로예상한다. 7. rgens 에의한 knock-in 세포주개발 rgens 으로 double strand break 을유도한다음 homologous recombination 을유도하여 knocki-in 세포주를개발중에있다

50 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 구분 ( 연도 ) 세부과제명 세부연구목표 달성도 (%) 연구개발수행내용 - 3 개의암수한우체세포주수립 - 한우암수 - 소복제시스템체세포주수립구축및배반포에서 PRNP 발현분 - 한우체세포석핵이식및배반포생산 개의한국재래칡소세포주수립 - 2개의한국재래흙소세포주수립 - 1개의거대한우 (1ton) 세포주수립 - 매주 2회의체세포핵이식실시 - 400개이상의배반포생산 - 한우암소체세 - 한우암수 1 차년포주수립및체세포주수립도 ZFNs 난자내주입 - ZFNs의난자내 ( 법평가주입법평가 012) - PRNP ZFNs 시스템구축 - PRNP ZFNs 시 스템구축 - PRNP-KO 검증 시스템 - PRNP-KO 복제 - 소복제시스템배아생산구축및배반포에 2 차년서 PRNP 발현분도석 - 복제배반포에서 ( PRNP-KO 확인 ~ ) - 한우암소체세 - 한개의 포주 수립 및 배반포에서 PRNP ZFNs 난자내주입 KO 검증 시스템 법평가 확립 세포주확립후성판정및증식평가 - PRPN유전자염기서열확인 -단위발생난자에 ZFNs의주입에따른단위발생란에서 KO평가 - PRNP 유전자서열분석을통한유전자가위고안 - 대량생산시스템을통한합성및활성조사 - PRNP ZFN target 위치에대한 PCR 조건확립 - 유전자가위처리후돌연변이관찰및효율비교 - 2개의불멸화세포주를제1협동연구팀에서받아대조군과발육능비교 - 최적의소체세포핵이식란발육시스템확립 - 한개의복제배반포에서 genomic DNA를추출하여 PRNP-KO 검증프로토콜확립 - 한개의배반포에서효율적으로 genomic DNA 와 RNA 추출기법확립

51 - PRNP KO 세포주 개발 - PRNP KO 세포주 - ZFNs을이용한 개발 KO 시스템개발 및검증 - 배반포에서 PRNP-KO 검증 - PRNP-KO 복제 PRNP-KO 복제 배아생산 배아 대량생산 체계확립 - 배반포에서 PRNP-KO 확인 3 차년 도 - PRNP KO 세포주 ( 개발 PRNP KO 유전자 가위최적화및 ) KO 검증 - PRNP KO 배반포 생산및검증 - PRNP 유전자가위 ZFNs을 이용한 다양화및최적화 KO 시스템개발 - rgens 을이용한 및검증 PRNP KO검증 방법확립 제3세부과제와협동하여 PRNP ZFNs/TALENs 을수립된소체세포주에적용 PRNP-KO 유도 - PRNP KO 세포주생산 - PRNP-KO 세포주개발 - PRNP-KO 효율증가 - PRNP-KO 검증 - 배반포단계에서복제및체외수정배반포에서 PRNP 유전자 KO 검증 - PRNP-KO 복제배아생산을위한최적의체세포핵이식조건확립 - 생산효율을높이기위한최적의배양조건확립 - 향상된생산효율로 PRNP-KO 복제배아대량생산체계확립 - 체외수정란과 PRNP-KO 복제배반포에서 genomic DNA 및 RNA 추출 - 제3세부과제와협동하여 PRNP nuclease (Talen 및 rgens) 을소체세포주에적용 PRNP-KO 유도및세포주개발 - 체외배아에 PRNP nuclease를미세주입후 PRNP-KO 배반포생산및검증 - PRNP KO 세포를이용한배반포생산및검증 - 세포용 PRNP rgens 개발 - 수정란용도 PRNP rgens 개발 - rgens 을이용한 in vitro 유전자변형검증법개발

52 제 5 장연구개발결과의활용계획 제 1 절. 연구개발의성과 1. 논문게재성과 게재 연도 논문명 저자 주저자교신공동저자 Embryonic development and implanatation related Saadeldi 2012 gene expression of oocyte Jang G reconstructed with bovine n trophoblast cells Productionof CMAH Knock out Preimplantation Embryos Derived From Immortalized Porcine Cells Via TALE Nucleases Identification of abnormal gene expression in bovine transgenic somatic cell nuclear transfer Oct4 overexpression facilitates proliferation of porcine fibroblasts and development of cloned embryos Disruption of Exogenous egfp gene Using RNA-guided Endonuclease in bovine transgenic somatic cells Moon JH Jang G Choi W, Roibas Da Torre B, Kim B, Lee B Lee CI, Kim SJ, Choi JY, Lee BC, Kim JS, 학술지명 Journal of reproductio n and developmen t Molecular Therapy-N ucleic acids Vol. (No.) 국내외구분 SCI구분 58(4) 국외 SCIE 3(5):e 166 국외 SCIE Cho JK Lee BC Kang SK J Vet Sci 15(2) 국내 SCIE Kim SJ Jang G Choi WJ Jang G Koo OJ, Park HJ, Moon JH, da Toore BR, Javaregowda PK, Kang JT, Park SJ, Saadeldin IM, Choi JY, Lee BC Yum SY, Lee SJ, Lee WW, Lee JH, Kim SJ, Koo OJ, Lee BC Zygote Zygote in press accep ted 국외 국외 SCIE SCIE 2. 학술대회발표 발표 연도 발표제목 주저자교신 저자 공동저자 학술대회 명 페이 지 국내외구분 발표장 소 2013 Diagnostic imaging of c o n g e n i t a l meningoencephalocele in a Holstein calf Lee JW Cho JK Jeung WC, Son JM, Oh SK, Kim SH, Lee HC, Lee KC, Choi HJ, Lee YW, Son HY, Shin ST, 한국임상수의학회 P-27- OB 국내 서울

53 A case of congenital hydrocephalus in a Holstein Targeted gene knockout using transcription activator-like effector nucleases in immortalized porcine fetal fibroblasts Implantation of transgenic bovine clone dembryos derived from transfected cells by piggybac transposon GENERATION AND CHARACTERIZATION OF BOVINE INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS Development of porcine cloned embryos using induced pluripotent stem-like cells Endocrine patterns on S u p e r o v u l a t i o n Treatment in Dairy cow K n o c k o u t beta-lactorglobulin (BLG) in bovine embryos using RNA-guided Cas9 system Producing a Transgenic Cattle using Transposon Case of congenital meningoencephalocele in a Holstein calf Kim YS Moon JH Choi WJ Koo OJ Cho JK Jang G Jang G Jang G Kim SJ Jang G Lee WY Choi WJ Choi WJ Jeung WC Improved developmental competence using Ramac immortalized cells ad handra donor in bovine nuclear S transfer Efficient PRNP deletion in bovine genome using WooJa gene-editing technologies e Choi in immortalized bovine cells Expression of prion-like protein gene (PRND) in PRNP knockout in PRNP Knockout Bovine Fibroblasts Choi WJ Jang G Jang G Jang G Cho JK Cho JK Jang G Jang G Kim SK, Kim SH, Oh SK, Cho SC, Shin ST Lee CI, Park SJ, Kim SJ, Kang JT, Choi JY, Choi WJ, Lee BC Lee SJ, Lee WW, Kim SJ, Saadeldin IM, Cho JK, Lee BC Kwon HS, Kwon DK, Kang KS, Lee BC Moon JH, Kwon HS, Bego, Park SJ, Koo OJ, Kang JT, Choi JY, Lee BC Bae SH, Kim HS, Park JH, Jang GJ Lee CI, Lee JH, Yum SY, Lee BC, Kim JS Park JH, Lee SJ, Kim SJ, Yum SY, Lee JH, Kim HJ, Lee WY, Lee BC Lee JW, Son JM, Lee HC, Lee KC, Choi HJ, Lee YW, Shin ST Malaweera DBO, Wu J, Oh SK, Kim SJ, Cho WJm Jang G Kim EJ, Yum SY, Lee CI, Lee JH, Moon JH, Cho JK, Lee BC, Kim JS, Kim SJ Kim EJ, Yum SY, Lee CI, Lee YH, Moon JH, Cho JK, Lee BC, Kim JS, Kim SJ 한국임상수의학회 제 11 회국제형질전환확회 제 39 회세계수정란이식학회 제 39 회세계수정란이식학회 제 11 회국제줄기세포확회 춘계동물번식학회 춘계수정란이식학회 춘계수정란이식학회 제 28 회세계우병학회 제 28 회세계우병학회 제 12 회형질전환학회 제 14 회발생공학회 P-23- OB 국내 서울 231 국외중국광저우 173 국외독일하노버 289 국외독일하노버 T-218 7(72) 국외 미국보스턴 P082 국내청주 P003 국내청주 P-75 국내청주 P53 국외호주케언즈 P68 국외호주케언즈 872 국외 P-40( 74) 국내 영국에딘버러 서울

54 Recombinase Dependent Target gene expression in 2014 a transgenic attle using piggybac transposon Yum SY Jang G Lee SJ, Kim HJ, Choi WJ, Lee JH, Jang GJ, Lee BC 제 14 회발생공학회 P-78( 139) 국내 서울 제 2 절연구추가연구의필요성 1. 본연구의결과로유전자가위를이용하여특정유전자인프리온단백질발현유전자인 PRNP 유전자가제거된세포주를수립하였고이를공여핵원으로하여체세포핵이식을하여생산된복제배아에서 PRNP 유전자가제거된것을확인되어본연구는목표인 PRNP 유전자제거된복제배아를생산하였음 2. 본연구과제의성공적인수행으로복제배아를생산하였으나복제배아단계에서는그활용가치가높지않으며단지소에서유전자가위효용성검증했다는데의의를둘수가있음가. 유전자가위가소의체세포에서적용되어그효용가능성이입증됨나. 그리고이세포를복제하였을경우복제배아에서도그유전자가제거되었음 3. 대리모에이식하여 PRNP 유전자가제거된복제송아지가태어날경우가. 국민들에게광우병내성소생산가능성에대해홍보가능나. 광우병예방에대한획기적기반을마련가능다. 국내에서최신기법으로광우병의원인이되는 prion knockout소를개발하면, 이에대한안전성연구에과학적인성과를거둘수있음라. 관련기술이아직진입단계이므로다양한대동물을이용한다양한모델동물을생산할수있는기술및특허를취득하여경제산업적으로도움가능함 4. 이에추가적으로본연구로성공적으로생산된복제배아에서연구가멈추는게아니라이를대리모에이식하여광우병내성소생산연구가필수적으로수행되어야함가. 소에서대리모이식은실험실에서하는연구보다그비용이훨씬많이들어가며소의경우현실적으로대리모를구입할수없기때문에학교농장또는일반축산농가에게대리모대여를하여함나. 대리모에대량생산된광우병내성복제배아를이식하였을경우임신기간 277일을거친후광우병내성소생산이가능하게됨 제 3 절. 다른연구에의응용 1. 본연구결과가성공하면, 생산된형질전환소의세포또는개체를이용하여 prion 의안 전성을과학적으로검증할수있으며, 이세포주또는개체가완성되면, prion 의질병의

55 발병및치료에대한기초자료가될수있는샘플을확보하여, 다양한기관들에게샘플을제공하여, 이분야에활발한연구를할수있을것이다. 2. 기대성과가. 기술적측면현재많은부분에서유전자변형, 특히 knockout에대한기술이 HR을이용하여적용되고있지만, 소와같은대형동물에서는그연구의한계로제한적이었다. ZFNs을이용한본연구의성공은대형동물에서목적에맞는유전자변형동물을좀더효과적으로생산할수있다는장점이있다. 나아가다른유전자및동물에도 ZFNs을적용할수있으므로대형동물형질전환동물을통한새로운장을열수있다. 나. 경제-산업적측면본연구의성공은광우병예방에대한획기적기반을마련할수있다. PRNP-KO 세포주및배반포가수립되면이를이용하여핵이식을실시 PRNP-KO 소를생산하고자한다. 일단국내에서최신기법으로광우병의원인이되는 prion knockout소를개발하면, 이에대한안전성연구에과학적인성과를거둘수있다. 나아가관련기술이아직진입단계이므로다양한대동물을이용한다양한모델동물을생산할수있는기술및특허를취득하여경제산업적으로도움이될수있다. 제 4 절. 기업화추진방안 1. 유전자가위를이용한넉아웃동물생산기업수립가. 현재소와돼지에서유전자가위를이용한넉아웃및넉인이된형질전환동물생산보고가미국및일본등생명공학선진국에서많이이루어지고있으며특히그동안이분야후진국으로분류되었던중국에서천문학전인연구비와인적자원투여로그생산보고가우리나라보다훨씬빠르게이루어지고있음나. 본연구가성공적으로이루어져산업동물에서유전자가위의적용가능성을보았으며생산된복제배아를대리모에이식하여광우병내성소가태어났을경우기업화를추진하여소나돼지에서원하는유전자가제거된동물을생산한다. 2. 기술이전가. 기업화가어려울경우본유전자가위기술을유수생명공학회사에전수하여그산업적가치를창출하고자함

56 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 제 1 절. 유전자가위기술 1. 유전자가위구조의개발유전자가위는맞춤형염기결합 protein에 nuclease domain을결합하여만들어지고 ( 그림 x) 한개의유전자가위는최소 20개염기쌍이상의서열을인식하기때문에세포내에서정확히원하는유전체상위치만을인식하여절단할수있다. 2011년유전자가위는 Nature Methods에서올해의기술로선정되었다. 이는유전자가위구조의다양화및유전자가위활용의다양화를통해유전자가위를이용한유전체조작이보편적인실험기법으로발전할수있는배경이마련된것에기인한다. 가. Zinc Finger Nuclease (ZFN) 최초의유전자가위는 3개의염기쌍을인식하는 Zinc finger 기본모듈이여러개연결되어만들어지는맞춤형염기결합단백질과 FokI 염기절단제한효소결합으로제작된 Zinc Finger Nuclease (ZFN) 이다. 지난약 5년간 ZFN은다양한동식물에서사용되어 Genome engineering 분야의초창기좋은연구성과를보여왔으나, 고효율의 ZFN을찾기위해많은노력이필요하고만들수있는위치도제한적인단점이있었다. 나. TAL Effector Nuclease (TALEN) 한편, 식물의 pathogen bacteria에서특별히발견되는 TAL effector의염기결합기능부분이각각하나의염기쌍을인식하는기본모듈십여개이상이연결되어있는구조임이 2009년말밝혀지면서 TAL effector의염기결합기본모듈이유전자가위의구성에새로운재료가되었다. 이러한특징을가진 TAL effector 염기결합모듈은하나의염기를인식하므로세개의염기서열을인식하는 zinc finger에비해더욱다양한염기서열에대한유전자가위가생산될수있는장점을가지고있다. 실제로 TALEN은높은정확도및다양한서열을타겟할수있는장점외에도평균적으로 ZFN에비해세포 toxicity가낮은것으로관찰되고있는큰장점이있다. 다. RNA-Guided ENdonucleases (rgens) CRISPR/CAS system은박테리아의 adaptive immunity 시스템으로서 guide RNA와 Cas nuclease 단백질로구성된다. 이중 TypeII S CRISPR/Cas system는 target-specific crrna 와 constant RNA 요소인 tracrrna로구성되는 guide RNA와 Cas9 단백질로구성된다. crrna의첫 20bp는 target 위치를정하는역할을한다. 이와함께 Cas9 단백질은 di-guanidine (GG) sequence를인식한다. 이중 crrna의목적서열은연구자에의해 reprogram이가능하여 Cas9의인식서열로고정된 GG sequence를제외한나머지 target sequence를자유롭고유연하게조정한새로운유전자가위를만들어내는것이가능하다. rgens의유전자가위가인식하는서열의길이는총 20nt로기존의 ZFN이나 TALEN

57 에비해상대적으로짧은점때문에유전자가위로서세포내사용을위해충분한특이성 을갖는지에대한연구가활발히진행되고있다. 그림 48 대표적인유전자가위구조및기능 표 12. 유전자가위특성비교

58 2. 유전자가위활용법의다양화유전자가위를이용한유전체조작은유전자가위가정확하게유전체상위치를자르는것으로시작한다. 이때유전자가위에의해잘려진유전체상위치는 DNA 양가닥절단의형태를보이기때문에세포는매우효율적인치료과정을통해손상부위를복구하게된다. 유전자가위를이용한유전체조작의형태는세포자체가가지고있는두가지손상치료기작인비상동말단결합 (Non-homologous recombination, NHEJ) 과상동재조합 (Homologous recombination, HR) 에의해결정된다. 그림 50 세포내의대표적인유전자손상수선메커니즘 이때특히 NHEJ에의해목적부위에도입되는 small insertion/deletion 돌연변이는단백질합성과정을방해하는 frameshift 돌연변이로작용하여유전자녹아웃형질을유도하게된다. 이때 NHEJ에의한유전자녹아웃과정은 1~20% 정도의효율로나타난다. 이러한효율은기존의유전체조작기법에비해서는수천 ~ 수만배높은고효율로서관찰되나유전자가위를사용해만든돌연변이세포와정상세포를쉽게구별할수없기때문에폭넓은활용에제약이있어왔다. 이러한점을극복하기위한유전자녹아웃세포농축시스템이개발됨으로써다양한방법을이용한돌연변이세포관찰과농축이가능해졌다. 유전자녹아웃세포농축시스템은유전자가위에의해복구되는리포터시스템의녹색형광단백질시그널을통해세포내정해진유전자에돌연변이가일어난세포들을선별해내는방법이다. 즉돌연변이를도입하여형광단백질이발현하지않도록고안된리포터와유전자가위를동시에세포에도입하면일부세포에서유전자가위의작용으로리포터상의돌연변이가고쳐져서형광단백질이발현되는데이들세포를분리하면세포내유전자에도높은효율로돌연변이가도입되어있음을확인하였다. 특히최근에는유전자가위활성리포터의다양화를통해기존의형광단백질을이용한세

59 포분리를위한 FACS 과정이세포의손상을많이일으켰던것에비해다양한세포분리 과정을위한유전자가위활성리포터개선을통해상대적으로세포에손상이적은 MACS 및 antibiotics-selection 을통한유전자녹아웃세포농축을가능하게하였다. 그림 51 녹아웃세포농축활용을위한유전자가위활성리포터

60 제 7 장연구시설ㆍ장비현황 - 해당사항없으며모두기존장비로연구하였음

61 제 8 장참고문헌 1. Prusiner, S. B. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A 95, (1998). 2. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science 216, (1982). 3. Lledo, P. M., Tremblay, P., DeArmond, S. J., Prusiner, S. B. & Nicoll, R. A. Mice deficient for prion protein exhibit normal neuronal excitability and synaptic transmission in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A 93, (1996). 4. Prusiner, S. B. et al. Ablation of the prion protein (PrP) gene in mice prevents scrapie and facilitates production of anti-prp antibodies. Proc Natl Acad Sci U S A 90, (1993). 5. Bueler, H. et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature 356, , (1992). 6. Manson, J. C. et al. 129/Ola mice carrying a null mutation in PrP that abolishes mrna production are developmentally normal. Mol Neurobiol 8, , (1994). 7. Bueler, H. et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell 73, (1993). 8. Weissmann, C. & Flechsig, E. PrP knock-out and PrP transgenic mice in prion research. Br Med Bull 66, (2003). 9. Nishida, N. et al. A mouse prion protein transgene rescues mice deficient for the prion protein gene from purkinje cell degeneration and demyelination. Lab Invest 79, (1999). 10. Scott, M. R., Kohler, R., Foster, D. & Prusiner, S. B. Chimeric prion protein expression in cultured cells and transgenic mice. Protein Sci 1, , (1992). 11. Scott, M. et al. Propagation of prions with artificial properties in transgenic mice expressing chimeric PrP genes. Cell 73, (1993). 12. Richt, J. A. et al. Production of cattle lacking prion protein. Nat Biotechnol 25, , (2007). 13. Hirata, R. K. et al. Efficient PRNP gene targeting in bovine fibroblasts by adeno-associated virus vectors. Cloning Stem Cells 6, 31-36, (2004). 14. Wang, S. et al. Knockdown of the prion gene expression by RNA interference in bovine fibroblast cells. Mol Biol Rep 37, , (2010). 15. Kim, T. Y. et al. Risk analysis of Bovine Spongiform Encephalopathy in Korea. J Vet Med Sci 67, (2005). 16. Jeong, B. H., Lee, Y. J., Kim, N. H., Carp, R. I. & Kim, Y. S. Genotype distribution of the prion protein gene (PRNP) promoter polymorphisms in Korean cattle. Genome 49,

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64 주 의 이보고서는농림축산식품부에서시행한생명산업기술개발사업의연구보고 서입니다 이보고서내용을발표할때에는반드시농림축산식품부에서시행한생명 산업기술개발사업의연구결과임을밝혀야합니다 국가과학기술기밀유지에필요한내용은대외적으로발표또는공개하여서는 아니됩니다