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정신 진
5 years ago
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1 일반담배 (Cigarette) 와금연보조담배 ( 금연초, 허브담배, 쑥담배 ) 의기관지상피세포에서 IL-6 유리효과비교 서울위생병원내과 1, 원광대학교의과대학내과학교실. 원광대학교의과대학산본병원 2 김명찬 1, 정재일 1, 정종훈, 김학렬, 양세훈, 정은택, 김휘정 2 The Comparison of the Effect of Cigarette and Stop Smoking-aiding Cigarette on Release of IL-6 from Bronchial Epithelial Cell Myoung Chan Kim, M.D. 1, Jeil Jung, M.D. M.D. 1, Jong Hoon Jung, M.D., Hak Ryul Kim, M.D., Sei Hoon Yang, M.D., Eun Taik Jeong, M.D., and Hui Jung Kim, M.D 2. Department of Internal Medicine, Seoul Adventist Hospital 1, and WonKwang University, School of Medicine, Sanbon Medical center, KunPo Korea 2 Background and Aims : Cigarette smoking induces an inflammatory response in the airways, which may play a key role in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Interleukin-6 (IL-6) is one of the cytokines that plays an important role in inducing bronchial inflammation. The aim of this study was to determine if the level of the pro-inflammatory cytokine, Interleukin-6, is increased when the bronchial epithelial cells are exposed to a cigarette smoke extract (CSE) and an extract from stop smoking-aiding cigarettes, and examined the safety of these commercially available stop smoking-aiding cigarettes. Method : Bronchial epithelial cells were exposed to CSE from cigarette and stop smoking-aiding cigarettes for 24 hours. ELISA was used to measure the IL-6 levels in the supernatant from each condition. The IL-6 mrna levels were measured by Taqman Real time RT-PCR. N acetyl L-cysteine(NAC) was added to each condition to determine if NAC can inhibit the release of IL-6 from the bronchial epithelial cells when they are exposed to CSE from cigarette and stop smoking-aiding cigarettes. Result : When bronchial epithelial cells were exposed to a CSE from cigarettes and stop smoking- aiding cigarettes, each type of CSE stimulated IL-6 production from the bronchial epithelial cells. The IL-6 mrna level in the Bronchial epithelial cells was also elevated and NAC was found to inhibit the release of IL-6 from bronchial epithelial cells when they were exposed to the CSE from cigarettes and stop smoking-aiding cigarettes. Conclusion : Commercially available stop smoking-aiding cigarette can induce bronchial inflammation and can be harmful to smokers. Therefore, the safety of these cigarettes for smoking cessation should be evaluated. (Tuberc Respir Dis 2005; 59: ) Key words : Cigarette, stop smoking-aiding cigarette, IL-6 서 담배연기에는 6000종이상의다양한화학물질이있고흡연하는경우이런다양한화학물의영향으로여러종류의폐질환을유발한다. 본연구는 2005년도원광대학교연구비지원에의하여시행되었습니다. Address for correspondence : Hui Jung Kim, M.D. Division of Pulmonary Medicine, Department of internal medicine, Wonkwang University Sanbon Medical Center, Sanbon-dong,Gunpo-city, Kyunggi-do Phone : Fax : hikim61@hotmail.com Received : Oct Accepted : Oct 론 흡연은기도에서염증반응을유발하여만성폐쇄성폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease) 의병태생리에중요한역할을한다고알려져있다. 현재까지여러보고에서흡연이기관지상피세포의염증과연관된싸이토카인인 IL-6를유리하게한다고알려져있고, 정상흡연자에서기관지폐포세척액 (bron choalveolar lavage fluid) 에서 IL-6가증가되어있다고알려져있다 1-3. 또한만성폐쇄성폐질환환자의기관지폐포세척액검사상 IL-8, TNF-α와더불어 IL-6도증가되어있고이를환자의폐활량값과비교시 FEV 1 값과반비례한다고알려져있어흡연자에서 IL-6가증가되어있는것이만성폐쇄성폐질환의병태생리에중요 530

2 Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 59. No. 5, Nov 한역할을한다고알려져있다 4. 우리나라는과거보다는흡연율이감소되고있는추세지만, 다른나라에비해서여전히높은흡연율을보이고있으며이런지속적인높은흡연율로인해향후흡연관련질환이지속적으로증가하리라예상되어진다. 흡연으로인한폐질환및기타여러질병을예방하기위해서는무엇보다도금연이가장중요한데금연하기위한방법은스스로본인의의지로금연하는방법, 금연교육에참여하여금연하는방법, 흡연대용품을이용해서흡연의오랜습관을점점줄여끊는방법, 니코틴대체요법으로니코틴중독으로인한금단증상을이겨내금연에성공하는방법등이있다. 우리나라에서는다른나라에비해한약제등을이용해만든흡연대용품으로금연을시도하려는흡연자들도많아여러다양한제품들이시중에판매되고있지만, 이들의기관지, 폐에대한안정성에관한연구는아직부족한실정이다. 특히흡연자중일부는금연보조담배를사용하는과정에서이들을상용하게되어금연보조담배의장기적사용시인체의안정성여부에대한연구는중요하리라사료된다. 이에저자등은국내에서시판되는 3가지종류의금연보조담배 ( 금연초, 허브담배, 쑥담배 ) 의기관지염증에관한효과를알아보기위해이들금연보조담배와일반담배의추출물을기관지상피세포에노출시킨후이들세포에서 IL-6의유리정도를비교하여연구하였다. 2. 담배연기추출물 (Cigarette smoke extract, CSE) 담배연기추출물 (Cigarette smoke extract, 이하 CSE) 은 Carp와Janoff 6 의방법으로만들었다. 100 mm길이의 filter가없는연구용담배를 (Research Grade Ciga rette, University of Kentucky) Speed Pump (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) 를통해연소시키면서담배연기를분당 50cc의속도로 25 ml의두번증류한증류수 (ddh 2 O) 에통과시킨뒤 0.22 μm pore filter (Lida Manufacturing Corp., Kenosha, WI) 에통과시켜세균과큰입자를제거하였다. 본실험에서는이용액을 100% CSE 로간주하여 LHC-D/RPMI 1640 medium 과혼합하여원하는농도를만들어사용하였다. CSE는매번실험마다새로만들어사용하였고만든후 30 분이내에사용하였다. 3. Material 본연구에사용된금연보조담배는금연초, 쑥담배, 허브담배 3종을선택해비교하였다. 금연초는두충잎을원료로하였고, 쑥담배는쑥을원료로, 허브담배는말린인동초꽃잎을사용하였고필터부위는허브를추가하여만들었다. 항산화제로사용된 NAC(N-Acetyl-L-Cysteine) 는 Sigma에서구입하였다. 4. ELISA 방법 1. 세포배양기관지상피세포 (human bronchial epithelial cell, HBEC) 는건강한공여자에의해제공된세포를 Kelsen 등의방법으로 5 LHC-9 과 RPMI 1640 을혼합한배양액에서배양하여사용하였고, 또기관지상피세포세포주인 BEAS-2B(American Type Culture Collec tion,crl-9609; Rockville, MD). 세포를함께사용하였다. 세포배양액의 IL-6 농도는 sandwich ELISA를통해서정량화하였다. 200 ml well microtiter plate를 purified goat antihil-6 antibody (R&D, Minneapolis, MN)) 로 coat한뒤 4 C에서 24 시간동안배양후 3 번 PBS 0.25% Tween-20 (washing solution) 으로세척후 ril-6 (Sigma, St. Louis) 를이용해상온에서 90분처리후다시세척하고,rabbit anti-hil-6 antibody (Calbiochem, La Jolla, CA) 를처리한다. 한시간후에 human serum absorbed peroxidase conjugated goat anti-rabbit antibody (ICN Biomedical, Costa Mesa, CA) 를첨가 531

3 MC Kim et al. : The Comparison of the Effect of Cigarette and Stop Smoking-aiding Cigarette and Stop Smoking-aiding Cigarette on Release of IL-6 from Bronchial Epithelial Cell 하고, 한시간후에세척한뒤 orthophenyldiamine (Sigma, St. Louis) 을이용해 490 nm ELISA reader 로정량화하였다. 5. Qantititive real-time PCR 기관지상피세포에서일반담배및금연보조담배의추출물에의한 IL-6 mrna 의증가여부를관찰하기위해 24시간동안각각의담배추출물에노출후기관지상피세포에서 Taq real time PCR로 IL-6 mrna 를정량화하였다. 사용한 IL-6 primer 와 probe의염기서열은다음과같다. Human IL-6 primers Name : IL F Sequence : CTCCAGGAGCCCAGCTATGA Name : IL R Sequence : CCCAGGGAGAAGGCAACTG TaqMan probe : Name : IL-6--68T Sequence : CTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGGT 6. 실험방법 담배와금연보조담배의추출물 (CSE) 을배양액에추가하여 24시간배양후상층액을모아각각의조건에서 IL-6의농도를 ELISA를이용하여정량화하고, 처리된세포를이용해 qantititive real time PCR을시행해 IL-6 m RNA를정량화하였다. 한편 NAC(N- Acetyl-L-Cysteine) 의항산화효과에의한 IL-6의억제효과를보기위해 10mM의 NAC를함께처리후 IL-6의농도를보았다. Acrolein 과 Acetaldehyde는알려진담배의주요한유해성분으로함께처리하여비교해보았다. 7. 통계처리모든값은 3번이상의실험결과로평균 ±SEM 으로구했고, 양군간의차이는 Student s t test를이용했다. P < 0.05를통계적으로의미있는차이로보았다. 결과 1. HBEC 에관한일반담배, 허브담배및쑥담배의 IL-6 유리효과비교 24 well plate에기관지상피세포를 1X 10 5 /ml 의농도로 LHC-D/RPMI로배양후정해진농도의일반 기관지상피세포 (Human bronchial epithelial cell, HBEC) 에연구용일반담배및허브담배, 쑥담배의 Figure 1. IL-6(pg/ml) Production by HBEC with varying concentrations of CSE and component of CSE. CSE 5% : 일반담배 5%, Herb : 허브담배, AA-acrolein, ACR-acetaldehyde. *p<0.05 compared with control 532

Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 59. No. 5, Nov. 2005 추출물을배양액에혼합하여농도별로 24 시간동안노출후배양액을이용해 ELISA 방법으로 IL-6농도를구했다.

4 Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 59. No. 5, Nov 추출물을배양액에혼합하여농도별로 24 시간동안노출후배양액을이용해 ELISA 방법으로 IL-6농도를구했다. 본연구에서사용한일반담배, 허브담배 (Herb) 및쑥담배모두대조군에비해의미있는 IL-6의증가를보였고, 두종류의금연보조담배에서도농도에따라의미있는 IL-6값의차이를보였다. 일반담배, 허브담배및쑥담배에서각기 5% 농도의담배추출물로 IL-6 유리정도를비교시쑥담배에서의미있게가장높았고허브담배는일반담배보다의미있게적은정도의 IL-6 유리를보였다 (Fig. 1.). 담배의알려진유해물질인 Acroleine 과 Acetaldehyde 를배양액에함께넣어배양시 acroleine 5mM은대조군에비해의미있는 IL-6의증가를보였으나 acet aldehyde 5uM은차이가없었다. 2. HBEC 에대한일반담배및금연보조담배의 IL-6 m RNA 발현담배및금연보조담배의기관지상피세포에서 IL- 6 mrna를비교해보았다. 대조군에비해서담배및금연보조담배에서모두의미있는 IL-6 m RNA유리를보였고특히쑥담배의경우많은증가를보여다른종류의담배보다 IL-6 값의의미있는증가를보였던 ELISA결과와부합되었다 (Fig. 2.). 3. 담배및금연보조담배의기관지상피세포 (BEAS- 2B) 에서 IL-6 유리에대한 NAC (N-Acetyl-L- Cysteine) 의효과기관지상피세포종인 BEAS-2B 세포에서담배및금연보조담배추출물노출에의한 IL-6 유리효과를다시측정했고, NAC의항산화효과가이들의 IL-6 유리효과에미치는영향을보기위해담배추출물노출시에함께배양액넣어효과를비교해보았다. 이들담배들은 BEAS-2B 세포에서도의미있게 IL-6를증가시켰고항산화효과를가진 NAC는일반담배및허브담배에서는이들의증가를의미있게억제하였지만쑥담배에서는이를억제하지못했다 (*p>0.05) (Fig. 3.). 4. 금연초의 BEAS-2B 세포에대한 IL-6 유리효과및 NAC의 IL-6 유리에대한효과우리나라에서금연보조담배로비교적잘알려진금연초를대조군및일반담배와 IL-6 유리효과및 NAC의 IL-6유리에대한억제효과를비교하였다. 금연초에서도의미있는 IL-6증가를보였고항산화효과를가진 NAC는 5% 일반담배및 5% 금연초 Figure 2. IL-6mRNA expression of HBEC with varying component of 5%CSE. Herb : 허브담배, Non-Herb : 쑥담배. *p<0.05 compared with control. #p<0.01 compared with control and other component of 5% CSE. Figure 3. IL-6 release of BEAS-2B cells by expose of CSE and inhibitory effect of NAC on IL-6 release by CSE. Control : each condition without adding NAC, NAC : each condition with NAC: the release of IL-6 was significantly inhibited with NAC except 5% nonherb CSE. (* p<0.05). non-herb CSE : 쑥담배. 533

MC Kim et al. : The Comparison of the Effect of Cigarette and Stop Smoking-aiding Cigarette and Stop Smoking-aiding Cigarette on Release of IL-6 from Bronchial Epithelial Cell Figure 4.

5 MC Kim et al. : The Comparison of the Effect of Cigarette and Stop Smoking-aiding Cigarette and Stop Smoking-aiding Cigarette on Release of IL-6 from Bronchial Epithelial Cell Figure 4. IL-6 release of BEAS-2B cells by expose of CSE and 5%/10% 금연초 and inhibitory effect of NAC on IL-6 release by CSE and 5%/10% 금연초. Control : each condition without adding NAC, NAC : each condition with NAC. The release of IL-6 on each condition was significantly inhibited with NAC except 10% 금연초 (* p<0.05) 에서는이들의증가를의미있게억제하였으나 10% 금연초에서는억제하지못했다 (Fig. 4.). 고 본연구는시중에판매되고있는금연보조담배 3 종 ( 금연초, 허브담배, 쑥담배 ) 의기관지상피세포에염증에대한효과를알아보기위해일반담배와이들담배의 IL-6의유리효과를비교하였다. 일반담배및금연보조담배 3종은대조군에비해의미있게기관지상피세포에서 IL-6를증가시켰고특히쑥담배에서가장많은증가를보였고이는 m RNA 검사에서도같은경향을보였다. 항산화효과를가진 NAC는일반담배, 허브담배, 금연초추출물에함께 NAC 를함께투여한경우 IL-6 의증가를억제할수있었지만, 쑥담배에서는의미있는억제효과를관찰할수없었다. IL-6는기도의기관지상피세포및대식세포등에서생산되는싸이토카인으로흡연자에서기관지폐포세척액및유도객담에서 IL-6가증가되어있음이보고되어져있다. 흡연자의기관지폐포세척액검사상 IL-8, TNF-α와더불어 IL-6도증가되어있고, 이를환자의 FEV 1 예측치와비교시 IL-8 및 IL-6값은 FEV 1 예측치값과 찰 역비례해 IL-6값이높을수록 FEV 1 예측치값은낮은것으로알려져있다 1-3. 만성폐쇄성폐질환환자의급성악화빈도는평상시객담내 IL-6 및 IL-8값이높을수록증가된다고알려져있어이들싸이토카인이급성악화의빈도를예측할수있는지표로이용될수있음을보고하였고, 이때 IL-8과는달리 IL-6는급성악화후에도지속적으로상승되는것으로알려져있다 7,8. 본연구에서는흡연에의해기관지상피세포에서증가되는여러염증지표중에서 IL-6 유리정도를일반담배와금연보조담배를이용해비교하였다. 기관지상피세포에서일반담배 5% 에서의미있는 IL-6증가를보였고허브담배, 쑥담배, 금연초등도의미있는증가를보였고 5%, 2.5%, 1.25% 등각각의농도에따른차이를보였다. 본연구에서는일반담배와각기다른성분으로제조된금연보조담배의기관지상피세포에서 IL-6유리정도를비교함에있어, 시간대별유리정도를비교하여이들의특성을비교하기보다는, 24시간동안담배연기추출물에의해기관지상피세포에서유리된 IL-6의총량을 ELISA 방법으로정량화하여비교하였다. IL-6 mrna를측정한경우에도같은경향을보여일반담배및허브담배, 쑥담배에서의미있는증가를보였고특히쑥담배에서증가되었다. 기관지상피세포에관한이들담배들의 IL-6유리효과가산화제와연관되어있는지여부를관찰하기위해, 이전의보고등에서 9-11 담배추출물에의한세포의 DNA 손상을억제해흡연으로인한폐손상으로부터세포를보호하는것으로알려져있는 NAC를항산화제로사용하여함께처리하였을때, 쑥담배에서는의미있는억제를보이지않았지만일반담배및허브담배, 5% 금연초 CSE 에서는의미있게억제되었다. 이들 3 종류의금연보조담배중에서쑥담배가 IL-6에대해단백질및 m RNA 검사에서비교적높은증가를보이고상대적으로 NAC의항산화효과에억제되지않았는데, 이런차이를보이는이유로는금연보조담배가각각원료가다르고이에따라연소시발생되는화학물질및산화제등의농도의차이를보이기때문인것으로사료되며, 기관지염증의측면 534

6 Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 59. No. 5, Nov 에서본다면다른금연보조제보다많은 IL-6유리를보이고, 반대로항산화물질에대해억제가적은쑥담배가인체에더유해하리라사료된다. 요약연구배경 : 우리나라에서는다른나라에비해약초등을이용해만든흡연대용품으로금연을시도하려는흡연자들도많고이에따라여러가지다양한제품등이판매되고있는데이들의기관지, 폐에대한안정성에관한연구는아직부족한상황이다. 특히흡연자중일부는이런금연보조제를사용하는과정에서이들을상용하게되어시판되는금연보조담배의장기적사용시인체의안정성여부에대한연구는중요하리라사료된다. 방법 : 일반담배및금연보조담배 3종의담배연기추출물 (cigarette smoke extract, CSE) 을기관지상피세포에 24시간노출후배양액에서 IL-6를측정하였고일반담배및허브담배, 쑥담배노출후세포에서 IL-6 m RNA를측정하여비교하였다. 항산화효과를가진 N acetyl L-cysteine(NAC) 를일반담배및금연보조담배추출물에함께투여해 IL-6의증가억제여부를보았다. 결과 : 대조군에비해일반담배및금연보조담배3종에서기관지상피세포에노출시에모두의미있는 IL-6증가를관찰할수있었고, IL-6 m RNA도같은경향으로증가하였다. NAC를함께투여시일반담배및허브담배금연초에서는 IL-6의증가를의미있게억제하였지만쑥담배에서는억제하지못하였다. 결론 : 현재우리나라에서시판되고있는금연보조담배 3 종 ( 허브담배, 쑥담배, 금연초 ) 은일반담배처럼기관지상피세포에염증을유발할수있어장기적사용시인체의안정성여부에대한연구는중요하리라사료된다. 참고문헌 1. Carpagnano GE, Kharitonov SA, Foschino-Barbaro MP, Resta O, Gramiccioni E, Barnes PJ. Increased inflammatory markers in the exhaled breath conden sate ofcigarette smokers. Eur Respir J 2003;21: Patel IS, Roberts NJ, Lloyd-Owen SJ, Sapsford RJ, Wedzicha JA. Airway epithelial inflammatory responses and clinical parameters in COPD. Eur Respir J 2003; 22: Kuschner WG, D Alessandro A, Wong H, Blanc PD. Dose-dependent cigarette smoking-related inflammatory responses in healthy adults. Eur Respir J 1996;9: Barnes PJ, Stockley RA. COPD: current therapeutic interventions and future approaches. Eur Respir J 2005;25: Kelsen SG, Mardini IA, Zhou S, Benovic JL, Higgins NC. A technique to harvest viable tracheobronchial epithelial cells from living human donors. Am J Res pir Cell Mol Biol 1992;7: Carp H, Janoff A. Possible mechanisms of emphysema in smokers: in vitro suppression of serum elastaseinhibitory capacity by fresh cigarette smoke and its prevention by antioxidants. Am Rev Respir Dis 1978; 118: Sauty A, Manuel J, Philippeaux M, Leuenberg P. Cy tostatic activity of alveolar macrophages from smokers and non-smokers: role of interleukin-1ß, interleukin-6 and tumor necrosis factor-α. Am J Respir Cell Mol Biol 1994;11: McCrea KA, Ensor JE, Nall K, Bleecker ER, Hasday JD. Altered cytokine regulation in the lungs of cigarette smokers. Am J Respir Crit Care Med 1994;150: Kim HJ, Liu XI, Wang H, Kohyama T, Kobayashi T, Rennard SI, et al. Glutathione prevents inhibition of fibroblast-mediated collagen gel contraction by cigarette smoke. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2002;283: L Kim HJ, Liu XI, Kohyama T, Conner H, Kohyama T, Rennard SI, et al. Reversible cigarette smoke extractinduced DNA damage in human lung fibroblasts. Am J Respir Cell Mol Biol 2004;31: Carnevali S, Nakamura Y, Mio T, Liu XI, Takigawa K, Rennard SI, et al. Cigarette smoke extract inhibits fibroblast-mediated collagen gel contraction. Am J Physiol 1998;274:L

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경락경혈학회지 Vol.27, No.1, pp.87 106, 2010 Journal of Meridian & Acupoint Dept. of 1 Meridian & Acupoint, 3 Acupuncture & Moxibustion, College of Oriental Medicine, Daejeon University 2 Division of Clinical