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1 REVIEW ARTICLE Korean J Clin Lab Sci. 2015, 47(4): pissn eissn Korean J Clin Lab Sci. Vol. 47, No. 4, Dec Enterotoxigenic Bacteroides fragilis-associated Diseases and Detection Sun-Yeong Gwon 1, In-Ho Jang 2, and Ki-Jong Rhee 1 1 Department of Biomedical Laboratory Science, College of Health Sciences, Yonsei University at Wonju, Wonju 26493, Korea 2 Department of Biomedical Laboratory Science, College of Health Sciences, Sangji University, Wonju 18950, Korea Enterotoxigenic Bacteroides fragilis 에의한질환과검출 권선영 1, 장인호 2, 이기종 1 1 연세대학교보건과학대학임상병리학과, 2 상지대학교보건과학대학임상병리학과 These commensal intestinal bacteria can enhance the immune system and aid in nutrient absorption but can also act as opportunistic pathogens. Among these intestinal bacteria, the anaerobic Bacteroides fragilis are divided into enterotoxigenic B. fragilis (ETBF) which secrete the B. fragilis toxin (BFT) and non-enterotoxigenic B. fragilis (NTBF) which do not secrete BFT. ETBF can cause diarrhea and colitis in both humans and livestock but can also be found in asymptomatic individuals. ETBF is predominantly found in patients with inflammatory diarrheal diseases and traveller s diarrhea. Several clinical studies have also reported an increased prevalence of ETBF in human patients with inflammatory bowel disease (IBD), colitis and colorectal cancer. In small animal models (C57BL/6 wild-type mice, germ-free mice, multiple intestinal neoplasia (Min) mice, rabbits and Mongolian gerbils), ETBF have been found to initiate and/or aggravate IBD, colitis and colorectal cancer. BFT induces E-cadherin cleavage in intestinal epithelial cells resulting in loss of epithelial cell integrity. Subsequent activation of the -catenin pathway leads to increased cellular proliferation. In addition, ETBF causes acute and chronic colitis in wild-type mice as well as enhances tumorigenesis in Min mice via activation of the Stat3/Th17 pathway. Currently, ETBF can be detected using a BFT toxin bioassay and by PCR. Advances in molecular biological techniques such as real-time PCR have allowed both researchers as well as clinicians to rapidly detect ETBF in clinical samples. The emergence of more sensitive techniques will likely advance molecular insight into the role of ETBF in colitis and cancer. Keywords: Bacteroides fragilis toxin, Colorectal cancer, Enterotoxigenic Bacteroides fragilis, Inflammatory diarrhea, T helper 17 Corresponding author: Ki-Jong Rhee Department of Biomedical Laboratory Science, College of Health Sciences, Yonsei University at Wonju, Wonju 26493, Korea Tel: kjrhee@yonsei.ac.kr This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Copyright 2015 The Korean Society for Clinical Laboratory Science. All rights reserved. Received: November 12, 2015 Revised: November 21, 2015 Accepted: November 21, 2015 서론사람의장내에는 1조개의미생물이서식한다 (Turnbaugh 등, 2007). 이런미생물군은사람의생활과긴밀한상호작용을이룬다. 장내세균이면역이나영양흡수등에긍정적인도움을준다는사실이현재많은연구자들에의해밝혀지고있다. 하지만, 이런미 생물군이사람의질병을유발한다는연구도활발히진행되고있다. 예를들어, 위장관의 Helicobacter pylori가전위암병변을일으킬수있다는사실은이제대다수의대중들에게알려졌다. 사람의장내세균중가장많이존재하는절대혐기성세균총의하나로 Bacteroidetes 가있다. 여기에속하는 Bacteroides spp. 는사람의장내에 20가지종이서식한다 (Wexler, 2007). Bacteroides spp.

2 162 Sun-Yeong Gwon, et al. ETBF-Associated Diseases and Detection 또한양면성을가진세균이다. Bacteroides spp. 는사람의면역이나영양상태에긍정적인도움을제공하지만때로는기회감염균으로작용하기도한다 (Neish, 2009). 특히 Bacteroides fragilis는복부의농양이나균혈증등을유발할수있는세균이다 (Polk와 Kasper, 1977; Redondo 등, 1995; Lassmann 등, 2007). B. fragilis는장독소 (enterotoxin) 을분비하는 strain과그렇지않은 strain으로나눌수있는데, 전자는 enterotoxigenic B. fragilis (ETBF), 후자는 non-enterotoxigenic B. fragilis (NTBF) 로구분한다. NTBF는기회감염균으로 polysaccharide 대사와사람을보호하기위한면역반응을활성화시키는데관여한다 (Troy와 Kasper, 2010). ETBF는병원성인자인 Bacteroides fragilis toxin (BFT 또는 fragilysin) 을분비하는균이지만, ETBF를보유한사람이라도염증등의증상을나타내지않을수도있다 (Basset 등, 2004). BFT는현재까지 B. fragilis의유일한병원성인자로알려진, 20 kda 크기의 zinc-dependent metalloprotease 이다 (Moncrief 등, 1995; Franco 등, 1999; Vines 등, 2000). 3개의 isotype 이밝혀져있으며 (BFT-1, BFT-2, BFT-3) 각각의생물학적활성도는유사하다 (Franco 등, 1997; Kling 등, 1997; Chung 등, 1999). ETBF는동물이나사람에게설사질환을일으킨다. 특히활동성 inflammatory bowel diseases (IBD) 나대장염, 대장암을유발하는데기여한다는보고가있다 (Prindiville 등, 2000; Basset 등, 2004). 본론 1. ETBF와질환 ETBF는 1984년에처음설사질환을앓는면양에서분리및동정했다 (Myers 등, 1984). 그이후 1987, 1992년에설사질환을가진사람에서검출했다 (Myers 등, 1987; Sack 등, 1992). ETBF는 5 세미만의어린이에게설사질환을일으킨다. 1세미만의어린이는아무증상없이 ETBF를가지고있다가, 1세이후에 ETBF에의한설사질환이발병한다 (Sack 등, 1994). 성인에서도 ETBF가유발하는설사질환은중요하다. 스웨덴의한연구에서, 급성설사질환으로입원한성인환자와건강한성인의 ETBF 분리율을조사했다. 782 명의환자중 27%, 194명의건강한성인중 12% (p<0.01) 에서 ETBF를검출했다. 이들중일부는 ETBF를가지고있지만다른증상은보이지않았다. 특히 30세미만인사람에서증상없이세균을보유하는경향이두드러졌다. 나이가적은사람은설사의유무와관계없이 ETBF의검출비율이유사했던반면에, 나이가많은사람은설사질환이있으면 ETBF를가질확률이높았다 (Zhang 등, 1999). ETBF 감염에의한설사는어린이나성인에서장염과전신 또는장내항체반응을유도한다. 그리고복통이나비열성염증성설사를동반한다. 대변내백혈구, 락토페린 (lactoferrin), 전염증성사이토카인 (proinflammatory cytokine; interleukin-8, tumor necrosis factor- ) 와 anti-bft 반응 (IgA, IgG) 도증가했다 (Sears 등, 2008). 또한 ETBF는여행자설사를일으킬수있는가능성을가진것으로알려졌다. 미국과유럽을여행하는사람중장내세균에의한급성설사질환이발병한사람에게서 ETBF를단독또는다른균과함께분리했다 (Jiang 등, 2010). 임상검체를이용한연구에서 ETBF의감염은건강한정상인에비해활동성 inflammatory bowel diseases (IBD) 와대장염및대장암을가진환자에서더많다는사실이보고되었다 (Prindiville 등, 2000; Basset 등, 2004; Toprak 등, 2006). Toprak 등 (2006) 이대장암환자 73명과정상인 59명의대변검체에서 ETBF의유병률을검사했다. Bacteroides bile esculin agar를이용하여 Bacteroides spp. 를선별한뒤 DNA를추출하였다. 그후 PCR을통해 BFT 유전자를가지고있는지조사했을때, Bacteroides spp. 의보균율은대장암환자에서 77%, 정상인에서 68% 로두집단간의유의성은없었다. 그러나대장암환자의 38% 가 ETBF를보유한반면, 정상인중 12% 만이 ETBF를보유했다 (p=0.009). 이는 ETBF가대장암환자에서증가한다는것을증명한첫실험이되었다. ETBF가 IBD 나대장암을유발한다는것을실험적으로증명하기위해여러동물모델이고안되었다. 실험실에서흔히사용하는마우스모델인 C57BL/6에 ETBF를구강접종하면급성대장염뿐만아니라지속적인만성대장염과장상피세포의 hyperplasia 가일어났다 (Rhee 등, 2009). ETBF를접종한마우스의장점막은두꺼워졌고염증세포들의침윤이증가했다. 또한 crypt의농양과상피세포의탈락과미란, 궤양이관찰되었다. 특히 NTBF에 BFT 유전자를삽입한 recombinant ETBF (retbf) 를마우스에접종했을때도유사한증상을보였다. 이러한증상들은 NTBF를접종하거나, NTBF에생물학적활성을제거한 BFT (H352Y) 유전자를삽입한 recombinant NTBF (rntbf) 를접종했을때는나타나지않았다. 한편, germ-free 마우스에 B. fragilis를접종하면, NTBF를접종했을때와는달리, ETBF를접종한경우에만치명적인대장염이일어났다. 이는일반마우스의장내세균이 ETBF의작용을약화시킬수있으며, ETBF가단독으로도대장염을일으킬수있다는것을제시한다. Multiple intestinal neoplasia (Min) 마우스란이형의 adenomatous polyposis coli (APC) 유전자를가진마우스를말한다. 한쌍의 APC 유전자중한쪽의돌연변이를가진이마우스에서는장암이발생한다. 이는대장암으로발전하게되는가족성용종증과유사한형태를보인다. 3개월된 Min 마우스에는자연적으로작은용종이생긴다. 그리고 3개월뒤에는 5개이상의대장암을관찰할

3 Korean J Clin Lab Sci. Vol. 47, No. 4, Dec 수있다. 이런 Min 마우스에 ETBF를접종했을때만성적인무증상의대장염에서부터상피내대장종양까지, 접종후 1주일만에관찰했다 (Wu 등, 2009). Rabizadeh 등 (2007) 은 IBD와유사한증상을일으키는마우스의 dextran sodium sulfate (DSS) 모델에서 ETBF 가대장염을심화시키는지연구하였다. NTBF나 ETBF 모두마우스의대장에 colonization 하는정도는유사했다. 그리고 DSS 제공여부와관계없이 ETBF를접종한마우스에서대장염이일어났다. 그러나 ETBF만접종한마우스보다, DSS를제공한마우스에 ETBF 를접종하면마우스체중의감소가더오래지속되고, 대장의염증이더증가했다. 이는 DSS를제공한마우스에 ETBF를접종하면 ETBF 접종만시행한마우스보다심한대장염이일어남을보여준다. 마우스모델외에도, 토끼에서 ETBF의감염이일어날경우, 혈액을동반한설사나사망을일으킴이알려졌다 (Myers 등, 1987; Myers 등, 1989; Sears 등, 1995). Mongolian gerbil 동물모델에 NTBF와 ETBF를접종했을때대변에서각각 CFU/gram의세균이검출되었다 (Yim 등, 2013). Gerbil에서도 NTBF를접종하면아무증상이없었으나, ETBF를접종했을경우체중이급격히감소하며, 대장에서심한상피세포탈락을보였다. ETBF는 gerbil에서치명적인대장염을일으켜세균접종후 3일만에집단내모든개체가사망했다. 여러연구의결과를토대로 ETBF 가대장염을일으키는것은이견이없어보인다. 또한 ETBF에의한 IBD, 대장염및대장암의심화가일어나는것은사실이나그정확한기전은아직밝혀지지않았다. 2. ETBF와기전앞서언급했듯이 BFT는 ETBF의유일한병원성인자이다. BFT 유전자는 B. fragilis pathogenicity island (BfPAI) 라고부르는 6 kb 크기의 deoxyribonucleic acid (DNA) 에 MPII 유전자와같이 encoding 되어있다. BFT 유전자와달리 MPII 유전자의역할은아직밝혀지지않았다. 이 6 kb의 DNA는오직 ETBF에만존재한다 (Moncrief 등, 1998; Franco 등, 1999; Sears, 2001). BFT 유전자는약 397개의아미노산으로구성되어있고, 각부분은 proprotein 부분과 mature protein 으로크게나눌수있다. BFT가생물학적활성을가지기위해서는 proprotein 과 mature protein 사이의 arginine (Arg) 과 alanine (Ala) 사이가분절되어야한다. 이후 mature protein 부분이효소로작용한다. Mature protein에는 HEXXH motif가포함되어있다. 이는 BFT에 zinc가결합하는부위로, BFT가 zinc에의한단백질분해활성이있는것을여러연구자들이확인하였다 (Moncrief 등, 1995; Obiso 등, 1995; Koshy 등, 1996). BFT가장상피세포의어떤단백질과결합하여독성을유도한다는것은알고있지만, 그것이어떤단백질인지는아직밝혀지지않았다 (Wu 등, 2006). 지금제시되는가설은직접적인분절과간접적인분절 2가지이다 (Fig. 1). 전자는 BFT가직접 E-cadherin 이라는장상피결합단백질과다른단백질의분절을유도한다는가정이다. 후자는 BFT가세포내다른 protease를활성화하여 E-cadherin 및다른단백질의분절을유도한다는가정이다. 하지만아직 BFT와직접결합하는 ligand 가무엇인지는발표된바없다. 지금까 Fig. 1. Two hypotheses of BFT mediated E-cadherin cleavage. (A) BFT directly binds and cleaves E-cadherin. (B) BFT induces E-cadherin cleavage by binding to a cellular receptor present on epithelial cells and activating a host proteinase which in turn cleaves E-cadherin.

4 164 Sun-Yeong Gwon, et al. ETBF-Associated Diseases and Detection 지보고된바에의하면사람의장암세포인 HT29/C1 cell line이나마우스의장조직에 BFT를처리하였을때, 120 kda의 E-cadherin 이분절된다. E-cadherin 은 80 kda의 extracellular domain과 33 kda의 cytoplasmic domain으로나뉘고, 잘려진 cytoplasmic domain은 -secretase 등에의해서분해된다 (Wu 등, 1998; Wu 등, 2007; Rhee 등, 2009). BFT가 E-cadherin의분절을유도함으로써장상피세포가가진막기능을저하시키고투과성을높이게된다. 이로인해 -catenin 신호전달계가활성화되어 c-myc의전사와발현이증가하고, 이로써장상피세포의증식이증가한다. 그리고 BFT는 NF- B 신호전달계도활성화한다 (Wu 등, 1998; Wu 등, 2003; Wu 등, 2004; Sears, 2009). 이밖에도마우스를이용한동물모델에서 ETBF가어떤신호전달작용을일으키는지에대한연구가이루어졌다 (Wu 등, 2009). 마우스에 NTBF와 ETBF를접종하여만성적으로 colonization 하도록만들고그들의상태를관찰했다. NTBF를접종한마우스와달리, ETBF를접종한마우스에서는 IL-17을생산하는 CD3 + CD4 + -T-세포와 CD3 + CD4 - -T-세포의대장고유판침투 (infiltration) 가발생했다. 즉, ETBF의감염이 T helper 17 (T H17) 의반응을촉진하였다. ETBF는 Min 마우스에서도대장의종양형성을빠르게촉진시켰다. 이러한질환의심화는 ETBF의감염이대장의 signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) 를활성화함으로써유도되었다. T H17 반응을증폭하는데중요한, IL-17 에대한항체로 IL-17을 blocking 하였을때, ETBF로인한대장염과대장의 hyperplasia, 종양형성또한억제되었다. 이는 ETBF로인한대장염및종양의형성이 Stat3와 T H17에의존적인전달체계에의해발생함을암시한다. 따라서사람의장내세균이염증과염증에의한암을일으킬수있다는새로운시각을제시할수있다. Rhee 등 (2009) 은 BFT가또다른면역기전을활성화하는지알기위한연구를진행하였다. Germ-free 마우스에 ETBF를감염시켰을때, germ-free 마우스가매우빠르게사망하였으므로그들은 BFT가혹시초항원으로써작용한것은아닌지의심했다. 그러나마우스에서얻은비장세포에정제한 BFT (5 nm) 를처리한결과, 비장세포의증식은발생하지않았다. 한편, Toll-like receptor (TLR)-2, TLR-3, TLR-4, TLR-7, TLR-9를과다발현시킨 HEK 293 세포에정제한 BFT를처리한경우에도, TLR 각각에대한양성대조군을처리한집단에비해 interleukin-8 (IL-8) 의분비가증가하지않았다. 이를통해 BFT가직접적으로 TLR을활성화하지않음을알아냈다. 그리고마우스에서유래한 bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) 에정제한 BFT를처리한결과, BMDCs가활성화할경우증가하는 MHC-II, CD80, CD86이증가하는모습을볼수없었다. 즉, 정제한 BFT는직접적으로림프구의증식을유 도하지않았다. 이결과들은 BFT의기전연구에있어좀더세부적인방향을제시한다. 차후더심화한연구를통해, ETBF에의한대장염이나대장암이동물모델에서만이아니라, 사람에서는어떻게일어나는지, 발생역학과기전을밝힐필요가있다. 3. ETBF의검출현재, ETBF만을바로검출하는진단기법은존재하지않는다. ETBF는세균동정과생물학적활성을가진 BFT에대한유전자의검출을같이시행함으로써검출할수있다. 즉, 먼저미생물학적기법들을통해 B. fragilis의단일 strain을분리한뒤그특성을다시조사해야한다. B. fragilis가절대혐기성세균이기때문에검체가공기중에노출되는시간이길수록검출할수있는세균수가줄어든다 (Rolfe 등, 1978; Kim 등, 1990). 따라서검체의공기노출시간을줄이는것이중요하다. 이를위해혐기성 jar나운송배지를이용하는것이 ETBF의검출에도움을준다. 검출한 B. fragilis가 ETBF인지를알아보기위해서는 BFT의생물학적활성을검사하는방법이있다. 초기에는 BFT의생물학적활성을알기위해, reversible ileal tie adult rabbit diarrhea (RITARD) assay를사용했다 (Myers 등, 1984; Myers 등, 1987). 이는많은비용과노동력을필요로했다. 이후사람의장암세포인 HT29/C1을배양하여 BFT를처리했을때, 세포의모양이변하는지확인하는방법, BFT toxin assay가등장했다. 이방법은 0.5 pm이라는적은양의 BFT로도세포의모양변화를확인할수있다 (Weikel 등, 1992; Saidi와 Sears, 1996). 많은연구자들이이방법을통해임상검체에서분리한 B. fragilis의특성과독소의분비량을조사해왔다. 또한, BFT가장상피세포에미치는영향을조사할때도이방법을사용했다 (Mundy 와 Sears, 1996; Wu 등, 1998; Wu 등, 2003; Wu 등, 2004; Ni Van 등, 2012). ETBF를검출하는방법으로분자진단학적방법인 polymerase chain reaction (PCR) 도빼놓을수없다. 특히이는 BFT toxin assay에비해빠르고생균을필요로하지않는다는점에서더편리하다. 먼저 B. fragilis를검출하는데사용하는 PCR 방법은크게 3 가지로보고되었다 (Sears, 2009). 일반적인 PCR과 nested PCR, multiplex PCR 3가지이다. Multiplex PCR은 B. fragilis 종간의차이를구분할수있는좀더특이적인방법이다 (Liu 등, 2003). PCR에비해 Real-time PCR (RT-PCR) 을이용하여 B. fragilis의 16S rdna 을검출하는방법은, 더적은양의세균 DNA만있더라도가능하다 (Tong 등, 2011). PCR의대상으로는 16S rdna외에도 leucine의생합성에사용되는 -isopropylmalate dehydrogenase (leub) 유전자, 또는 DNA gyrase (gyb) 의 B-subunit을사용한다 (Miki 등, 2005; Lee와 Lee, 2010; Lee 등, 2011). RT-PCR

5 Korean J Clin Lab Sci. Vol. 47, No. 4, Dec 로 PCR을진행하면일반적인 PCR에비해더빠르게 B. fragilis의특징을알수있다. ETBF를검출할때, 일반적인 PCR로는 BFT를발현하는 BFT 유전자를증폭한다. Isotype의구분없이 BFT 유전자만검출하는방법으로분리배양된세균의 DNA를추출하기만하면된다 (Sears 등, 2008). Multiplex PCR은 BFT의 isotype을구분할수있게개발되었다 (Avila-Campos 등, 2007). 이두방법을통하면빠른시간내임상검체내의 ETBF를확인할수있지만, 이는분리동정된세균에한해서만가능하다. RT-PCR 은임상검체내다른균과섞여있는 B. fragilis를검출하는데유용하며 RT-PCR 로도 BFT의 isotype을구분할수있다. RT-PCR 에서사용한 primer는 Table 1에제시하였다 (Merino 등, 2011). 특히기술의발달로환자의대변에서 DNA를추출하여바로 RT-PCR 이가능하다. 한연구에서 peptone yeast glucose with bile (PYGB) broth에대변검체를먼저배양하게되면검출민감도를높일수있다는내용이발표되었다 (Chen 등, 2015). 각각검사법을비교했을때 RT- PCR이일반적인 PCR보다더민감하며, 증폭에서확인까지걸리는시간은별차이가없어 ETBF 검출에큰도움을줄것으로보인다 (Papaparaskevas 등, 2013). 결론 만성대장염을일으키고, 대장용종의발생을촉진시킨점을고려하면, ETBF가염증성설사나 IBD만이아닌, 대장염, 대장암을일으키는원인균으로가정할수있게만든다. 특히사람의성숙에따라 ETBF의감수성이달라진다는점은흥미로운이야기이다. 성장에따른발현의차이가 ETBF의염증기전에중요하다면, 이와관련한연구를진행하여기전을밝히는데도움을줄수있다. 현재까지의연구로동물모델이나세포실험에서 ETBF에의한대장염이 T H17 면역반응을증가시키는것이밝혀졌다. 그러나이발견이바로사람의 IBD나대장암유발과연결되지않는다. 계속적인실험도중요하며, 임상에서 ETBF의검출을높여해당환자에서의 ETBF와면역작용을검사할필요성이여기서대두된다. 또한이를통해 ETBF 와면역반응의상관관계를조사하여이를질병의치료에사용할수있다. 한편임상에서는항생제내성에대한 B. fragilis에대한관심도커지고있다. 이는 ETBF를연구를저해할수있기때문에임상에서 ETBF를검출할때충분히고려되어야한다. 장내의많은미생물때문에 ETBF의작용규명이어려울수있지만, 이를극복함으로써장내미생물과인체의상호작용원리와질환의예방및치료에한발짝더다가갈수있을것이다. 이종설을통해 ETBF와설사질환및대장질환과의연관성, ETBF에대한직접적인진단법개발의중요성이충분히제시되기를바란다. 사람이가진세포수보다많은수의미생물이사람과함께공존하고있다. 이러한미생물이사람에게영향을끼치지않기란쉽지않다. 그렇기때문에장내미생물에대한연구가활발히이뤄지는것은필연적이다. 사람의장내세균에대한연구는설사질환이나대장질환뿐만아니라, 비만등의다른대사질환이나식습관등의생활습관에까지매우다양하다. 이런연구는인간의기대수명이증가함에따라그필요성이더욱두드러진다. 여기서는대장의정상균무리인 Bacteroidetes 의 Bacteroides spp. 에속하는 B. fragilis를논했다. 특히병원성인자인 BFT를분비하는 ETBF는장상피세포의 E-cadherin의분절을유도한다. 이는세포실험에서는물론, 동물실험에서도같은결과가나타났다. 하지만아직 BFT 의정확한 ligand가밝혀지지않았다. BFT에대한항체가없기때문에이는더어려움을겪고있다. 동물모델에서 ETBF가급성또는 요약정상인에서장내세균은숙주의면역이나영양흡수를돕지만, 때로는기회감염균으로서그들을위협하기도한다. 그중절대혐기성세균인 Bacteroides fragilis는분비되는장독소 (enterotoxin) 인 Bacteroides fragilis toxin (BFT) 의유무에따라 nonenterotoxigenic B. fragilis (NTBF) 와 enterotoxigenic B. fragilis (ETBF) 로나뉜다. ETBF는가축및사람에서설사질환및대장질환을유발한다그러나때때로 ETBF를가지고있으나증상이없는사람도존재한다. ETBF는염증성설사질환, 여행자설사환자의대변에서검출되어주목받고있다. 또한, 몇몇연구를통해 inflammatory bowel disease (IBD) 나대장염및대장암환자에서 ETBF가증가한다는것이밝혀졌다. 일반 C57BL/6 마우스및 Table 1. Target genes and sequences of primer and probe in real-time PCR Gene Sequences (Annealing temperature : 58 o ) Forward primer (5 3 ) Reverse primer (5 3 ) Probe (5 3 ) bft GGG ACA AGG ATT CTA CCA GCT TTA TA ATT CGG CAA TCT CAT TCA TCA TT CGC AAT GGC GAA TCC ATC AGC TAC A bft-1 GGG ATG TCC TGG TTC A AAT TAT CCG TAT GCT CAG CG CTT CGG ATT TTR AAG CCA GTG GGA TGT C bft-2 CTT AGG CAT ATC TTG GCT TG GCG ATT CTA TAC ATG TTC TC CTT CGG ATT TTR AAG CCA GTG GGA TGT C bft-3 TTT GGG CAT ATC TTG GCT CA ATC ATC CGC ATG GTT AGC A CTT CGG ATT TTR AAG CCA GTG GGA TGT C

6 166 Sun-Yeong Gwon, et al. ETBF-Associated Diseases and Detection germ-free 마우스, multiple intestinal neoplasia (Min) 마우스, 토끼, Mongolian gerbil 등여러동물모델에서 ETBF가 IBD나대장염, 대장암을유발또는촉진한다는것이발표되었다. ETBF의유일한병원성인자인 BFT는 E-cadherin 의분절을유도하여장상피세포의투과성을높인다. 이어서 -catenin 신호전달계가활성화하여장상피세포의증식이증가한다. 또한 ETBF의감염은일반마우스에서급성이나만성의대장염을일으키고 Min 마우스에서종양형성을촉진한다. 이는 Stat3에의존한 T H17 면역반응의활성화를통해일어난다. 현재 ETBF의검출방법에는크게 BFT toxin assay와몇가지 PCR 방법이있다. 최근 real-time PCR과같은분자진단학적기법의발달로일반적인 PCR보다더정확한 ETBF의검출이가능하게되었다. 이것을이용하여앞으로실제임상에서 ETBF와대장염및대장암의발달관계에대한심도깊은연구가이뤄질것으로본다. Acknowledgements: None Funding: None Conflict of interest: None References 1. Avila-Campos MJ, Liu C, Song Y, Rowlinson MC, Finegold SM. Determination of bft gene subtypes in Bacteroides fragilis clinical isolates. J Clin Microbiol. 2007,45: Basset C, Holton J, Bazeos A, Vaira D, Bloom S. Are Helicobacter species and enterotoxigenic Bacteroides fragilis involved in inflammatory bowel disease? Dig Dis Sci. 2004,49: Chen LA, Van Meerbeke S, Albesiano E, Goodwin A, Wu S, Yu H, et al. Fecal detection of enterotoxigenic Bacteroides fragilis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2015,34: Chung GT, Franco AA, Wu S, Rhie GE, Cheng R, Oh HB, et al. Identification of a third metalloprotease toxin gene in extraintestinal isolates of Bacteroides fragilis. Infect Immun. 1999, 67: Franco AA, Mundy LM, Trucksis M, Wu S, Kaper JB, Sears CL. Cloning and characterization of the Bacteroides fragilis metalloprotease toxin gene. Infect Immun. 1997,65: Franco AA, Cheng RK, Chung GT, Wu S, Oh HB, Sears CL. Molecular evolution of the pathogenicity island of enterotoxigenic Bacteroides fragilis strains. J Bacteriol. 1999,181: Jiang ZD, Dupont HL, Brown EL, Nandy RK, Ramamurthy T, Sinha A, et al. Microbial etiology of travelers' diarrhea in Mexico, Guatemala, and India: importance of enterotoxigenic Bacteroides fragilis and Arcobacter species. J Clin Microbiol. 2010,48: Kim KH, Lee KY, Jang IH, Lee HH. Isolation and transfer for R-plasmid of Bacteroides fragilis. Korean Journal of Medical Technologists. 1990,22: Kling JJ, Wright RL, Moncrief JS, Wilkins TD. Cloning and characterization of the gene for the metalloprotease enterotoxin of Bacteroides fragilis. FEMS Microbiol Lett. 1997,146: Koshy SS, Montrose MH, Sears CL. Human intestinal epithelial cells swell and demonstrate actin rearrangement in response to the metalloprotease toxin of Bacteroides fragilis. Infect Immun. 1996,64: Lassmann B, Gustafson DR, Wood CM, Rosenblatt JE. Reemergence of anaerobic bacteremia. Clin Infect Dis. 2007,44: Lee CS, Lee J. Evaluation of new gyrb-based real-time PCR system for the detection of B. fragilis as an indicator of human-specific fecal contamination. J Microbiol Methods. 2010, 82: Lee CS, Marion JW, Lee J. A novel genetic marker for the rapid detection of Bacteroides fragilis in recreational water as a human-specific faecal indicator. J Water Health. 2011,9: Liu C, Song Y, McTeague M, Vu AW, Wexler H, Finegold SM. Rapid identification of the species of the Bacteroides fragilis group by multiplex PCR assays using group- and species-specific primers. FEMS Microbiol Lett. 2003,222: Merino VR, Nakano V, Liu C, Song Y, Finegold SM, Avila- Campos MJ. Quantitative detection of enterotoxigenic Bacteroides fragili subtypes isolated from children with and without diarrhea. J Clin Microbiol. 2011,49: Miki T, Kuwahara T, Nakayama H, Okada N, Kataoka K, Arimochi H, et al. Simultaneous detection of Bacteroides fragilis group species by leub-directed PCR. J Med Invest. 2005,52: Moncrief JS, Obiso R, Jr., Barroso LA, Kling JJ, Wright RL, Van Tassell RL, et al. The enterotoxin of Bacteroides fragilis is a metalloprotease. Infect Immun. 1995,63: Moncrief JS, Duncan AJ, Wright RL, Barroso LA, Wilkins TD. Molecular characterization of the fragilysin pathogenicity islet of enterotoxigenic Bacteroides fragilis. Infect Immun. 1998, 66: Mundy LM, Sears CL. Detection of toxin production by Bacteroides fragilis: assay development and screening of extraintestinal clinical isolates. Clin Infect Dis. 1996,23: Myers LL, Firehammer BD, Shoop DS, Border MM. Bacteroides fragilis: a possible cause of acute diarrheal disease in newborn lambs. Infect Immun. 1984,44: Myers LL, Shoop DS, Stackhouse LL, Newman FS, Flaherty RJ, Letson GW, et al. Isolation of enterotoxigenic Bacteroides fragilis from humans with diarrhea. J Clin Microbiol. 1987,25: Myers LL, Shoop DS, Collins JE, Bradbury WC. Diarrheal disease caused by enterotoxigenic Bacteroides fragilis in infant rabbits. J Clin Microbiol. 1989,27: Neish AS. Microbes in gastrointestinal health and disease. Gastroenterology. 2009,136: Ni Van, Ned Ahlberg, Byung Chul Jung, Min Ho Lee, Seung Ju Ahn, In-soo Lee, et al. Evaluation of Enterotoxigenic Bacteroides fragilis from colonic washings from patients undergoing colonoscopy. J Exp Biomed Sci. 2012,18: Obiso RJ, Jr., Lyerly DM, Van Tassell RL, Wilkins TD. Proteolytic activity of the Bacteroides fragilis enterotoxin causes fluid se-

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