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- 민기 정
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1 대한구강내과학회지 Vol. 34, No. 4, 2009 전남대학교치의학연구소, 치의학전문대학원구강내과학교실 1 전남대학교치의학연구소, 치의학전문대학원구강해부학교실 2 광주보건대학치위생과 3 윤선학 1 고현미 2 박지일 3 김재형 1 미란형구강편평태선과재발성아프타성구내염은 T 림프구에의해매개되는염증성면역질환이다. T 림프구에영향을주는다양한조절인자들중 CD28, CD45, CD152, CD154, CD279 등의 mrna 가미란형구강편평태선및재발성아프타성구내염환자들의비자극성전타액내에서어떻게발현되는지를살펴보고, 이것의진단학적가치를평가하고자한다. 미란형구강편평태선으로진단받은환자군 18 명, 재발성아프타성구내염으로진단받은환자군 12 명, 정상군 8 명에게서비자극성전타액을 10 분간채득한후, 상피세포를분리하여 mrna 를추출하였다. Real time PCR 을이용하여각군의 T 림프구조절인자들의 mrna 발현양상을비교분석하였다. 미란형구강편평태선의 T 림프구조절인자들의 mrna 발현양상은정상인과비교결과, CD45, CD279 는높게측정되었고, CD154 는낮게측정되었다. 재발성아프타성구내염환자들의 T 림프구조절인자들의 mrna 발현양상은정상인과비교결과, CD45, CD279 는높게발현되었고, CD28, CD154 는낮게발현되었다. 부가적으로미란형구강편평태선환자군의타액내 CD152 의발현양상은재발성아프타성구내염환자군보다높게발현되었다. 미란형구강편평태선과재발성아프타성구내염환자들의비자극성전타액내 T 림프구조절인자들의 mrna 발현양상은각질환의진단에기여할수있을것으로사료된다. 주제어 : 구강편평태선, 아프타성구내염, 타액, CD28, CD45, CD152, CD154, CD279 1)Ⅰ. 서 구강편평태선 (Oral lichen planus, OLP) 은비교적흔한만성염증성질환으로, 중년여성에게주로나타나고, 협점막, 혀, 치은에호발한다. 1) 임상적소견에 론 교신저자 : 김재형광주광역시북구용봉로 77 전남대학교치의학전문대학원구강내과학교실전화 : Fax : tmjkim@chonnam.ac.kr 원고접수일 : 원고수정일 : 심사완료일 : * 이논문은전남대학교병원임상의학연구소학술연구비 (CRI ) 에의하여연구되었음 따라비미란형 (Non-erosive OLP, NEOLP) 과미란형 (Erosive OLP, EOLP) 으로구분하고있다. 2) Wickham 선조로알려진백색의융기된레이스모양의조직이주로관찰되는 NEOLP 는증상이거의없으나, 홍반및백색위막부위가혼재되어나타나는 EOLP 는뜨겁거나매운음식등에대해민감한통증을호소한다. 1-4) EOLP 는위막성캔디다증, 점막성유천포창, 심상성천포창, 홍반성루프스등과감별하기가어렵고, 편평세포암종으로의전이가능성때문에조직검사가필요하다. 3,4) OLP 는조직학적으로상피및피하층의 T 림프구침윤과기저세포층의파괴및액화변성등이관찰된다. 상피층 T 림프구의대부분은 CD8+ T 림프구인반면고유판 (lamina propria) 내의 T 림프구의대부분은 CD4+ T 림프구이다. CD4+ T 림프구는항원제시세포 363
2 윤선학 고현미 박지일 김재형 (Antigen presentation cells, APCs) 에의해제시된 MHC(major histocompatibility complex) class II 항원을인식하고, 이후 CD4+ T림프구는 IL-2, IFN-γ 등을발현시켜 CD8+ T림프구를활성화시킨다. CD8+ T림프구는 MHC class I 항원에의해서도활성화되는데, 이후기저세포의자멸사에관여하는것으로알려져있다. 5,6) 재발성아프타성구내염 (Recurrent aphthous stomatitis, RAS) 은흔한구강점막질환중하나로, 주로여성에게나타나고, 하나혹은여러개의둥글고움푹패인궤양소견을보인다. 조직학적으로질환초기에는림프구의침윤이피하층에침윤이되고, 시간이지남에따라림프구가상피층으로이주하게되며, 이후각화세포의괴사가진행된다. 침윤된림프구는대부분 T림프구인데, HLA (Human leukocyte antigen), LFA (Lymphocyte function antigen), ICAM (Intercellular adhesion molecule), 몇몇 MHC 항원들에의해 T림프구가활성화되어세포매개면역반응이일어나는것으로알려져있다. 7,8) 이상에서살펴본바와같이 OLP와 RAS는 T림프구에의해매개되는면역질환이므로, T림프구의분화, 활성화, 억제, 조절등은각질환의병태생리에매우중요하다. T림프구의표면에수용기성물질로부착하여 T림프구를조절하는인자들에는 CD28, CD45, CD152, CD154, CD279 등이있다. CD45 (Leukocyte common antigen) 는 SFKs(Src family kinases) 의 C 말단티로신을탈인산화 / 인산화시켜 T 림프구를조절한다. 9) CD154 (CD40 Ligand, CD40L) 는항원제시세포와 T림프구의상호작용에중요한역할을수행하며, T림프구와관련된자멸사를조절한다. 10) CD28은항원노출이후초기면역반응에있어서필수적인역할을하는물질로 T림프구를활성화시키는상호증진기능을가지고있는반면, CD152 (Cytotoxic T-Lymphocyte antigen 4, CTLA-4) 는 CD28의배위자인 CD80과 CD86에길항적으로작용하여 T림프구를억제한다. 11) CD279 (Programmed cell death 1, PD-1) 는항원제시세포, 수지상세포, 대식세포등의활성화에의해나타나는 CD274 (Programmed cell death ligand 1, PD-L1 or B7-H1), CD273 (Programmed cell death ligand 2, PD-L2 or B7-DC) 에결합하여 T림프구의조절에영향을미치고있다. 12) 타액은윤활작용, 항세균작용, 완충작용등의보호기능과소화작용, 수분대사조절, 배설및용매작용등 을통하여구강조직의기능유지에중요한역할을수행하는것으로알려져있다. 13) 최근에는타액내특이성분을찾아내질병의진단에이용하는연구가활발하게이루어지고있는데, 타액을이용한진단학적방법은기존의조직검사에비하여비침습적이고, 통증이수반되지않으며, 쉽고, 간편한이점이있다. 14) 이에저자는전술한 T 림프구의조절인자들이타액에서발현된다면, 타액을이용한진단학적방법이가능하리라생각하였다. OLP, RAS 환자들의비자극성전타액 (Unstimulated whole salva, UWS) 내 T 림프구조절인자들의 mrna 발현양상을살펴보고, 정상인의발현양상과비교분석하여, 이것의진단학적가치가있는지를살펴보고자한다. 1. 연구대상 Ⅱ. 연구재료및방법 전남대학교치과병원구강내과에내원한환자들중 EOLP 또는 RAS 로진단받은환자들중임상실험에대해충분한설명후자발적으로동의한환자들을대상으로하였고, 그중활동성구강질환, 특이적전신질환, 그리고약물처방등을받는환자들은배제하여 EOLP 군 18 명과 RAS 군 12 명을실험군으로하였다. 구강질환및전신질환이없고그리고약물을복용하지않는건강한중년여성 8 명을대조군으로하였다 (Table 1). 2. 타액채득및상피세포분리 타액채득은채득 1 시간전부터음식이나물의섭취를제한한후원심분리가가능한용기에뱉는방법 Table 1. Demographics of the study groups. Male Female age (m.±s.d.) EOLP ±13.9 RAS ±20.7 Control ± m.±s.d. : mean±standard deviation 364
3 으로 10 분간실시하였고, -80 에서냉동저장후 24 시간이내에상피세포를분리하였다. 타액을 Zap-o- Globin 용해제 (Beckman Coulter, USA) 가 2 방울첨가된등장액 (Hematronix, Inc, CA, USA) 으로 10 배희석한후, 2000 rpm 에서 10 분간원심분리하였다. 세포덩이를 Hanks 평형염액 (Life technologies, MI) 에재현탁시킨후 40 μm 두께의멸균된나일론막 (BD Biosciences, Bedford, MA) 에통과시켜상피세포를분리해냈다. 3. 실시간역전사중합효소연쇄반응 (Real time Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction, Real time RT-PCR) RNA 는 Trizol reagent (Gibco BRL) 을이용하여추출하였으며, DNase I (Gibco BRL) 을처리하여 DNA 오염가능성을배제하였다. 추출한 3 μg 의 RNA 를 1 μg 의 oligo(dt) 와혼합시켜 70 에서 5 분간반응시킨후역전사반응액 (Promega, Madison, WI : 1 reverse transcription buffer, 5mM dntp mixture, 5mM MgCl 2, 10 units rrnasin, 10 units avian myeloblastosis virus reverse transcriptase) 을혼합하여 42 에서 30 분간반응시켜 cdna 를합성하였다. 실시간 RT-PCR 은합성한 cdna, 각각의 primers 와 SYBR Green PCR Master Mix Reagent Kit (Qiagen, Valencia, CA) 를혼합하여실시간역전 사중합효소연쇄반응을시행하였다 (Table 2). mrna 의상대적인수준은 Corbett Research 에서제공한소프트웨어 (Corbett Research) 를사용하여분석하였고, 결과는정상군수치의배수로표현하였다. 4. 통계방법 SPSS 17.0 을이용하였고, EOLP, RAS, 정상인에서나타나는 CD28, CD45, CD152, CD154, CD279 등의상대적인 mrna 의발현양상을비교하기위하여 Kruskal wallis test 를이용하였으며, p<0.05 수준에서유의성을결정하였다. Ⅲ. 결과 EOLP 군과정상군의비교결과, CD45, CD279 는높게측정되었고, CD154 는낮게측정되었다. RAS 군과정상군의비교결과 CD45, CD279 는높게발현되었고, CD28, CD154 는낮게발현되었다. EOLP 군과 RAS 군의비교결과, CD152 만 EOLP 군에서높게측정되었다 (Table 3, 4). Ⅳ. 고찰 CD45 는조혈세포에서발현되는수용기성물질로 T 림프구및 B 림프구의기능에중요한역할을하고, Table 2. Specific Primer for PCR Factors CD28 CD45 CD152 CD154 CD279 β-actin Primer 5 -TCTGGATAGGAAATGACCG-3 and 5 -TGGCACTGTAAGACTTGGC-3 5 -ATGTGTGTGTATGCTACTACAAAAA-3 and 5 -ATTGAAAACCCCATGTAAAGA-3 5 -ATTTCAATTTCCAAGAGCTGAGG-3 and 5 -GCTGATGTGACAGAAACATCCC-3 5 -GGCCGTTGCTAGTCAG -3 and 5 -GCAGGTAGATACAATAGATTTCC-3 5 -GCCGTGCCTGTGTTCTCT-3 and 5 -TCCGCTAGGAAAGACAATGG-3 5 -CTGAAGTCACCCATTGAACATGGC-3 and 5 -CAGAGCAGTAATCTCCTTCTGCA-3 365
4 윤선학 고현미 박지일 김재형 Table 3. Relative levels of mrna of lymphocyte regulatory factors of EOLP, Control and RAS Control (m±s.d.) EOLP (m±s.d.) RAS (m±s.d.) CD ± ± ±0.54 CD ± ± ±41.07 CD ± ± ±0.82 CD ± ± ±0.74 CD ± ± ±0.30 UWS : unstimulated whole saliva EOLP : erosive oral lichen planus RAS : recurrent aphthous stomatitis m.±s.d. : mean±standard deviation Table 4. Statistical difference in mrna expression of T lymphocyte regulatory factors CD28 CD45 CD152 CD154 CD279 EOLP vs Control.054a.000a a.016a EOLP vs RAS a RAS va Control.012a.003a a.031a EOLP vs RAS, Control.045a.001a.042a.003a.041a EOLP : erosive oral lichen planus RAS : recurrent aphthous stomatitis a : significant difference in p<0.05 다른 PTP 보다높게발현되는데, 자극유형, 세포유형등에따라기능이상반되게나타나는경향을보이기도한다. 9,15) 또한, CD45 의구조는세포외부분, 세포막투과부분, 세포내부분등으로나뉘는데, 세포외부분의구조적다양성으로인해여러가지이성체가존재하고, 각각의이성체는다른역할을수행한다. 16) Sugerman 등 5) 에의하면, 조절 T 림프구와억제 T 림프구의불균형은 OLP 의임상적양상과관련이있다고하였고, 억제활동과연관있는 CD4+CD45RA+ T 림프구가 OLP 에서감소되는것을보고하였는데, 이는면역반응조절의실패를의미한다고하였다. Rodríguez-Núñez 등 17) 에의하면, EOLP 의혈액에서 CD4+CD45RO+ T 림프구가높게발현되고, CD4+ CD45RA+ 및 CD8+CD45RA+ T 림프구가낮게발현된다고하였다. 본연구에서는혈액이아닌타액내 CD45 의 mrna 의발현양상을보았는데, EOLP 군의 CD45 은정상인에비하여 20 배이상발현되었고, 다 른조절인자들에비하여 10 배이상풍부하게발현되었다. RAS 군에서도정상인에비하여 10 배이상발현되었다. 이는 T 림프구의활성혹은억제, 분화, 조절에다양한기능을하였을것으로사료되나, 선행연구에서는다양한이성체를분별하고, 각각의역할에대해다양한해석을이야기하고있어, 본연구의결과도다양한이성체에대한다각적인연구가필요할것으로사료된다. CD154 는 CD40 과더불어염증반응, B 림프구및 T 림프구조절, 자가면역, 장기이식등에관여하고있다. 10) 뿐만아니라 CD154 는 CD4+CD45RO+ T 림프구에서발현되는데, 시간이지남에따라점진적인감소를나타낸다. 18) Neppelberg 등 19) 의연구에의하면자멸사를촉진하는 CD40/CD154 는 OLP 에서하향조절 (down-regulation) 된다고보고하였다. 본연구에서도 CD154 는 EOLP 군과 RAS 군모두낮게발현되었는데, 이는시간에따른점진적인감소로해석할수있고, 366
5 CD154의낮은발현은질병의진행을억제하는역할을한다고생각할수있다. CD28은항원복합체와 TCR을통한신호전달을증진시켜 T림프구의활성화및분화를촉진하고, 사이토카인등을생산하게하며, Bcl-XL과같은반자멸사 (anti-apoptosis) 물질을상향조절 (up-regulation) 시켜 T림프구의생존이가능하게하는등의다양한기능을수행하고있다. 11) 반면 CD152는 CD28과같은배위자인 CD80과 CD86에친화성이있어 CD28의기능을조절하는역할을수행할수있다. 11,20) Zhao 등 21) 에의하면 APC에의한 MHC class II 항원복합체가 CD28과 CD152, CD54 등에의해 T림프구를조절한다고하였는데, 이는 Sugerman 등 5) 과 Lodi 등 6) 에의한가설과일맥상통한다. 본연구에서는 EOLP군에서통계적으로유의하진않으나 CD28이다소높게관찰되는경향이보이는데, 이는 T림프구를활성화시키는것으로여겨지고, 더불어 CD152의발현양상이정상인과유사한양상을보이는것은 CD28에의한활성화된 T림프구에대한 CD152의억제가불충분하여질환의심도에영향을미치는것으로사료된다. CD279는 B7군의확장된그룹으로판단되는데, 항원제시세포, 수지상세포, 대식세포등의활성화에의해나타나는 CD273, CD274 배위자에결합하여 T림프구의조절에영향을미치고있다. 12) Fife 등 22) 도 CD279가 CD28/CD152의 T림프구조절에영향을미친다고하였다. Youngnak-Piboonratanakit 등 23) 의연구에의하면 CD279는 CD274와함께각화세포에영향을미쳐구강편평태선의자가면역기전을활성화시킨다고보고하고있다. 본연구에서도 EOLP 및 RAS군모두 CD279의높은활성도가측정되었으며, 이는면역기전을활성화시켜질병을심화시키는역할을수행하였을것으로사료된다. RAS는원인및병태생리가정확하게밝혀져있지않은염증성, 면역질환으로여겨지고있다. HLA와연관된유전적성향을보이며, 다양한 T림프구가궤양병소주변에침윤된양상을관찰할수있고, 면역글로불린및보체와의연관성또한제기되고있다. 7,8) 본연구에서는 EOLP와 RAS의비교에서 CD152외에다른인자들은차이가없는것으로관찰되었는데, 이는두질환이임상적으로다른양상을띠고있으나조직학적으로 T림프구에의해매개되는유사한면역질환이기때문인것으로사료된다. 다양한기능을수행하는것으로알려진타액은최근진단용물질로활발하게연구되고있는데, 구강암, 치주질환, 치아우식증등의구강질환뿐만아니라, 당뇨병, 유방암등의전신질환의진단에서도유용할것으로보고되고있다. 14) 본연구에서는 T림프구의조절인자들을살펴보았는데, 전술한바와같이조직및혈액학적연구와비슷한결과를도출하고있어, 본연구의타당성및타액을이용한진단학적방법의유용성은높으리라사료된다. 향후조직병변의면역조직화학검사결과와타액을이용한본연구결과를비교분석하여타액을이용한점막질환의진단학적유용성을확립할수있을것으로생각된다. EOLP 환자군의비자극성전타액에서나타난 CD28, CD45, CD152, CD154, CD279들의 mrna 발현양상은정상군과비교결과, CD45, CD154, CD279 에서유의한차이를보였고, RAS군과의비교결과 CD152에서유의한차이를보였다. 뿐만아니라 RAS 군의비자극성전타액에서나타난 CD28, CD45, CD152, CD154, CD279들의 mrna의발현양상은정상군과비교결과 CD28, CD45, CD154, CD279에서유의한차이를보였다. 이상의결과를통해, 타액을이용한진단법이유용할수있고, EOLP 및 RAS 환자들의비자극성전타액내 T림프구조절인자들의발현양상은각질환의진단에기여할수있을것으로사료된다. 참고문헌 1. Neville BW, Damm DD, Allen CM, Bouquot JE. Oral and Maxillofacial PATHOLOGY. 3rd ed., W.B. Saunders Co., USA, 2009, pp 이윤미, 김명찬, 김종열. 구강편평태선환자의임상적특징에관한연구. 대한구강내과학회지 1996;21(1): Ismail SB, Kumar SKS, Zain RB. Oral lichen planus and lichenoid reactions: etiopathogenesis, diagnosis, management and malignant transformation. J Oral Sci 2007;49: Gonzalez-Moles MA, Scully C, Gil-Montoya JA. Oral lichen planus: controversies surrounding malignant transformation. Oral Diseases 2008;14: Sugerman PB, Savage NW, Walsh LJ et al. The pathogenesis of oral lichen planus. Crit Rev Oral Biol Med 2002;13(4): Lodi G, Scully C, Carrozzo M et al. Current controversies in oral lichen planus: report of an international consensus meeting. Part 1. Viral infection and etiopathogenesis. Oral Surg Oral Med 367
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7 - ABSTRACT - Expression Pattern of T Lymphocyte Regulatory Factors in Unstimulated Whole Saliva of Erosive Oral Lichen Planus and Recurrent Aphthous Stomatitis Patients Seon-Hack Yoon, D.D.S. 1, Hyun-Mi Ko, Ph.D. 2, Ji-Il Park, D.D.S.,M.S.D. 3, Jae-Hyung Kim, D.D.S.,M.S.D.,Ph.D. 1 Department of Oral medicine, Scool of Dentistry, Dental Science Research Institute, Chonnam National University 1 Dental Science Research Institute, 2nd stage Brain Korea, School of Dentistry, Chonnam National University 2 Department of Dental Hygiene, Gwangju Health college university 3 Erosive oral lichen planus (EOLP) and recurrent aphthous stomatitis (RAS) are T-cell mediated inflammatory immune disorders. It was investigated mrna expression pattern of several regulatory factors, such as, CD28, CD45, CD152, CD154, CD279, which influence T lymphocyte in unstimulated whole saliva (UWS) of EOLP and RAS patients. It was collected unstimulated whole saliva during 10 minute in EOLP 18 people, RAS patients 12 people, healthy control 8 people. We investigated mrna expression of T lymphocyte regulatory factors, such as, CD28, CD45, CD152, CD154, CD279, with real time reverse transcription polymerase chain reaction. In EOLP group, CD45, CD279 expressed higher and CD154 expressed lower than control. In RAS, CD45, CD270 expressed higher and CD28, CD154 expressed lower than control. In addition CD152 salivary mrna expression of EOLP is higher than that of RAS. The above results were suggested that the mrna expression of T lymphocyte regulatory factors in unstimulated whole saliva of EOLP and RAS contributes to diagnosis of diseases. Key words: Oral lichen planus, Aphthous stomatitis, Saliva, CD28, CD45, CD154, CD152, CD
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