01-김기수(전화교정)

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수진 오
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1 대한척추외과학회지제 13 권제 4 호 Journal of Korean Spine Surg. Vol. 13, No. 4, pp 225~233, 2006 성숙생쥐뇌로부터다기능신경줄기세포주의확립 김기수 최용수 서승용 김병학 김영선 # 이민철 # 광주기독병원정형외과, 전남대학교의과대학병리학교실 # Establishment of a Multipotent Neural Stem Cell Line from the Adult Mouse Cerebrum Ki-Soo Kim, M.D., Yong-Soo Choi, M.D., Seung-Yong Seo, M.D., Byung-Hak Kim, M.D.,Young-Seon Kim, M.D. #, Min-Cheol Lee, M.D. # Department of Orthopaedics, Kwangju Christian Hospital, Department of Pathology, Chonnam National University Medical School #, Gwangju, Korea Abstract Study Design: Establishment of a multipotent neural stem cell line from the adult mouse cerebrum. Objectives: To establish a daughter cell line, B2A1, from B2 cells through the limiting dilution method, and to determine if the cells have the characteristics of neural stem cell (NSCs) using immunocytochemistry and RT-PCR methods. Summary and Literature Review: In the development of NSCs, differentiated organ or tissue-derived multipotent stem cells have attracted considerable interest because of the lack of ethical issues. Previously, a glial precursor cell line (B2 cells) was generated from the primary cultures of oligodendrocytes/ astrocytes in an adult BALB/c mouse brain. These cells exhibited the cell-type specific markers for immature neuroectodermal cells, astrocytes, and oligodendrocytes in serum-contained media. Materials and Methods: The primary cultures of oligodendrocytes/astrocytes were established from the whole brains of 12 to 16-week-old BALB/c mice from either gender. After 6 months with 25 serial passages, the culture consisted of a morphologically homogeneous cell population, which was designated as B2 cells. A subclone, B2A1, was isolated from B2 cells through two consecutive limiting dilutions. Results: More than 90% of B2A1 cells showed immunopositivity for nestin, a specific marker for NSC. The cells also showed immunopositivity for the neuronal, astrocytic and oligodendroglial markers. These cells expressed the genotypic mrna messages for both neural progenitor cells and differentiated neuronoglial cells. These positive immunocytochemical reactions and mrna messages for neuronoglial cells varied according to the extrinsic growth factors used. However, the treatment of extrinsic growth factors did not produce any significant differences in the nestin-immunopositive cells. Conclusions: B2A1 cells have the immunocytochemical and cytogenetic properties of NSCs, and the capacity to differentiate into neuronoglial cells. Key Words: Neural stem cell, B2A1 cell, Adult mouse cerebrum Address reprint requests to Yong-Soo Choi, M.D. Department of Orthopaedics, Kwangju Christian Hospital, 264, Yanglim-dong, Nam-gu, Gwangju, , Korea Tel: , Fax: , stemcellchoi@yahoo.co.kr 연구비지원 : 본연구는한국과학기술평가원 (STEPI) 의특정연구개발과제연구비 (M ) 의지원을받아시행되었음

2 대한척추외과학회지 Vol. 13, No. 4, 2006 서 론 연구대상및방법 외상성척수손상은손상된중추신경이재생능력이매우낮거나전혀재생되지않아심각한신경장애와합병증을야기한다. 줄기세포이식술은손상된중추신경계의해부학적및기능적회복을위해서손상에의한사멸된세포를대체할수있는치료법으로연구되고있다. 줄기세포는자가재생산, 분화, 다기능성을갖는세포로서여러장기들, 특히조혈기계 1) 와중추신경계 2,3) 에서잘알려져있다. 최근에인간질병의치료적인면에서보면수정된난자나초기분열세포에서기원하는전능줄기세포나포배기의내세포종에서기원하는배아줄기세포대신에, 성숙된장기나조직에서기원하는성체줄기세포의이용에관심이모아지고있다 4,5). 성체줄기세포는성인에게서도얻을수있으므로윤리적문제를야기하지않으며, 배아줄기세포에비하여세포의분화력이이미제한되어있어특정한형질을지닌세포를얻기가오히려용이하다는장점이있다. 신경줄기세포의존재는이미포유류의대뇌피질에서보고된바있으며, 그세포들은세가지타입의중추신경계세포즉신경원, 성상세포, 희돌기교세포로분화될수있다 6,7). 이전구세포들은일반적으로뇌실하부 (Subventricular zone) 에위치하며, 성숙생쥐나인간의뇌에서도확인되었다 8,9). 성장인자, cytokine, adhesion molecule 같은여러가지인자들이신경줄기세포의분화와자가재생산을조절한다고보고되어있다 10,11). 최근골수세포나아기가출생할때탯줄에존재하는제대혈이신경이나근육및지방세포로분화할수있다는사실이알려지면서성체줄기세포를이용해다양한질병을치료할가능성도밝혀지고있다. 이전의연구에서, B2 신경교세포주는성숙생쥐의대뇌로부터분리한희돌기교세포분획을 1 년이상계대배양함으로써얻어졌다 12). 이세포주는희돌기교세포 (O4, galactocerebroside), 성상세포 (GFAP), 신경외배엽세포 (vimentin) 표지자에면역조직화학적으로양성반응을나타냈으며이세포들은 camp 의일종인 dibutyryl camp 를첨가하여배양하였다. 저자들은본연구에서성숙한실험동물의뇌조직으로부터다능성줄기세포를생성하기위해 B2 세포로부터복제세포주를확립하였으며, 이를 B2A1 세포라고명명하였고, 이세포가신경줄기세포주의특성을가지는지조사하였다. 1. B2 세포로부터 B2A1 세포의발생 대뇌세포중희돌기교세포분획의일차배양은앞서기술한방법대로 12~16 주연령의성숙 BALB/c 생쥐의대뇌로부터얻어졌다 12,13). 대뇌에서희돌기교세포분획의일차배양법은다음과같다. 분리된세포들은물리적인방법으로잘게부수고분해효소를처리하여 Percoll 을이용한밀도구배원심분리법을이용하여대뇌로부터 enriched-oligodendrocyte /astrocyte 가얻어졌다. 이세포들은 10% 우태아혈청 (FBS), 100 U/ml penicillin 과 100 μg /ml streptomycin 이첨가된 Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM) 배양액을사용하였고 5% CO2/ 95 % air, 37 C 의배양기에서배양되었으며배양액은 4 일마다교체하였다. 배양첫주동안세포의 60~80% 가희돌기교세포에특이한표지자인 galactocerebroside (GalC) 에양성을보였다. 2~3 주후배양결과비희돌기교세포의과증식이관찰되었으며이들은 glial fibrillary acidic protein (GFAP) 을발현하는편평성상세포 (20~40%), Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) 을발현하는소교세포 (1~5%), 그리고형태학적으로다른교세포들과는구별되는작은양극또는삼극세포 (30~40%) 로구성되어있었다. 이새로운세포들을채집하여 0.1% trypsin /1ml EDTA 로처리후배양배지상에 10 6 cells/ml 로 75 cm 2 T 형플라스크에배양하였다. 계대배양은일주일에한차례씩하였다. 이연속적인배양과정에서혼합된성상세포와소교세포는점점수가줄어들게되었다. 25 번의계대배양이있은 6 개월후에배양세포는형태학적으로균질의세포집단을형성하게되었고이를 B2 세포라명하였다. 혈청첨가배지에서 B2 세포는배양배지상에서어느성장인자도필요없이충분히성장을했다. 그것들은 10% 마혈청 (HS) 을포함하는배양배지에서 25 번의계대배양과정을거친 6 개월동안더유지되었다. 생쥐에서추출한세포임을확인하기위하여 G-banding 법 14) 을이용한핵형분석을한결과 B2 세포의총염색체수는 40 개로 BALB/C 생쥐의정상체세포의염색체수와동일하였다. B2A1 세포는 B2 세포로부터두번의연속적인최대희석법 (limiting dilution) 을통해분리하였다 15). 단일세포를얻기위해 B2 세포를 0.1% trypsin/0.02% EDTA 에서 37 C 에서 15 분동안배양하였고, 10% FBS 를포함하는배지에배양하고, 96 well microtiter plate 상에한 well 당하나의세포를분주하였다. 배양액은일주일에 2 번씩바

3 성숙생쥐뇌로부터다기능신경줄기세포주의확립 김기수외 꾸었고잘분리된세포군체를선택하여 3~4 주후에이런과정을반복하였다. 첫번째희석배양상 3 개의 well 에서세포증식을확인하였고이를 B2A 라고명명하였다. 두번째희석실험에서 28 개의 well 에단일세포를배양한결과하나의 well 에서증식, 분리된세포를 B2A1 으로명명하였다. 이세포들은 10% HS 를포함하는 DMEM 에서유지되었다. 2. 면역세포화학검사 면역세포화학적염색을위하여 B2A1 세포는 poly-llysine (PLL) 를처리한 9 mm Aclar coverslip 에 10 4 cells/coverslip 의세포를배양하였다. 세포들은또한 10% HS 가첨가된 DM4 media 16) 에서 5 일동안배양하였고, DM4 media 는 10 μg/ml insulin, 10 μg/ml trans ferrin, 0.3 nm triiodothyronine, 30 nm sodium selenite, 그리고 50 nm hydro cortisone 이첨가된 DMEM 으로구성되었다. Insulin (Novo Laboratories, Willow dale, ON, Canada) 을제외한모든약품들은 Sigma (St. Louis, MO) 사로부터얻었다. 신경세포표현형을확인하기위해세포배양물은세포형특이표지자즉, 신경줄기세포의 nestin, 신경원의 βtubulin isotype 과 low molecular weight neuro-filament protein, 성상세포의 GFAP, 희돌기교세포의 galactocerebroside (GalC), 소교세포의 Ricinus communis agglutinin lectin (RCA-1) 항체를이용한면역조직화학염색을시행하였다. Mouse anti-βtubulin isotypeⅢ 단일크론항체와 biotinylated RCA-1 은 Sigma 사, GFAP 와 myelin basic protein (MPB) 에대한 Rabbit antibody 는 DAKO 사로부터구입하였으며, Mouse anti GalC monoclonal antibody 는 Dr. S. Miller 가제공했다 17). 일차항체와반응후에 biotinylated secondary antibody 와 avidin-biotin complex (ABC, Vector, Burlingame, CA) 반응을거쳐 3-amino-9-ethyl carbazole (AEC, Sigma) chromogen 으로발색시켰다. 신경세포들의면역화학적특징인항체를이용하였다 (Table. 1). 3. 성장인자로처리한 B2A1 세포의면역세포화학적 & RT-PCR 분석 B2A1 세포에작용하는다양한성장인자들과약물에대한신경세포분화능력에대해연구하기위해세포들은 10 4 cells/coverslip 의비율로 PPL-coated coverslip 에준비하였다. 그리고 DM4 에서 triiodothyronine 과 hydrocortisone supplement 와함께다음의성장인자를각각첨가하여 72 시간동안배양하였다 : 10% HS, 10 mg/ml insulin, 10 mg/ml transferrin, 30 nm selenite 혼합액 (ITS,Sigma), 1 mm dbc-amp (Sigma), 10 μm retinoic acid (RA)(Sigma), 100 ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bfgf)(gibco BRL, Gaithersburg, MD), 100 ng/ml recombinant human platelet-derived growth factor (PDGF) AA (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), 10 ng/ml leukocyte inhibitory factor (LIF, Sigma) or 100 nm phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, Sigma). Nestin, βtubulin Ⅲ, GFAP, GalC 에대한면역세포화학적인염색도앞서기술한배양절차를따랐다. RT-PCR 분석을위해 B2A1 세포를 6 well plate 에 cells/well 로분주한후위의 cytokine 들중하나를처리한 DM4 배양액에서 5 일간배양하였다. RT-PCR 은 oligonucleotide primer (Table. 2) 를가진각각의 well 에서추출한세포에서시행하였다 18,19). 신경줄기세포는표지자로서 nestin, Notch1, PDGFRα 의발현으로결정하였다. B2A1 세포의신경원의특성을확인하기위해 cdna 는 NF-L 로 35 회 PCR cycle 을거친다. 추가로다른중추신경계세포표지자들즉성상세포에는 GFAP, 희돌기교세포에는 MBP 를검사하였다. 표준표지자는 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) 를이용하였다. 전체의 RNA 는각각의검 Table 1. Cell type specific immunocytochemical markers Antigen Specificity Clone name Subtype Source Nestin Neural stem cell IgG1 Chemicon NF-L Neuron MAb IgG1 Neo Marker βtubulin III Neuron SDL.3D10 MAb IgG1 Sigma GFAP Astrocyte Rabbit DAKO GalC Oligodendrocyte Mouse Dr. S. Miller MBP Oligodendrocyte Rabbit DAKO RCA-1 Microglia Lectin Sigma NF-L: low molecular weight neurofilament protein, GFAP: glial fibrillary acidic protein, GalC: galactocerebroside, MBP: myelin basic protein, RCA-1: Ricinus communis agglutinin-1 lectin

4 대한척추외과학회지 Vol. 13, No. 4, 2006 체들로부터 TRIzol reagent (GIBCO-BRL, Gaithersberg, MD) 를사용하여추출하였다. 각각의검체로부터보체 DNA (cdna) 가닥들이, 35~40 회의 PCR 증폭주기 (30 초동안 94 C, 60 초동안 55 C 에서서서히달구고 90 초동안 72 C 에서 extension) 를거친 MMLV reverse transcriptase (GIBCO-BRL) 400 unit 을사용하여 oligo dt primer 들로부터얻어진 2 μg 의 total RNA 로부터준비되었다. 각각의 PCR product 의 10 μl 가 1.5% agarose gel 전기영동법에의해분석하였고신뢰되는 band 는선택적효소분해에의해결정하였다. 결 과 1. 면역조직화학법에의한 B2A1 세포의신경줄기세포의표현형질 혈청을함유한배지에서 B2A1 세포는 7~8 μm 크기를가진양극또는삼극세포로보였고, 개별적으로성장하거나작은덩어리로응집하는경향을보였다 (Fig. 1A). 그세포는 nestin 에 91.8% 에서면역반응성을나타냈다 (Fig. 1B). 또한 NF-L (3.1%)(Fig. 1C), βtubulin Ⅲ(2.7%) 양성의신경원세포가관찰되었으며, GFAP ( 성상세포표지자 ) 를포함하는다른중추신경계표지자에서도세포의 6.9% 에서면역양성을보였으며 (Fig. 1D), GalC 와 MBP ( 희돌기교세포표지자 ) 는각각 5.6% 와 4.7% 를나타냈다. 소교세포표지자인 RCA-1 은면역음성반응을나타냈다 (Table. 3). 2. 성장인자처리에의한 B2A1 세포의면역세포화학적특징 혈청과다양한성장인자로처리된 DM4 무혈청배양액에서배양된 B2A1 세포에대한 Nestin, βtubulin Ⅲ, GFAP, GalC 에양성인세포들은 Fig. 2 와같다. 10% HS, ITS, c-amp, bfgf, PDGF, LIF 또는 PMA 를함유하는배양배지에서배양되면, B2A1 세포의 88~93% 에서 nestin 에면역반응성을보였다 (Fig. 2A). nestin 에양성인세포의비율은 RA 를포함하는배양배지에서약간감소하였다 (70.5%). PDGF, βtubulin Ⅲ 로처리된배양에서 B2A1 세포의 3.8% 가발현하였고, 반면 10% HS, camp, RA, bfgf 로처리된배지에서는더적게 (1.8~2.7%) 발현을했다 (P<0.05). 단지몇몇세포 (0.5% 이하 ) 만이 ITS, LIF, PMA 로처리된배양배지에서 βtubulin Ⅲ 에양성을보였다 (Fig. 2B). camp 나 PDGF 를함유하는배양배지에서배양하면 Table 3. Immunocytochemical expression of B2A1 cells Antigen B2A1 cells Nestin 91.8% NF-L 03.1% βtubulin III 02.7% GFAP 06.9% GalC 05.6% MBP 04.7% RCA-1 - %: proportion of positive immunoreactivity in B2A1 cells -: negative immunoreactivity Table 2. Sequence of PCR primers Gene Sequence (Sense and Antisense) Product size (bp) Nestin 5 -AGT GTG AAG GCA AAG ATA GC TCT GTC AGG ATT GGG ATG GG-3 Notch1 5 -TCA AGG CCC GGA GGA AGA AGT C TCA GGG GAT GGG GTG AGG AAG-3 PDGFRα 5 -CTG TAA CTG GCA GGC TCG GAG GTT GTC TGC AGT ACA AGT TGG CG-3 NF-L 5 -TCC TAC TAC ACC AGC CAT GT TCC CCA GCA CCT TCA ACT TT-3 GFAP 5 -GCA GAG ATG ATG GAG CTC AAT GAC C GTT TCA TCC TGG AGC TTC TGC CTC A-3 MBP 5 -ACA CGG GCA TCC TTG ACT CCA TCG G TCC GGA ACC AGG TGG GTT TTC AGC G-3 G3PDH 5 -CCA TGT TCG TCA TGG GTG TGA ACC A GCC AGT AGA GGC AGG GAT GAT GTT C

(C) βtubulin III, (D) and GFAP. Fig. 2. Multipotential differentiation of B2A1 cells by treatment of growth factors.

5 성숙생쥐뇌로부터다기능신경줄기세포주의확립 김기수외 Fig. 1. Cytologic characteristics of B2A1 cells disclosed bi- or tripolar cells (A) phase contrast microscopy (B) and show immunopositivities for nestin (C) βtubulin III, (D) and GFAP. Fig. 2. Multipotential differentiation of B2A1 cells by treatment of growth factors. Most of all cells were immunopositive for nestin in any culture condition (A). Immunopositive cells for βtubulin III significantly increased in PDGF-contained media (B), while GFAP (C) and galactocerebroside (D) positive cells markedly increased in c-amp or PDGF-contained media

대한척추외과학회지 Vol. 13, No. 4, 2006 GFAP 는 B2A1 세포의 14.7~16.4% 에서발현되었고, 10% HS, ITS, RA, bfgf, LIF 를함유하는배지에서는 4.1~6.9% 에서발현되었다 (P<0.01). GFAP 에대한면역양성반응은 PMA 를함유하는배지에서는 B2A1 세포가 2.2% 에서보였다 (Fig. 2C).

6 대한척추외과학회지 Vol. 13, No. 4, 2006 GFAP 는 B2A1 세포의 14.7~16.4% 에서발현되었고, 10% HS, ITS, RA, bfgf, LIF 를함유하는배지에서는 4.1~6.9% 에서발현되었다 (P<0.01). GFAP 에대한면역양성반응은 PMA 를함유하는배지에서는 B2A1 세포가 2.2% 에서보였다 (Fig. 2C). 10% HS, camp, PDGF 를함유하는배지에서배양되면 B2A1 세포의 5.6~6.8% 가 GalC 에양성인세포들이었고, 4.2~2.9% 는 RA, ITS, bfgf, PMA 함유하는배지에서양성이었다 (P<0.05)(Fig. 2D). 3. Cytokine 처리에의한 B2A1 세포의유전형질적발현 B2A1 세포가초기분열하는신경원, 성상세포, 희돌기교세포뿐만아니라신경줄기세포의발현표지자인지알아보기위해, 다양한 cytokine 으로처리하여배양된세포에서 RT-PCR 을시행했다. 발현된정도는 house keeping 유전자 G3PDH 의발현을대조군으로삼았으며, 그결과는중추신경계의줄기세포혹은초기전구세포표지자 (nestin, Notch1, PDGFα), 신경원표지자인 NF-L, 성상세포표지자인 GFAP, 희돌기교세포표지자인 MBP 가동시에발현되었다 (Fig. 3). 발현의정도가처리된혈청혹은성장인자에대해다양하게보였지만, 유전자형의표지자는상대적으로면역세포화학적표현형질과관련되어있었다. 고 찰 척수손상에서줄기세포의적용은미분화된줄기세포가손상된신경을복원하는데필요한세포로분화되어축삭의재생및목표방향으로성장유도, 신경교성반흔또는낭종의복원등아직까지확인되지않은기전까지의복원과정에기여할것으로기대하고있다. 줄기세포를연구하기위해서는조직이나기관으로부터줄기세포를순수하게분리하고많은세포를얻어야한다. 특정한세포의종류를풍부하게하는방법중의하나는형광활성화된세포분류법 (FACS) 과자기적으로활성화된세포분류법 (MACS) 이다 20). 이러한방법들은세포표면에있는단백에항체가결합하는능력에따라결정되고, 주로조혈계줄기세포를분리하는데에사용된다. 줄기세포를분리시키는다른방법은장기간에걸친배양이다 21,22). 간단히말하면, 중요한조직으로부터세포집단이분리되어배양하며성숙되어줄기세포가증식하고줄기세포의특징을유지할수있게된다. 이러한방법은장간막줄기세포와신경줄기세포의분리에적용되어져왔다. 이연구에서 B2A1 이라명시된신경줄기세포주는성숙생쥐의대뇌로부터추출한세포에서장기간의두단계의배양과정에서생겨났다. 첫단계는희돌기교세포가풍부한분획의일차배양과 1 년이상의기간에걸친계대배양으로부터 B2 세포를생성했다. B2 세포는 10% HS 함유배지에서미성숙신경외배엽세포 23,24) 의주요중간필라멘트단백인 vimentin 에면역양성을나타내는양극혹은삼극형세포의모양을보였다. 혈청이없는배지에서 1mM dbcamp 의존재하에 5 일간배양하여, vimentin, GFAP ( 성상세포의표지자 ), O4 와 GalC ( 희돌기교세포의표지자 ) 에면역양성을보였다. B2 세포는신경원성, 소교세포성, 내피세포에대해서는어느세포특이적인표지자도발현하지못했다. 이러한면역세포화학적인특징은 B2 세포가미성숙신경외배엽세포와신경교전구세포로구성되어있다는것을의미한다. 두번째단계는희석법을사용하여 B2 세포의응집체로부터분리된단일세포배양으로부터 B2A1 세포를생성했다. 고도로정제된양극또는삼극형작은세포들이배양으로부터얻어졌다. 혈청이제거된배지 DM4 16) 에서배양된세포는혈청과성장인자들에의해처리되어면역세포화학과 RT-PCR 에의해검증되었다. B2A1 세포는다음과같은신경줄기세포의여러가지특징이확인되었다. 먼저대부분의세포 (91.8%) 가중추신경계의신경줄기세포에특이적으로발현하는중간필라멘트단백인 nestin 에대해면역양성이었다 25,26,27). 둘째로 B2A1 세포또한신경원, 성상세포, 희돌기교세포표지자에대해양 Fig. 3. Gene expression of cell type specific markers studied by RT-PCR in B2A1 cells. The cells expressed both neural progenitor cell markers (nestin, Notch1, PDGFα) and differentiated cell markers for neurons (NF-L), astrocytes (GFAP), and oligodendrocytes (MBP). The expression levels were variable related to addition of growth factors

7 성숙생쥐뇌로부터다기능신경줄기세포주의확립 김기수외 성면역반응을보였다. 이러한면역세포화학적인특징들은 B2A1 세포가중추신경계에서세포분화에있어서다능성을가진다는것을암시한다. 셋째로, B2A1 세포는 ITS, camp, RA, bfgf, PDGF, LIF, PMA 같은성장인자들투여하에배양된신경세포표지자를유지했다. 신경원성분화는 PDGF 의투여로증가했다. 성상세포분화는 camp 와 PDGF 의투여하에유의하게증가했고, 희돌기교세포는 PDGF 투여하에증가했다. 넷째로 RT- PCR 결과 B2A1 세포에서의유전형의발현은 nestin, Notch1, PDGFRα 에대한 mrna 를발현했다. 현재분자유전학연구에서는많은분자들은배아기신경발달초기단계에서발현된다고한다. 이것들은 Brain1 (Brn1), Numb, NeuroD 그리고 Notch1, Hes1, Presenilin, Sox2 의 effector 같은전사요소를포함한다 28,29,30,31,32). Notch1 은쥐에서뇌실하구역내의원시세포에서발현을했고, 포유류의피질신경발생동안원시세포증식과신경분화의두가지면에서생물학적역할을의미한다 28). PDGFα 발현은주로초기중추신경계발달동안희돌기교세포전구세포에서보인다 33). 최근의연구에서 PDGFα 는쥐의배아기 8.5 일에생후소뇌에발달하고있는과립세포, 성숙쥐의소뇌에있는 Purkinje 세포, 그리고후근신경절세포를발달시키는과정에서뿐만아니라신경판의신경상피세포에서관찰되었다 34). 이러한보고는 PDGF α 가미분화세포, 즉신경원이나교세포로분화할수있는세포에대한또다른표지자라는것을의미한다. 이연구에서 B2A1 세포가 PDGF 에서배양될때, 분화된신경원, 성상세포, 희돌기교세포의증가된분획이있었다. B2A1 세포의세포학적인분화는 PDGFα 의존재하에일어날수있다. 다섯째, NF-L, GFAP, MBP 같은다른분화된신경세포 mrna 가 B2A1 세포에서동정되었다. 이연구에서는 RT-PCR 과면역세포화학적인측면에의한 mrna 발현사이에연관성이있었다. 지금까지쥐에서의다능성신경줄기세포의발생에관한몇가지연구가있었다. 중추신경계에서기원한불멸의신경전구세포주는 retroviral vector 를사용하여 NGF 를분비하는세포를만들기위해서발생되었다 35). 다른신경세포주는성숙생쥐의대뇌로부터 flow cytomery 에의해얻었고, 신경, 비신경세포를발생시키는능력에대해연구했다 36). 다른다능성신경전구세포 (2Y6f1) 는성숙 p53-/- 쥐의소뇌로부터만들었다 37). 본연구의 B2A1 세포는지금까지보고되었던종양유전자를이용하거나, 유전자를조작하여확인된신경줄기세포와달리정상적인생리조건하에성숙생쥐의대뇌로부터장기간의일차배양으로부터신경줄기세포를얻었다는것은커다란의미가있어신경줄기세포생물학을연구하는데에유용할것으로사료된다. 임상적의 의는향후중추신경계내의손상된축삭의해부학적및기능적회복을위해성인다기능줄기세포주를적용할수있는근거를제시하는바이며, 인간신경계발달을유도하는인자의확인또는약제의개발등에응용될수있으리라사료된다. 결 론 B2A1 세포는성숙대뇌로부터수립된신경줄기세포주로서, 이들세포는각종성자인자들에의하여신경원. 별세포및희돌기교세포로분화될수있음을확인할수있었다. 참고문헌 01) Bartlett PF, Brooker GJ, Faux CH et al: Regulation of neural stem cell differentiation in the forebrain. Immun Cell Biol 1998;76: ) Brustle O, Spiro AC, Karram K, Choudhary K, Okabe S, McKay RD: In vitro-generated neural precursors participate in mammalian brain development. Proc Natl Acad Sci USA 1997;94: ) Flax JD, Aurora S, Yang C et al: Engraftable human neural stem cells respond to developmental cues, replace neurons, and express foreign genes. Nat Biotechnol 1998;16: ) Thomoson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS et al: Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998;282: ) Shamblott MJ, Axelman J, Wang S et al: Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95: ) Davis AA, Temple S: A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature 1994 ;372: ) Gage FH: Mammalian neural stem cells. Science 2000;287: ) Kuhn HG, Dickinson-Anson H, Gage FH: Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. J Neurosci 1996 ;16: ) Kukekov VG, Laywell ED, Suslov O et al: Multipotent stem/progenitor cells with similar properties arise from

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9 성숙생쥐뇌로부터다기능신경줄기세포주의확립 김기수외 of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev 1996;10: ) Andrae J, Hansson I, Afink GB, Nister M: Plateletderived growth factor receptor-alpha in ventricular zone cells and in developing neurons. Mol Cell Neurosci 2001;17: ) Martinez-Serrano A, Lundberg C, Horellou P et al: CNS-derived neural progenitor cells for gene transfer of nerve growth factor to the adult rat brain: complete rescue of axotomized cholinergic neurons after transplantation into the septum. J Neurosci 1995;15: ) Rietze RL, Valcanis H, Brooker GF, Thomas T, Boss AK, Bartlett PE: Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature 2001;412: ) Ohkawara B, Okuno M, Ishii T, Horiuchi M, Tomooka Y: Characterization of a multipotent neural progenitor cell line cloned from an adult p53-/- mouse cerebellum. Brain Res 2003;959: 국문초록 연구계획 : 성숙생쥐대뇌로부터다기능신경줄기세포주의확립연구목적 : 성숙한실험동물의뇌조직으로부터다능성줄기세포를생성하기위해 B2 세포로부터복제세포주를확립하였으며, 이를 B2A1 세포라명명하였고, 이세포가신경줄기세포주의특성을가지는지조사하였다대상및방법 : 실험동물은생후 12~16주된 BALB/c 용생쥐를사용하였다. 대뇌를적출하여잘게부수고단백분해효소를처리하여각각분리된세포를만든후 percoll을이용한밀도구배원심분리법을이용하여희돌기교세포 / 별세포분획을분리하여일차배양하였다. 미분화된소세포를분리하여 6개월이상에걸쳐 25회계대배양하면서 2차례에걸쳐최대한희석시켜단일세포를배양하였다. 단일세포배양으로부터증식된하나의세포군 (B2A1세포) 을분리하였고, B2A1세포는면역세포화학적염색과 RT-PCR법을통하여동정하였다. 결과 : B2A1세포는면역세포화학적으로 90% 이상에서 nestin에양성으로염색되어신경줄기세포임을확인할수있었고, 그외에NF-L, β-tubulin Ⅲ, GFAP, MBP, Ga1C에양성으로염색되었다. 그리고 B2A1세포에각종성장인자를투여하여관찰한결과 nestin 양성세포는약 90% 로동일하였다. 또한이들성장인자투여에인한 RT-PCR결과 B2A1 세포에서는 nestin, PDGFRα, Notch1, NJ-L, GFAP, MBP에대한mRNA가다양하게발현되었다. 결론 : B2A1세포는성숙대뇌로부터수립된신경줄기세포주로서, 이들세포는각종성장인자들에의하여신경원, 별세포및희돌기교세포로분화될수있음을확인할수있었다. 색인단어 : 신경줄기세포, B2A1 세포, 성숙생쥐대뇌 통신저자 : 최용수광주광역시남구양림동 264 광주기독병원정형외과 Tel: Fax: stemcellchoi@yahoo.co.kr

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Æ¯ÇãÃ» '' - 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - ' - 6 - - 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - Super-Bio Co., Ltd. KWON, Suk-Tae Thermostable DNA Polymerase-encoding Gene from Thermus sp. X-1 an d Amino Acid Sequence