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범석 경
5 years ago
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1 한방비만학회지제 18 권제 2 호, 2018 J Korean Med Obes Res 2018;18(2): pissn , eissn JKOMOR Original Article 소금첨가에따른도라지발효특성과미생물변화및항비만효능평가 신나래 임수경 김호준 동국대학교한의과대학한방재활의학교실 Effect of Platycodon grandiflorum Fermentation with Salt on Fermentation Characteristics, Microbial Change and Anti-obesity Activity Na Rae Shin, Sokyoung Lim, Hojun Kim Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Dongguk University Received: November 2, 2018 Revised: November 30, 2018 Accepted: November 30, 2018 Correspondence to: Hojun Kim Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, Dongguk University Ilsan Oriental Hospital, College of Korean Medicine, Dongguk University, 27 Dongguk-ro, Ilsandong-gu, Goyang 10326, Korea Tel: Fax: kimklar@dongguk.ac.kr Copyright 2018 by The Society of Korean Medicine for Obesity Research Objectives: This study investigated the effect on microbial ecology, fermentation characteristics and anti-obesity of Platycodon grandiflorum (PG) fermentation with salt. Methods: PG was fermented for four weeks with 2.5% salt and the characteristics of fermented PG were performed by measuring ph, total sugar content, viable bacteria number and microbial profiling. Also, we measured total polyphenol, flavonoid and the percent of inhibition of lipase activity and lipid accumulation. Results: Salt added to PG for fermentation had an effect on ph, total sugar, total and the number of lactic acid bacteria. Total sugar and ph were reduced and number of total and lactic acid bacteria were increased after fermentation. The majority of bacteria for fermentation were Lactobacillus plantarum, Leuconostoc psedomesenteroides and Lactococcus lactis subspecies lactis regardless of salt addition. However, microbial compositions were altered by added salt and additional bacteria including Weissella koreensis, W. viridescens, Lactobacillus sakei and Lactobacillus cuvatus were found in fermented PG with salt. Total flavonoid was increased in fermented PG and lipid accumulation on HepG2 cells treated with fermented PG was reduced regardless of salt addition. Moreover, fermented PG without salt suppressed lipase activity. Conclusions: Addition of salt for PG fermentation had influence on fermentation characteristics including ph and sugar content as well as number of bacteria and microbial composition. In addition, fermented PG showed anti-obesity effect by increasing flavonoid content and inhibition of lipase activity and lipid accumulation. Key Words: Platycodon grandiflorum, Fermentation, Salts, Lactic acid bacteria, Anti-obesity agents 서론 도라지 (Platycodon grandiflorum) 는초롱꽃과로길경 ( 桔梗 ), 경초 ( 梗草 ), 백약 ( 白藥 ), 고경 ( 苦梗 ), 이여 ( 利如 ) 로불리며, 식용으로이용되는한약재로 saponin과 platycodin A, C, D와 inulin, betulin 등이함유되어있다고알려져있다 1). 한방에서는거담배농 ( 祛痰排膿 ), 선폐이인 ( 宣肺利咽 ) 과같은염 증성호흡기치료에사용되고소갈 ( 消渴 ) 같은당뇨증상과장명 ( 腸鳴 ) 과같은증상에처방되는약재이다 2). 비록도라지가호흡기치료약재로사용되었지만현대약리연구를통해비만흰쥐를이용한도라지추출물의항비만효능이검증되었다 3). 발효는식품속의당을기반으로세균과곰팡이, 효모등의미생물이다양한기질들을대사하면서건강에유익 64

2 신나래외 : 소금첨가에따른도라지발효특성과미생물변화및항비만효능평가 한산물을생성하는것을의미한다. 식품발효에주로사용되는유산균은유기산을생성하여부패균과식중독균의생장을저해시켜오랜기간식품보관에안전성을주는역할을한다 4). 따라서발효를통해식품의안전성을높이고효능을증진시키는다양한연구들이시도되고있다. 하지만식품에비해한약은표준화공정이나질을평가하는데부족하며약물로서사용되므로타약물과의상호작용및개인차등의문제점을가지고있다 5). 따라서최근에는발효한약을개발함으로써약효성분의체내흡수율과생체이용률을높이고자하는연구가다수수행되었다. 발효한약은주로항산화, 항암, 항비만, 알레르기억제효과등의연구가진행되었고 6) 곰팡이, 세균, 효모와같은미생물을넘어버섯균사체등을이용한발효한약제조에대한연구도진행되고있다 7). 도라지를이용하여발효한연구도다수수행되었으며, 그예로곰팡이인 Aspergillus oryzae와함께발효시켰을때항산화활성증진및 3T3-L1 세포에서지방세포에서의지방축적감소가보고되었다 8). 또한도라지와효모를함께발효시켜혈관내피세포에서세포성장을촉진시켜혈관의안정성과이동을촉진시킨연구가보고되었고 9) 식품연구로젖산균과도라지당추출을함께발효한후항산화활성과관능평가를실시하여식품산업에의사용가능성을평가하였다 10). 우리나라전통발효식품에있어서김치, 막걸리, 된장등은발효중특성과미생물변화, 스타터로의활용가치에대한연구가다수수행되었다 4). 하지만대부분의도라지발효연구들은기존에알려진유산균이나효모, 곰팡이를이용한연구가진행되었고자연발효되었을때미생물의분포나발효전후에따른연구가미미한실정이다. 따라서자연발효를통해도라지에잘적응하는균주들에대한연구또한필요하다. 더불어김치와된장같은전통발효식품에는소금을첨가하여발효를시킨다. 특히김치에서소금은발효과정중미생물의생육을조절하고삼투압작용으로유해한미생물을사멸시키며내염성이있는미생물을생육시키는역할을한다 11). 따라서본연구는소금을첨가한도라지를자연발효시키는동안이화학적특성과미생물학적인변화를모니터링함으로써스타터로서의가능성이있는균주들을선발하고, 나아가발효에따른항비만효능을검증하여활성을증진시킨발효한약을개발하고자하였다. 재료및방법 1. 도라지발효 본실험에사용한도라지는충북충주에서생산된생도라지 (Bburi-maeul, Chungju, Korea) 를사용했다. 도라지의불필요한부분을제거하고세척한후분쇄하여발효에사용했다. 발효를위해 1 kg의도라지를대조군으로사용했고소금첨가그룹은 2.5 g/kg의소금농도로소금을첨가하여옹기에담았으며통풍이잘되고서늘한곳에 4주동안발효시켰다. 발효기간동안매주 100 g씩채취하여 -80 에보관한뒤시료로사용하였다. 2. ph 측정발효정도를분석하기위해 ph를측정하였다. 이를위하여 1 g 시료를 9 ml의 0.85% NaCl로희석한후, ph 미터 (Thermo Scientific, Beverly, MA, USA) 를이용하여측정하였다. 3. 총당의함량측정발효중의도라지의당함량변화를측정하기위해페놀-황산법을이용하여총당함량을측정했다. 즉발효샘플을 saline으로 100배희석한후희석한샘플 2 ml에 5% 페놀 1 ml를첨가한후혼합하였다. 그후 95% 황산을 5 ml 첨가한후 30분동안실온에방치하였다. 총당의함량은 470 nm에서흡광도 (Spectramax Plus, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 를측정하였으며, 총당함량을정량하기위해포도당을표준물질로사용했고표준곡선을작성하여총당함량을환산하여표시하였다. 4. Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) 분석발효도라지의미생물은 PCR-DGGE를이용하여분석하였다. 매주얻은시료는 PowerFood TM Microbial DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories Inc., Carlsbad, CA, USA) 를사용하여 genomic DNA를추출하였다. PCR-DGGE는기존연구방법에따라분석하였다 12). Total DNA 는미생물의 16s rrna gene primer인 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') 와 1492R (5'-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3') 을이용하여 nested-pcr을시행하였다. PCR 산물은 1.5% 아가로스젤 (agarose gel) 에전기영동하여 PCR 산물의크기 65

3 한방비만학회지제 18 권제 2 호, 2018 를확인한후약 1.5 kb에서증폭된밴드만잘라 Accuprep gel purification kit (QIAGEN, Hilden, Germany) 를사용하여 PCR 산물을정제하였다. 2차 PCR은 GC clamp가부착된 GC338F (5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3') 와 518R (5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3') 를사용하여 PCR 산물을증폭하였다. PCR-DGGE는 D Code universal mutation detection system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 을사용하여분석을수행하였다. Denaturing gradients는 30~60% 로농도구배가연속적으로형성된젤을제작하여사용하였다. 제작된젤에 2차 PCR 산물을로딩하고 1X Tris-acetate-EDTA buffer (60 ) 에서 20 V로 30분을전기영동한후 60 V로 13시간을전기영동하였다. 전기영동이종료된젤은 ethidium bromide로염색시킨후 UV illumination (LAS-3000; Fuji photo film, Tokyo, Japan) 을사용하여밴드를확인하였다. 5. DGGE fragment DNA 추출 PCR-DGGE를통해분리된각 DNA 밴드의염기서열을분석하고동정하기위해각위치의밴드를자른후 tube에옮겨 Gel & PCR Purification System (BioFACT Co., Ltd., Daejeon, Korea) 의 protocol을변형하여수행했다. 잘라진 gel 무게의 3배의 UB를첨가한다음 4 에서 overnight으로배양후다음과정은 BioFACT Co., Ltd. 에서제공한방법과같은방법으로 DNA를정제했다. 정제된 DNA의염기서열분석은 Macrogen Inc. (Seoul, Korea) 에의뢰하였으며, 분석된염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 에서 BLAST ( 분석하여동정했다. 6. 미생물생균수분석세균수를분석하기위해시료는각각 2 g씩 18 ml 0.85% NaCl 로혼합후균질화한다음, 균질액 1 ml를 9 ml 0.85% NaCl로희석하였다. 총세균수는 Tryptic Soy Agar (TSA) 배지 (Difco, Detroit, MI, USA) 를, 유산균은 de Man, Rogosa and Sharpe (MRS) agar 배지 (Difco, Detroit, MI, USA) 를이용해분석했다. 희석한시료는 100 μl씩 TSA와 MRS 배지에분주하여도말한후 37 에서 48시간배양했다. 생균수는생성콜로니개수는 colony forming units (CFU)/g 으로나타냈다. 7. 미생물분리및동정 TSA와 MRS agar plate에서자란콜로니중무작위로 20개씩선발하여순수배양하였다. 미생물의분류는이전연구에서사용된방법에따라수행하였다 12). 순수분리한미생물은 random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction (RAPD-PCR) 을이용하여균주를분류하였다. RAPD-PCR을위하여 M13 primer (5 -GAG GGT GGC GGT TCT-3 ) 를사용했고 PCR은 94 에서 5분간반응시킨후 94 에서 1분, 45 에서 20초, 72 에서 2분의반응을총 30회수행한후 72 에서 10분간최종신장하였다. PCR 산물은 2% agarose gel에로딩한후 100 V에서 3분, 50 V에서 2시간동안전기영동한후 UV illumination (LAS- 3000; Fuji photo film) 을사용하여밴드를확인하였다. 밴드패턴이비슷한균주를그룹으로나눈다음 Genomic DNA를추출하였고 DNA의염기서열분석은 Macrogen Inc. (Seoul, Korae) 에의뢰하였으며, 분석된염기서열은 NCBI 에서 BLAST 분석하여동정하였다. 8. 총폴리페놀및총플라보노이드함량총페놀함량 (total polyphenol) 을분석하기위해시료는 13,000 rpm에서 5분간원심분리한후상등액을얻어사용하였다. 2% Na 2CO 3 1 ml에시료 50 μl, 50% Folin-Ciocalteu s phenol reagent (Sigma, Louis, MO, USA) 50 μl를혼합한후실온에서 10분간반응시킨후 720 nm에서 UV ELISA microplate reader (Spectramax Plus, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 를이용해흡광도를측정하였다. Gallic acid를표준물질로사용하여표준곡선을작성한후총폴리페놀함량을환산하였다. 총플라보노이드 (total flavonoid) 함량은시료 500 μl에 5% NaNO2 300 μl를혼합하여 5분간반응시킨후 10% AlCl3 300 μl를혼합하여 5분간반응시킨후에 1 M NaOH 2 ml로반응을정지시킨후 570 nm 에서흡광도를측정하였다. Quercetin을표준물질로사용하였고표준곡선을작성하여총플라보노이드함량을환산하였다. 9. Lipase 저해활성 Lipase 활성을분석하기위해시료는 13,000 rpm에서 5분간원심분리한후상등액을얻어사용하였다. Lipase from pocine pansreas Type II (Sigma, Louis, MO, USA) 를 10 mg/ml 농도로용해시킨후 16,000 rpm에서 5분동안원심 66

4 신나래외 : 소금첨가에따른도라지발효특성과미생물변화및항비만효능평가 분리시킨후상등액을효소액으로사용하였다. 기질은 3 mm p-nitrophenyl-dodecanoate를 5 mm sodium acetate buffer (ph 5.0) 에 1% triton X-100을첨가하여 100 에서 2분동안용해시킨후 37 에서식혀서기질로사용하였다. 50 μl 샘플에 100 μl lipase 효소액과 150 μl 100 mm tris-hcl buffer (ph 5.0) 를넣어서준비한후 100 μl 기질을첨가하여 37 에서 2시간동안배양하였다. 배양액은 10,000 rpm 에서 1분동안원심분리한후상층액을따서 420 nm에서흡광도를측정하였다. 10. 간세포배양및 Oil red O 염색사람에서유래한간암세포주인 HepG2 세포는 ATCC (Manassas, VA, USA) 에서분양받아사용하였다. 세포는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 에 10% fetal bovine serum (FBS) 과 1% Penicillin/Streptomycin solution (P/S) 을첨가한배지에배양하였다. 6 well platedp cells/well의양으로 seeding한후 37, CO 2 배양기에 24 시간배양하였다. 1 mm free fatty acid (Oleic acid:palmitic acid=2:1) 와 30% 에탄올로추출한추출물을 100 mg/ml의농도로처리한후 24시간배양한뒤 Oil red O 염색으로간세포에축적된지방량을측정하였다. Oile red O 염색은배양된세포를 phosphate-buffered saline (PBS) 로 3번씻어낸후 4% formalin에 5분간배양한후다시버리고 2시간동안세포를고정시켰다. 고정된세포는 60% isopropanol로씻어낸후 Oil red O solution을분주한후 10분동안배양한뒤염색된세포는물로 4번씻어낸후 100% isopropanol로염색된 Oil red O를녹인후 520 nm에서흡광도를측정하였다. 결과 1. ph 및총당함량변화 발효의정도는 ph와총당함량을이용하여분석했다. 도라지발효중소금의첨가유무가결과에차이를나타냈다. 발효전도라지의 ph는 5.86, 소금첨가도라지의 ph는 5.57이고, 발효 1주일후도라지는 4.14인반면소금첨가도라지는 4.4로 ph가더높은것으로나타났다. 매주 ph를측정하였고, 대조군은발효 4주일후 ph 4.09까지내려갔으며소금첨가도라지는발효후 ph 3.94로더낮은 ph를보였다 (Fig. 1A). 총당함량변화에도소금첨가유무에따른차이를보였는데, 발효후 1주까지는소금첨가유무에따른차이는없이감소했고, 3주후부터도라지의총당함량이유의하게더감소되었으며 4주발효후최종총당함량은각각 109.5와 mg/g으로소금첨가도라지에서약 2배정도높은총당함량을보였다 (Fig. 1B). 따라서도라지는발효중 ph와당함량모두감소시켰으며, 특히소금첨가도라지에서총당함량의감소가더디게나타는것을확인했다. 11. 통계분석모든측정값은 3번반복하여측정하였고평균값 (mean) 과표준오차 (Standard Error of the Mean) 로나타냈으며, 각실험군간의통계분석은 Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) 를사용하였고 one-way analysis of variance (ANOVA) test 혹은 Student t-test를통해시행했다. 실험결과의통계적인유의성은 P-value 가 0.05 이하인경우에유의한것으로인정했다. Fig. 1. Change (A) ph and (B) total sugar of Platycodon grandiflorum during fermentation with and without salt. Data are expressed as means±standard Error of the Mean (SEM). *P<0.05; ***P<0.001 vs. control. 67

한방비만학회지제 18 권제 2 호, 2018 2. 미생물의생균수변화발효에관여하는미생물수의변화를비교하기위해총세균과유산균의생균수를측정했다. 총세균수와유산균수는발효전소금첨가유무에따른차이는보이지않았다.

유산균분석에서도발효 1주후소금첨가도라지에서유의하게균수가증가되었고, 최종 4주후에도유의하게증가되었다 (Fig. 2B). 소금첨가유무에상관없이도라지발효중유산균도상당수증가되었다. 3.

발효전나타났던 Uncultured Chroococcidiopsis species, Rhizobium tropici 균주는발효가진행됨에따라미생물의상대적인분포도가줄어들었다.

plantarum과 Leu. pseudomesenteroides, Lc. lactis subsp. lactis는발효전부터약하게존재했고발효가진행됨에따라그분포가증가되었다.

Enterobacteriaceae bacterium이눈에띄게증가했다 (Fig. 3, Table 1). 도라지발효는 Lactobacillus 와 Weilssella와같은유산균이주요발효미생물로관찰되었다. 4.

2. Changed viable cells of (A) total bacteria and (B) Lactic acid bacteria during Platycodon grandiflorum fermentation with and

5 한방비만학회지제 18 권제 2 호, 미생물의생균수변화발효에관여하는미생물수의변화를비교하기위해총세균과유산균의생균수를측정했다. 총세균수와유산균수는발효전소금첨가유무에따른차이는보이지않았다. 하지만총세균수에서발효 1주후소금첨가도라지에서유의하게증가하였고 2주후에는도라지에서유의적으로증가하였으며, 마지막 4주후다시소금첨가도라지에서유의하게높은총세균수를보였다 (Fig. 2A). 유산균분석에서도발효 1주후소금첨가도라지에서유의하게균수가증가되었고, 최종 4주후에도유의하게증가되었다 (Fig. 2B). 소금첨가유무에상관없이도라지발효중유산균도상당수증가되었다. 3. 미생물의분포변화발효중미생물분포의변화를보기위해 PCR-DGGE 분석을하였다. 그결과전체적인미생물의분포는발효 전그리고발효 1주후로구분되었으며 1주후부터발효기간이지남에따른변화는크게나타나지않았다. 발효전나타났던 Uncultured Chroococcidiopsis species, Rhizobium tropici 균주는발효가진행됨에따라미생물의상대적인분포도가줄어들었다. 소금첨가유무에상관없이 Lactobacillus plantarum, Leuconostoc pseudomesenteroides와 Lactococcus lactis subsp. lactis가공통적으로발효중증가되었다. 특히 L. plantarum과 Leu. pseudomesenteroides, Lc. lactis subsp. lactis는발효전부터약하게존재했고발효가진행됨에따라그분포가증가되었다. 또한소금첨가도라지에서는더다양한미생물들이발효에관여했는데 Weissella koreensis, Weissella viridescens, Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus, Uncultured Enterobacteriaceae bacterium이눈에띄게증가했다 (Fig. 3, Table 1). 도라지발효는 Lactobacillus 와 Weilssella와같은유산균이주요발효미생물로관찰되었다. 4. 유산균의분리및동정 DGGE로분석한미생물을분리하기위해총 200종의미생물을순수분리했고, RAPD-PCR로그룹을나누어총 18종의미생물그룹을동정하였다. 그결과, 가장진한밴드를보였던 L. plantarum이가장많이동정되었고, 또한 Fig. 2. Changed viable cells of (A) total bacteria and (B) Lactic acid bacteria during Platycodon grandiflorum fermentation with and without salt. Data are expressed as means±sem. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 vs. control. Fig. 3. Bacteria profile by Denaturing gradient gel electrophoresis during Platycodon grandiflorum fermentation with (C0-C4) and without salt (S0-S4). The meaning of each number is shown in Table 1. C: control, S: salt. 68

6 신나래외 : 소금첨가에따른도라지발효특성과미생물변화및항비만효능평가 Table 1. Identification of Bacteria on DGGE Band No. Discription Ident (%) 1 Weissella koreensis 98 2 Weissella viridescens 98 3 Lactobacillus plantarum 99 4 Weissella viridescens 99 5 Leuconostoc pseudomesenteroides 98 6 Lactobacillus sakei 98 7 Lactobacillus curvatus 95 8 Lactococcus lactis subsp. lactis 97 9 Uncultured Enterobacteriaceae bacterium Uncultured Enterobacteriaceae bacterium Rhizobiumtropici Rhizobiumtropici Wimmerella hederacea Weissella viridescens Lactobacillus plantarum Uncultured Chroococcidiopsis sp Lactobacillus plantarum Lactococcus lactis subsp. lactis Wimmerella hederacea 97 Porterellacarnosula Lobelia thuliniana DGGE: denaturing gradient gel electrophoresis, subsp: subspecies, sp: species. Table 2. Identification of Isolated Bacteria from Fermented Platycodon grandiflorum Name Description Ident (%) 1-1T Lactobacillus plantarum T Lactobacillus plantarum T Lactobacillus plantarum 100 S1-3T Lactobacillus curvatus 99 S1-4T Lactobacillus sakei 99 S2-1T Lactobacillus plantarum 99 S2-2T Lactobacillus plantarum 99 S2-9T Lactobacillus sakei 98 S3-1T Pseudomonas fluorescens 97 S4-6T Lactobacillus plantarum 99 1M-1-1 Leuconostoc mesenteroides 95 1M-2-3 Lactobacillus brevis 96 1M-2-12 Lactobacillus plantarum 91 1M-4-3 Lactobacillus plantarum 97 1M-4-6 Lactobacillus plantarum 97 1M-S1-2 Lactobacillus curvatus 95 1M-S-1-3 Lactobacillus plantarum 97 1M-S4-5 Lactobacillus plantarum 96 Leu. pseudomesenteroides는분리되지않았지만 Leuconostoc mesenteroides가분리되었고, 그외에도 DGGE 밴드에나타난 L. sakei와 L. curvatus 도분리되었다. 그외에도 Pseudomonas fluorescens와 Lactobacillus brevis가추가적으로분리되었다 (Table 2). 5. 총폴리페놀및총플라보노이드함량발효중활성물질들의변화를보기위해총폴리페놀및총플라보노이드함량을측정하였다. 총폴리페놀함량은소금첨가유무에상관없이발효전후에따른차이는보이지않았다 (Fig. 4A). 반면총플라보노이드함량은발효전후로유의한차이를보였다 (P<0.05). 도라지발효전 1.11 mg/g에서발효 4주후 2.10 mg/g으로증가하였고, 소금첨가도라지는발효전 1.53 mg/g에서 3.04 mg/g으로증가하였다 (Fig. 4B). 따라서도라지발효는소금첨가유무에상관없이총플라보노이드함량은증가시켰으나, 총폴리페놀의함량에는변화가없었다. Fig. 4. Content (mg/g) of (A) total polyphenol and (B) flavonoid before and after fermentation of Platycodon grandiflorum with and without salt. Data are expressed as means±sem. *P<0.05 vs. control. 69

한방비만학회지제 18 권제 2 호, 2018 6. Lipase 저해활성 도라지발효전후에따른지방가수분해에미치는영향을측정하기위해 lipase 저해활성을측정했다. 그결과발효전에도 lipase 활성을억제시켰고, 특히대조군인도라지에서발효전과비교했을때발효후 lipase 저해활성이유의하게증가했다 (P<0.05).

하지만도라지발효후소금첨가유무에상관없이지방산흡수가약물을처리하지않은대 Fig. 5. Lipase inhibition of extracted Platycodon grandiflorum of before and after fermentation. Data are expressed as means±sem. *P<0.05 vs. control. Fig. 6.

7 한방비만학회지제 18 권제 2 호, Lipase 저해활성 도라지발효전후에따른지방가수분해에미치는영향을측정하기위해 lipase 저해활성을측정했다. 그결과발효전에도 lipase 활성을억제시켰고, 특히대조군인도라지에서발효전과비교했을때발효후 lipase 저해활성이유의하게증가했다 (P<0.05). 반면소금을첨가한그룹에서도발효후그값이증가했지만유의한차이는보이지않았다 (Fig. 5). 따라서도라지는발효후지방가수분해효소의활성저해를증가시켰다. 7. 간세포에서의지방축적억제효과 간세포에서도라지발효에따른지방억제능을평가하기위해 HepG2 세포에유리지방산을처리하여지방의축적을관찰했다. 발효전에도지방축적값이감소했지만, 유의한차이는없었다. 하지만도라지발효후소금첨가유무에상관없이지방산흡수가약물을처리하지않은대 Fig. 5. Lipase inhibition of extracted Platycodon grandiflorum of before and after fermentation. Data are expressed as means±sem. *P<0.05 vs. control. Fig. 6. Oil red O staining for HepG2 cells of extracted Platycodon grandiflorum of before and after fermentation. Data are expressed as means±sem. *P<0.05; **P<0.01; vs. control. FFA: free fatty acid, w: weeks. 조군과비교하여유의하게감소했다 (P<0.05). 특히도라지만발효했을때더유의한차이를보였다 (Fig. 6). 고찰 발효식품에대한관심이커지면서기존식품발효이외에도한약을발효시켜효능을평가하는연구들이다수수행되고있다. 한약을발효하기위해사용되는미생물은세균에서는 Bacillus, Bifidobacterium과 Lactobacillus를, 곰팡이에서는 Aspergillus, 효모중에는 Saccharomyces를이용하고주로식품유래의미생물을이용하고있다 7). 대표적인예로 Lactobiacillus를이용하여쌍화탕과방풍통성산을발효시켜혈소판응집억제효능과항산화활성및항균활성을평가한연구가수행되었다 5,6). 하지만한약재를자연발효시켜효능을검증하는연구는아직미미하다. 따라서본연구에서한약재인도라지를자연발효시킴으로써이화학적인변화와미생물학적인변화를분석하였고발효전후에따른비만에미치는영향을평가하였다. 발효식품에서소금은유해균을억제시키고내염성을가지는유산균의생육을증진시키는역할을한다. 이를위해도라지에 2.5% 의소금을첨가하여대조군과비교하였다. 도라지발효에사용된소금의농도는같은식물성발효식품인김치발효를위해사용하는농도로맞추어사용하였다 11). 도라지는발효 1주일후, ph는발효전보다각각대조군에서 4.14, 소금첨가군은 4.40으로떨어졌고총당함량은발효전보다각각대조군에서 190 mg/g, 소금첨가군은 182 mg/g씩떨어졌다. 총세균수는발효후대조군은 log 1.9 CFU/g, 소금첨가군은 log 1.9 CFU/g씩급증했고, 유산균수도발효후대조군은 log 3.6 CFU/g, 소금첨가군은 log 5.1 CFU/g씩증가했다. 유산균은주로당을주요탄소원으로사용하여생장하며발효에영향을준다. 기존연구에서전통발효식품중김치는발효전 ph가 5.0에서발효 10일후 ph 4.0~3.7 정도로내려갔다 13). 도라지역시 ph나총당의함유를볼때발효가진행되었다고사료된다. ph 변화에있어서소금첨가유무에따른차이는크게나지않았지만총당햠량은유의한차이가나타났는데소금이발효속도조절에도상당한역할을했을것이다. 당은젖산균과초산균에의해젖산과초산으로변하게되고 ph가낮아진다. 그중초산은효모에의해알코올이되면 70

8 신나래외 : 소금첨가에따른도라지발효특성과미생물변화및항비만효능평가 ph는유지되지만, 당함량이감소될수있다 14). 대표적인젖산발효인김치의 ph는 4.0~3.7 정도로내려갔지만 13), 초산균은젖산균에비해식품의 ph를더낮춘다고보고되었다. 초산균종류에따른식초의품질을평가한연구에서도모든초산균이 ph를 3 이하로낮추었다 15). 비록본연구에서초산과효모의분포에대한연구는수행하지않았지만, 소금첨가도라지에서는초산균이 ph를낮추는역할을하였을것으로사료되고, 대조군에서효모는알코올을생성하면서 ph의변화없이총당함량을감소시켰을것으로사료된다. 추후이를규명하는연구가더필요할것이다. 소금첨가유무에따라총세균과유산균수도발효 1주후유의하게차이를보였는데이러한변화도발효속도에영향을주었다고사료된다. 소금첨가유무에따른도라지의발효과정중전체미생물의조성을비교하기위하여 PCR-DGGE를수행했다. PCR-DGGE는배양하기어려운미생물로부터 DNA를추출하여 PCR로증폭함으로써비교적 DNA 양이적어도미생물의군집과다양성을분석할수있는기술로사용되고있다 16). 발효전 Uncultured Chroococcidiopsis sp, Rhizobium tropici 균주가발견되었다. Chroococcidiopsis sp는광합성하는남세균 17) 으로 Rhizobium은질소고정세균으로알려져있으며 18), 인체에미치는영향에대한연구는되어있지않았다. 하지만발효중증식한 Lactobacillus 와 Leuconostoc, Lactococcus는프로바이오틱스로건강에유익한영향을주는균주로보고되었다 19). L. plantarum과 Leu. psedomesenteroides, Lc. lactis subsp. lactis는소금첨가유무에상관없이발효중증가했다. 한약발효연구중삼정환을이용한자연발효연구에서비록 L. brevis가우점종으로나타났지만 L. plantarum과 Lc. lactis subsp. lactis도발효중증가했다 11). 발효시킨약재에차이는있지만식물유래의약재발효에는 L. plantarum과 Lc. lactis subsp. lactis와같은미생물들이발효에영향을주는것으로생각된다. 반면소금첨가로 W. koreensis, W. viridescens, L. sakei, L. cuvatus와같은균주는추가적으로증가되었다. 위의균주들의영향으로총당함량과 ph 등의지표성분에영향을준것으로사료된다. W. koreensis, L. sakei와같은균주이외에도 Lue. mesenterodes는발효도라지에서순수분리된균주로기존연구에서도김치발효중생성되었다 20). 김치는발효중소금에의해자라는생균수나미생물의패턴에도영향을미쳤으며 11), 본연구결과에서도소금에의해발효 중성장하는미생물의분포와생균수에도영향을주었을것이다. 도라지는발효동안생리활성물질의함량에도변화를주었다. 특히총플라보노이드함량은소금첨가유무에상관없이유의하게증가되었다. 페놀화합물은과일채소와같은식물성식품에존재하며항산화활성및암과관련된산화스트레스억제에역할을하고있다. 유산균은이런페놀화합물을 decarboxylase나 reductase와같은효소에의해 caffeic acid는 vinyl catechol이나 ethyl catechol 로대사한다. 또한유산균은 tannic acid와 methyl gallate와같은식물유래페놀화합물을 tanase에의해 gallic acid로대사한다 21). 도라지발효동안총플라보노이드함량증가는미생물들에의해큰분자로있던플라보노이드가분해되어그함량이증가된것으로예상된다 21). 항비만제는식욕억제와대사활성증진, 지방흡수를억제하는기전에따라분류된다. 그중지방흡수억제기전은장에서지방을분해하는효소인 lipase의활성을억제시켜장에서지방이흡수되지않고몸밖으로배출시키는것이다 22). 도라지는발효후지방을분해하는 lipase의저해효과를증진시켰다. 이런효능은발효도라지를섭취했을때장내에서지방의분해가억제되어체외로배출되는데도움을줄것으로기대한다. 또한간세포에서유리지방산으로비알코올성간염을유발한모델에서도도라지발효후간내지방축적이억제되었고이런발효도라지의효능은비만치료와예방에도움을줄수있을것이다. 한방에서도라지는호흡기치료에사용되었지만 2) 기존연구중에는호흡기질환이외에도비만과같은대사질환에대한연구도수행되었다. 나아가곰팡이와효모, 세균과같이다양한미생물을이용한발효연구및효능평가에대한연구들도수행되었다. 하지만도라지에잘정착하여성장하며효능을증진시킬수있는발효에대한연구는미미한실정이다. 본연구는자연발효를통해도라지에잘적응하는균주들을조사하였고이를통해도라지발효에활용할수있는미생물의정보를제공할수있을것으로사료된다. 또한도라지발효전후효능을비교해봄으로써 lipase의활성억제나간세포의지방축적억제와같은항비만효능에활성을나타냈다. 비록도라지발효에소금첨가는 ph와총당함량, 총세균수와유산균수, 미생물의조성에영향을주었지만, 총플라보노이드함량과 71

9 한방비만학회지제 18 권제 2 호, 2018 lipase 저해활성에는발효후소금첨가로효능을감소시켰다. 두그룹모두간세포에서지방축적억제기능에서효능을보였지만소금첨가의상승효과를발견하지못했다. 따라서비만을유도한동물모델을이용한항비만효능평가를통한추가적인연구가더필요하다. 결론 도라지는발효중소금첨가유무에따라 ph, 총당함량, 총세균수와유산균수에영향을주었다. 특히발효중미생물의분포를비교해보면소금첨가로인해 W. koreensis, W. viridescens, L. sakei, L. cuvatus와같은유산균의다양성이더증가되었다. 발효전후에따른플라보노이드의함량에도상당한영향을주었고도라지만발효시켰을때, lipase를저해하는활성이더크게나타났다. 하지만소금첨가유무에상관없이발효중 L. plantarum과 Leu. psedomesenteroides, Lc. lactis subsp. lactis가주요미생물로발효에관여했으며간에서지방축적이억제되었다. 비록소금첨가가미생물에영향을주었지만, 발효후효능에있어상승효과는나타나지않았다. 결론적으로본연구결과를통해도라지발효는소금첨가와상관없이장내지방분해와간의지방축적을억제함으로써비만예방과치료에도움이될수있을것으로기대된다. 감사의글 본연구는 2016년한국연구재단의지원에의해수행되었다 ( 과제고유번호 : NRF-2016R1A2B ). References 1. Hong MW. Statistical analyses of Platycodi radix prescriptions. Korean Journal of Pharmacognosy ; 5(1) : Jang YE, Seo BI. The anti-obesity effects of Platycodi Radix, combination of Platycodi Radix and Cyperi Rhizoma on obesity induced by high fat diet. Kor J Herbology ; 31(3) : Byun BH. Antiobesity effects of Platycodon grandiflorum extract on body weight changes and serum lipid profiles of obese rats induced high fat diet. Korean J Life Sci ; 13(6) : Park KY. Increased health functionality of fermented foods. Food Industry and Nutrition ; 17(1) : Son CY, Song BJ, Ma JY, Kwon KI. Anti-platelet aggregation study of fermented Galgeun Tang and fermented Ssanghwa Tang. Yakhak Hoeji ; 55(5) : Kang DH, Kim JS. Functionality analysis of Korean medicine fermented by lactobacillus strains. J Microbiol Biotechnol ; 39(3) : Choi YK, Sul JU, Park SK, Yu SN, Kim SH, Rhee MS, et al. Research trends of fermented medicinal herbs based on their clinical efficacy and safety assessment. J Life Sci ; 22(12) : Kang YH, Kim KK, Kim TW, Yang CS, Choe M. Evaluation of the anti-obesity activity of Platycodon grandiflorum root and Curcuma longa root fermented with Aspergillus oryzae. Korean J Food Sci Technol ; 47(1) : Choi W, Song J, Park MH, Yu HJ, Park H. Effect of fermented Platycodon grandiflorum extract on cell proliferation and migration in bovine aortic endothelial cells. J Life Sci ; 26(1) : Lee KS, Kim JN, Chung HC. Study on anti-oxidative activities and beverage preferences relating to fermented lotus root and Platycodon grandiflorum extracts with sugar through lactic acid fermentation. The East Asian Society of Dietary Life ; 25(1) : Park SJ, Park KY, Jun HK. Effects of commercial salts on the growth of kimchi-related microorganisms. J Korean Soc Food Sci Nutr ; 30(5) : Shin NR, Wang JH, Lim D, Lee MJ, Lim H. Microbial change and fermentation characteristics during Samjung- Hwan natural fermentation. J Korean Med Obes Res ; 15(2) : Han KI, Kim MJ, Kwon HJ, Kim YH, Kim WJ, Han MD. The effect of container typees on the growth of bacteria during Kimchi fermentation. The Korean Journal of Food And Nutrition ; 26(2) : Lee SY, Yoo KM, Moon BK, Hwang IK. A study on the development of vinegar beverage using Yacon Roots (Smallanthus sonchifolius) and analysis of components changes during the fermentation. Korean J Food Cook Sci ; 26(1) : Baek SY, Kim JS, Mun JY, Lee CH, Park YK, Yeo SH. Quality characteristics of detoxified Rhus verniciflua vinegar fermented using different acetic acid bacteria. Korean J. Food Preserv ; 23(3) : Kim YJ, Cho HJ, Yu SN, Kim KY. Diversity of marine microbes by PRC-DGGE. Kor J Fish Aquat Sci ; 40(6) : Caiola MG, Billi D, Friedmann EI. Effect of desiccation on envelopes of the cyanobacterium Chroococcidiopsis sp. (Chroococcales). Eur J Phycol ; 31(1) :

10 신나래외 : 소금첨가에따른도라지발효특성과미생물변화및항비만효능평가 18. Ehrhardt DW, Wais R, Wais SR. Calcium spiking in plant root hairs responding to Rhizobium nodulation signals. Cell ; 85(5) : Cha SK. Probiotic microorganisms and lactic acid bacterial foods. J Microbiol ; 26(2) : Jung JY, Lee SH, Jin HM, Hahn Y, Madsen EL, Jeon CO. Metatranscriptomic analysis of lactic acid bacterial gene expression during kimchi fermentation. Int J Food Microbiol ; 163(2) : Rodríguez H, Curiel JA, Kandete JM, Rivas B, Felipe FL, Gómez-Cordovés, et al. Food phenolics and lactic acid bacteria. Int J Food Microbiol ; 132(2) : Back G, Goo BG, Ahn BJ, Park JK. Effects of water-soluble polysaccharides from tott on lipid absorption and animal body weight. J Korean Soc Food Sci Nutr ; 42(4) :

Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,