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주혁 낭
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1 당뇨병제 30 권제 1 호, 2006 원저 자연살세포억제와저용량방사선골수조사방법으로유도된혼합키메라의동종췌도이식거부반응억제효과 가톨릭대학교의과대학내분비대사내과교실, 가톨릭의정부혈액종양내과, 서울대학교의과대학미생물학교실 박헌석조석구박정규홍옥기김지원김보령윤건호 The effects of mixed chimerism conducted by natural killer cell depletion with non myeloablation on islet allograft rejection Heon-Seok Park, Seok-Goo Cho 1, Chung-Gyu Park 2, Oak Kee Hong, Ji-Won Kim, Bo-Ryung Kim, Kun-Ho Yoon Division of Endocrinology and Metabolism, Division of Hemato-Oncology 1, Department of Internal Medicine, The Catholic University of Korea Department of Microbiology and Immunology, Tumor Immunity Medical Research Center, Transplantation Research Institute, Seoul National University College of Medicine 2, Seoul, Korea - Abstract - Background: Because of the shortage of human pancreas and immunorejection, very small fraction of patients with type 1 diabetes can be treated with islet transplantation. The immune tolerance induction for overcoming the immume rejectin of trausplamted islets could be conducted by hematopoietic mixed chimerims with various invasive methods. The purpose of this study is to investigate the effect of mixed chimerims conducted by newly developed minimally invasive methods on islet allografts rejection in streptozotocin induced diabetic mice. Methods: Recipient, Balb/c (H-2K d ) mice were injected intraperitoneally with antiasialogm1 antibody at one day before bone marrow transplantation. There were received total body irradiation at a dose of 500 cgy and followed by tail vein injection of the 2x10 7 T-cell depleted bone marrow cells from C57BL/6 (H-2K b ). Mixed chimerism mice were determined by gdna PCR of lymphocyte MHC class I gene (H-2K) on 21st day. Streptozotocin induced diabetic mixed chimera mice were received islet transplantation from bone marrow donors. Grafts, spleen and peripheral blood were obtained from the mixed chimera mice, and there were used by Immunohistochimeical staining, flow cytometric analysis and gdna PCR on 21st day. Results: The blood glucose levels of streptozotocin induced diabetic mice were normalized by transplantation of bone marrow donor islets and maintained during 30 days. After removal of first islet allografts, hyperglycemia was re-established. We could re-confirmed donor specific tolerance of transplanted islets by second transplantation of bone marrow donor islets. Normoglycemia was maintained during 21 days after second islet transplantation. Furthermore islet grafts from MHC-mismatched third party mice were immediately rejected. Flow cytometric analysis results suggest that the mixed chimerism mice were maintain during the whole study period. Conclusion: The mixed chimerism model conducted by newly developed and minimally invasive method effectively prevents the islet allo grafts rejection in STZ-induced mixed chimerism 접수일자 : 2005년 8월 27 일, 통과일자 : 2006년 1월 2 일, 책임저자 : 윤건호, 가톨릭대학교의과대학강남성모병원내분비내과

2 - 박헌석외 6 인: 자연살세포억제와저용량방사선골수조사방법으로유도된혼합키메라의동종췌도이식거부반응억제효과 - mice (J Kor Diabetes Assoc 30:54~63, 2006). Key words: Insulin, Islet, Transplantation, Mixed chimera, Type 1 diabete 서 자가면역기전에의한베타세포파괴로인슐린의분비 가저하되어유발된제1형당뇨병은적절한혈당조절이어 려워결국당뇨병성만성합병증이발생함으로심각한질환 으로발전된다 1,2). 따라서완치할수있는치료법의개발이 필요하며, 췌장혹은, 췌도이식이임상에소개되고있다. 그러나공여자췌장의심각한부족과면역거부반응등의장 애로보편적인치료방법으로자리잡지못하고있다. 장기 의이식이성공적이라도지속적인면역억제제의사용은이 후, 수혜자에게여러가지요인으로부작용을유발하게된 다 3). 이러한문제의근본적인해결책으로면역반응극복에 영구적로안정적이며, 효율적이고, 안전한방법들의개발이 필요한상황이다 4). 그중공여자의골수를수혜자에게이식 함으로써, 수혜자가공여자의조직적합항원에대한내성을 론 가지게하는키메라방법이주목받고있다. 최근골수이식을이용해혼합키메라를유도하여면역 내성을유도하는방법으로면역거부반응을극복할수있는 새로운치료법들이다양하게연구되고있다. 혼합키메라는 완전키메라가가지고있는부작용인이식편대숙주병 (graft versus host disease, GvHD) 이최소화된다는점에서주목받 고있다 5,6). 혼합키메라가유도되면골수공여자의장기이 식후대부분성공적인면역내성을유도하는것으로보고 되고있다 6-8). 그러나혼합키메라 ( 혹은완전키메라 ) 유도 를위한방사선조사및면역억제제사용에의한면역기능 의심각한억제및장기손상등의부작용과, 고비용의부담 이있다. 따라서골수의기능억제와, 이식비용을최소화 하면서도혼합키메라를성공적으로유도할수있는새로운 방법의혼합키메라유도법이개발된다면이식학분야에커 다란발전을이룰수있을것으로기대되고있다. 새로운방 법중수혜자의자연살세포의작용을억제하여이식하는방 법이있다. 이러한방법이고안된배경은몇몇의연구들에 서골수의안정적인이식에서수혜자의자연살세포의중요 성이보고되고있기때문이다 9). 또한자연살세포는이식된 조직적합항원부적합세포에가장먼저이식후거부반응을 유발하는것으로보고되고있다 10,11). 본실험에서는저용량의방사선을단한차례조사하고, 수혜자의자연살세포억제제를처리한후에, 항 Thy-1.2를 이용하여 T-세포를제거한공여자의골수를이식하였다 12). 이러한방법을통해서, 자연살세포의억제에의해이식된 골수가생착되어혼합키메라가성공적으로유도되어었는 가를확인하였다. 또한성공적로유도된혼합키메라 Balb/c 생쥐에당뇨병을유발시킨후골수공여자의췌도를이식하 여면역관용이발생하는가를관찰하였다. 1. 실험군과대조군 대상및방법 혼합키메라를만들기위해서공여자는조직적합항원유 전자가 H-2K b 인 C57BL/6 (Orient, Seoul, S. Korea) 생쥐 를사용하였고, 수혜자는 H-2K d 인 Balb/c (Orient) 생쥐를 이용하였다. 췌도를제공하는생쥐는골수공여자인 C57BL/6 와, 골수를제공하지않은제3종으로 H-2K k 인 C3H/H (Orient) 생쥐를실험대조군으로이용하였다. 혼합키메라 Balb/c의대조군은면역거부반응내성을비 교하기위해 wild Balb/c 를두어골수공여자인 C57BL/6 의 췌도를각각이식하여군마다의내성유무를비교하였다. 비교방법은고혈당으로유도한후, C57BL/6의췌도이식 후혈당변화와, 이식된췌도의인슐린염색유무로평가하 였다. 골수공여자인 C57BL/6 췌도의선택적인면역거부반 응내성을비교하기위하여골수비공여자인 도를혼합키메라 C3H/H의췌 Balb/c에이식하여면역거부반응을비교 하였다. 비교방법은이식한후 C57BL/6의췌도와동일한 시기에수거하여인슐린염색을실행하여비교하였다. 2. 실험방법 혼합키메라 Balb/c의유도는그림 1-A 와같이골수이 식전날에 anti-asialogm1 (Wako Chemicals, Osaka, Japan) 40 μl를 D-PBS (Gibco, N.Y, USA) 200 μl에섞 어서주입하여수혜자의자연살세포를억제한후다음날에 전신방사선조사를한후골수이식을수행하였다. 골수이 식후혼합키메라유도를확인한후췌도이식 6일전에 Streptozotocin (STZ, Sigma & Aldich, St. Louis, USA) 을 주사하여혼합키메라 Balb/c 의혈당이 300 mg/dl 이상오 른것을확인하고, 최소 3 일간지속된다음, 골수공여자의 췌도이식을시행하였다. 골수공여자의췌도를이식후

3 - 당뇨병제 30 권제 1 호, 일이지난뒤이식부위를제거한후다시혈당이오르는 것을확인하여 골수공여자의췌도가면역거부반응에내 성을가졌다는것을 1 차확인한후, 동일한방법으로 2차 이식을하여골수공여자의조직적합항원에대한내성을재 확인하였다. 그리고 2차이식시에골수를제공하지않은 제3종의췌도를 2차이식부위의반대편신장막하에동일 한날에이식하여이후최종적으로 2차이식부위를수거할 때에같이수거하여면역염색법으로췌도의면역거부반응 에대해대조확인하였다 (Fig. 1-B). Wild Balb/c 역시 STZ를이용하여당뇨병을유도한후 골수공여자의췌도를동일한방법으로이식하여이식후 면역거부반응에대해서대조하였다. 단 지않았다. 3. 혼합키메라 Balb/c 유도 2차이식은수행하 골수이식하루전에 40 μl의 anti-asialogm1 을수혜자 인 Balb/c (H-2k d ) 에게주사하였다. 골수이식당일 Balb/c 에방사선을 500 cgy 세기로전신방사선에한차례노출시 켰다. 골수공여자인 C57BL/6 (H-2K b ) 의대퇴골과경골에 서골수를뽑은후 100 μm 나일론체 (Becton Dickinson, NJ, USA) 에통과시켰다. 걸러진세포들을 1000 rpm에 10 분간원심분리를하였다. 상층액을제거하고 Dulbecco`s PBS (D-PBS, Gibco) 를첨부하여 1500 rpm에서 3분간원 심분리를하는방법으로두차례세척을하였다. C57BL/6 에서채취된골수에서 T-세포들을제거하기위 하여 mini magnetic cell sorting (Miltenyi biotec, CA, USA) 을이용하였다. 자성을가진 micro bead conjugated anti Thy-1.2 항체 (Miltenyi biotec) 를채취된골수 1x10 7 /μ L 당 10 μl 를넣었다. 항체를넣은후 15분간 4 에서배 양한후, mini MACS column 에통과시켰다. 통과되어나 온골수는 D-PBS를이용하여세척한후이식에이용하였 다. 방사선조사 10~30분후 T-세포가제거된 2x10 7 개의 C57BL/6 의골수를 250 μl D-PBS 에섞어꼬리의정맥에 한차례주입하였다 (Fig. 1-A). 혼합키메라발생은꼬리에 Fig. 1. Schematic of experimental design. (A) Method of mixed chimerism mice induction. -1 day. Anti-asialoGM1 was injected to Balb/c. Total body irradiated and 2x10 7 Bone marrow cells were transplanted to the Balb/c on 0 day. (B) Islet transplantation schedule in STZ induced type 1 DM mixed chimerism mice. On 21 days before islets transplantation to induced mixed chimerism in Balb/c. On 6day before transplantation, type 1 diabetes was induced by STZ injection. On day 0, 1st B6 islets transplantation to the mixed chimerism mice. Graft removal or sham op was done on 30th day. On the 35th day, the second islet transplantation was performed, at the same time third party islets were co-transplanted on the other side of the same kidney. Finally, on the 56th day and the 65th day, all grafts, spleen, peripheral blood and pancreas were harvested. TBI: Total body irradiation BMCs: Bone marrow cells BMT: Bone marrow transplantation STZ: Streptozotocin DM: Diabetes mellitus

4 - 박헌석외 6 인: 자연살세포억제와저용량방사선골수조사방법으로유도된혼합키메라의동종췌도이식거부반응억제효과 - 서채취한말초혈액을이용한지놈 DNA 중합효소연쇄반 응을통해확인하였다. 4. 혼합키메라유도확인 이식된골수가제대로정착하여정상적으로세포분열하 여혈액세포들을방출하는지확인하기위해혼합키메라 Balb/c 의꼬리정맥에서 지놈 200 μl 의말초혈액을추출하였다. DNA를추출하기위하여 Mini blood QIAamp (QIAGEN, CA, USA) 을사용하였다. 중합효소연쇄반응을 수행하기위하여조직적합항원 Class I 유전자인 H-2K gene 의 primer 인 forward: 5'-cgactgtagaaccttagctg-3' 와 reverse: 5'-tggagvtgtcctccttgtag-3' 을사용하였다. Perfect PreMix (Takara Biomedicals, Otsu, Japan) 를이용하여중 합효소연쇄반응을수행하였고, 2 % agarose gel에서전기 영동하여 C57BL/6과 Balb/c 간의염기서열크기차이를 이용하여확인하였다. 5. 생쥐췌도분리 7주령의 C57BL/6의수컷들을 1:4 로혼합한럼푼 (Bayer, Leverkusen, German) 과케타민 ( 유한양행, S. Korea) 을주사용식염수 ( 대한약품, Kyeoki, S. Korea) 로 1:1로희석하여마취하고 Media 199 (M199, Gibco) 1 ml 당 collagenase P (Roche, Basel, Switzerland) 1 mg을용해 시킨용액 2 ml을췌장에연결되는담관을통해주입하여 37 수조에서 60 rpm 으로 25분간흔들며진탕하여소화 시켰다. 10% bovine serum (Gibco) 을섞은 M199 로세번 세척을한후 500 μm의구멍크기를가진체 (Sigma-Aldich) 로여과하여일정크기이상의췌장조각은제거하였다. 췌 도의순도를높이기위하여 Histopaque 1077 (Sigma -Aldich) 로밀도차를이용한분리방법으로췌도를분리하였 다. 분리한췌도들을 M199 (+10% bovine serum) 로세척 하여췌도수를확인한후에 10 % Fetal Bovine Serum (JBI, Taegu, S. Korea) 을섞은 Low glucose D-MEM (Gibco) 으로옮겨서 37 5 % CO2 배양기에서약 1시간 배양한후이식에이용하였다. 6. 췌도이식및이식편제거와수거 STZ를주사하여혼합키메라 Balb/c의혈당이 300 mg/dl 로오른후 3 일후에이식을시행하였다. 분리한 C57BL/6 의췌도를 CO 2 배양기에서 1시간배양한후 100~250 μm크기들을수거하여 500 개씩을각각 PE-50 tube (Becton Dickinson) 에넣은후신장피막하에이식하였다. 이 식을위하여 Hamilton syringe 를이용하여균일한압력으로 췌도가오른쪽신장막하에외부로분출되지않도록하면서 이식하였다. 이식후열봉합기를이용하여이식을위해절 개한부분을열로봉합하였다. 이식후 30일날에이식된 C57BL/6 의췌도부위를수 거하기위하여이식된혼합키메라 Balb/c 를마취한후, 이식부위를열봉합기를이용하여열로제거하였다. 열로 제거한이유는이후에진행되어질 2차이식부위는직접 신장을채취할것이므로, 이러한처리후 1차이식이되어 진신장이남아서 2차이식부위가있는신장을채취한 후에도생존하도록하여, 혈당변화를관찰하기위한것이 다. 또한열처리를직접이식부위에하지않고주변에만 열처리를하는허위시술을하는군을분리하여, 이식된 췌도에의해혈당이유지되었는지를알아보았다. 이후최 종수거를할때는같이수거하여염색을통하여제대로 제거가되어, 이후실험결과에미치는영향을확인하였 다. 이식부위를제거한 5일후 C57BL/6 와 C3H/H 의분리 된췌도를처음 C57BL/6 췌도를제거한군과, 허위시술한 군모두의왼쪽신장막의각기다른위치에이식하였다. 2 차이식후 17일째와 24일째에처음이식된 C57BL/6 췌 도를제거한군과, 허위시술한군모두에서이식된 C57BL/6, C3H/H 의이식부위를수거하였다. 또한허위 시술된군의처음이식된 C57BL/6 의췌도 1차이식후 55 일째에수거하였다 (Fig. 1-B). 7. 혈당측정및복강내당부하검사 혈당의측정은꼬리를조금자른후나오는혈액을이용 하여혈당측정기 (Roche) 로오전 9~10 시에확인하였다. 측 정은격일과 3 일간격으로수행하였다. 복강내당부하검 사는이식편을제거하기 2 일전에수행하였다. 25% 포도당 을 ( 대한약품 ) 2 g/kg 용량으로복강내에주입한후 30 분, 60 분, 90분 120 분에혈당을측정하였다. 8. 유세포분석법 비장은막자를이용하여잘게부수어 100 μm나일론체 를통과시킨후 RBC lysis buffer 를처리한후사용하였다. RBC lysis buffer 처리를한후비장세포들을 1% FBS를 첨가한 Hank`s balanced salt solution (HBSS, JBI) 에항체 를첨부하여염색을하였다. 혼합키메라비율은조직적합 항원 class I 항원과결합하는바이오틴이결함된항 H-2K b 을스트랩토아비딘 APC (Becton Dickison) 로결합한것과, FITC conjugated anti H-2K d ( Becton Dickison) 로염색하 여골수의수혜자와공여자의비율을측정하였다. 혼합키 메라 Balb/c 에서공여자의 T- 세포, B-세포비율은스트랩토 아비딘 APC conjugated H-2K b 에반응하는세포들을각각 PE conjugated anti-cd4, PE conjugated anti-cd8a, PE conjugated anti-cd45r/b220 (Becton Dickison) 로이중 염색하여측정하였다

- 당뇨병제 30 권제 1 호, 2006 - Fig 2. Pancreatic damage after streptozotocin treatment.

5 - 당뇨병제 30 권제 1 호, Fig 2. Pancreatic damage after streptozotocin treatment. Insulin immunohistochemical staining (Arrow) in wild Balb/c (B) and mixed chimerism Balb/c (A) pancreatic islet on 1 day before islet transplantation. BrdU immunohistochemical staining in wild Balb/c (D) and mixed chimerism Balb/c (C). pancreatic islet on 6th day after STZ treatment. Insulin immunohistochemical staining in Mixed chimerism Balb/c (E). on 65th day after islet transplanted of bone marrow cell donor. Beta cell percentage in islets of wild Balb/c and mixed chimerism Balb/c on -1 day (F). (Original magnification x400, * P 0.001) 9. 면역조직염색법 결 과 췌장과이식된췌도를 10% 포르말린 (Sigma-Aldich) 으 로고정한후파라핀으로포매하였다. 인슐린은 1:100 비율 로 Guinea pig anti-insulin (Zymed, CA, USA), CD4 (+) T-세포는 mouse anti-cd4 (Becton & Dickinson ) 를일차항 체로사용하였다. 세포분열을보기위해 anti mouse anti- BrdU (Neomarkers, CA, USA) 을이용하였다. Vectastin ABC kit (Vector laboratories, CA, USA) 을사용하여비특이 적반응억제와, 스트랩토아비딘 - 바이오틴결합을유도한후, Diamin- obenzidine tetrahydrochloride (DAB, Sigma -Aldich) 로발색하였다. 10. 베타세포비율측정 조직내베타세포의상대적비율은현미경하에서 200배율 렌즈를통하여비디오화면으로투시한다음 point count 법으 로측정하였다 13). 11. 통계적검증 각실험결과는평균 ± 표준편차 (standard error) 로표시 하였고, 각군간의비교는독립표본 t-test 로유의성을확 인하였으며, p 값은 0.05 이하를유의수준으로하였다. 1. 말초혈액의지놈 DNA 중합효소연쇄반응을통한 혼합키메라유도확인 혼합키메라 Balb/c의말초혈액에서추출한지놈 DNA 중합효소연쇄반응결과에서는 C57BL/6 의유전자 (H-2K b ) 만이나타났다 (Fig. 3). 2. STZ 에의한베타세포손상및당뇨병발생확인 STZ를투여한후 1 일째부터혈당은급격히상승하였다. 그후 300mg/dL 이상을 3일이상유지되는것을관찰하였 다. STZ 투여 3일후췌장베타세포의양상은정상 Balb/c, 혼합키메라 Balb/c 모두인슐린염색되는세포가거의발 견되지않았다 (Fig. 2-A, 2-B). Fig. 2-B에서염색된부분 은베타세포가죽은후의잔류물로보이며, 핵의수가확연 히줄어들어있다는것을알수있다. Point count를사용하 여베타세포의비율을확인한결과, 정상췌장에서의베타 세포의비율에비해현저히떨어졌으며, mixed chimerism Balb/c 와 wild Balb/c 간의유의한차이는없었다 (2-F). BrdU 염색을하여췌장베타세포의재생하는것은큰차이

- 박헌석외 6 인: 자연살세포억제와저용량방사선골수조사방법으로유도된혼합키메라의동종췌도이식거부반응억제효과 - Fig. 3. Induced mixed chimerims Balb/c confirmed by genomic DNA PCR in peripheral blood. Fig. 4.

6 - 박헌석외 6 인: 자연살세포억제와저용량방사선골수조사방법으로유도된혼합키메라의동종췌도이식거부반응억제효과 - Fig. 3. Induced mixed chimerims Balb/c confirmed by genomic DNA PCR in peripheral blood. Fig. 4. Blood glucose levels were measured after islet transplantation. Islets of bone marrow cell donor were transplanted to STZ- induced diabetic mixed chimerims Balb/c. Islet of bone marrow cell donor and third party were re-transplanted after depleted(30th day) of the first graft (- - 1st graft depleted group n=4, - - 1st graft did not deplete group n=2). Islets of bone marrow cell donor were transplanted to wild Balb/c mice (- - n=14). * P (- - vs - - & - - vs - -) + Streptozotocin injection (300mg/Kg) Islet transplantation IP-GTT (- - & - -) End point of death (- -) 점이나타나지않았다 (Fig. 2-C, 2-D). 이식후 65일후의혼합키메라 Balb/c의췌장을수거하 여인슐린염색을한결과에서역시베타세포의수는현저 히감소되어있는것을관찰할수있어 (Fig. 2-E), 췌도이 식후혈당이내려간후지속적로혈당조절능력을가지는 것은오직이식된췌도에의한것임을예측할수있다. 3. 혈당변화 혼합키메라 Balb/c 는골수의공여자인 C57BL/6 췌도의 1 차이식후오랜기간혈당이정상으로유지되었으며, 1차 이식부위를제거하자마자다시혈당이오르는것을확인 할수있었다 (n=4). 2차로췌도를이식하였을때에도 1차 이식과동일하게혈당이정상화되었다 (Fig 4). 정상 Balb/c 에서 C57BL/6 췌도는이식후 10일째부터다시고 혈당이유발되기시작하여, 이식후 17일째에는혈당이 300 mg/dl 이상으로올라갔다. 4. 면역조직염색법을통한골수공여자, 제3종췌도이 식부위의상태비교. 이식되어진췌도에의해서만혈당이조절이되는것을

- 당뇨병제 30 권제 1 호, 2006 - Fig 5. Insulin immunohistochemical staining in islet graft. (A) Islet of bone marrow cell donor in the graft was stained with insulin immunohistochemical staining at 56th day.

7 - 당뇨병제 30 권제 1 호, Fig 5. Insulin immunohistochemical staining in islet graft. (A) Islet of bone marrow cell donor in the graft was stained with insulin immunohistochemical staining at 56th day. (B) Second islet 1st graft depleted group were stained with insulin immunohistochemical staining at 26 days after 2nd islet transplantation. (Original magnification x 400) 확인하기위하여수행되어진, 1차이식을한후열봉합기를 이용하여제거한실험군의 1차이식부위는신장막조차소 실되어있었으며, 인슐린염색은되지않았다. 두번이식된골수공여자의췌도는이식후 58일째제 거하지않은 1 차이식부위와, 2차이식부위를모두수거 하여인슐린염색을하였을때인슐린염색은췌장에서인 슐린염색한것과동일하게잘되었으며, 세포의상태도매 우양호하였다 (Fig. 5). 혼합키메라 Balb/c 에이식된제3 종췌도는관찰되지않았다. 5. 유세포분석법을이용한혼합키메라비율확인. 2 차이식후췌도를수거하면서비장을같이채취하여 유세포분석방법을이용하여골수공여자의전체비율과, T- 세포, B- 세포의비율을각기측정하였다 (Fig. 6). 골수 공여자의임파구비율은 94.12%, 52.57%, 90.71% 의비율 로나타났으며, 이중에서 CD4+T-세포의비율은 7.90%, 3.40%, 10.84% 이며, CD8+T- 세포는 8.82%, 2.80%, 2.97% 비율이었다. 반면 B-세포는 58.07%, 33.56%, 64.30% 로 T- 세포보다매우높은비율로측정되었다. 고 제1형당뇨병의근본적인치료는지속적으로체내에인 슐린이분비되어혈당이조절되는것을의미하는것으로, 췌장혹은췌도를이식함으로써충족된다. 하지만조직적합 항원이다름으로인하여다양한면역기전작용에의해이식 된세포, 조직, 장기들은이식거부반응으로소실되어지게된 다. 따라서면역억제제, 조직적합항원이맞는장기이식을 필요로한다. 이식후면역거부반응을억제하기위하여면 역억제제를투여하여야하는데, 몇몇면역억제제에서오히 려췌도베타세포에악영향을주는부작용이발생된다 14,15). 그로인해면역억제제를이용하지않으면서도조직적합항 원부적합췌장, 췌도를이식할수있는방법으로키메라법 이제시되었다 16). 키메라는공여자의세포로완전히바뀐 완전키메라, 수혜자와공유하는혼합키메라로구분된다. 혼합키메라는완전키메라가골수공여자의조직적합항 찰

8 - 박헌석외 6 인: 자연살세포억제와저용량방사선골수조사방법으로유도된혼합키메라의동종췌도이식거부반응억제효과 - Fig 6. The diagram of flowcytometric analysis in mixed chimerism Balb/c. Splenocytes were stained with C57BL/6 marker CD45.2 on mixed chimerism mice. Histogram of C57BL/6 origin lymphocyte (CD4, CD8a, CD45R/B220;B-cell) has been shown from the CD45.2 positive region. 원에대해서만내성을가지고있는것에비해, 공여자, 수혜 자의모두에대한조직적합항원내성을가지게됨으로써공 여자의장기가이식되었을때면역내성이유도됨은물론, 수혜자에서의이식편대숙주병 (GvHD; 발진, 염증등) 이감 소되는장점을가지고있다. 이러한이유는혼합키메라는 골수완전제거방법을쓰는것에반해완전혼합키메라는 계획적인골수비완전제거방법을사용하기때문이다 17). 혼합키메라유도를위해현재까지다양한방법들이소개되 고있으며, 대부분은골수에일정량의방사선조사및항 T- 세포혹은자연살세포항체를이용하여이식되어질공여자 의골수생착을유도하는방법들이있다. 이중자연살세포 는골수이식후초기에먼저작용하는것으로알려졌으며, 이후의자연살세포에유도되어진항원특이반응이활성화 되어 T-cell 에게도정보를전달하여본격적인이식되어진 골수세포에대한면역작용이발생되어지는것으로알려지 고있다 9,11). 그렇기때문에골수이식을위해서는초기의 자연살세포억제가중요하다고보이며, 이렇게유도되어진 면역관용은 1 주일간지속되어지며, 이후에는자연살세포가 정상적인수치로돌아옴을확인할수있다 12). 본연구에서는골수의 T-세포를억제하는방법이아닌 자연살세포를억제함으로써혼합키메라를유도하였고, 이 러한방법에의해생성된혼합키메라 Balb/c에서골수공 여자의췌도를이식하였을때안정적인생착이되어유지되 는지를살펴보았다. 우선적으로췌도를이식한후면역거 부반응의유무를알기위하여, 췌도이식에의해혈당이정 상화되는지를살펴보기위해 STZ 로제1형당뇨병모델을 사용하였다. STZ는베타세포에특이적으로일산화질소 (NO) 자극을유발시킴으로써세포사멸을발생시키게된다. 이와같은 STZ 작용을이용하여제1형당뇨병을발생시킨 후혼합키메라와정상쥐들의췌도손상의차이를확인하 였다. 혼합키메라의발생유도확인은지놈 DNA 중합효소 연쇄반응을이용하였다. 결과에서는 Balb/c 의유전자인 H-2K d 는보이지않으며, 단지공여자인 C57BL/6 의유전 자인 H-2K b 만이강하게나타남을확인하였다. 그러나공 여자전체세포의높은비율에비해 T-세포의비율은이후 에시행된유세포분석법에서매우낮음을확인하였다. 반 면 B- 세포의비율은공여자의것이많음을알수있었다. 골수공여자에서유래된 B- 세포의높은비율과, 실험에서 관찰하지않은다른혈액구성세포 ( 예: 과립구, 자연살세포 등) 들대부분은골수공여자유래성임을예상할수있다. 적 은비율의공여자유래성 T- 세포와, 수혜자유래성 T-세포 들은공여자와수혜자의골수에서분화되어진항원제시세

9 - 당뇨병제 30 권제 1 호, 포에의해공여자, 수혜자에조직에대한면역관용을얻은 것으로보여진다. 혼합키메라 Balb/c의췌장을인슐린면역조직염색하였 을때, 이식 1 일전과, 이식후 65일사이의베타세포는동 일하게낮은비율이유지되는것을확인할수있었다. 두차 례에걸친이식에서혼합키메라 Balb/c는모두정상적인 혈당을유지하였으며, 모두최종수거를하기전까지생존 하는것을확인하였다. 그리고또한이식된 1차췌도를제 거하였을때에는혈당이다시급속히증가하는것을보여, 혈당의정상화는이식췌도에의한것임을확인할수있었 다. 또한그림을제시하지않았지만첫번째췌도이식후 29 일째에복강내당부하검사를한결과에서혼합키메라 Balb/c 에서는정상내당능상태를나타냈다. 반면정상 Balb/c 에이식한경우에는그와반대로이식후정상혈당 을오랜기간지속시키지못하였으며, 이식후 9일째부터 혈당은다시증가하는것을관찰할수있었다. 이것은이식 된췌도는정상 Balb/c 에서는면역반응에의해손상되었음 을의미한다. 혼합키메라 Balb/c의최종수거를통해서얻 어진췌도 1 차, 2차이식편에서면역조직염색법을통해서 인슐린분비를확인할수있었으며, 대부분의췌도의상태 는건강했고또한, CD4+ T 세포의염색은나타나지않음을 확인하였으며, 이것은췌도이식후에면역거부반응이없 었거나미약했다는것임을확인할수있다. 유세포분석법은비장을이용하였다. 전체적으로 C57 BL/6 (CD45.2 H-2K b ) 의비율이높은것을확인할수있었 으며, 이러한결과는췌도이식전의말초혈액을통해서확 인한지놈 DNA 중합효소연쇄반응과비슷한결과를보여 주고있다. 이러한결과는선행실험과 12) 동일하다. 결과적 으로혼합키메라 Balb/c 는최종수거를할때까지혼합키 메라를유지하였으며, 이러한영향으로이식된골수공여자 의췌도는안정적으로인슐린분비를할수있게된것임을 알수있다. 결론적으로자연살세포를억제하고, 저용량의전신방사 선조사 (500cGy), 공여자의골수에항 T-세포항체를처리 한후이식하는비교적간단한방법으로유도된혼합키메 라 Balb/c는안정적으로골수공여자의췌도에대하여자가 조직으로인식하여거부반응이소실되어 유도된제1 형당뇨병이치유됨을알수있다. STZ를이용하여 자연살세포억제를이용하여골수를이식한후혼합키 메라를유도함으로써골수제공자의장기에대한면역관용 을가지게한이실험방법은조직면역적합항원이다른사 람들끼리의췌도를포함한거의모든장기이식에기여할수 있을것이다. 그리고자연살세포의면역작용기전에대한 정확하게알려진바가없음으로, 수혜자의자연살세포억제 후감염, 암유발등에대한주의가필요할것으로보인다. 본연구중에서는감염과, 암발생이관찰되지않았다. 요 연구배경 : 제1형당뇨병의치료방법중에서혼합키메라 유도방법은일반적으로공여자의골수를방사선이나약물 로골수세포를제거한수혜자에게직접정맥에주사하는방 식으로유도한다. 그리고골수의생착을위한보조자극차 단항체를보편적으로사용한다. 본연구에서는수혜자의독 성을줄이고, 수혜자의자연살세포만을억제하는방법으로 혼합키메라를유도하고, 여기에공여자의췌도를이식하여 면역거부반응을관찰하였다. 방법 : Anti-asialoGM1 로자연살세포를억제한 Balb/c 에 500cGy 로전신방사선조사후, C57BL/6의골수를 anti- CD90 (Thy-1.2) 항체로처리한후에꼬리정맥에마리당 2x10 7 세포를주사하였다. 지놈 DNA 중합효소연쇄반응을 이용하여유도된혼합키메라 약 Balb/c의성공적인혼합키메 라유도확인을하였다. 그후에 Streptozotocin (STZ) 으로 당뇨병을유발시킨후골수공여자의췌도를신장막부위에 μm크기로 500 개를이식하였다. 이식 3주후이식 부위를제거하고, 혈당이상승되는것을확인한후, 골수 공여자및제3종쥐의췌도를각각 500 개씩이식하였다. 2 차이식 하여지놈 3 주후모든이식부위와, 췌장, 혈액, 비장을수거 DNA 중합효소연쇄반응, 면역조직염색법및유 세포분석법을하였다. 결과 : STZ 에의해상승한혈당은 C57BL/6 췌도를이 식한후곧정상치화되었으며, 30일간지속됨을확인하였 다. 그리고췌도이식부위제거후에다시고혈당으로되는 것을관찰하였다. 두번째의이식에서도똑같이혈당이정 상으로돌아오는것을확인하였다. 면역조직염색법으로각 이식부위를염색하였을때골수공여자의췌도이식편에서 인슐린이강하게염색되는것을확인하였으며, 제3종의이 식편은면역거부반응에의해소실되어나타나지않았다. 마지막이식부위를적출할때에혼합키메라의유도후지 속여부를비장과, 혈액을유세포분석법으로분석한결과, 혼합키메라가유지되는것을확인할수있었다. 결론 : 수혜자의면역체계등에대한나쁜영향을최소로 하고, 골수의자연살세포억제를이용한새로운방법으로 유도된혼합키메라는 STZ 로당뇨병을유도한후에골수 공여자의췌도를이식하였을때정상적인혈당을유지되는 것을확인할수있었다. 감사의 본연구는바이오디스커버리복제기술기반사업에형질전환 돼지췌도를이용한당뇨병치료기술개발연구과제의지원으 로이루어졌음. 글

10 - 박헌석외 6 인: 자연살세포억제와저용량방사선골수조사방법으로유도된혼합키메라의동종췌도이식거부반응억제효과 - 참고문헌 1. Atkinson MA, Maclaren NK: The pathogenesis of insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med. 331: , Patricia MG, George SE: Pathogenesis, prediction and trials for the prevention of insulin-dependent (type 1) diabetes mellitus. Advanced Drug Delivery Reviews 35:143-56, Stratta R: Late acute rejection after pancreas transplantation. Transplantation Proceedings 30:646, Nakhleh R E, Gruessner RWG: Ischemia due to vascular rejection causes islet loss after pancreas transplantation. Transplantation Proceedings 30:539-40, Spiros D, Gaetano CC, George WB III, Rolando GM, Joshua M: Donor bone marrow transplantation chimerism and tolerance. Transplant Immunology 13:105-15, Hans JK, Georg L: Tolerance and chimerism. Transplantation 75: 26s-31, Li H, Inverardi L, Damaris RM, Antonello P, Camillo R: Nonlethal condiioning for the induction of allogeneic chimerism and tolerance to islet allografts. Transplantation 75:966-70, Zhiguang G, Tao W, Hakan S, Yisheng P, Neal H, Hannes K, David E R Sutherland, Bruce R Blazar, Bernhard J, Hering: A substantial level of donor hematopoietic chimerism is required to protect donor=specific islet grafts in diabetic nod mice. Transplantation 75:909-15, William J M, Vinay K, Michael B: Acute rejection of murine vone marrow allografts by natural killer cells and T cells -differences in kinetic and target antigen recognized. J Exp MED 166: , Pierre T, Dan LL, John WW, WG Alvord, Craig WR: Anti-asialo GM1 antiserum treatment of lethally irradiated recipients before bone marrow transplantation: Evidence that recipient natural killer depletion enhances survival, engraftment, and hematopoietic recovery. Blood 76: , William JM, Crystal Y. K, Arati R, Michael B, Dan LL: Immunobiology of natural killer cells and bone marrow transplantation: Merging of basic and preclinical studies. Immunological Reviews 181: , Cho SG, Yukinobu S, Yasushi S, Yukoh N, Kiyoko I, Kaoru U, Satoshi T, Kenzaburo T, Arinobu T, Shigetaka A: Anti-NK cell treatment induces stable mixed chimerism in MHC-mismatched, T cell-depleted, nonmyeloablative bone marrow transplantation. Experimental Hematology 32: , Weibel ER: Stereplogic methods. In practical methods for biologic morphometry. London, Academic Press, 1: Drachenberg CB, Klassen DK, Weir. MR, Wiland. A, Fink. JC, Bartlett ST, Cangro CB, Blahut S, Papadimitriou JC: Islet cell damage associated with tacrolimus and cyclosporine: Morphological features in pancreas allograft biopsieds and clinical correlation. Transplantation 68: , Guo, Zhiguang, Chong ASF, Shen. J, Foster P, Sankary HN, McChesney L, Mital D, Jensik SC, Gebel H, Williams JW: In vivo effects of leflunomide on normal pancreatic islet and syngeneic islet graft function. Transplantation 63:716-21, Paul SR, Catharine MC, Megan S, Hiroshi I, Juanita S, Robert BC: Tolerance, mixed chimerism, and chronic transplant arteriopathy The Journal of Immunology 167: , Sykes M: Mixed chimerism and transplant tolerance. Immunity 14:417-24,

Pharmacotherapeutics Application of New Pathogenesis on the Drug Treatment of Diabetes Young Seol Kim, M.D. Department of Endocrinology Kyung Hee Univ

Pharmacotherapeutics Application of New Pathogenesis on the Drug Treatment of Diabetes Young Seol Kim, M.D. Department of Endocrinology Kyung Hee Univ Application of New Pathogenesis on the Drug Treatment of Diabetes Young Seol Kim, M.D. Department of Endocrinology Kyung Hee University College of Medicine & Hospital E mail : ycell2@yahoo.co.kr Abstract